CN109331186A - 一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方面的应用 - Google Patents

一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方面的应用。所述金纳米粒复合物为脂质体包裹的吸附有能够干扰α‑突触核蛋白合成的质粒的金纳米粒子，并且表面修饰神经生长因子和二十二碳六烯酸。通过本发明制备得到的脂质体修饰的金纳米粒复合材料，在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，将能够干扰α‑突触核蛋白合成的质粒转染到细胞内，干扰α‑突触核蛋白的合成，来治疗帕金森小鼠的运动障碍和探索能力障碍，发现其可以通过干扰脑内α‑突触核蛋白的表达来改善帕金森小鼠的运动与探索能力，对于帕金森氏症的治疗和行为障碍改善具有重要的意义和应用价值。

Description

一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方 面的应用
技术领域
本发明涉及帕金森氏症治疗技术领域，更具体地，涉及一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方面的应用。
背景技术
帕金森氏症（Parkinson’s disease，PD），又名震颤麻痹，是一种常见的神经系统退行性疾病，其发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD），为世界第二大神经性的疾病。目前，全球65岁以上人群中大约有1.5%的人口患有PD，到2030年，PD患者可能会翻倍增长到九百万人左右。PD主要临床症状表现为肌强直、震颤、运动减慢以及平衡和行走障碍，随着PD研究的不断深入，研究人员发现PD患者除了表现出典型运动障碍以外，同时还存在着许多非运动性的症状，例如情绪障碍、焦虑，抑郁以及思考迟缓、认知衰退等认知方面的障碍。研究表明PD的病理特征为中脑黑质纹状体的多巴胺能神经元坏死，导致多巴胺释放量减少，最终造成PD各种障碍。
目前，针对PD主要有三种治疗的方法：1）手术治疗：通过移植多巴胺能神经元细胞，来降低用药量，但是并不能从根本上解决问题。2）药物治疗：左旋多巴胺、儿茶酚转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B、谷氨酸-N-甲基-D-天冬氨酸拮抗剂、酶抑制剂。然而，疾病的恶化是不可避免的，病人很快就会出现运动性障碍，如步伐紊乱、痴呆等。3）基因治疗：RNA干扰特定蛋白的表达，目前相关研究较多。因为RNA通过干扰基因转录为相应的蛋白而沉默特定基因，所以理论上来讲，任何基因都可以通过RNAi靶向沉默，这样就可以为治疗疾病提供一个巨大的前景。
基因治疗由于其靶向性强，疗效明显等优势，成为目前的研究热点。基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体两类，非病毒载体价格低、制备简单、安全有效、无免疫原性等优点，已渐成为病毒类基因载体的替代者。非病毒载体，按其尺寸大小可以分为三类：纳米载体、微米载体和大尺寸载体。
在过去的十几年里，金纳米粒子由于具有生物相容性好、合成简单、分散性好、易功能化、细胞内吞率高、循环半衰期长、易于渗透肿瘤细胞及特殊的化学惰性、表面特性、电子结构和光学特性，使它已经在诊断疾病、化疗、医学成像、热疗、新疫苗的设计、放疗、基因疗法等临床研究中成为一种理想的纳米载体。
但是目前为止尚无一种高效安全的针对帕金森症的基因治疗药物出现。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，利用巯基将金纳米粒子（GNP）巯基化后，将干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA（pDNA）吸附在金纳米粒子上，得到GNP(pDNA)，通过卵磷脂与胆固醇合成脂质体（Lipo），利用脂质体将GNP(pDNA)包裹得到GNP(pDNA)-Lipo，随后通过光化学固定的方法将神经生长因子（NGF）修饰上，得到GNP(pDNA)-Lipo-NGF，最后利用EDC/NHS活化羧基把二十二碳六烯酸（DHA）连接到复合物上，最终得到金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF-DHA，即AuNPs。接着将金纳米粒子复合物AuNPs用于治疗帕金森小鼠，发现该复合物能够明显的抑制脑内α-突触核蛋白的表达，并改善帕金森小鼠的的运动与探索能力。
本发明的第一个目的是提供一种脂质体修饰的金纳米粒复合物。
本发明的第二个目的是提供所述的金纳米粒复合物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供任一所述制备方法制备得到的脂质体修饰的金纳米粒复合物。
本发明的第四个目的是提供所述金纳米粒复合物在制备帕金森氏症治疗药物中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述金纳米粒复合物在制备干扰脑内α-突触核蛋白的表达药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述金纳米粒复合物在制备保护脑内多巴胺能神经元免受损伤药物中的应用。
本发明的第七个目的是通过所述金纳米粒复合物在制备恢复/提高长期的运动迟缓药物中的应用。
本发明的第八个目的是通过所述金纳米粒复合物在制备恢复/提高空间记忆能力障碍药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过硼氢化钠还原氯金酸，十二烷基硫醇对金纳米粒进行改性得到带正电的金纳米粒子，通过静电吸附作用吸附带负电的质粒DNA，并通过卵磷脂与胆固醇脂质体的合成将金纳米粒子包裹，并通过光接枝的方法将连接信号分子NGF、识别脑组织和血脑屏障的靶向分子氧化型DHA连接到复合物上，构建了一种金纳米粒复合物；其中脂质体在PD中的应用主要是构成药物递送系统，充当药物运输载体，保护包封药物，提高药物稳定性。并分别利用透射电镜、紫外-可见分光光度法、琼脂糖凝胶电泳、傅里叶红外光谱等方法进行表征检测，确保粒子合成成功后，进行小鼠实验，实验结果显示，该金纳米粒复合物（AuNPs），保护脑内多巴胺能神经元免受损伤，并改善运动迟缓和空间记忆能力障碍。因此本发明要求保护一种脂质体修饰的金纳米粒复合物，所述金纳米粒复合物为脂质体包裹的吸附有能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒的金纳米粒子，并且表面修饰神经生长因子和二十二碳六烯酸。
