CN110974805A - 具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒及制备 - Google Patents

具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒及制备 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种制备具有提呈抗原作用的高效免疫佐剂活性的壳聚糖纳米粒的方法。具体方法如下：将不同分子量不同取代位点的带有壳聚糖负电荷的衍生物和不同分子量季铵盐衍生物通过聚电解质复合法进行纳米粒的制备，筛选出具有一定免疫活性的纳米粒，且经过对树突细胞实验处理，表现出较好抗原提呈作用。为近年来壳聚糖作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和理论指导。

Description

具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒 及制备
技术领域
本发明属于海洋生物技术，具体涉及一种具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法。
背景技术
壳聚糖是自然界唯一带有正电荷的天然多糖，并由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。由于壳聚糖来源丰富，且安全无毒具有良好的生物兼容性，与人体细胞有良好的相容性，在食品医药，农业，材料科学领域具有很大的应用潜力。但壳聚糖本身难溶于水的特点限制了其应用与发展，对其进行衍生化修饰增加其溶解性等将使其应用更加广泛。纳米粒的研究是近年来研究热点之一，利用纳米粒作为药物载体是目前医学上多种药物的重要研究方向。壳聚糖本身具有较好的生物相容性，在生物体内无毒副作用能够被生物体所降解，而所制备出的纳米粒一方面发挥着载体作用，因此以壳聚糖为基础材料作为疫苗免疫佐剂的开发具有一定优势。佐剂的抗原提呈作用在疫苗发挥作用过程中十分重要，能够增强疫苗的免疫原性同时提高免疫效果。是检验一个材料能够作为免疫佐剂的标准之一。
发明内容
本发明考虑以上问题，提供一种具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒及其制备和应用。
为实现上述目的，本实验采用的技术方案为：
一种壳聚糖衍生物纳米粒，通过不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，以聚电解质复合法获得粒径162.40nm-332.80nm、电位19.5mV-40.60mV的壳聚糖衍生物纳米粒；所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。
所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同分子量和不同取代位点的壳聚糖羧甲基化衍生物；不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物为不同分子量壳聚糖季铵化衍生物；
所述不同分子量和不同取代位点的壳聚糖硫酸酯化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的N.O位取代、N位取代以及O为取代羧甲基壳聚糖；优选为分子量为180-200K Da的N.O位取代羧甲基壳聚糖，180-200K Da的N位取代羧甲基壳聚糖。
所述不同分子量壳聚糖季铵化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物。优选为分子量为180-200K Da的壳聚糖季铵化衍生物。
一种壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法，所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，通过以聚电解质复合形成纳米粒子；其中，正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。
所述正负电荷衍生物在室温，以500r-700r磁力搅拌20-40min,过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存。
一种壳聚糖衍生物纳米粒的应用，其特征在于：所述壳聚糖衍生物纳米粒在制备具有抗原提呈作用的疫苗免疫佐剂中的应用。
一种包裹抗原的免疫疫苗，疫苗佐剂为所述壳聚糖衍生物纳米粒，佐剂与抗原按质量比为0.5-2：1的比例混合。
进一步的说将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物与抗原混合均匀后，加入带不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
所述抗原为能够引起机体免疫反应的物质，例如模式抗原OVA以及灭活病毒抗原。
一种包裹抗原的免疫疫苗的制备方法，将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物与抗原混合均匀后，加入带不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
进一步的说，利用所述壳聚糖衍生物纳米粒，采用对树突状细胞的免疫活性进行测定。通过对未包裹抗原纳米粒的细胞毒性测定，确定其对细胞无毒的纳米粒最大浓度为100μg/mL。通过对免疫因子表达量和细胞免疫因子分泌量的测定，优选分子量均为180～200K Da的N.O位取代羧甲基壳聚糖作为负离子壳聚糖衍生物，季铵盐壳聚糖作为正离子壳聚糖衍生物，此时制备纳米粒条件羧甲基壳聚糖浓度为1.5mg/mL，季铵盐浓度为1.0mg/mL，纳米粒具有最好的免疫效果。
