CN113425853A - 一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体及其制备方法，其能成功被细胞吞噬并发出黄色的荧光；能够最大程度增加C6和SH‑SY5Y细胞活性；且修复MPP+引起的细胞凋亡；能明显降低MPP+导致的ROS升高，恢复到正常水平；能够明显降低α‑突触核蛋白的蛋白表达水平，同时络氨酸羟化酶和α‑syn的免疫荧光也显示表达水平与对照组相当。该基因运输载体能够增加神经元靶向性和营养性，实现对α‑突触核蛋白的合成干扰，在静脉注射后能够顺利突破血脑屏障(BBB)成功进入脑实质，成功修复体内外帕金森疾病模型的功能损伤，是一种很有前景的基因运输载体。

Description

一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体 及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药材料技术领域，具体地，涉及一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体。
背景技术
帕金森症(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的中老年神经系统变性疾病，患者表现出动作迟缓、手或脚及身体其他部分发生震颤、身体失去柔韧性、肌肉僵硬。帕金森症已成为继心脑血管疾病和癌症之后危害生命的又一杀手。帕金森症患者主要受影响大脑区域是中脑黑质纹状体的左旋多巴胺变性。
帕金森症发病机理尚不明了，传统治疗存在很大局限性。目前，针对PD主要有二种传统治疗方法：1)手术治疗：通过移植多巴胺能神经元细胞来降低用药量；2)药物治疗：使用左旋多巴胺、儿茶酚转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂等。这些药物大多通过在体内替代或者提高多巴胺的利用度和作用时间，从而改善因黑质致密部受损引起纹状体多巴胺减少的情况。然而，这些方法都不能有效阻止疾病恶化，病人很快就出现运动性障碍，如步伐紊乱、痴呆等。
基因治疗(Gene therapy)作为一种新的治疗手段已被证明可以治疗多种复杂疾病。癌症、遗传性/心血管/神经系统疾病等都是基因治疗的主要领域。基因治疗是指通过外来遗传物质干预疾病基因层面的发生、恶化和进展，替代并纠正人自身基因结构和功能上的错乱，消灭病变细胞或提高机体清理病变细胞能力。基因治疗的主要目标是研制安全高效基因导入系统，将外源基因靶向输入到靶细胞。其中，RNAi是一种有效方式，通过人为引入与内源靶基因相配对的双链RNA，诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达功能。
帕金森症患处位于脑内，普通药物一般无法直接通过血脑屏障到达患处。为实现快速透过血脑屏障、靶向可控释放RNAi质粒，可以采用基因治疗。已有研究表明可以用病毒载体或是非病毒方法。常用的病毒载体有：慢病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒和腺病毒。但是，使用病毒做基因载体，可能会产生自身免疫反应和炎症，甚至有基因突变的风险。基因传递的非病毒方法一是基因枪，通过DNA涂覆在金纳米粒表面，将基因直接传递到组织或者细胞，然后进入细胞核。另一种是电穿孔，注射核酸后，通过控制电场改变细胞膜的通透性，提高转染效率。同时，在非病毒载体方面，有报道PEG修饰的脂质体纳米粒可以将基因主动转运到中枢神经系统。
氧化锌量子点是一种半导体材料，有三种结构：六边纤锌矿结构、立方闪锌矿结构，以及比较罕见的氯化钠式八面体结构。纤锌矿结构在三者中稳定性最高，所以也最常见。氧化锌量子点在光电器件、气体传感器、压电换能器、光波导、紫外激光发射器和太阳能电池等领域有着巨大的应用潜力。它也是一种无毒、廉价的材料，已用于商业防晒霜、白色涂料、导电玻璃和抗菌剂。氧化锌在阳光、水和空气的环境条件下非常稳定。这些优点使氧化锌成为一种很有前途的多功能材料。在过去的十年里，已经报道了大量的氧化锌纳米结构，其中包括纳米颗粒、纳米棒、纳米管、纳米带、纳米板、纳米环甚至纳米花。相应的合成方法有简单热解法和严格控制气相外延生长法。这些合成方法常常决定最终氧化锌产品的物理性质。例如，溶胶-凝胶法制备的ZnO纳米颗粒主要表现为可见荧光，而水热法合成的相同尺寸的纳米颗粒通常是紫外发光体。
当前，针对帕金森症的细胞研究主要涉及的多巴胺神经细胞类型有：人成神经细胞瘤SH-SY5Y、人纤维肉瘤细胞HT1080、人胚肾细胞HEK-293、人中脑细胞LUHMES、大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12(PMID：26279968；PMID：18512151；PMID：25986246)。而针对帕金森症的动物研究则首先要构建：包括化学药物模型、生物毒性物质模型、蛋白酶抑制剂模型、基因模型及其他模型等(PMID：19056420；PMID：11154766；PMID：10501545；PMID：17490626)。其中生物毒性物质模型在帕金森症研究中有广泛应用。生物毒性物质模型主要包括：1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)模型、鱼藤酮模型、甲基苯丙胺模型、除草剂模型及脂多糖(LPS)模型。其中MPTP模型有PD症状及DA能神经元选择性损伤，但无Lewy小体特征性病理改变。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体。
本发明的第一个目的是提供一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体。
本发明的第二个目的是提供一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述的基因运输载体，和/或任一所述的基因运输载体的制备方法制备得到的基因运输载体，在制备突破血脑屏障进入脑实质靶向脑的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明公开了一种亲水性纳米氧化锌量子点并通过功能化修饰使其具备生物荧光标记、基因运输、血脑屏障和神经元靶向能力。
首先使用溶胶-凝胶法合成疏水的纳米氧化锌，然后与甲基丙烯酸连接合成甲基丙烯酸锌，最后在引发剂偶氮二异丁腈和一水合氢氧化锂作用下和甲基丙烯酸酯聚合形成发黄色荧光的亲水性纳米氧化锌量子点(ZnO@Polymer)。该粒子是一种无机有机复合物的共聚物，外壳与内核通过共价键的形式结合在一起。其中外壳分为两层，一层是疏水的聚甲基丙烯酸酯，外层是亲水的聚甲基丙烯酰胺。这种结构不仅能够很好地保护氧化锌内核不被水分子的破坏，维持其表面缺陷结构(发光中心)，而且使其具有很好地水溶性，能够自由的分散在水溶液中。为了实现神经元靶向和营养作用，神经生长因子通过紫外光接枝技术嫁接到粒子表面(ZnO@Polymer-N)。借助甲基丙烯酰胺和神经生长因子提供的大量的氨基，带负电的质粒DNA通过静电吸附作用被负载到粒子表面(ZnO@Polymer-Np)。为了使粒子在静脉注射后顺利穿过血脑屏障进入脑实质，谷胱甘肽作为靶向分子通过酰胺反应被连接到粒子表面的氨基端，最终合成谷胱甘肽修饰的纳米氧化锌量子点复合物ZnO@Polymer-NGF-pDNA-GSH(ZnO@Polymer-NpG)。
ZnO@Polymer-NpG的物理化学性质被表征，结果显示复合物在330nm紫外光照射下发出稳定的黄色荧光，紫外光谱，荧光光谱和红外光谱都显示出特定吸收峰，表明粒子被成功合成。琼脂糖凝胶电泳表明pDNA被成功吸附，电位结果表明复合物带正电荷，透射电镜显示复合物呈球形，粒径约为5nm。通过计算，ZnO@Polymer-NpG的量子产率为14.3％。