优选地，脂质体为胆固醇和卵磷脂。
优选地，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒为连接有Pan troglodytessynuclein alpha (SNCA)或其片段的真核质粒过表达载体。
优选地，所述真核质粒过表达载体为元件顺序为CMV-EGFP-MCS-SV40-Neomycin的GV144载体，连接位点为XhoI和BamHI酶切位点之间。
优选地，所述Pan troglodytes synuclein alpha (SNCA) 片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1
ATGGATGTATTCATGAAAGGACTTTCAAAGGCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGCTGCTGAGAAAACCAAACAGGGTGTGGCAGAAGCAGCAGGAAAGACAAAAGAGGGTGTTCTCTATGTAGGCTCCAAAACCAAGGAGGGAGTGGTGCATGGTGTGGCAACAGTGGCTGAGAAGACCAAAGAGCAAGTGACAAATGTTGGAGGAGCAGTGGTGACGGGTGTGACAGCAGTAGCCCAGAAGACAGTGGAGGGAGCAGGGAGCATTGCAGCAGCCACTGGCTTTGTCAAAAAGGACCAGTTGGGCAAGAATGAAGAAGGAGCCCCACAGGAAGGAATTCTGGAAGATATGCCTGTGGATCCTGACAATGAGGCTTATGAAATGCCTTCTGAGGAAGGGTATCAAGACTACGAACCTGAAGCCTAA
最优选地，所述能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段的GV144载体，连接位点为XhoI和BamHI酶切位点之间。
优选地，脂质体、能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒、金纳米粒子、表面修饰神经生长因子和二十二碳六烯酸的质量比为8.5～10：0.8～1.2：8.5～10：2.5～3.0：17.5～19.0。
优选地，脂质体、能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒、金纳米粒子、表面修饰神经生长因子和二十二碳六烯酸的质量比为9：1：9：2.7：18。
所述的金纳米粒复合物的制备方法，包括以下步骤：
S1. 制备得到巯基修饰的金纳米粒GNP；
S2. 用能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA吸附在GNP表面，得到GNP (pDNA)；
S3. 制备脂质体Lipo；
S4. 制备脂质体Lipo包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo；
S5. 在GNP(pDNA)-Lipo表面修饰神经生长因子（NGF）和二十二碳六烯酸（DHA）得到金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF- DHA。
优选地，步骤S1的具体操作为：用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP。
优选地，硼氢化钠溶液用4℃预冷的纯水现配现用。
优选地，混合溶液1中氯金酸、柠檬酸钠和正十二烷基硫醇的质量比为4.95～5.05：4.95～5.05：1.66～1.72。
更优选地，混合溶液1中氯金酸、柠檬酸钠和正十二烷基硫醇的质量比为5：5：1.69。
优选地，混合溶液1和硼氢化钠水溶液的体积比为50～60：3.95～4.05。
更优选地，混合溶液1和硼氢化钠水溶液的体积比为55.02：4。
优选地，硼氢化钠水溶液的浓度为0.85～0.95 g/L。
更优选地，硼氢化钠水溶液的浓度为0.9 g/L。
优选地，步骤S2的具体操作为：GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置，滴加PBS缓冲液，搅拌，得到GNP (pDNA)。
优选地，滴加PBS缓冲液的速度为1.4～1.6 mL/min。
更优选地，滴加PBS缓冲液的速度为1.5 mL/min。
优选地，搅拌的速度为55～65 r/min。
更优选地，搅拌的速度为50 r/min。
优选地，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液浓度为80～88 μg/mL。
更优选地，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液浓度为83 μg/mL。
优选地，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒为连接有Pan troglodytessynuclein alpha (SNCA)或其片段的真核质粒过表达载体。
优选地，所述真核质粒过表达载体为元件顺序为CMV-EGFP-MCS-SV40-Neomycin的GV144载体，连接位点为XhoI和BamHI酶切位点之间。
优选地，所述Pan troglodytes synuclein alpha (SNCA) 片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
最优选地，所述能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段的GV144载体，连接位点为XhoI和BamHI酶切位点之间。
优选地，GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液混合的体积比为8.8～9.2：0.95～1.05。
更优选地，GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液混合的体积比为9：1。
优选地，混合溶液2与PBS缓冲液的体积比为0.95～1.05：1.95～2.05。
更优选地，混合溶液2与PBS缓冲液的体积比为1：2。
优选地，室温放置15.5～16.5 h。
更优选地，室温放置16 h。
优选地，搅拌的速度为290～310 r/min。
更优选地，搅拌的速度为300 r/min。
优选地，搅拌的时间为不低于10 h。