本发明所具有的优点：
1.本发明使用壳聚糖的正负离子衍生物，在不引入交联剂的条件下进行纳米粒的制备，去除了交联剂的毒副作用，保证其在生物体内的安全，经细胞毒性试验检测，其在适当的浓度下，具有生物安全性。
2.本发明所制备的纳米粒可作为免疫佐剂，将其具有使用于小鼠DCS细胞进行免疫效果验证，结果表明多数纳米粒能够促进小鼠四种细胞因子的表达及分泌量，证明所制备纳米粒具有一定免疫效果。
3.本发明通过流式细胞仪检测，并使用MFI(平均荧光强度)对不同纳米粒促进树突细胞表面蛋白分泌水平进行测定，表明所制备纳米粒具有增强树突细胞抗原提呈作用能力。在制备高效且无副反应免疫佐剂方面具有良好应用价值。
附图说明
图1A-E为本发明实施例1中获得的不同分子量壳聚糖测定结果的HPLC图谱；其中，A为1kDa分子量、B为3kDa分子量、C为5kDa分子量、D为50kDa分子量、E为200kDa分子量。
图2为本发明实施例3中获得的不同位点壳聚糖羧甲基化衍生物的红外图谱。
图3为本发明实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的电位(A)和粒径(B)表征图。
图4为本发明实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的扫描电镜图。
图5为本发明实施例6中获得的纳米粒促进DC细胞表面蛋白分泌量流式图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
本发明以壳聚糖为基础，进行纳米粒的制备并对其免疫活性进行测定，最终得具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒。
具体方法如下：将不同分子量不同取代位点的带有壳聚糖负电荷的衍生物和不同分子量季铵盐衍生物通过聚电解质复合法进行纳米粒的制备，通过细胞实验，得出具有最佳免疫活性的壳聚糖衍生物纳米粒，由以上原料和条件下所制备的壳聚糖纳米粒，无毒副作用，且经过小鼠树突细胞实验证明能够促进树突细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ四种免疫因子基因表达量的提高，且促进了这四类细胞因子分泌量的增加。通过流式细胞仪检测MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD86四种细胞表面共刺激分子从而促进促进树突细胞的成熟同时增强树突细胞抗原提呈作用。为近年来壳聚糖衍生物作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和指导。
实施例1不同分子量壳聚糖的制备
取6g分子量为182KDa原料壳聚糖加入98mL H2O，2mL醋酸，45℃条件下，搅拌速度为200r/min，搅拌1h后向其中加入壳聚糖酶1g，36h后测定其分子量为5138Da的壳聚糖。
按照上述方法，采用不同分子量的原料壳聚糖使用壳聚糖酶进行降解，仅改变壳聚糖酶的加入量以及反应时间和温度，即可得不同分子量的壳聚糖及其分子量测定结果如下表1和图1；其中，在为保证降解得到壳聚糖具有相同脱乙酰度，一般使用同一批次壳聚糖进行降解。
表1壳聚糖的分子量测定结果
Figure BDA0002330755350000031
Figure BDA0002330755350000041
注：其中1820000Da和210000Da壳聚糖为购买所得，即为原料壳聚糖。
实施例2不同分子量壳聚糖季铵盐的制备
取5g上述实施例制备获不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)和10g 2、3-环氧丙基三甲基氯化铵。并向其中加入70mL蒸馏水，80℃水浴、转速为200r/min条件下进行搅拌，反应时间为24h。将得到的反应液在透析袋中使用蒸馏水透析72h，后在冻干机中-80℃条件下冻干，得到样品a即分子量为4740Da的壳聚糖季铵盐。
同样方法采用不同分子量的壳聚糖分别与2、3-环氧丙基三甲基氯化铵按照上述的过程即可制备获得不同分子量产物壳聚糖季铵盐，所得不同分子量产物壳聚糖季铵盐的分子量测定结果如下表2。
表2季铵盐的分子量测定结果
Figure BDA0002330755350000042
实施例3不同分子量不同取代位点羧甲基壳聚糖的制备
1)不同分子量N、O位取代羧甲基壳聚糖的制备
取10g上述实施例制备获不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)向其中加入100ml异丙醇，室温下溶胀30min。配25ml 10N氢氧化钠溶液，分6次加入到上述反应液中，每次间隔为20min。完全加入后碱化搅拌45min。再向其中加入氯乙酸12g，且分为5次加入，每次间隔时间为5min，完全加入后在60℃条件下，水浴反应3h。反应完毕后向其中加入9ml蒸馏水，并用醋酸将pH条件到7。后透析冷冻干燥得到产物b，即分子量为4640Da的N、O位取代羧甲基壳聚糖。
按照上述的方法采用不同分子量的壳聚糖分别通过氢氧化钠的碱化再与氯乙酸分批次反应后对pH进行调节至中性。按照上述的过程即可制备获得不同分子量N、O位取代羧甲基壳聚糖，所得不同分子量N、O位取代羧甲基壳聚糖的分子量测定结果如下表3。
表3 N、O位羧甲基壳聚糖的分子量测定结果
Figure BDA0002330755350000043
2)不同分子量O位取代羧甲基壳聚糖的制备
首先准备水和异丙醇体积比为1:4的混合液，取10g上述实施例制备获不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)并向其中加入13.5g氢氧化钠，在50℃条件下，水浴搅拌碱化反应1h。另制备氯乙酸的异丙醇溶液，在20ml异丙醇溶液中溶解15g氯乙酸，30min内滴加入上述反应液中，后反应4h。后加入200ml的70％乙醇终止反应。透析冷冻干燥得到样品c，即为4950Da分子量的O位取代羧甲基壳聚糖。
