CN108498461A - 金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种金纳米‑脂质体复合纳米颗粒，所述纳米颗粒为由脂质体囊泡包裹的金纳米颗粒，所述脂质体囊泡的表面修饰有二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇，所述金纳米颗粒表面修饰有质粒和穿膜肽，所述脂质体囊泡由二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3‑二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇组成。本发明还提供了所述金纳米‑脂质体复合纳米颗粒的制备方法及其包括所述金纳米‑脂质体复合纳米颗粒的一种药物组合物。本发明提供的金纳米‑脂质体复合纳米颗粒作为载体具有较高的转染效果，本发明提供的药物组合物对于多种肿瘤具有较好的治疗效果。

Description

金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域。具体而言，本发明提供了一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用。
背景技术
目前，在多种肿瘤的基因治疗中，常用载体主要有病毒载体和非病毒载体。虽然病毒载体展现了优秀的基因转染效率，但是它们可能引发突变和其它致癌作用。再者，病毒载体的重复使用可能诱发免疫缺失。而常用的非病毒载体包括聚合物，纳米颗粒(磁性纳米粒子、金纳米颗粒、具有不同表面修饰的碳纳米颗粒)和商业试剂(Lipofectamine2000,Lipofectamine3000)等，转染效率较低，不能对癌症起到很好的基因治疗效果。而目前金纳米颗粒的使用很大程度的用于肿瘤的光热治疗，在基因治疗方面的应用也仅用于载体。
CRISPR/Cas9系统是一个多功能的基因编辑平台，在治疗具有挑战性的疾病(如癌症)时有潜在的优势。但由于常用的Cas9蛋白尺寸较大，目前的常用载体很难对其进行高效的递送，限制了其在基础研究和治疗的应用。
因此，寻找一种合适的载体将治疗肿瘤的药物(如CRISPR/Cas9系统)高效地递送到肿瘤病灶，就显得尤为重要。
发明内容
因此，基于上述已有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用。
针对上述发明目的，本发明是通过下述技术方案实现的：
本发明提供一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒为由脂质体囊泡包裹的金纳米颗粒，所述脂质体囊泡的表面修饰有二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)，所述金纳米颗粒表面修饰有穿膜肽和质粒，所述脂质体囊泡由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵(DOTAP)和胆固醇组成。
优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述穿膜肽为HIV-1-transactivator转录肽。更优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒的粒径为10～20nm。
再优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述金纳米颗粒和所述质粒的摩尔比为0.1～1000：0.1～10000000，优选为0.1～100：1～100000，更优选为0.1～10:5000～100000，还优选为1～1000：50000。
还优选地，根据前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其中，所述脂质体囊泡中的二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比为0.1～4：0.1～8：0.1～9，优选为0.2～4：0.1～5：0.1～6。
本发明提供一种前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法，其中，所述方法包括：(1)按照配比，将穿膜肽，质粒与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液，(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液，(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒。优选地，步骤(1)、(2)的静止时间和/或(3)的混合时间为15-30分钟。其中，步骤(1)中穿膜肽、质粒与金纳米颗粒可在水、PBS或葡萄糖溶液中进行混合。步骤(3)中所述混合温度可为55℃。
优选地，根据前述的制备方法，其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，(b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水、PBS或葡萄糖，(d)超声至形成所述脂质体囊泡。优选地，步骤(b)中的旋转蒸发温度为30-35℃。
本发明提供一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括治疗肿瘤的药物和前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒。优选地，所述治疗肿瘤的药物选自以下的一种或多种：核苷酸、核苷酸衍生物、核酸、核酸衍生物、多肽和蛋白。其中，所述金纳米-脂质体复合纳米颗粒可作为所述药物的载体。
优选地，根据前述的药物组合物，其中，
所述治疗肿瘤的药物包括核酸时，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示或如SEQ ID NO：1所示的任意一种核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列，优选地，所述核酸选自脱氧核糖核酸、小干扰核糖核酸和导向核糖核酸中的一种或多种；
所述治疗肿瘤的药物包括蛋白时，所述蛋白为Cas9。
在一些实施方案中，在所述药物组合物中，所述治疗肿瘤的药物为CRISPR/Cas9系统。其中，所述CRISPR/Cas9系统中sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，可以促进细胞凋亡(Gen Bank id:568815582:23678822-23690367)。
本发明提供前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒或前述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药品或医疗产品中的应用。优选地，所述肿瘤为黑色素瘤、前列腺癌或乳腺癌。