优选地，PBS缓冲液pH=6.2～6.8。
更优选地，PBS缓冲液pH=6.5。
优选地，步骤S3的具体操作为：胆固醇和卵磷脂溶于有机溶剂，蒸干溶剂，加入PBS缓冲液，溶解，超声处理得到脂质体Lipo。
优选地，卵磷脂为大豆卵磷脂。
优选地，胆固醇和卵磷脂的质量比为230～245：479～489。
更优选地，胆固醇和卵磷脂的质量比为235：484。
优选地，有机溶剂为氯仿。
优选地，PBS缓冲液pH=6.2～6.8。
更优选地，PBS缓冲液的pH=6.5。
优选地，胆固醇和卵磷脂的质量之和与PBS缓冲液的质量体积为71.4～72.4：9.95～10.05（μg/ mL）。
更优选地，胆固醇和卵磷脂的质量之和与PBS缓冲液的质量体积为71.9：10（μg/mL）。
优选地，利用螺旋蒸发仪蒸干溶剂。
优选地，利用螺旋蒸发仪28～32℃减压蒸发，转速90～110 r/min，真空度0.09～-0.1MPa。
更优选地，利用螺旋蒸发仪30℃减压蒸发，转速100 r/min，真空度-0.1MPa。
优选地，超声处理25～35 min。
更优选地，超声处理 30 min。
优选地，步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，搅拌，得到制备脂质体包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo。
更优选地，Lipo溶液与GNP(pDNA)溶液的体积比为0.95～1.05：0.95～1.05。
更优选地，Lipo溶液与GNP(pDNA)溶液的体积比为1：1。
优选的，使用磁力搅拌器进行搅拌。
优选的，搅拌300 r/min的速度搅拌11～13 h。
更优选的，搅拌300 r/min的速度搅拌12 h。
优选地，步骤S5的具体操作为：依次通过光接枝法和EDC/NHS活化羧基法将神经生长因子和二十二碳六烯酸连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo表面。
优选地，将神经生长因子连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo表面的具体步骤为：将神经生长因子、PBS磷酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐混合，冰浴中搅拌反应得到NGF-AAH溶液；NGF-AAH溶液与GNP(pDNA)-Lipo溶液，混合物在紫外灯下反应，用对产物进行纯化得到GNP(pDNA)-Lipo-NGF。
优选地，用超滤管对产物进行纯化。
优选地，PBS磷酸缓冲液PH=6.2～6.8。
更优选地，PBS磷酸缓冲液PH=6.5。
优选地，PBS和DMF的质量为0.9～1.1：3.8～4.2。
更优选地，PBS和DMF的质量为1：4。
优选地，神经生长因子、PBS磷酸缓冲液/N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐的质量体积比为0.85～0.95：4.8～5.2：0.00576～0.0058（g/mL/g）。
更优选地，神经生长因子、PBS磷酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐的质量体积比为0.9：5：0.00581（g/mL/g）。
优选地，冰浴中搅拌反应47～49 h。
更优选地，冰浴中搅拌反应48 h。
优选地，NGF-AAH溶液与GNP (pDNA)-Lipo溶液的体积比为0.8～1.2：5.8～6.4。
更优选地，NGF-AAH溶液与GNP (pDNA)-Lipo溶液的体积比为1：6。
优选地，紫外灯下反应9～11 s。
更优选地，紫外灯下反应10 s。
优选地，通过神经生长因子连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF表面的具体步骤为：（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入二十二碳六烯酸，得到EDC/NHS/DHA溶液，EDC/NHS/DHA溶液与GNP(pDNA)-Lipo-NGF溶液反应，透析后得到脂质体修饰的金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF-DHA。
优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.006～0.008 mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001～0.003 mol/L。
更优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.007 mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.002 mol/L。
优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸的体积比为95～105：0.95～1.05。
更优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸的体积比为100：1。
优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸常温反应25～35 min。
更优选地，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸常温反应30 min。
优选地，EDC/NHS/DHA溶液GNP (pDNA)-Lipo-NGF溶液的体积比为95～107：48～52。
更优选地，EDC/NHS/DHA溶液GNP (pDNA)-Lipo-NGF溶液的体积比为101：50。
具体更优选地，作为一种可选择方案，所述制备方法包括以下步骤：
S1. 用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP；
S2. GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置；滴加PBS缓冲液，搅拌，得到GNP (pDNA)；
S3. 胆固醇和卵磷脂溶于有机溶剂，蒸干溶剂形成，加入PBS缓冲液，水化，超声处理得到脂质体Lipo；
S4. 步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，搅拌，得到制备脂质体包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo；