按照上述的方法采用不同分子量的壳聚糖分别通过氢氧化钠的碱化，与异丙醇所溶解的氯乙酸反应后醇沉。按照上述的过程即可制备获得不同分子量O位取代羧甲基壳聚糖，所得不同分子量O位取代羧甲基壳聚糖的分子量测定结果如下表4。
表4 O位羧甲基壳聚糖的分子量测定结果
Figure BDA0002330755350000051
3)不同分子量N位取代羧甲基壳聚糖的制备
取10g上述实施例制备获不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)溶于质量分数为1％的100ml醋酸溶液中。向其中加入乙醛酸3.5g。搅拌均匀后使用1N氢氧化钠将pH调节至4.5。50℃条件下搅拌反应6h。制备取0.7g硼氢化钠溶于14ml蒸馏水中得到5％硼氢化钠溶液对反应液进行还原，后反应3h。透析冻干得到产物d。即为5030Da分子量的N位取代羧甲基壳聚糖。
按照上述的方法采用不同分子量的壳聚糖分别先与乙醛酸反应，再通过氢氧化钠调节pH至最佳还原条件使用硼氢化钠进行还原。按照上述的过程即可制备获得不同分子量N位取代羧甲基壳聚糖，所得不同分子量N位取代羧甲基壳聚糖的分子量测定结果如下表5。
表5 N位羧甲基壳聚糖的分子量测定结果
Figure BDA0002330755350000052
实施例4包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒的制备
试剂：1.0mg/ml不同分子量壳聚糖季铵盐溶液a，1.5mg/ml的不同分子量N、O-位羧甲基壳聚糖溶液、N-位羧甲基壳聚糖溶溶液、O-位羧甲基壳聚糖溶液b以及2.0mg/ml标准抗原OVA溶液m；
取a溶液5mL在25毫升烧杯中，置于磁力搅拌器中转速为300r/min。向其中滴加2ml抗原m溶液，搅拌10min后向其中再滴加b溶液。继续搅拌至30min。过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存，获得包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒，测定该纳米粒的粒径范围为：162.40nm-332.80nm，电位范围为19.5mV-40.60mV。
由上述三种方法制备得到三种不同类型衍生物与季铵盐壳聚糖所制备纳米粒，其理化性质表征如表所示。
表6不同分子量不同取代位点包裹OVA壳聚糖衍生物纳米粒的理化性质表征
Figure BDA0002330755350000061
由电位和粒径结果可知，为保证纳米粒稳定性以及更好在细胞和后续动物体内发挥更好载体和释放作用，得出粒径在150nm～350nm及电位在15mV～45mV的纳米粒。NO-CMC—HACC 1800kDa，O-CMC—HACC 1800kDa以及N-CMC—HACC 1800kDa样品粒径不符合条件，O-CMC—HACC 200kDa、50kDa、3kDa，N-CMC—HACC 3kDa样品电荷量不符合条件不再进行后续测定。实施例5壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞的免疫活性的影响
1)空白纳米粒(即，不包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒)和上述实施例获得包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒按照CCK-8法分别对DC细胞的毒性测试，如表8、表9。
表7空白纳米粒对DC细胞的毒性测试
Figure BDA0002330755350000062
表8包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞的毒性测试
Figure BDA0002330755350000071
由表7和8结果表明空白纳米粒大部分在100μg/mL以内对细胞无毒，包裹抗原纳米粒多数在50μg/mL以内，少数在100μg/mL以内对细胞无毒。
2)将上述实施例制备获得由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒通过荧光定量PCR对DC细胞四种免疫因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ基因表达量的影响测试，实验结果如表9。
所述荧光定量PCR：(首先使用RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，提取完成后使用NanoDrop 2000超微量紫外\可见分光光度计测定其RNA含量和质量，再进行后续RNA反转以及定量测试，其中测试PCR测试条件为，Stage 2:95℃5s、60℃34s；Stage 3:95℃15s。)
表9由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞基因表达量的影响
Figure BDA0002330755350000072
表明所制备的由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒，对四种细胞因子表达量都具有一定促进作用。但是不同纳米粒表达量有所差异，其中分子量为200k Da的NO-CMC—HACC及分子量为200k Da的N-CMC—HACC纳米粒最佳。
3)由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒在不同浓度下通过使用Elisa试剂盒(abcam小鼠专用试剂盒)进行酶联免疫吸附测定其在450nm处吸光度值，测定其，对细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ分泌量的检测(参见表10、表11)