在细胞摄入测试中，ZnO@Polymer-NpG成功被PC12和SH-SY5Y细胞吞噬并发出黄色的荧光，能够很好的应用于生物荧光标记。细胞相容性实验结果表明0.75μg/mL的ZnO@Polymer-NpG能显著提升C6和SH-SY5Y细胞活性，且修复MPP+引起的细胞凋亡。活性氧(ROS)检测显示，该复合纳米粒子能明显降低MPP+导致的ROS升高，恢复到正常水平。同样，荧光定量PCR和免疫印迹显示该复合物纳米粒子能够明显降低α-突触核蛋白的蛋白表达水平，同时络氨酸羟化酶(TH)和α-syn的免疫荧光也显示表达水平与对照组相当(ns)。
最后，在帕金森小鼠模型中，ZnO@Polymer-NpG复合纳米粒子能够成功修复行为损伤，减缓运动障碍。此外，体外器官成像和黑质致密部荧光切片表明复合物在小鼠尾静脉注射后能够成功达到脑部并穿过BBB进入黑质致密部，为其发挥作用提供可能。同时黑质致密部的TH和α-syn免疫组化提示复合物具有修复效果，且该部位提高的ROS也被降低。重要的是，苏木精-伊红染色(HE)和血常规都表明ZnO@Polymer-NpG复合物具有良好的生物相容性。
ZnO@Polymer-NpG复合物被成功合成，其功能和效果评价显示该复合物能够成功修复体内外帕金森疾病模型的功能损伤，是一种很有前景的基因运输载体。本发明根据其对帕金森疾病体内外模型中的治疗作用，开发了一种针对于帕金森疾病的新型基因运输系统，在实现基因运输的基础上，同时具备生物荧光成像作用，为粒子的实时定位和活体示踪提供了可能。
因此本发明要求保护一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体，所述基因运输载体为表面修饰有神经生长因子NGF、DNA和谷胱甘肽的氧化锌纳米量子点。
优选地，所述DNA为质粒pDNA，其携带有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列。该质粒用于干扰下游α-突触蛋白的表达，见实施例1。
本发明还要求保护一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体的制备方法，包括以下步骤：纳米氧化锌与甲基丙烯酸反应制备得到甲基丙烯酸锌；通过自由基聚合反应合成氧化锌纳米量子点ZnO@Polymer；氧化锌纳米量子点表面接枝神经生长因子NGF；并吸附DNA，得到ZnO@Polymer-NGF；再连接谷胱甘肽；优选地，所述DNA为质粒，其携带有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列。
优选地，纳米氧化锌利用溶胶-凝胶法制备得到，见实施例1。
现有技术中纳米氧化锌有如下方法制备，包括沉淀法、湿化学合成法、固态热解法、生物合成法与溶胶凝胶法，其他方法的制备较为复杂，需要高温煅烧，不可控的水解速率等，因此选择简便成熟的溶胶-凝胶法制备。
优选地，纳米氧化锌的制备方法为：LiOH的水溶液逐滴加到无水醋酸锌Zn(Ac)2悬浮液中，至液体透明为止，即得，见实施例1。
优选地，纳米氧化锌与甲基丙烯酸反应制备得到甲基丙烯酸锌的步骤为：将甲基丙烯酸的水溶液与纳米氧化锌混合，充分反应，固液分离保留液体，去除溶剂，纯化，干燥，即得，见实施例1。
更优选地，甲基丙烯酸的水溶液中甲基丙烯酸与水的体积比为1：2～6。
进一步优选地，甲基丙烯酸的水溶液中甲基丙烯酸与水的体积比为1：4，见实施例1。
更优选地，以质量计算，氧化锌用量为甲基丙烯酸水溶液的1～4％。
进一步优选地，以质量计算，氧化锌用量为甲基丙烯酸水溶液的2.5％，见实施例1。
更优选地，6000～14000rpm条件下搅拌充分反应0.5～2h。
进一步优选地，10000rpm条件下搅拌充分反应1h，见实施例1。
更优选地，待冷却至室温后，用漏斗抽滤去除未反应完全的白色粉末，以固液分离保留液体，见实施例1。
更优选地，用旋转蒸发仪在55～80℃条件下旋转蒸发去除溶剂。
进一步优选地，用旋转蒸发仪在70℃条件下旋转蒸发去除溶剂，见实施例1。
更优选地，用超纯水和乙醇清洗并置于70～80℃真空烘干干燥。
进一步优选地，用超纯水和乙醇清洗并置于75℃真空烘干干燥，见实施例1。
优选地，通过自由基聚合反应合成氧化锌纳米量子点的步骤为：甲基丙烯酸锌与二缩三乙二醇混合，溶解；加入偶氮二异丁腈和甲基丙烯酰胺，充分反应；加入一水合氢氧化锂和偶氮二异丁腈，充分反应；除杂，即得氧化锌纳米量子点ZnO@Polymer，见实施例1。
更优选地，甲基丙烯酰胺与二缩三乙二醇的用量比为6～10mol：1mol。
进一步优选地，甲基丙烯酰胺与二缩三乙二醇的用量比为8mol：1mol，见实施例1。
更优选地，加入偶氮二异丁腈和甲基丙烯酰胺，1500～2300rpm转速下搅拌使溶液温度缓慢升至60～70℃(0.7～1.5℃/min)，保持3～7min，以充分反应。
进一步优选地，加入偶氮二异丁腈和甲基丙烯酰胺，2000rpm转速下搅拌使溶液温度缓慢升至65℃(1.3℃/min)，保持5min，以充分反应，见实施例1。
更优选地，一水合氢氧化锂与偶氮二异丁腈的用量的质量比为2～6：27。
进一步优选地，一水合氢氧化锂的用量4：27，见实施例1。
更优选地，在65～78℃下充分聚合0.5～2h，以充分反应
进一步优选地，在72℃下充分聚合1h，以充分反应，见实施例1。
更优选地，用分子量为8000的透析袋用超纯水透析36～52h，以除杂。
进一步优选地，用分子量为8000的透析袋用超纯水透析48h，以除杂，见实施例1。
优选地，氧化锌纳米量子点表面接枝神经生长因子NGF的步骤为：避光下条件下，NGF的PBS和DMF的混合液的溶液与叠氮苯胺盐酸盐混合，充分反应得到NGF-AAH，纯化后用PBS复溶；将ZnO@Polymer与纯化后复溶的NGF-AAH混合，紫外线反应，固液分离，去除液体，得到ZnO@Polymer-NGF，见实施例1。
更优选地，PBS和DMF的混合液中PBS和DMF的用量的体积比为1：2～6。
进一步优选地，PBS和DMF的混合液中PBS和DMF的用量的体积比为1：4，见实施例1。
更优选地，NGF和叠氮苯胺盐酸盐(AAH)的用量的质量比为9：5～7。
进一步优选地，NGF和叠氮苯胺盐酸盐(AAH)的用量的质量比为9：5.81，见实施例1。
更优选地，冰浴中搅拌反应36～52h，充分反应得到NGF-AAH。
进一步优选地，冰浴中搅拌反应48h，充分反应得到NGF-AAH，见实施例1。
更优选地，得到的NGF-AAH用超滤管对产物进行纯化后，加入的PBS复溶。
更优选地，ZnO@Polymer与纯化后复溶的NGF-AAH的用量以质量计算，NGF：Zn＝1:6～10。
进一步优选地，ZnO@Polymer与纯化后复溶的NGF-AAH的用量以质量计算，NGF：Zn＝1:8，即NGF与ZnO@Polymer中的Zn的用量的质量比为1:8，见实施例1。
更优选地，用70～85W的紫外灯下照射5～15s反应。
进一步优选地，用80W的紫外灯下照射10s反应，见实施例1。
更优选地，用超滤管在15000～22000rpm转速下去除液体。
进一步优选地，用超滤管在20000rpm转速下去除液体，见实施例1。
优选地，吸附DNA的步骤为：ZnO@Polymer-NGF与DNA混合，充分反应，得到ZnO@Polymer-Np，见实施例1。
更优选地，ZnO@Polymer-NGF与DNA混合的用量，以质量计算Zn：DNA＝1：25～35。
进一步优选地，ZnO@Polymer-NGF与DNA混合的用量，以质量计算Zn：DNA＝1：30，即ZnO@Polymer中的Zn与DNA的用量的质量比为1:30，见实施例1。
优选地，连接谷胱甘肽的步骤为：活化谷胱甘肽的羧基，与ZnO@Polymer-Np混合，充分反应；除杂，即得ZnO@Polymer-NpG，见实施例1。
更优选地，室温反应约0.5～2h充分反应。
进一步优选地，室温反应约1h充分反应，见实施例1。
更优选地，透析袋中透析12～36h。
进一步优选地，透析袋中透析24h，见实施例1。
所述的基因运输载体，和/或任一所述的基因运输载体的制备方法制备得到的基因运输载体，在制备突破血脑屏障进入脑实质靶向脑的药物中的应用，也属于本发明的保护范围。
优选地，所述药物治疗帕金森症。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