S5. 依次通过光接枝法和EDC/NHS活化羧基法将神经生长因子和二十二碳六烯酸连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo表面。
更优选地，所述制备方法包括以下步骤：
S1. 用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP；
S2. GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置；缓慢滴加PBS缓冲液，搅拌，得到GNP (pDNA)；
S3. 胆固醇和卵磷脂溶于有机溶剂，蒸干溶剂形成一层均匀薄膜，加入PBS缓冲液，水化至薄膜溶解，超声处理得到脂质体Lipo；
S4. 步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，搅拌，得到制备脂质体包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo；
S5. 将神经生长因子、PBS磷酸缓冲液和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐混合，冰浴中搅拌反应得到NGF-AAH溶液；NGF-AAH溶液与GNP(pDNA)-Lipo溶液，混合物在紫外灯下反应，用超滤管对产物进行纯化得到GNP(pDNA)-Lipo-NGF；通过神经生长因子连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF表面的具体步骤为：（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入二十二碳六烯酸，得到EDC/NHS/DHA溶液，EDC/NHS/DHA溶液与GNP(pDNA)-Lipo-NGF溶液反应，透析后得到脂质体修饰的金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF-DHA。
进一步优选地，所述制备方法包括以下步骤：
S1. 用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP，混合溶液1中氯金酸、柠檬酸钠和正十二烷基硫醇的质量比为4.95～5.05：4.95～5.05：1.66～1.72，混合溶液1和硼氢化钠水溶液的体积比为50～60：3.95～4.05，硼氢化钠水溶液的浓度为0.85～0.95g/L，硼氢化钠溶液用4℃冰箱中预冷的纯水于现配现用；
S2. GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置15～17 h；1.4～1.6 mL/min滴加pH=6.2～6.8的PBS缓冲液，速度为55～65 r/min搅拌不低于10 h，得到GNP (pDNA)，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液浓度为80～88 μg/mL，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒连接有Pan troglodytes synuclein alpha (SNCA)或其片段的真核质粒过表达载体，GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液混合的体积比为8.8～9.2：0.95～1.05，混合溶液2与PBS缓冲液的体积比为0.95～1.05：1.95～2.05；
S3. 胆固醇和卵磷脂溶于有机溶剂，利用螺旋蒸发仪28～32℃减压蒸发，转速90～110r/min，真空度0.09～-0.1MPa蒸干溶剂形成一层均匀薄膜，加入pH=6.2～6.8的PBS缓冲液，水化至薄膜溶解，超声处理25～35 min得到脂质体Lipo，胆固醇和卵磷脂的质量比为230～245：479～489，胆固醇和卵磷脂的质量之和与PBS缓冲液的质量体积为71.4～72.4：9.95～10.05（μg/ mL），；
S4. 步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，使用磁力搅拌器进行搅拌280～329 r/min的速度搅拌11～13 h，得到制备脂质体包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo，Lipo溶液与GNP(pDNA)溶液的体积比为0.95～1.05：0.95～1.05；
S5. 神经生长因子、PBS磷酸缓冲液/N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液（PBS和DMF的质量为0.9～1.1：3.8～4.2）与叠氮苯胺盐酸盐混合，冰浴中搅拌反应47～49 h得到NGF-AAH溶液；NGF-AAH溶液与GNP(pDNA)-Lipo溶液，混合物在紫外灯下反应9～11 s，用超滤管对产物进行纯化得GNP(pDNA)-Lipo-NGF，神经生长因子、PBS磷酸缓冲液/N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐的质量体积比为0.85～0.95：4.8～5.2：0.00576～0.0058（g/mL/g），NGF-AAH溶液与GNP (pDNA)-Lipo溶液的体积比为0.8～1.2：5.8～6.4；
（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入二十二碳六烯酸，得到EDC/NHS/DHA溶液，EDC/NHS/DHA溶液与GNP(pDNA)-Lipo-NGF溶液常温反应25～35 min，透析后得到脂质体修饰的金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF-DHA，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.006～0.008 mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.001～0.003 mol/L，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸的体积比为95～105：0.95～1.05，EDC/NHS/DHA溶液GNP(pDNA)-Lipo-NGF溶液的体积比为95～107：48～52。
最优选地，所述制备方法包括以下步骤：