表10分子量为200k Da的NO-CMC—HACC包裹抗原纳米粒细胞因子分泌量
浓度(μg/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
0 3925.63 408.50 0.330 6.150
6.25 4762.20 535.42 0.81 10.21
12.5 4789.35 501.98 1.39 7.219
50 4867.83 1001.17 1.82 24.85
100 5164.39 1736.25 2.18 22.61
表11分子量为200k Da的N-CMC—HACC包裹抗原纳米粒细胞因子分泌量
浓度(μg/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) IFN-γ(pg/mL)
0 3913.91 408.50 0.33 6.15
6.25 4726.80 499.58 0.77 6.15
12.5 4823.69 531.42 1.11 10.88
50 5080.60 507.42 1.97 22.61
100 5164.39 753.58 1.64 23.70
实施例6壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞抗原提呈作用的影响
流式细胞仪分析细胞抗原提呈作用，对DC细胞的抗原提呈作用进行测定，使用荧光显色剂标记的抗体与细胞孵育，检测细胞标志物的分泌水平是否受到纳米粒影响，从而体现纳米粒对抗原提呈细胞递呈抗原作用的影响。MHC-Ⅱ、CD80、CD86是细胞表面重要分泌物。MHC-Ⅱ作为组织相容性复合体其成分较为复杂，是DC细胞呈递外源性抗原的主要复合物。CD11c被称为补体受体4，是粘附分子的重要组成部分，属于跨膜型糖蛋白。在树突细胞中高度表达，参与其迁移和粘附过程同时对树突细胞的抗原识别和呈递具有重要作用。CD80、CD86同样为细胞膜表面蛋白，是DC细胞成熟和抗原提呈能力的重要指标。使用流式细胞仪对DC细胞表面蛋白进行测定，并使用完全培养基做阴性对照，OVA作为阳性对照。对其MFI值进行计算。(参见表12、图5)
表12纳米粒对树突细胞表面共刺激分子分泌的影响
Figure BDA0002330755350000081
Figure BDA0002330755350000091
表明所制备并筛选出的两种羧甲基壳聚糖和壳聚糖季铵盐所制备纳米粒，能够有效激活DC细胞，并增强其抗原呈递能力。

Claims (8)

1.一种具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒，其特征在于：通过不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，以聚电解质复合法获得粒径162.40nm-332.80nm、电位19.5mV-40.60mV的壳聚糖衍生物纳米粒；所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。
2.按权利要求1所述的具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒，其特征在于：所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同分子量和不同取代位点的壳聚糖羧甲基化衍生物；不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物为不同分子量壳聚糖季铵化衍生物。
3.按权利要求2所述的具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒，其特征在于：所述不同分子量和不同取代位点的壳聚糖羧甲基化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的N,O位取代、N位取代以及O位取代羧甲基壳聚糖；
所述不同分子量壳聚糖季铵化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物。
4.按权利要求1所述的具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法，其特征在于：所述正、负电荷衍生物在室温，以500r-700r磁力搅拌20-40min,以聚电解质复合法获得纳米粒子，过滤于4℃保存。
5.一种权利要求1所述的壳聚糖衍生物纳米粒的应用，其特征在于：所述壳聚糖衍生物纳米粒在制备作为具有抗原提呈作用的疫苗免疫佐剂中的应用。
6.一种包裹抗原的免疫疫苗，其特征在于：疫苗佐剂为权利要求1所述壳聚糖衍生物纳米粒，佐剂与抗原按质量比为0.5-2：1的比例混合。
7.按权利要求6所述的包裹抗原的免疫疫苗，其特征在于：将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物与抗原混合均匀后，加入带不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
8.一种权利要求7所述的包裹抗原的免疫疫苗的制备方法，其特征在于：将不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物与抗原混合均匀后，加入带不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物，通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
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