开发的一种新型的基因运输载体—谷胱甘肽修饰的纳米氧化锌量子点复合物ZnO@Polymer-NpG。
其在330nm紫外光照射下能发出稳定的黄色荧光，紫外光谱，荧光光谱和红外光谱都显示出特定吸收峰，表明粒子被成功合成。琼脂糖凝胶电泳表明pDNA被成功吸附，电位结果表明复合物带正电荷，透射电镜显示复合物呈球形，粒径约为5nm。通过计算，ZnO@Polymer-NpG的量子产率为14.3％。
体外研究表明，其能成功被PC12和SH-SY5Y细胞吞噬并发出黄色的荧光，能够很好的应用于生物荧光标记。细胞毒性实验结果说明0.75mg/L的ZnO@Polymer-NpG能够最大程度增加C6和SH-SY5Y细胞活性，且修复MPP+引起的细胞凋亡。活性氧(ROS)检测显示，复合物能明显降低MPP+导致的ROS升高，恢复到正常水平。同样，荧光定量pcr和免疫印迹显示复合物能够明显降低α-突触核蛋白的蛋白表达水平，同时络氨酸羟化酶(TH)和α-syn的免疫荧光也显示表达水平与对照组相当(ns)。
该复合物能够增加神经元靶向性和营养性，实现对α-突触核蛋白(α-syn)的合成干扰，在静脉注射后能够顺利突破血脑屏障(BBB)成功进入脑实质，成功修复体内外帕金森疾病模型的功能损伤，是一种很有前景的基因运输载体。
附图说明
图1为纳米氧化锌量子点复合物ZnO@Polymer-NpG的合成示意图。
图2为不同粒子的紫外-可见光谱。
图3为白光和紫外光照射下不同粒子的图片(左)和荧光光谱(右)。
图4为不同粒子的的红外光谱图。
图5为ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-NpG的透射电镜图。
图6为NGF接枝率(左)和不同重量比的琼脂糖凝胶电泳(右)。
图7为Cy5标记的NGF的荧光光谱图检测ZnO@Polymer-NpG的pH相应性。
图8为琼脂糖凝胶电泳检测pH响应(左)和pDNA血清稳定性(右)。
图9为ZnO@Polymer-NpG的量子产率及其稳定性。
图10为溶性血实验评估粒子的血液相容性。
图11为ZnO@Polymer-NpG与PC12细胞一起培养追踪转染后10分钟和1小时的细胞内摄取，比例尺，50μm。
图12为ZnO@Polymer-NpG和PC12细胞孵育1、3和5h的的荧光显微图像，ZnO QD在330nm处激发，比例尺，10μm。
图13为PC12细胞分化实验结果；a：PC12细胞与原生NGF，ZnO@Polymer或ZnO@Polymer-N孵育的分化试验，箭头表示在PC12细胞中的神经元生长，比例尺，50μm。右图为神经元生长的放大图；b：PC12细胞数量统计；c：神经突触大于50μm的细胞数量统计。
图14为C6和SH-SY5Y细胞活性测试，建模组预先用MPP+处理。
图15为ZnO@Polymer-Np能够携带pDNA进入细胞抑制α-突触核蛋白(SNCA)的表达；a：qPCR分析SNCA的mRNA表达水平。(b,c).免疫印迹检测不同组的SNCA和TH蛋白表达水平，β-actin作为内参。
图16为免疫荧光分析SNCA和TH在细胞内的表达情况；a：SNCA和TH免疫荧光，比例尺，50μm；b：SNCA和TH的荧光定量分析。
图17为SH-SY5Y细胞内活性氧(ROS)水平检测，比例尺，10μm。
图18为ROS的荧光光谱
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种亲水性纳米氧化锌量子点的制备
一、实验方法
1、溶胶-凝胶法制备纳米氧化锌
将1.10g(5mmol)Zn(Ac)2·2H2O样品溶解于50mL常压煮沸乙醇中，然后冷却到0℃。在接近室温的条件下沉淀出白色粉末，为无水醋酸锌Zn(Ac)2。
接着将0.29g(7mmol)LiOH·H2O在室温下溶解于50mL乙醇中，在超声波浴中冷却至0℃。在0℃剧烈搅拌下，将含氢氧化物的溶液逐滴加入到上述制备的Zn(Ac)2悬浮液中。当加入约0.1g LiOH时，反应混合物变得透明。将得到的纳米ZnO储存在≦4℃或者冷冻干燥储存。
2、甲基丙烯酸锌的制备
将甲基丙烯酸与超纯水按1：4体积比混合，加热至65℃，使其溶解。将制备得到的纳米ZnO加入甲基丙烯酸水溶液(以质量计算，纳米ZnO的投入量为甲基丙烯酸水溶液量的2.5％)并在10000rpm条件下搅拌反应1h，待冷却至室温后用漏斗抽滤去除未反应完全的白色粉末。过滤后的液体用旋转蒸发仪在70℃条件下旋转蒸发去除溶剂得到粗品甲基丙烯酸锌。而后，将粗品用少量超纯水和乙醇清洗并置于75℃真空烘箱干燥，冷却至室温后即可得到无水的纯的甲基丙烯酸锌。
3、水溶性纳米氧化锌核壳量子点(ZnO@Polymer)的合成
称取0.235g的甲基丙烯酸锌加入至20mL的二缩三乙二醇(TEG)中，并加热到72℃，不停用玻璃棒搅拌使其溶解。待温度恢复至室温，将0.054g的引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)和一定量的甲基丙烯酰胺(MAM)[n(MAM)：n(Zn)＝8：1]一同加入上述溶液中，然后在2000rpm转速下搅拌使溶液温度缓慢升至65℃(1.3℃/min)，保持5min。最后再向溶液中加入0.08g一水合氢氧化锂(LiOH·H2O)和0.054g偶氮二异丁腈，在72℃下充分聚合1h。反应完成后的溶液用分子量为8000的透析袋用超纯水透析48h，即可得到发黄色荧光的水溶性氧化锌量子点。锌的浓度通过原子吸收光谱测定。
4、神经生长因子(NGF)的光接枝
称取9μg的NGF加入到5mL的PBS/DMF(V:V＝1:4)混合溶液中，然后在避光下条件下，加入5.81μg的叠氮苯胺盐酸盐(AAH)，冰浴中搅拌反应48h，得到NGF-AAH；用超滤管对产物进行纯化后，加入2mL的PBS溶解，并用BCA试剂盒检测NGF-AAH的浓度，以确定其中NGF的含量。然后将合成的ZnO@Polymer与NGF-AAH按照以质量计，NGF：Zn＝1:8的比例混合，用80W的紫外灯下照射10s，反应完成后，用超滤管在20000rpm转速下去除未接枝的NGF-AAH，得到ZnO@Polymer-NGF。
5、质粒DNA(pDNA)的吸附
将ZnO@Polymer-NGF与天然带负电荷的pDNA，按照以质量计算Zn：pDNA＝1：30，在4℃条件下搅拌30min，得到ZnO@Polymer-Np。
该pDNA用于干扰下游α-突触蛋白的表达，该质粒为GV144质粒载体，在双酶切位点XhoI/BamH插入该核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列。详见本实验室发表的文章Niu SQ+,Zhang LK+,Zhang L,Zhuang SY,Zhan XY,Chen WY,Du SW,Yin L,You R,Li CH,GuanYQ*.Inhibition by multifunctional magnetic nanoparticles loaded with alpha-synuclein RNAi plasmid in a Parkinson's disease model.Theranostics 2017；7(2):344-56.。
SEQ ID NO:1：
ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGCTGCTGAGAAAACCAAACAGGGTGTGGCAGAAGCAGCAGGAAAGACAAAAGAGGGTGTTCTCTATGTAGGCTCCAAAACCAAGGAGGGAGTGGTGCATGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGAAGACCAAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGAGGAGCAGTGGTGACGGGTGTGACAGCAGTAGCCCAGAAGACAGTGGAGGGAGCAGGGAGCATTGCAGCAGCCACTGGCTTTGTCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATGAAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGAATTCTGGAAGATATGCCTGTGGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAA。