S1. 用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP，氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇的体积比为10：1：0.02，混合溶液1中氯金酸、柠檬酸钠和正十二烷基硫醇的质量比为5：5：1.69，混合溶液1和硼氢化钠水溶液的体积比为55.02：4，硼氢化钠水溶液的浓度为0.9g/L，硼氢化钠溶液用4℃冰箱中预冷的纯水于现配现用；
S2. GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置16 h；1.5 mL/min滴加pH=6.5的PBS缓冲液，转速为50 r/min，搅拌不低于10 h，得到GNP (pDNA)，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液浓度为83.0 μg /mL，能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段的GV144载体，连接位点为XhoI和BamHI酶切位点之间，GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒溶液混合的体积比为9：1，混合溶液2与PBS缓冲液的体积比为1：2；
S3. 胆固醇和卵磷脂溶于氯仿，利用螺旋蒸发仪30℃减压蒸发，转速100 r/min，真空度0.09～-0.1MPa蒸干溶剂形成一层均匀薄膜，，加入pH=6.5的PBS缓冲液，水化至薄膜溶解，超声处理30 min得到脂质体Lipo，胆固醇和卵磷脂的质量比为235：484，胆固醇和卵磷脂的质量之和与PBS缓冲液的质量体积为71.9：10（μg/ mL）；
S4. 步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，使用磁力搅拌器进行搅拌300 r/min的速度搅拌12 h，得到制备脂质体包裹金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo，Lipo溶液与GNP(pDNA)溶液的体积比为1：1，；
S5. 神经生长因子的PBS磷酸缓冲液/N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液（PBS和DMF的质量为1：4）与叠氮苯胺盐酸盐混合，冰浴中搅拌反应48 h得到NGF-AAH溶液；NGF-AAH溶液与GNP(pDNA)-Lipo溶液，混合物在紫外灯下反应10 s，用超滤管对产物进行纯化得到GNP(pDNA)-Lipo-NGF，神经生长因子、PBS磷酸缓冲液/N，N-二甲基甲酰胺的混合溶液与叠氮苯胺盐酸盐的质量体积比为0.9：5：0.00581（g/mL/g），NGF-AAH溶液与GNP (pDNA)-Lipo溶液的体积比为0.8～1.2：5.8～6.4；
（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液加入二十二碳六烯酸，得到EDC/NHS/DHA溶液，EDC/NHS/DHA溶液与GNP(pDNA)-Lipo-NGF溶液常温反应30 min，透析后得到脂质体修饰的金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF-DHA，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液中（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为0.007mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.002mol/L，（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液与二十二碳六烯酸的体积比为100：1，EDC/NHS/DHA溶液GNP (pDNA)-Lipo-NGF溶液的体积比为101：50。
任一所述制备方法制备得到的脂质体修饰的金纳米粒复合物，也属于本发明的保护范围。
同时，本发明还要求保护以下内容：
所述金纳米粒复合物在制备帕金森氏症治疗药物中的应用。
所述金纳米粒复合物在干扰脑内α-突触核蛋白的表达中的应用/制备干扰脑内α-突触核蛋白的表达药物中的应用。
所述金纳米粒复合物在保护脑内多巴胺能神经元免受损伤中的应用/制备保护脑内多巴胺能神经元免受损伤药物中的应用。
所述金纳米粒复合物在恢复/提高长期的运动迟缓/制备恢复/提高长期的运动迟缓药物中的应用。
所述金纳米粒复合物在恢复/提空间记忆能力障碍/制备恢复/提高空间记忆能力障碍药物中的应用。
优选地，神经元免受损伤是由α-突触核蛋白的表达引起的。
优选地，运动迟缓是由α-突触核蛋白的表达症引起的。
优选地，记忆能力障碍是由α-突触核蛋白的表达引起的。
优选地，神经元免受损伤是由帕金森症引起的。
优选地，运动迟缓是由帕金森症引起的。
优选地，记忆能力障碍是由帕金森症引起的。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
通过本发明制备得到的脂质体修饰的金纳米粒复合材料，在解决化学用药和传统转染试剂副作用大的前提下，将pDNA转染到细胞内，干扰α-突触核蛋白的合成，来治疗帕金森小鼠的运动障碍和探索能力障碍，发现其可以通过干扰脑内α-突触核蛋白的表达来改善帕金森小鼠的运动与探索能力，对于帕金森氏症的治疗和行为障碍改善具有重要的意义和应用价值。
附图说明
图1为GNP (pDNA)-Lipo-NGF-DHA合成示意图。
图2为GNP的紫外光谱图。
图3为GNP、GNP (pDNA)、GNP (pDNA)-Lipo、GNP (pDNA)-Lipo-NGF的粒径分布柱状图。pDNA GNP (pDNA) GNP (pDNA)-Lipo
图4为GNP (pDNA)与脂质体复合物的凝胶电泳图。
图5为DHA，GNP (pDNA)-Lipo-NGF，GNP (pDNA)-Lipo-NGF-DHA的红外光谱。
图6为GNP的TEM图（a为GNP，b为GNP (pDNA)-Lipo）。
图7为金纳米粒复合物提高长期PD小鼠SN的TH表达量并抑制α-syn过表达。
图8为金纳米粒复合物改善长期PD小鼠运动迟缓。
图9为金纳米粒复合物改善长期PD小鼠探索能力。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实验动物：6-8周龄C57BL雄性小鼠，体重24 ± 3 g，由中山医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（粤）2016-0029。饲养环境温度25 ± 2℃，12 h 光照/黑暗交替，自由获取饮水和食物，适应7 d后开始实验。
