CN112402621A - 一种硫酸酯-季铵盐壳聚糖纳米粒作为载体的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种硫酸酯壳聚糖‑季铵盐壳聚糖纳米粒在作为载体的应用。硫酸酯壳聚糖‑季铵盐壳聚糖纳米粒在作为牛血清白蛋白(BSA)免疫载体的应用。通过细胞免疫实验证实其具有一定免疫效果，激光共聚焦测定表明细胞对纳米粒具有一定摄取作用，从而发挥免疫效果。为近年来壳聚糖衍生物作为抗原及药物载体的研究提供一定的方法和指导。

Description

一种硫酸酯-季铵盐壳聚糖纳米粒作为载体的应用
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒在作为载体的应用。
背景技术
纳米技术的研究是近年来研究热点之一，利用纳米粒作为药物载体是目前医学上多种药物的重要研究方向。但是，作为药物及疫苗的抗原，很大一部分是由蛋白组成，不同蛋白的分子量，等电点以及所带电性和电荷都有所不同，并不是所有的蛋白都能够被同一个纳米粒所负载，且其负载条件也有较大差异性。蛋白能否与载体通过电荷发生复合接或者化学键偶连从而被负载到载体上，对于载体材料十分重要。因此有必要研究载体材料对于蛋白的负载情况以及负载后活性。从而说明其作为载体的特异性。
发明内容
本发明考虑以上问题，提供一种壳聚糖硫酸酯-季铵盐壳聚糖纳米粒在作为载体的应用。
为实现上述目的，本实验采用的技术方案为：
一种壳聚糖纳米粒作为载体的应用，硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒在作为牛血清白蛋白(BSA)载体的应用。
所述纳米粒与牛血清白蛋白(BSA)按照质量比位0.5-2:1的比例混合。
所述纳米粒为通过不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和壳聚糖正电荷衍生物，以聚电解质复合法获得粒径135.70nm-255.00nm、电位16.00mV-38.40mV的包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒；所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。
所述不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同取代位点的壳聚糖硫酸酯化衍生物；壳聚糖正电荷衍生物为壳聚糖季铵化衍生物；其中，所述的硫酸酯壳聚糖为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位、C3-位、C2-位、C2,3-位或C2,6-位的硫酸酯壳聚糖，且其分子量为200kDa；所述季铵盐壳聚糖为2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物，其分子量为200kDa。
所述的硫酸酯壳聚糖为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位的硫酸酯壳聚糖，且其分子量为200kDa；所述季铵盐壳聚糖为2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物，其分子量为200kDa。
所述两种壳聚糖衍生物在室温，以500r-700r/min磁力搅拌20-40min,过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存。
所述两种壳聚糖衍生物之间的用量为：壳聚糖负电荷衍生物：壳聚糖正电荷衍生物质量比为3:5。
将带正电的季铵盐壳聚糖与牛血清白蛋白(BSA)混合均匀后，加入带负电的硫酸酯壳聚糖，通过静电吸附作用使牛血清白蛋白(BSA)负载于纳米粒。
所述包裹抗原的载体对于DCS细胞具有较好的免疫活性，能够促进细胞因子表达量的提高且能够被细胞摄取，硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒具有作为抗原载体的特征。
进一步的说，利用所述硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒，采用对DCS细胞的免疫活性进行测定。通过对未包裹抗原纳米粒的细胞毒性测定，确定其对细胞无毒的纳米粒最大浓度为100μg/mL，而包裹抗原后纳米粒，其对细胞无毒的纳米粒最大浓度也为100μg/mL，表明包裹抗原后，纳米粒对细胞毒性变化不大，因此在无毒浓度下，通过对免疫因子表达量的测定，确定制备纳米粒条件为硫酸酯壳聚糖浓度为1.5mg/mL，季铵盐壳聚糖浓度为1.0mg/mL，纳米粒具有最好的免疫效果。而后通过共聚焦显微镜照片拍摄，表明纳米粒负载抗原后，随着时间增加包裹抗原的纳米粒被细胞摄取量也增加。表明所制备纳米粒具有作为抗原载体潜力。