6、靶向分子谷胱甘肽(GSH)的连接
首先将0.019170g的EDC、0.011509g的NHS，和6mg的谷胱甘肽溶于1ml的超纯水中，置于4℃活化4h，之后加入到上一步制备得到的ZnO@Polymer-Np中，室温反应约1h，之后置于1000KDa透析袋中透析24h，得到最终产物ZnO@Polymer-NpG。
二、实验结果
如图1所示，本实施例首先使用凝胶-溶胶法合成不溶于水的纳米氧化锌，之后通过与甲基丙烯酸反应制备得到甲基丙烯酸锌。再通过自由基聚合反应合成具有水溶性且发黄色荧光的氧化锌纳米粒子。此外还对共聚物进行了功能化修饰，通过紫外光接枝技术成功修饰神经生长因子(NGF)以增加神经元靶向性和营养性。通过静电吸附将质粒DNA(pDNA)成功吸附到粒子表面实现对α-突触核蛋白(α-syn)的合成干扰。更重要的是，为了实现粒子在静脉注射后能够顺利突破血脑屏障(BBB)成功进入脑实质，谷胱甘肽通过酰胺反应被修饰到粒子表面以增加脑靶向性，最终合成了GSH修饰的脑靶向氧化锌量子点基因运输载体ZnO@Polymer-NGF-pDNA-GSH(ZnO@Polymer-NpG)。
实施例2紫外-可见光谱分析水溶性纳米氧化锌核壳量子点
一、实验方法
将实施例1制备的ZnO@Polymer，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG(以等质量的[Zn]计)溶液各取2ml置于石英皿中，同时用去离子水作为空白，然后用Unico 2802紫外分光光度计进行吸收峰扫描，波段设置为200nm～800nm。
二、实验结果
图2是三种粒子的紫外-可见光吸收光谱。从图中可以看出ZnO@Polymer在330nm左右出现明显的激子吸收峰，在NGF和pDNA和GSH修饰后330nm的吸收峰仍然存在，说明经过功能化修饰后的粒子都保留了ZnO内核，且被多聚物外壳很好的保护。此外，在ZnO@Polymer-NpG中出现了谷胱甘肽的特征吸收峰说明靶向分子被成功连接。由经验公式可以计算出ZnO@Polymer的平均粒径(1240/λ1/2＝a+b/D2-c/D其中a＝3.556,b＝7.999,c＝2.264,λ1/2为紫外吸收峰的半峰位置，D是粒子的粒径范围是2.5～6.5nm)，将ZnO@Polymer的λ1/2＝350代入公式，计算得出D＝3.6nm，这也和后文透射电镜的结果吻合。
实施例3荧光光谱分析及光致发光检测
一、实验方法
将实施例1制备的ZnO@Polymer，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG(以等质量的[Zn]计)溶液各取3ml置于石英荧光比色皿中，同时用去离子作为空白基底。然后用HoribaJobinYvon fluoromax-4荧光光谱仪进行扫描。激发波长设定为330nm，吸收波长的范围设定为400～700nm。
光致发光检测，即将实施例1制备的ZnO@Polymer，ZnO@Polymer-N，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG溶液各取3～4mL置于石英比色皿中，然后用白光和紫外光照射，记录照片。
二、实验结果
结果如图3所示，图3a为室温下四种粒子在白光和紫外光照射下发出的颜色结果，可以看出在白光照射下四种粒子均无颜色变化，但在330nm紫外光照射下，ZnO@Polymer发出黄色的荧光，而ZnO@Polymer-N，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG发绿色的荧光，说明在功能化修饰之后，氧化锌量子点的荧光发生了蓝移。
图3b是四组粒子的荧光光谱，可以看到ZnO@Polymer的发射峰在550nm左右，而功能化修饰的氧化锌量子点发射峰在500nm左右，荧光强度也有所减弱，可能是由于NGF和GSH和锌离子发生了配位作用(图3)。
实施例4红外光谱测试
一、实验方法
取10mL左右的实施例1制备的ZnO@Polymer，ZnO@Polymer-N，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG溶液，冻干，然后在研钵中研磨直至呈均匀的粉末(粒径小于2μm)，再进行干燥除水。最后将油压机压力设置为10MPa左右将混合物压成透明薄片，上机测定。
二、实验结果
结果如图4所示，在ZnO@Polymer的红外光谱结果中，氨基N-H的振动吸收带在3433cm-1附近。1581cm-1显示的是C＝O的振动吸收峰，1204cm-1是C-N的振动吸收峰，451cm-1是ZnO的特征吸收峰，这些结果表明甲基丙烯酰胺已成功连接到氧化锌表面。同时，2970cm-1的振动吸收峰常是甲基和亚甲基，但是在红外光谱中未见C＝C的吸收峰，这就说明了甲基丙烯酸能充分和甲基丙烯酰胺聚合，从而发挥壳的保护作用。ZnO@Polymer-NpG在保留原有吸收峰的基础上，又增加了巯基的特征振动吸收峰2026cm-1说明靶向分子谷胱甘肽被成功修饰在粒子之上。
实施例5水合粒径及透射电镜形貌检测
一、实验方法
将实施例1制备的ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-N分别稀释到0.1mg/mL，取微量加入到粒径比色皿中，用马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器检测粒子的水合粒径。同时取适量样品负染，待样品在室温下干燥后，放样，插样品杆，抽真空两次，最后查找合适的视野拍摄照片。(JEM-2010透射电子显微镜，200kV)
二、实验结果
为了观察ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-NpG的形貌和粒径，使用了粒度分析仪检测ZnO@Polymer的水合粒径，结果如图5所示，ZnO@Polymer的水合粒径为5nm左右，与紫外光谱中计算所得的差不多。此外，透射电镜显示两组粒子呈球形且分布均匀。值得注意的是ZnO@Polymer在TEM中的平均粒径也为5nm左右，经过功能化修饰之后的ZnO@Polymer-NpG不影响粒径，这一粒径符合脑部载体递送的要求。
实施例6计算NGF接枝率
一、实验方法
以了5种比例(以质量计，NGF：Zn＝1：1、1：4、1：6、1：8、或1：16)，按照和实施例1的方法制备ZnO@Polymer-NpG，但是在紫外光接枝完成后，用超滤管超速离心去除未接枝上的游离NGF，并用微量BCA试剂盒测量离心得到的NGF量。则NGF的接枝率为：
Figure BDA0003056628720000121
其中C1为NGF的总量；C2为游离的NGF的量；C0为粒子中Zn的总质量；LE(％)表示NGF的装载率。
二、实验结果
结果如图6所示，从实验结果中可以看出(左)，当NGF：Zn＝1:1时，NGF的装载率仅有12.5％左右；1:4和1:6的装载率为40％左右，然而当NGF：Zn的比例增加到1:8和1:16时NGF的接枝率在50％左右，且两者没有显著性差异(ns)，此时的NGF装载量达到最大值，所以在本发明中按照1:8的比例光接枝NGF。
实施例7琼脂糖凝胶电泳
一、实验方法
(1)称取0.75g琼脂糖倒入放有70mL的1×TAE缓冲液中，用玻璃棒充分搅拌后，将锥形瓶瓶口用小烧杯盖紧，置于微波炉中加热5-10分钟，直到溶液变得清澈透明，琼脂糖全部融化，即制备成1％的琼脂糖凝胶。
(2)制备胶板
将玻璃板和玻璃槽用清水洗晾干后，在水平桌面上固定玻璃板形成模槽。待琼脂糖凝胶冷却至65℃左右缓慢倒入内槽玻璃板中，使凝胶水平面缓慢上升直至接近玻璃板边缘。然后，将梳子缓慢竖直插入胶中，形成胶孔。将其放在室温下静置，待凝胶完全凝固后，轻轻拔出梳子，最后将凝胶和内槽一并放入电泳槽中，加入1×TAE缓冲液直至没过胶板1～2mm左右。
(3)上样