主要试剂与动物：神经生长因子购自广州新特药店；干扰质粒购自上海基凯基因公司；1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）购自Sigma公司，蛋白抗体购自Abcam公司，C57BL/6小鼠购自中山大学实验动物中心。
仪器：发射扫描电镜LEO 1530 VP, Nikon显微镜，透射电镜 磁力搅拌器，HV-85高压灭菌器ZH-ZFT型联合旷场系统，三壁迷宫，；恒温水浴锅等。
实施例1 脂质体修饰的金纳米粒复合物的制备
一、巯基修饰的金纳米粒的制备
取氯金酸固体粉末0.05 g，溶于50 mL纯水中，再加入1%的柠檬酸钠溶液5 mL和20 μL（0.0169g）正十二烷基硫醇。现配硼氢化钠溶液，取100 mL纯水于4℃冰箱中预冷，待温度稳定后称取0.9 g硼氢化钠加入搅拌溶解，4 mL硼氢化钠溶液边搅拌边迅速加入氯金酸溶液中，观察到溶液颜色由浅黄迅速变为橙色。待颜色稳定后停止搅拌，制备得到巯基修饰的金纳米粒GNP，将GNP溶液置于4℃冰箱保存。
二、pDNA吸附的金纳米粒的制备
取GNP溶液900 μL与100 μL的能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒（pDNA）混合，室温下放置16 h。之后1.5 mL/min缓慢滴加pH=6.5的PBS缓冲液2 mL，50 r/min 慢速搅拌不低于10 h后溶液体系即可稳定存在，得到pDNA吸附的金纳米粒GNP (pDNA)。
三、脂质体的制备
取0.0235 g胆固醇和0.0484 g大豆卵磷脂加入至10 mL氯仿中，超声助溶。随后加入螺旋蒸发仪中，恒温30℃减压蒸发至溶液蒸干，转速100 r/min，真空度-0.1MPa。待蒸干形成一层均匀薄膜后停止蒸发，加入10 mL PBS缓冲液(pH=6.5)，将烧瓶置于磁力搅拌器中低速搅拌水化，直到薄膜溶解。最后80W超声处理30 min以降低脂质体粒度，得到脂质体粒Lipo溶液。
四、脂质体包裹金纳米粒的制备
取1 mL上述Lipo溶液与1 mL GNP (pDNA)溶液混合，利用磁力搅拌器中以300 r/min的速度搅拌12 h ，得到GNP (pDNA)-Lipo放入4℃冰箱中储存。
五、复合物表面修饰NGF与DHA
将900 μg的NGF（神经生长因子）溶解在5 mL的PH=6.2～6.8 PBS/DMF (质量比1:4)中，在避光下加入5.81 μg的叠氮苯胺盐酸盐（AAH），冰浴中搅拌反应48 h；然后取1 mL NGF-AAH与6 mL GNP (pDNA)-Lipo混合，混合物在紫外灯下反应10 s，并用超滤管对产物进行纯化，得到GNP (pDNA)-Lipo-NGF。
称取0.1146 g的EDC（（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）0.0007mol），0.0345 g的NHS（N-羟基琥珀酰亚胺 0.0002 mol），加入至100 mL超纯水中，溶解，取1mL EDC/NHS混合液，加入10 μL的DHA（二十二碳六烯酸）常温反应30 min（用EDC/NHS活化其羧基）后，得到EDC/NHS/DHA溶液，再加入GNP (pDNA)-Lipo-NGF溶液0.5 mL进行反应，最后透析除去EDC和NHS以及未反应的DHA得到脂质体修饰的金纳米粒复合物GNP (pDNA)-Lipo-NGF-DHA。
六、结果
通过硼氢化钠还原氯金酸，十二烷基硫醇对金纳米粒进行改性得到带正电的纳米金，通过静电吸附作用吸附带负电的质粒pDNA，并通过卵磷脂与胆固醇脂质体的合成将纳米金包裹，并依次通过光接枝法和EDC/NHS活化羧基法将连接信号分子NGF、识别脑组织和血脑屏障的靶向分子氧化型DHA连接到复合物上，构建纳米金复合物。合成示意图如图1所示。
实施例2 脂质体修饰的金纳米粒复合物的表征
一、紫外光谱检测
（1）实验操作
通过紫外可见分光光度计，在190-900 nm的波长范围内对样品进行扫描，以获得样品在该波长范围内的最大吸收波长。以分散剂水为参比液，3 mL金纳米溶液加入比色皿中，在190-900 nm的范围内进行光谱扫描检测。
（2）实验结果
紫外-可见分光光度法是利用物质的吸收光谱进行光度定性和定量分析。物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量。因此可利用这一性质对金纳米粒子进行定性检测，从而判定金纳米粒子是否成功合成。本实验中在紫外-可见分光光谱仪的190-900 nm波长范围内对样品溶液进行扫描，取3 mL样品溶液加入到光径为10 mm的石英比色皿中，以纯水的光谱为基线，进行光谱扫描。所得结果如图2示，可见529 nm处有特征吸收峰，对比相关文献可知此处应为金纳米粒子的特征吸收峰，因此可基本确定金纳米粒子合成成功。
二、纳米粒度检测
（1）实验操作
将GNP，Liposome，GNP (pDNA)，GNP (pDNA)-Lipo和GNP (pDNA)-Lipo-NGF分别稀释到适当的浓度。然后将以上样品用移液枪分别加入到洁净的样品池里，塞上塞子，放入马尔文Zetaszier Nano-ZS仪器中，调整预热时间为100 s，重复次数为2，进行检测。
（2）实验结果
为了初步评估GNP，Au-pDNA，Au-pDNA-Lipo和GNP (pDNA)-Lipo-NGF的粒度分布情况，本实验采用马尔文Zetaszier Nano-ZS 仪测定了粒子的尺寸分布。测定得结果如图3所示。金纳米粒子粒径主要在20-40 nm，连接pDNA后粒径稍有增大，测得粒径在40-50 nm范围内。脂质体包裹后复合物粒径大小主要集中在80 nm附近，与脂质体的粒径没有明显差异。而接枝NGF后，复合物粒径显著增大至200 nm到300 nm。
三、琼脂糖凝胶电泳
（1）实验操作
称取0.2 g琼脂糖加入至20 mL的TAE(1×)缓冲液中，待琼脂糖溶解后把溶液放置于微波炉中，加热至琼脂糖完全融化；待冷却至50℃左右，加入1 μL GV染料，混匀后倒入胶槽中；待胶完全凝固后，将胶放入电泳槽中，并加入1×TAE缓冲液浸没过胶面；分别取pDNA、GNP(pDNA)和脂质体复合物16 μL，在点样前，各加入4 μL Loading buffer（6×）；然后将20μL的样品加入对应的琼脂糖点样孔中。在120 V的条件下电泳30 min。
（2）实验结果