本发明所具有的优点：
1.本发明载体与特定蛋白之间具有特异性，通过载体的电荷发生复合接或者化学键偶连从而将蛋白被负载到载体上，进而促进被负载蛋白或药物更好的发挥作用。
2.本发明所使用材料以具有较好的生物相容性的壳聚糖为基础，经衍生化制备的硫酸酯衍生物和季铵盐衍生物保存了壳聚糖的特性，同时纳米粒制备过程中没有交联剂的引入，保证其在生物体内的安全，经细胞毒性试验检测，其在使用浓度下，具有生物安全性。
3.本发明所制备的纳米粒可作为抗原载体，将负载有牛血清白蛋白BSA抗原的纳米粒应用于DCS细胞进行载体效果验证，结果表明负载抗原的纳米粒能够促进四种细胞因子的表达量，保证抗原发挥其作用，证明所制备纳米粒具有抗原载体作用。在获得高效且无毒副作用的抗原载体方面具有很好的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1、2中获得的不同位点硫酸酯壳聚糖和季铵盐壳聚糖的红外图谱。
图2为本发明实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的粒径(A)和电位(B)表征图。
图3为本发明实施例4中获得的不同放大比例包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒扫描电镜图(A):500nm，(B):200nm。
图4为本发明实施例5获得的纳米粒对三种抗原的不同负载率。
图5为本发明实施例6获得的DCS细胞对包裹抗原的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒的摄取图，其中处理时间分别为a:0h，b:0.5h，c:3h。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
本发明以硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒作为载体的负载能力及负载载体后性能进行测定。
具体方法如下：将不同取代位点的硫酸酯壳聚糖和季铵盐壳聚糖通过聚电解质复合法进行纳米粒的制备，通过纳米粒度仪测定选择具有较好分散指数，粒径和电位都较为稳定的纳米粒进行后续试验。通过细胞实验，得出具有最佳负载抗原作用的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒，由以上原料和条件下所制备的纳米粒，无毒副作用，经过抗原试验，且经过对小鼠树突细胞(DCS)作用实验，证明负载抗原的纳米粒能够促进DCS细胞IL-6、TNF-α、IL-1β三种免疫因子基因表达量的提高。通过激光共聚焦测定表明细胞对所制备的负载抗原的纳米粒具有一定摄取作用，从而发挥免疫效果。为近年来壳聚糖衍生物纳米粒作为药物载体的研究提供一定的方法和指导。
实施例1季铵盐壳聚糖的制备
取5g分子量为200kDa的壳聚糖和10g 2、3-环氧丙基三甲基氯化铵。并向其中加入70mL蒸馏水，80℃水浴、转速为200r/min条件下进行搅拌，反应时间为24h。将得到的反应液在透析袋中使用蒸馏水透析72h，后在冻干机中-80℃条件下冻干，得到样品a(本实施例获得季铵盐壳聚糖其红外表征如图1)。
实施例2不同取代位点硫酸酯壳聚糖的制备
1)C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯的制备
取2g分子量为200kDa的壳聚糖，加入50mL甲酰胺溶剂，将上述混合物搅拌均匀后，加入5mL甲酸，50mL磺化剂DMF·SO3，在50℃温度下搅拌反应1.5h，然后将上述反应液用其3倍体积量的无水乙醇沉淀，放到4℃冷藏柜中沉化约30min，得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品。将上述沉淀物抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，2N NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得淡黄色样品b，即得C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯。(本实施例获得C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯其红外表征如图1)；
2)C3,6-位壳聚糖硫酸酯的制备