将ZnO@Polymer-NGF和裸pDNA分别按照以质量计算Zn：pDNA＝1：0、1：1、1：3、1：5、1：10、1：30混合，在与上样缓冲液按比例充分混合，然后用微量移液枪吸取各样品3～5μL按顺序小心加入到胶块的样品槽内。
(4)电泳
将电压设定为100V，待观察到溴酚蓝指示剂移动到距离胶板底约1～2cm时，即可停止电泳。
(5)染色拍照
电泳结束后取出胶板，用含有0.5μg/mL的溴化乙锭1×TAE缓冲液染色20min左右，再用清水漂洗10min。之后，即可使用凝胶成像系统拍照。
二、实验结果
图6右图是琼脂糖凝胶电泳检测不同Zn：pDNA比例时候ZnO@Polymer-NGF对pDNA的吸附效果。从图中可以看出，ZnO@Polymer-NGF粒子完全可以吸附pDNA使其留在上样孔内，且当Zn的量不变的情况下，随着pDNA的量增多粒子对其吸附的量也增高。在以质量计算Zn：pDNA＝1:30的时候，被吸附的pDNA量最大。
实施例8粒子pH敏感性检测
一、实验方法
ZnO具有pH响应性机制，在弱酸环境下如溶酶体中能被降解，为pDNA溶酶体逃逸提供了可能。为了验证粒子的pH敏感性，首先将实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG中NGF被Cy5标记并在pH为7.4和5.5的磷酸缓冲液溶液中孵育0到48h，超速离心后测量各时间点上清的荧光光谱。激发波长为650，发射波谱设定为600～800nm。
此外，为了进一步证明粒子的pH响应性，琼脂糖凝胶电泳被用来检测pDNA在不同时间和不同pH条件下的电泳情况，电泳步骤如实施例7。
二、实验结果
结果如图7所示，当ZnO@Polymer-NpG在pH＝7.4条件下孵育时，0-48h的吸收光谱无明显差别，暗示ZnO没有被降解，NGF分子没有脱离粒子。相反，当ZnO@Polymer-NpG在pH＝5.5条件下孵育时，在第12h即出现Cy5-NGF较高发射峰，说明此时已有ZnO降解，从而导致上清中存在大量游离的NGF。此外，第24h和48h的荧光发射峰相近说明在第24h ZnO内核即将被降解完全，在第48h时降解完全。
从图8(左)可以看出，在pH＝7.4条件下，第1，3,5h pDNA都被很好的固定在上样孔内，表明粒子在中性条件下没有发生降解。然而，在pH＝5.5的条件下孵育1h pDN即从粒子上脱离。而且从图中可以看出，在第5h游离的pDNA量最多，表明此时粒子几乎全被降解。以上实验结果表明ZnO@Polymer-NpG具有良好的pH响应性，为pDNA的溶酶体逃逸提供了可能。
实施例9粒子的血清稳定性分析
一、实验方法
首先将裸pDNA和实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG分别和10％的小牛血清孵育1、3和5h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，观察pDNA电泳情况，电泳步骤同3.7.6，其中上样变为不同时间点和不同pH的裸pDNA和ZnO@Polymer-NpG。
二、实验结果
从图8(右)可以看出，当裸露的pDNA在血清里时很快会被降解，然而当ZnO@Polymer-NpG在血清孵育1、3、5h后，pDNA依然吸附在粒子表面，表明其对pDNA起到一个很好的保护作用，从而避免pDNA在血清内被降解。
实施例10ZnO@Polymer-NpG量子产率及其稳定性
一、实验方法
量子点的量子产率由比较方法确定。如前所述，在无水乙醇中制备了两种标准溶液，荧光素(0.01m NaOH)和罗丹明6G(Rhodamine 6G)。测试溶液为溶解于不同浓度水中的实施例1制备的ZnO@Polymer，ZnO@Polymer-Np和ZnO@Polymer-NpG量子点。用紫外可见分光光度计测定溶液激发波长处的吸光度值。用FLS920荧光计在350nm激发波长下记录了所有溶液的光致发光(PL)发射光谱。积分荧光强度是在400至800nm波长范围内PL曲线下的面积。然后使用积分荧光强度相对于吸光度的图表绘制，并为每条曲线添加一条趋势线，截距为零。方程用于计算量子产率。
Figure BDA0003056628720000151
其中下标ST和X分别表示标准和测试，是荧光量子产率，Grad是积分荧光强度与吸光度的关系曲线的梯度，是溶剂的折射率。
量子点的量子产率稳定性是测量不同时间点的量子产率，步骤如上。
二、实验结果
采用硫酸奎宁做标准物质，在330nm的激发波长下，硫酸奎宁的量子产率为56.0％。通过测量计算，ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-Np的量子产率分别为16.4％和16.3％，ZnO@Polymer-NpG的量子产率为15％左右。表明合成的粒子拥有相对较高的量子产率，能满足生物标记的要求。而且，实验还测量了粒子在一段时间内的量子产率稳定性。结果表明(图9)，ZnO量子点复合物水溶液放置36h后，发射荧光的能力没有明显的改变，具有很好的稳定性。
实施例11ZnO@Polymer-NpG的血液相容性
一、实验方法
在以前的药物/基因传递研究中，生物相容性评估通常仅限于细胞毒性。然而，基因载体通常是通过静脉内注射传递的，不可避免地与各种血液成分如红细胞和血小板接触。相互作用不仅影响基因载体的递送效率，而且还影响血液组织的功能，例如凝血功能。因此，必须评估纳米载体对血液组织的作用，以确保其安全进入体循环。
溶血试验用50μL红细胞悬液(PBS中16％v/v)与浓度为0.25、0.5、0.75、1.0、5.0、和10.0μg/mL实施例1制备得到的ZnO@Polymer-NpG孵育，PBS(阴性对照)和纯水(完全溶血对照)为对照组。孵育12小时后，离心红细胞悬液，将上清液加入96孔板中，并在540nm处用酶标仪(Multiskan MK3，Thermo scientific)测量红细胞中血红蛋白的释放。通过比较540nm处的吸光度值与完全溶血样品的吸光度值，计算不同浓度ZnO@Polymer-NpG处理后红细胞的溶血率。
二、实验结果
溶血表明生物材料引起的红细胞(RBC)膜完整性紊乱，已广泛用于各种生物医学材料的生物安全性评估。实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG即使在高浓度下也对RBC(裂解5％内)没有显着影响(图10)。这表明即使浓度高达10μg/mL，ZnO@Polymer-NpG也不损害RBC膜的完整性。
实施例12荧光成像
一、实验方法
1、细胞培养
(1)细胞复苏：首先快速从液氮罐中取出保存的PC12细胞细胞，置于37℃温水中水浴，并用镊子夹住轻轻摇晃使其解冻。然后在无菌操作台上用1mL移液枪将细胞吸取到5mL的离心管中，并迅速加入2mL 1640培养液(PC12细胞)或者DMEM培养液(SH-SY5Y细胞)，拧紧离心管盖，1000rpm，离心3min。结束后，用75％酒精擦拭离心管表面，再在超净工作台内倒出上清。然后加入2ml的新鲜培养液并用灭菌后的滴管轻轻吹打，直至细胞均匀分散在培养液中，最后将2ml细胞悬液平均移到2个培养瓶中，每个培养瓶再补充2～3mL的培养基，最后置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)细胞传代：待细胞长满后，将培养基在无菌环境中倒掉，每个培养瓶
加入2ml PBS轻轻摇晃清洗细胞2次。然后加入1ml胰酶消化液，静置30秒到1分钟，待观察到大量细胞开始收缩，瓶底泛白后立即停止消化，倒掉消化液，然后用手轻拍瓶底至细胞在瓶底滑落，接着每瓶加4mL培养基，并用滴管轻轻吹打使细胞完全脱落并均匀分散在培养基中。最后平方到2个培养瓶中(1传2)，并每瓶不加1～2mL新鲜培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
2、荧光成像