由于带正电性的纳米载体能够吸附电负性的pDNA。也就是说，带正电荷的载体有很大的能力去完全或者部分地中和电负性的pDNA，从而使pDNA在琼脂糖凝胶上被阻滞。电泳结果如下图4所示，最左侧的条带为标准pDNA，可见到跑出清晰条带。第二道为GNP (pDNA)，图中隐约可见微弱条带，电泳距离较标准pDNA短。认为是pDNA被金纳米粒子吸附阻滞，说明经过修饰后的金纳米粒对pDNA有吸附效果。GNP (pDNA)-Lipo对pDNA表现出明显的吸附效果，电泳条带几乎没有跑动。
四、包封率检测
（1）实验操作
先配置金纳米胶体标准曲线，分别取本实验中合成的金纳米溶液0 μL、300 μL、600 μL、900 μL、1200 μL、1500 μL、1800 μL后，均定容至2 mL。利用紫外光分光光度计分别按顺序测定其在520 nm处的吸光值，制成标准吸光度曲线。另取1 mL脂质体，加水稀释至2 mL。再以该空白脂质体溶液调零后，加入2 mL GNP (pDNA)-Lipo溶液，测出样品在520 nm处的吸光值。得到吸光值后代入标准曲线，即可得出样品中纳米金的浓度，经过计算后可算出包封率。
（2）实验结果
由测得金纳米标准曲线得到回归方程y = 0.0005x + 0.0575(R2 = 0.9967)，其中y为吸光度，x为纳米金用量。测得样品的吸光度为0.342，代入所得回归方程中计算得理论用量为569 μL，而样品中纳米金用量为1500 μL，因此可计算出包封率为62.1%。
五、NGF接枝率
（1）实验操作
由于本实验中NGF用量较少，常规的检测方法灵敏度一般仅能达到1 mg/mL。因此本实验采用紫外吸收法测定NGF浓度。先取GNP (pDNA)-Lipo溶液2 mL加入至光径为10 mm的石英比色皿中，调零之后加入同浓度的GNP (pDNA)-Lipo-NGF溶液2 mL，在紫外分光光度计上直接测量其在280 nm处的吸光值。
（2）实验结果
本实验中采用的是鼠神经生长因子，参考产品说明书上的序列在ExPASy网站上预测其吸光系数。查得其消光系数为19480 M-1 cm-1，溶剂为水，波长为280 nm。吸光系数为1.446，Abs 0.1% (=1 g/L)。样品测得吸光值为0.066。依照其吸光系数 1mg/L的NGF光吸收值为1.446。1 μg/L的NGF的光吸收值为0.001446。可计算得样品中NGF含量为45.64 μg。而实际NGF投用量为180 μg，因此NGF接枝率为25.4%。
六、红外光谱检测
（1）实验操作
分别取适量浓度的DHA、GNP (pDNA)-Lipo-NGF、GNP (pDNA)-Lipo-NGF-DHA进行干燥处理，然后放入研钵中，加入一定量的KBr，研磨均匀使混合物粒度小于2 μm，以免散射光影响，再放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用10 MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定。
（2）实验结果
为了证明DHA成功地连接至复合物上，利用傅立叶转换红外光谱仪（Vector-33，德国Bruker公司）进行表征。红外结果如图5所示，3483 cm-1的吸收峰为O-H键的伸缩振动；3018cm-1的吸收峰为烯烃的C-H伸缩振动；2936 cm-1为烷烃的C-H 伸缩振动；1710 cm-1是羧酸的C=O 伸缩振动1642 cm-1是不饱和脂肪酸的C=C的伸缩振动；1387 cm-1为烷烃的C-H的弯曲振动；1049 cm-1为烯烃的C-H的弯曲振动；713 cm-1为顺式烯烃上C-H 的变形振动，是DHA的一个特征峰。样品的红外光谱数据说明结构中存在C=C酯键及顺式碳碳双键等基团。在GNP(pDNA)-Lipo-NGF中，主要红外检测的主要检测对象是脂质体，因为其浓度较高，而同样有较高浓度的金纳米粒子对红外基本没有影响。本实验中脂质体的的构成成分是卵磷脂和胆固醇，脂质体的合成没有发生化学变化，红外检测实质是对这两种化合物进行的。3475 cm-1为胆固醇所带的O-H键的伸缩振动；2928 cm-1为烷烃的C-H 伸缩振动；1665 cm-1应为酯类的C=C的伸缩振动。连接后的GNP (pDNA)-Lipo-NGF-DHA的红外光谱中，可见C=O、C=C吸收峰的强度大大提高，而且在1300-400 cm-1的指纹区内出现了与DHA峰形相似的区段，因此可基本认为DHA成功连接至GNP (pDNA)-Lipo-NGF上。
七、透射电镜
（1）实验操作
将GNP与GNP (pDNA)-Lipo分别加入至超纯水中，用枪头将溶液滴在透射电镜专用铜网的石蜡膜上，待溶剂挥发出去，用透射电镜（TEM，JEM-2100HR 显微镜，200 keV 电子动能）测定以上纳米粒的形貌。
（2）实验结果
为了进一步地评估GNP的粒度分布和形态特征，本实验用透射电镜（TEM，JEM-2100HR显微镜，200keV 电子动能）进行测定。结果如图6所示，可见大部分金粒子尺度在5-15 nm左右，部分团聚成20 nm左右；金粒子基本形状为球形，部分团聚后形态有一定变化。GNP(pDNA)-Lipo粒径在100 nm左右，可见脂质体内包裹有金纳米粒。
实施例3 金纳米粒复合物对PD小鼠的治疗效果
一、PD小鼠模型建立
（1）实验方法
利用MPTP建立PD小鼠模型，选用腹腔注射MPTP溶液（30 mg/kg，1周注射2次，共10次）的方式，空白组每天相同时间点腹腔注射同体积的生理盐水。通过免疫印迹的方法，检测小鼠黑质内TH的表达量，
（2）实验结果
金纳米粒复合物提高PD小鼠脑内TH表达量，抑制α-syn过表达。如图7检测小鼠SN内TH和α-syn蛋白表达量时，我们发现长期MPTP处理导致黑质内的TH表达量明显减少，表明小鼠脑内的多巴胺能神经受损，另外α-syn的表达量却急剧增多，再次表明小鼠出现了PD的病理特征。而在我们给予小鼠AuNPs处理后发现，AuNPs可以显著性地提高PD小鼠黑质内TH的表达量，降低α-syn的过度表达，表明AuNPs可以保护长期PD小鼠的脑内多巴胺能神经元免受损伤。
二、金纳米粒复合物改善长期PD小鼠运动迟缓
（1）实验方法
旷场实验（open field test, OFT）用来评价实验动物在新异环境中的自主行为与紧张度。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集处理系统两部分组成，由安徽正华仪器有限公司提供。旷场反应箱高50 cm，底边长100 cm，内壁及底部均为白色，底面平均分为4个50cm×50 cm的方格，正上方2 m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。旷场光照为人工照明，所用软件为实验平台中的自发活动，4鼠模式。分析软件将每一方格自动平分为九宫格并实时追踪动物轨迹。实验需在安静环境下进行，将动物从底面中心放入，进行15min的测试。每批实验结束后，喷洒70%的酒精清理箱底与内壁，并去除气味，待酒精挥发后再进行下一组实验。