将4g分子量为200kDa的壳聚糖、100mL甲酰胺、5g邻苯二甲酸酐、3mL乙二醇混合均匀后，在90℃反应2.5h，反应完毕，将温度降至55℃，然后慢慢滴,80mL磺化试剂DMF·SO3，反应2.5h，反应完毕，将其倒入冰水中，用2M NaOH中和可得透明溶液，蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯产物。再将2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯脱去邻苯二甲酸酐保护基，3g 2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯，用100mL水充分溶解后，加入20mL水合肼，在70℃下反应4h，反应完毕加入100mL蒸馏水浓缩，如此反复四次，用蒸馏水透析，浓缩，冷冻干燥得白色棉花状固体c。即得到C3,6-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得的C3,6-位壳聚糖硫酸酯其红外表征如图1)
3)C6-位壳聚糖硫酸酯的制备
首先制备C2,3-位壳聚糖铜螯合物：取3g分子量为200kDa的壳聚糖加入到80mL1％的甲酸中，使其溶解成粘稠状态，取10mL蒸馏水溶解4.65g的CuSO4·5H2O慢慢滴加到上述粘溶液中，室温搅拌3h。然后用氨水调节pH值至6.0－6.5，室温继续搅拌3h。搅拌后用1:1的无水乙醇与丙酮混合溶剂沉淀螯合物，放置少许时间，抽滤，烘干，粉碎待用。
取2g上述壳聚糖铜螯合物，加入50mL甲酰胺溶剂，30mL磺化剂DMF·SO3，在55℃温度下搅拌进行磺化反应，反应1.5h，然后将上述反应液用3倍体积量的无水乙醇沉淀，放到4℃冷藏柜中沉化约30min，得到白色絮状沉淀。将上述沉淀物抽滤，滤饼用蒸馏水溶解得蓝色溶液，2N NaOH溶液将其中和，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得蓝色壳聚糖铜螯合物的硫酸酯化产品。最后进行脱铜处理，将壳聚糖铜鳌合物的磺化产物用蒸馏水溶解后，通过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱，溶液颜色由蓝色变为黄色，Cu即被脱掉，用2N NaOH中和，浓缩，透析，冷冻干燥得样品d，即C6-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得C6-位壳聚糖硫酸酯，其红外表征如图1)。
4)C3-位壳聚糖硫酸酯的制备
取2g上述步骤2)获得的C3,6-位壳聚糖硫酸酯，用50mL水溶解后，加入160mL N-甲基-2-吡咯烷酮，混匀后，在90℃下反应6h，反应完毕用NaOH调节pH值到9，透析，浓缩，冷冻干燥得淡黄色粉末状产品e；即得到C3-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得的C3-位壳聚糖硫酸酯其红外表征如图1)；
同时，按照现有技术记载还可以获得C2-位壳聚糖硫酸酯,C2,3-位壳聚糖硫酸酯,C2,6-位壳聚糖硫酸酯，同时在各制备过程中调整基团保护方法和保护剂，对不同位点进行保护和衍生(Holme et al.,1997；Nishimura et al.,1998；Jayakumar et al.,2007)。再使用壳聚糖进行同样衍生即可获得上述不同取代位壳聚糖硫酸酯。
实施例3硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖空白纳米粒的制备
试剂：1.0mg/mL季铵盐壳聚糖(实施案例1中获得)溶液a，1.5mg/mL的C2,3,6-位硫酸酯壳聚糖(实施案例2中获得)溶液b。
取a溶液5mL在25毫升烧杯中，置于磁力搅拌器中转速为300r/min。搅拌10min后向其中滴加2mL的b溶液。继续搅拌至30min。过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存，获得壳聚糖衍生物空白纳米粒(参见表1)，测定该纳米粒的粒径范围为：177.67nm-461.33nm、电位0.084.00mV-47.16mV。
按照上述记载方法将溶液b替换为不同取代位点硫酸酯壳聚糖，即可获得不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖空白纳米粒。
表1不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖空白纳米粒的理化性质表征
Figure BDA0002804105860000051
由上述结果可知，测定该纳米粒的粒径范围为：177.67nm-461.33nm、电位0.084.00mV-47.16mV。且C3位取代硫酸酯壳聚糖与季铵盐壳聚糖所形成的空白纳米粒由于点位较低，不具有作为纳米粒的稳定性不进行后续测定。
实施例4包裹抗原的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒的制备
试剂：1.0mg/mL季铵盐壳聚糖溶液a，1.5mg/mL的C2,3,6-位硫酸酯壳聚糖溶液b以及2.0mg/mL抗原溶液m(本实施案例中使用BSA作为抗原溶液)，同时以OVA和肌红蛋白作为对照；