采用荧光显微镜(Olympus FluoView FV1000)进行活细胞成像。PC12细胞接种于96孔板上，密度为1×105个细胞/孔，在5％CO2，37℃培养箱孵育过夜。之后，将实施例1制备的实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG颗粒加入到培养孔中再孵育10min和1h后，用PBS洗涤细胞3次，去除未进入细胞和吸附在细胞膜外表面的实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG颗粒。最后加入100μL 1640培养基，在330nm激发波长下，用荧光显微镜对细胞成像。荧光强度用Image J统计分析。
二、实验结果
图11显示了在孵育10min和60min的两个时间点拍摄的明场图像和荧光图像。在10分钟的细胞内仅观察到较弱的黄色荧光，这表明很少的实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG颗粒通过与细胞的短时间接触而被内化到细胞中。相比之下，转染后3h，细胞内化了大量实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG，并在激发下显示出明亮稳定的荧光，定量结果也说明孵育1h明显比孵育10min的摄取量高(p<0.01)。这些结果证明粒子具有良好的生物成像功能。
实施例13ZnO@Polymer-NpG转染细胞
一、实验方法
1、细胞培养
使用DMEM培养液按照实施例12中“1、细胞培养”的方法培养SH-SY5Y细胞。
2、ZnO@Polymer-NpG在细胞内的基因转染
用Cy5标记的实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG(ZnO@Polymer-Np-Cy5)研究粒子对神经细胞SH-SY5Y的摄取。
在六孔培养板上接种SH-SY5Y细胞(4×105个/孔)在5％CO2，37℃培养箱孵育过夜。之后，将制备得到的ZnO@Polymer-Np-Cy5量子点加入到培养孔中再孵育1h，3h和5h，孵育过后用PBS清洗3次，然后在室温下用4％多聚甲醛固定30min，再用0.1％Triton X-100渗透1min，最后用荧光显微镜(Olympus FluoView FV1000)拍摄细胞在明场和在330nm，650nm激发光的照片，观察粒子细胞内化和基因转染情况。
二、实验结果
通过观察ZnO QDs(黄色)和Cy5标记的pDNA(红色)在不同时间点的荧光显微镜图像来评估实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG在SH-SY5Y细胞内得基因转染能力。图12实验结果显示，治疗1h后，已经有少量红色荧光出现，同时合并图像中出现明显的橙色荧光点(黄、红色荧光重叠)说明pDNA与ZnO QDs共定位。随着孵育时间延长至3h，在细胞内可以观察到更多的红色荧光。当孵育5h后，黄色荧光和红色荧光相比于孵育1h和3h都强得多。
此外，荧光定量结果也表明细胞内ZnO QDs的黄色荧光在各时间点存在明显差异(1hvs 3h：p<0.001；3h vs 5h：p<0.01；1h vs 5h：p<0.001)。同样的，Cy5-pDNA的红色荧光随着时间的延长也表现出不断积累的趋势。
这些结果说明，实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG能够成功将基因运输至SH-SY5Y细胞。
实施例14PC12细胞分化实验
一、实验方法
为了证明NGF在接枝到ZnO@Polymer仍具有活性(ZnO@Polymer-NGF)，进行PC12细胞分化实验。PC12细胞(一种通常用于体外模拟CNS组织的神经细胞系)用天然裸的NGF，ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-NGF处理。当NGF从ZnO@Polymer-NGF释放到PC12细胞的培养介质中，游离的NGF可以结合原肌球蛋白受体激酶A(TrkA)并且可以通过细胞内途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联反应诱导这些PC12细胞的分化和神经突向外生长。
在处理之前，将PC12细胞1640培养基换成由RPMI，1％ES和1％P/S组成的分化培养基，持续12h。然后，加入天然NGF，ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-NGF，NGF的终浓度为100和200ng/mL。PC12细胞在每孔的三个随机区域成像，每隔100-200个细胞在相衬下每隔一天成像一次。然后从在不同区域拍摄的图像计数具有延伸的神经突(>50μm)的PC12细胞的数量。第5d，将细胞洗涤，用低聚甲醛(4％，w/v)固定，用Triton X-100(0.5％，w/v)渗透，用BSA(5％，w/v)封闭。然后用荧光显微镜对细胞成像和计数。
二、实验结果
图13a显示，裸的NGF和ZnO@Polymer-NGF均可诱导PC12细胞成熟，分化出较多的神经突触且细胞形状由未成熟的圆形变成梭形。而经ZnO@Polymer处理的细胞没有出现明显的延伸的神经突触且细胞形状多为圆形，表明ZnO@Polymer在无NGF的情况下无法促进模型细胞的生长分化。
此外，图13b显示裸的NGF和ZnO@Polymer-NGF促进细胞增殖能力相当(NGF vsZnO@Polymer-NGF:ns)。更重要的是，用天然NGF和ZnO@Polymer-NGF处理后，神经突触大于50μm的PC12细胞数量相似(图13c)，这表明NGF的接枝不会改变其生物学活性。
实施例14MTT细胞增殖和毒性分析
一、实验方法
MTT是噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl etrazoliumbromide)，进入细胞后能够被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物甲臜(formazan)。二甲基亚砜(DMSO)可以溶解甲臜，然后通过酶标仪测定490nm波长附近的吸光度。细胞增殖速度越快，则吸光度越高；细胞毒性越大，则细胞增殖减慢从而导致吸光度降低。
①将对数期生长的SH-SY5Y和C6细胞消化，通过细胞计数器将细胞计数，然后调整悬液浓度为2×104个/mL。在超净工作台中将细胞接种于96孔板中，100μL/孔。在孔的边缘用PBS填充。
②将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
③将实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG药物首先用0.22μm的滤膜过滤除菌，然后与DMEM培养基混合制备成浓度为0.25、0.5、0.75、1.0和3.0mg/L的药物溶液，用100μL的药物溶液替换掉孔中的培养基，同时设置空白对照组，阳性对照组，每组设置6个复孔。
④将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h。
⑤在无菌条件下，向每个孔加入20μL的MTT溶液，然后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。
⑥培养完成后，弃掉培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。
二、实验结果
结果如图14所示，首先左图显示的是两种细胞在没有任何处理的情况下与实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG共同培养的细胞活性结果。实验不仅说明在[Zn]浓度小于3.00mg/L的情况下粒子对两种细胞不仅没有杀伤性，而且具有一定的营养作用，如当[Zn]浓度为0.75mg/L时，相比于对照组C6细胞的活性为150％左右(p<0.05)，而SH-SY5Y细胞的活性达到了180％左右(p<0.001)。这可能是由于NGF的营养作用增加了两种细胞的细胞活性。此外当[Zn]浓度为1.00mg/L和3.00mg/L时，两种细胞的活性相比于0.75mg/L略有下降，这可能是由于高浓度的ZnO QDs进入细胞后产生了Zn2+，导致细胞产生了一定量的活性氧(ROS)，因此对细胞有一定的杀伤效果，但是细胞活性依然比空白组高，说明实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG在一定浓度下具有很好的生物相容性。