（2）实验结果
金纳米粒复合物改善长期PD小鼠运动迟缓。如图8所示，长期MPTP处理后，小鼠的运动速度减慢、总路程减少，说明小鼠出现了运动障碍，而停留在中央区域的时间以及中央区域的路程并没有显著性变化，表明小鼠并没有出现焦虑状态。给予AuNPs治疗后，小鼠的运动速度明显加快，总路程明显增多，说明AuNPs可以改善长期PD小鼠的运动迟缓。
三、金纳米粒复合物改善长期PD小鼠探索能力
（1）实验方法
自发交替行为实验（Spontaneous alternation behavior, SAB）用来评估实验动物对新异环境的探索能力和空间工作记忆。测试全程保持安静和黑暗。利用Y-maze迷宫装置进行自发交替评估空间记忆测试。正式测试前用70%的酒精溶液清洁Y-maze迷宫，待酒精味散去，并明确标记迷宫外侧三臂为“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”。正式测试前，小鼠在原鼠笼进行30 min的暗适应。将小鼠放进Y-maze迷宫的任一壁中，闭合各臂上方挡板，开始观察记录小鼠在Y-maze迷宫中的活动情况。观察员在保证能看清小鼠轨迹的前提尽可能远离迷宫。每只鼠测试一次，每次进行10 min，记录小鼠每分钟进入不同迷宫区域的顺序。统计小鼠每分钟的进臂次数、正确进臂次数和正确率，并统计总进臂次数及总平均正确率。
（2）实验结果
金纳米粒复合物改善长期PD小鼠探索能力。如图9所示，长期MPTP处理导致小鼠总进臂次数明显减少，而AuNPs明显可以改善这种探索能力的减弱；而在评估小鼠空间记忆能力后，结果显示，MPTP导致小鼠空间记忆能力出现障碍，但是AuNPs能改善这种现象。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种脂质体修饰的金纳米粒复合物及其在治疗帕金森氏症方面的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 423
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggatgtat tcatgaaagg actttcaaag gccaaggagg gagttgtggc tgctgctgag 60
aaaaccaaac agggtgtggc agaagcagca ggaaagacaa aagagggtgt tctctatgta 120
ggctccaaaa ccaaggaggg agtggtgcat ggtgtggcaa cagtggctga gaagaccaaa 180
gagcaagtga caaatgttgg aggagcagtg gtgacgggtg tgacagcagt agcccagaag 240
acagtggagg gagcagggag cattgcagca gccactggct ttgtcaaaaa ggaccagttg 300
ggcaagaatg aagaaggagc cccacaggaa ggaattctgg aagatatgcc tgtggatcct 360
gacaatgagg cttatgaaat gccttctgag gaagggtatc aagactacga acctgaagcc 420
taa 423

Claims (10)

1.一种脂质体修饰的金纳米粒复合物，其特征在于，所述金纳米粒复合物为脂质体包裹的吸附有能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒的金纳米粒子，并且表面修饰神经生长因子和二十二碳六烯酸。
2.权利要求1所述的金纳米粒复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 制备得到巯基修饰的金纳米粒GNP；
S2. 用能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA吸附在GNP表面，得到GNP (pDNA)；
S3. 制备脂质体Lipo；
S4. 制备脂质体Lipo包裹的金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo；
S5. 在GNP(pDNA)-Lipo表面修饰神经生长因子NGF和二十二碳六烯酸DHA得到金纳米粒复合物GNP(pDNA)-Lipo-NGF- DHA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体操作为：用氯金酸的水溶液、柠檬酸钠的水溶液和正十二烷基硫醇混合，得到混合溶液1；将混合溶液1和硼氢化钠水溶液混合反应溶液颜色变为橙色，制备得到GNP。
4. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2的具体操作为：GNP溶液与能够干扰α-突触核蛋白合成的质粒DNA溶液混合，得到混合溶液2，室温放置；缓慢滴加PBS缓冲液，搅拌，得到GNP (pDNA)。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3的具体操作为：胆固醇和卵磷脂溶于有机溶剂，蒸干溶剂，加入PBS缓冲液，溶解，超声处理得到脂质体Lipo。
6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4的具体操作为：Lipo溶液与GNP (pDNA)溶液混合，搅拌，得到制备脂质体包裹的金纳米粒GNP(pDNA)-Lipo。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5的具体操作为：依次通过光接枝法和EDC/NHS活化羧基法将神经生长因子和二十二碳六烯酸连接到复合物GNP(pDNA)-Lipo表面。
8.权利要求2到7任一所述制备方法制备得到的脂质体修饰的金纳米粒复合物。
9.权利要求1或8所述金纳米粒复合物在制备帕金森氏症治疗药物中的应用；在制备干扰脑内α-突触核蛋白的表达药物中的应用。
10.权利要求1或8所述金纳米粒复合物在制备保护脑内多巴胺能神经元免受损伤药物中的应用；在制备恢复/提高长期的运动迟缓药物中的应用；在制备恢复/提高空间记忆能力障碍药物中的应用。
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