取a溶液5mL在25毫升烧杯中，置于磁力搅拌器中转速为300r/min。向其中滴加2mL抗原溶液m，搅拌10min后向其中再滴加2mL的b溶液。继续搅拌至30min。过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存，获得包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒，测定该纳米粒的粒径范围为：135.70nm-255.00nm、电位16.00mV-38.40mV。
按照上述记载方法将溶液b替换为不同取代位点硫酸酯壳聚糖，m溶液替换为不同蛋白即可获得负载不同抗原的不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒。其理化性质表征如表2所示。
表2负载不同蛋白的不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒的理化性质表征
Figure BDA0002804105860000052
由电位和粒径结果可知，为保证纳米粒稳定性以及更好在细胞和后续动物体内发挥更好载体和释放作用，确定粒径范围在100nm-300nm及电位范围在15mV-40mV的纳米粒进行后续测定，C3 SCS—HACC负载BSA样品电荷量不符合条件，不再进行后续测定。而包裹BSA的纳米粒相比包裹OVA及Mb的纳米粒，其点位均在30mV以上，且粒径均在200nm以下，这就保证了纳米粒具有能够保持更长时间稳定性的潜力，且粒径大于100nm同时低于200nm更有利于纳米粒进入细胞内部发挥作用。并对包裹抗原纳米粒进行扫描电镜测定，以确定其粒径和纳米粒度分析仪测定一致，附图3为，包裹抗原BSA的C2,3,6SCS—HACC纳米粒在不同放大条件下的扫描电镜图。
实施例5硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒对不同抗原的包封率
取8mL制备好纳米粒溶液，将其置于10mL离心管中，在13000g/min条件下离心30min。取上清液使用BCA试剂盒测定上清液中蛋白含量，其中使用试剂盒中标准品做标准曲线，计算蛋白包封率，其结果如图4所示，结果表明：对于标准抗原OVA，包裹率均在60％左右，牛血清白蛋白BSA抗原，纳米粒对其包裹率均在75％以上，且对于每一个位点的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒，其对牛血清白蛋白BSA的包封率均大于对标准抗原OVA的包封率，表明纳米粒对BSA具有更好的选择性和特异结合性。而对于肌红蛋白Mb，纳米粒对其包裹率均低于20％。表明纳米粒对蛋白的包裹具有特异性，对不同抗原的包封率有较大差别，这与抗原本身的特点有较大相关性。
实施例6空白纳米粒及负载牛血清白蛋白BSA的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒性能测定(对DCS细胞的免疫活性的影响)
1)空白纳米粒(即，不包裹抗原的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒)和上述实施例4获得的包裹三种不同抗原的硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒按照CCK-8法分别对DCS细胞的毒性测试。
实验结果表明空白纳米粒大部分在100μg/mL以内对细胞无毒，包裹抗原纳米粒也多数在100μg/mL以内对细胞无毒；
2)将上述实施例制备获得的空白纳米粒、单独牛血清白蛋白溶液以及由不同取代位点壳聚糖负电荷衍生物和正电荷壳聚糖季铵盐制备的负载抗原的壳聚糖衍生物纳米粒，通过荧光定量PCR对DCS细胞三种免疫因子IL-6、TNF-α、IL-1β基因表达量的影响测定，实验结果如表3和表4。
所述荧光定量PCR：(首先使用RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，提取完成后使用NanoDrop 2000超微量紫外\可见分光光度计测定其RNA含量和质量，再进行后续RNA反转以及定量测试，其中测定PCR的测定条件为，Stage 2:95℃5s、60℃34s；Stage 3:95℃15s。)
表3由空白纳米粒和单独抗原对DCS细胞基因表达量的影响
样品(空白纳米粒) IL-6 TNF-α IL-1β
C2.3.6 SCS—HACC 1.09 4.09 2.02
C3.6 SCS—HACC 1.09 1.15 3.07
C6 SCS—HACC 1.08 1.2 1.01
BSA 1.7 1.5 1.2
表4由包裹抗原的不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒对DCS细胞基因表达量的影响
Figure BDA0002804105860000071