实施例15MTT检测粒子神经修复效果
一、实验方法
为了检测实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG是否能够逆转建模药物导致的细胞活性降低，实验首先收集对数期生长的SH-SY5Y和C6细胞，通过将细胞计数，然后调整悬液浓度为2×104个/ml。在超净工作台中将细胞接种于96孔板中，100μL/孔。在孔的边缘用PBS填充。将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
除了阴性对照加PBS，其余孔中都加入建模药物MPP+，至终浓度为40mg/ml，然后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养12h。倾倒含有建模药物的培养基用浓度为0.25、0.5、0.75mg/L的含实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG培养基代替，然后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。最后，在无菌条件下，向每个孔加入20μL的MTT溶液，然后将96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h。培养完成后，弃掉培养基，每孔加入150μL二甲基亚砜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 570nm处测量各孔的吸光值。
二、实验结果
实验结果如图14右图，当细胞用建模药物处理后，两种细胞的细胞活性均降低至50％左右。当用[Zn]浓度为0.25mg/L和0.50mg/L治疗后，两种细胞的细胞活性没有明显的改变，然而，当用0.75mg/L的[Zn]浓度治疗后，C6细胞的活性增至70％左右(vs PBS:p<0.01)，SH-SY5Y细胞活性上升至60％左右(vs PBS:p<0.001)，这可能是由于pDNA和NGF的双重治疗作用。
总之，这些实验结果说明实施例1制备的ZnO@Polymer-NpG在一定浓度范围内不仅没有细胞毒性，而且具有细胞生长促进作用。此外，ZnO复合物还能够在一定程度上修复由于建模药物MPP+导致的细胞活性降低，为进一步的动物实验奠定了基础。
实施例16ZnO@Polymer-Np携带pDNA进入细胞抑制α-突触核蛋白(SNCA)的表达
一、实验方法
为了在基因和蛋白水平证明ZnO@Polymer-Np能够携带pDNA进入细胞抑制α-突触核蛋白(SNCA)的表达，实验用荧光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印迹测量α-突触核蛋白的表达水平。细胞培养和处理同上文细胞毒性分析
1、荧光定量PCR
为了证明荷载的pDNA在细胞内发挥了RNAi的作用，使用了qPCR在mRNA水平测试了SNCA的表达水平。为了进行实时qPCR分析，进行了与上述细胞毒性分析相似的细胞培养和处理。
(1)将细胞用液氮充分研磨，加入1mL预冷的Trizol提取液(鼎国)，加液氮速冻，继续研磨成粉状。待溶解成液体状，转移至2mL离心管中，漩涡振荡，室温放置5min，4℃，12000rpm，离心10min。取上清，加入200μL氯仿，振荡混匀，4℃，12000rpm，10min。取上清，加入1/3体积无水乙醇，轻轻混匀，转至RNA纯化柱中，4℃，12000rpm，1min。弃下层废液，加入450μL 75％乙醇，4℃，12000rpm，2min，该步骤重复一次。空甩30s，超净工作台中吹4min，加入65℃预热的DEPC水30μL，静置1min，4℃，12000rpm，2min。琼脂糖凝胶检测及浓度纯度检测。
(2)cDNA的合成
参考TaKaRa Prime Script RT reagent kit with DNA Eraser说明书。
(3)RT-PCR
RT-PCR选用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa)的反应体系，按照说明书进行操作。所用仪器为ABI 7500PRISM real-time PCR system(Applied Biosystems)。
PCR反应程序：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃34s(取决于不同的引物的最适反应温度)，72℃20s，共45个循环。循环结束后，从结果中提取目的基因和内参基因的Ct值，处理数据采用相对定量的二阶导数法。
2、免疫印迹
首先提取经PBS，MPP+,ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-Np处理的细胞蛋白。
(1)将细胞培养基倒掉，用吸水纸去除残留的培养基。
(2)用刮棒将细胞从瓶底刮掉或者用胰酶消化后离心收集细胞，然后加入2ml预冷的PBS，并用移液枪反复吹打，清洗细胞3次，每次清洗完后需1000r离心5分钟。
(3)每瓶细胞加入100μl的细胞裂解液，并用移液枪反复吹打直至和细胞充分混匀，以便彻底裂解细胞。裂解完后，置于-80℃影响保存。
蛋白提取完成后，即可操作免疫印迹：
(1)配胶：将玻璃板和玻璃槽用清水冲洗干净，然后置于室温下晾干。然后将玻璃板固定在玻璃槽中形成槽模。将配好的分离胶先导入槽中，并用蒸馏水封口，待分离胶凝固之后倒掉蒸馏水，加入浓缩胶，然后垂直插入梳子。待浓缩胶凝固之后即可缓慢拔掉梳子。
(2)上样：将提取的蛋白质和Marker与1×loading buffer按比例充分混合，然后用微量移液枪吸取各样品和3-5μL按顺序小心加入到胶块的样品槽内。
(3)电泳：先将电压调至80V，待条带移动到分离胶时再调整电压至120V。当条带迁移至距离胶底部边缘1cm左右时停止电泳。
(4)转模：取出胶块置于转移液中浸泡，然后按从下到上依次为滤纸，胶，PVDF膜，滤纸的顺序放置在电转槽内，注意中间不能有气泡。然后将电转槽置于冰水混合物中，恒流400mA，湿转4h。
(5)封闭：电转结束后，将膜取出置于PBST中清洗3次，5min/次。然后用封闭液封闭1h。
(6)孵育一抗：将封闭后的膜置于含有一抗的封闭液中，4℃孵育过夜。孵育结束后用PBST清洗3次，5min/次。
(7)孵育二抗：将膜置于二抗的稀释液中室温孵育1h，孵育结束后用PBST清洗3次，5min/次。
(8)成像：使用Biorad-ChemiDoc-XRS系统显示条带。
二、实验结果
图15a qPCR结果表明，建模药物MPP+处理后的细胞SNCA mRNA表达量上升，且ZnO@Polymer处理后也没有得到任何改善。然而，ZnO@Polymer-Np处理后的mRNA表达水平与建模组相比降低了很多(PBS vs MPP+/ZnO@Polymer-Np:p<0.05)。
图15b和图15c的定量结果也表明SNCA在ZnO@Polymer-Np处理后表达量显著减低，结果与qPCR符合。此外，实验还检测了络氨酸羟化酶(TH)的蛋白表达水平。TH是参与多巴胺生物合成的关键酶，其表达与多巴胺能神经元功能密切相关，因此脑组织中TH水平的降低被认为是多巴胺能神经元丧失的直接指标。图15b和图15c实验结果表明建模组较低的TH表达水平可以有效的被ZnO@Polymer-Np逆转，然而ZnO@Polymer没有能力抑制TH的表达量降低。
实施例17免疫荧光
一、实验方法
由于GSH是脑靶向分子，设计用于突破血脑屏障的，因此我们在细胞层面的研究中选用不接GSH的粒子。为了更加直观的观察SNCA和TH在经不同药物(PBS、MPP+、ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-Np)处理后的细胞内的表达情况，进行免疫荧光分析。
(1)固定：细胞经PBS、MPP+、ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-Np处理后，去掉药物和培养基，加入4％的多聚甲醛固定30分钟，固定完成后用PBS清洗3次，5min/次。
(2)透化：用0.2％的Triton-100透化细胞30min，透化完成后用PBS清洗3次，5min/次。
(3)孵育SNCA和TH一抗：将透化后的细胞加入一定量的一抗稀释液，4℃孵育过夜，孵育结束后用PBS清洗3次，5min/次(或者回收)。
(4)孵育二抗：在避光条件下将细胞与二抗稀释液孵育30分钟，孵育结束后用PBS清洗3次，5min/次。
(5)染核：在避光条件下将细胞与DAPI染液孵育30分钟，孵育结束后用PBS清洗3次，5min/次。
(6)荧光成像。
二、实验结果
结果如图16a所示，细胞核被DAPI染成蓝色，SNCA和TH被FITC标记的二抗染成绿色。结果显示在控制组中SNCA有少量表达，而TH表达量较高，且细胞和形态规则。当用建模药物MPP+处理后，SNCA的表达水平明显上升，而TH的表达水平明显下降，且从DAPI染核的结果看，在这组实验中，PC12细胞的细胞核呈现明显的破裂现象，表明在建模过程中，细胞受到了损伤，且达到了帕金森症的建模效果。当ZnO@Polymer治疗后两种蛋白的表达水平与建模组相比并没有明显的改变，且细胞状态改善的幅度也较小。然而，当ZnO@Polymer-Np处理后，SNCA的表达水平出现大幅度降低，与控制组的蛋白表达量相当(ns)。同样，ZnO@Polymer-Np处理后TH的表达水平虽然不能恢复到正常水平，但与建模组相比也得到了有效的逆转(图16b)。
这些结果说明制备的ZnO@Polymer-Np能够成功荷载基因进入SH-SY5Y细胞发挥RNA干扰作用，降低帕金森体外细胞模型的SNCA表达。同时，由于SNCA蛋白含量降低以及神经生长因子的作用，细胞活性增加，促进了TH表达含量上升，这将使得细胞内的左旋多巴胺含量升高，进而促进多巴胺的分泌，使细胞活性恢复。
实施例18细胞活性氧检测
一、实验方法
建模药物MPP+发挥作用的机制之一是破坏线粒体复合物Ⅰ，导致活性氧(ROS)含量上升，从而导致神经元死亡。因此，用DCF-DA荧光探针检测了SH-SY5Y细胞中的ROS水平。
首先将细胞按照实施例15处理，然后按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度2×105/ml，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照和PBS，MPP+，ZnO@Polymer和ZnO@Polymer-Np刺激细胞。然后用荧光显微镜拍摄照片，绿色即为活性氧，含量越高颜色越深。同时也可在488nm为激发波长测定荧光吸收光谱，活性氧浓度越高，发射光谱的积分面积越大。
二、实验结果
图17结果表明，经过MPP+处理后，SH-SY5Y细胞中的ROS生成确实显著升高(PBS vsMPP+:p<0.001)，且ZnO@Polymer-Np治疗后明显可以减低ROS的含量(PBS vs MPP+/ZnO@Polymer-Np:p<0.05；MPP+vs MPP+/ZnO@Polymer-Np:p<0.001)，而ZnO@Polymer处理没有观察到的任何改善(MPP+vs MPP+/ZnO@Polymer:ns)。
相似的结果也可以从ROS的荧光光谱中观察到，如图18所示，MPP+和ZnO@Polymer处理的细胞活性氧水平较高且荧光密度相当，而ZnO@Polymer-Np组能够明显降低ROS水平，与PBS组的ROS含量相似。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatgtat tcatgaaagg actttcaaag gccaaggagg gagttgtggc tgctgctgag 60
aaaaccaaac agggtgtggc agaagcagca ggaaagacaa aagagggtgt tctctatgta 120
ggctccaaaa ccaaggaggg agtggtgcat ggtgtggcaa cagtggctga gaagaccaaa 180
gagcaagtga caaatgttgg aggagcagtg gtgacgggtg tgacagcagt agcccagaag 240
acagtggagg gagcagggag cattgcagca gccactggct ttgtcaaaaa ggaccagttg 300
ggcaagaatg aagaaggagc cccacaggaa ggaattctgg aagatatgcc tgtggatcct 360
gacaatgagg cttatgaaat gccttctgag gaagggtatc aagactacga acctgaagcc 420
taa 423

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体，其特征在于，所述基因运输载体为表面修饰有神经生长因子NGF、DNA和谷胱甘肽的氧化锌纳米量子点。
2.根据权利要求1所述的基因运输载体，其特征在于，所述DNA为质粒，其携带有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列。
3.一种谷胱甘肽修饰的靶向脑的氧化锌量子点的基因运输载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：纳米氧化锌与甲基丙烯酸反应制备得到甲基丙烯酸锌；通过自由基聚合反应合成氧化锌纳米量子点ZnO@Polymer；氧化锌纳米量子点表面接枝神经生长因子NGF；并吸附DNA，得到ZnO@Polymer-NGF；再连接谷胱甘肽；优选地，所述DNA为质粒，其携带有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，纳米氧化锌的制备方法为：LiOH的水溶液逐滴加到无水醋酸锌Zn(Ac)2悬浮液中，至液体透明为止，即得。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，纳米氧化锌与甲基丙烯酸反应制备得到甲基丙烯酸锌的步骤为：将甲基丙烯酸的水溶液与纳米氧化锌混合，充分反应，固液分离保留液体，去除溶剂，纯化，干燥，即得。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，通过自由基聚合反应合成氧化锌纳米量子点的步骤为：甲基丙烯酸锌与二缩三乙二醇混合，溶解；加入偶氮二异丁腈和甲基丙烯酰胺，充分反应；加入一水合氢氧化锂和偶氮二异丁腈，充分反应；除杂，即得氧化锌纳米量子点ZnO@Polymer。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，氧化锌纳米量子点表面接枝神经生长因子NGF的步骤为：避光下条件下，NGF的PBS/DMF的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐混合，充分反应得到NGF-AAH，纯化后用PBS复溶；将ZnO@Polymer与纯化后复溶的NGF-AAH混合，紫外线反应，固液分离，去除液体，得到ZnO@Polymer-NGF。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，吸附DNA的步骤为：ZnO@Polymer-NGF与DNA混合，充分反应，得到ZnO@Polymer-Np。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，连接谷胱甘肽的步骤为：活化谷胱甘肽的羧基，与ZnO@Polymer-Np混合，充分反应；除杂，即得ZnO@Polymer-NpG。
10.权利要求1或2所述的基因运输载体，和/或权利要求3到9任一所述的基因运输载体的制备方法制备得到的基因运输载体，在制备突破血脑屏障进入脑实质靶向脑的药物中的应用。
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