上述结果表明所制备的负载牛血清白蛋白BSA的不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒，对三种细胞因子表达量具有一定促进作用，但是不同纳米粒表达量有所差异。以上结果证明，纳米粒不仅对牛血清白蛋白BSA具有较高的包封率，且硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒包裹抗原后，能够保证抗原其本身能够引起细胞发生免疫反应的能力。
3)将不同取代位点硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒(本实施案例中以包裹BSA的C2,3,6硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒为例)在100μg/mL条件下作用于DCS细胞，测定细胞对包裹抗原的纳米粒摄取情况。所述摄取试验实验过程为：在单孔皿中放入盖玻片，使用移液枪取细胞液置于单孔皿中，培养12h后，弃去原细胞培养基，更换为浓度为100μg/mL的负载抗原的纳米粒溶液(且本案例所使用纳米粒经过Cy5.5对纳米粒进行染色)。培养一定时间后，弃去培养基，并使用PBS洗三遍，后取1mL多聚甲醛溶液固定细胞，15min后吸走多聚甲醛取出盖玻片放置含有DAPI的载玻片上。避光保存后于激光共聚焦显微镜上观察细胞摄取情况并进行拍照。由图5可见负载抗原的纳米粒随着时间增加，细胞对其的摄取量也增加。表明纳米粒能够作为抗原的载体，使抗原进入到细胞体内发挥免疫作用。

Claims (8)

1.一种壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：硫酸酯壳聚糖-季铵盐壳聚糖纳米粒在作为牛血清白蛋白(BSA)抗原载体的应用。
2.按权利要求1中所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述纳米粒与牛血清白蛋白(BSA)按照质量比位0.5-2:1的比例混合。
3.按权利要求1或2所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述纳米粒为通过不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和壳聚糖正电荷衍生物，以聚电解质复合法获得粒径135.70nm-255.00nm、电位16.00mV-38.40mV的包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒；所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10：1-4的比例混合。
4.按权利要求3所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同取代位点的壳聚糖硫酸酯化衍生物；壳聚糖正电荷衍生物为壳聚糖季铵化衍生物；其中，所述的硫酸酯壳聚糖为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位、C3-位、C2-位、C2,3-位或C2,6-位的硫酸酯壳聚糖，且其分子量为200kDa；所述季铵盐壳聚糖为2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物，其分子量为200kDa。
5.按权利要求4所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述的硫酸酯壳聚糖为C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位的硫酸酯壳聚糖，且其分子量为200kDa；所述季铵盐壳聚糖为2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物，其分子量为200kDa。
6.按权利要求5所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述两种壳聚糖衍生物在室温，以500r-700r/min磁力搅拌20-40min,过滤后得到纳米粒溶液，4℃保存。
7.按权利要求6所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：所述两种壳聚糖衍生物之间的用量为：壳聚糖负电荷衍生物：壳聚糖正电荷衍生物质量比为3:5。
8.按权利要求5或7所述壳聚糖纳米粒作为载体的应用，其特征在于：将带正电的季铵盐壳聚糖与牛血清白蛋白(BSA)混合均匀后，加入带负电的硫酸酯壳聚糖，通过静电吸附作用使牛血清白蛋白(BSA)负载与纳米粒。
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