在采用前述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体的转染过程中，可以采用激光照射的方法提高细胞摄入率和转染效率。具体地，所述激光照射的时间可以为1～20分钟，所述激光照射的强度可以为10-100mW～24-48W/cm2，激光器为500-540nm。
本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体具有较高的转染效果。通过采用所述金纳米-脂质体复合纳米颗粒，在不需要任何其他转染试剂的情况下，可以高效地将CRISPR/Cas9系统递送到细胞内，通过激光照射，提高了细胞摄入率和转染效率，从而达到多种肿瘤的基因治疗效果。本发明提供的药物组合物对于多种肿瘤具有较好的治疗效果。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备以及治疗流程；
图2示出了实施例1所制备的纳米颗粒；其中，附图标记A为所述纳米颗粒的结构，附图标记B为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1：10制备的纳米颗粒；附图标记C为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1000：1000制备的纳米颗粒。
图3示出了实施例1所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒作为载体对黑色素瘤的治疗；
图4示出了在不同照射时间和激光强度下，实施例8制备的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的体外转染效果；
附图标记说明：
1、金纳米颗粒；2、穿膜肽；3、质粒；4、脂质体囊泡。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例中，除具体指明的试验材料、条件以及操作方法外，实施例中所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的。因此，本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：十六烷基三甲基溴化铵CTAB，氯金酸，硼氢化钠，硝酸银，硫酸，抗坏血酸，二油酰磷脂酰乙醇胺，2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)，氯仿，甲醇，购自上海西格玛奥德里奇；
sgPLK-1a质粒，穿膜肽HIV-1-transactivator转录肽：唯尚立德。
实施例1：
本实施例用于说明本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法。
1.金纳米颗粒的制备
通过种子生长法制备得到金纳米颗粒分散液的过程如下：
(1)金种制备
取十六烷基三甲基溴化铵CTAB溶液，搅拌条件下加入氯金酸(HAuCl4)的水溶液后，加入硼氢化钠(NaBH4)溶液，搅拌3min，得到金种备用；
其中，CTAB的物质的量：氯金酸的物质的量：硼氢化钠的物质的量＝7500:24.8:6；
(2)生长液制备
取CTAB溶液，加入氯金酸(HAuCl4)的水溶液、硝酸银水溶液、硫酸和抗坏血酸水溶液；
其中，CTAB的物质的量：氯金酸的物质的量：硝酸银的物质的量＝5.5×104：278.3：1.3；
CTAB的物质的量：硫酸的物质的量：抗坏血酸的物质的量＝103：102：5.5；
(3)金纳米颗粒分散液的制备
取步骤1制备的金种，加入到步骤2制备的生长液中，在30℃下生长12～15h，得到金纳米颗粒分散液。
2.金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备
二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比为1：1：0.8。
所述制备方法具体如下：
(1)按照配比，将质粒，金纳米颗粒与穿膜肽(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1～1000：10～1000)混合后静止获得第一混合液，静止15-30分钟，
(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡(摩尔比1：1000-200：1000)混合后静止获得第二混合液，静止15-30分钟，(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(摩尔比1000：1-200：1)混合获得所述脂质体纳米颗粒，55℃下混合15-30分钟。
其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
(b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，
(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
(d)超声至形成所述脂质体囊泡。
附图2示出了实施例1所制备的纳米颗粒；其中，附图标记A为所述纳米颗粒的结构，附图标记B为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1：10制备的纳米颗粒；附图标记C为质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比50000：1000：1000制备的纳米颗粒。
实施例2～10
本实施例用于说明本发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法。
采用实施例1所述制备方法制备所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒。
其中，金纳米颗粒、质粒和穿膜肽摩尔比以及二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比如下表：
试验例1：
本试验例用于说明发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒治疗黑色素瘤。
采用实施例11制备的复合纳米颗粒进行试验。
具体实验方法如下：
(1)按照配比(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比30000：1：100)，将质粒，穿膜肽与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液，静止15-30分钟，
(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液(摩尔比1：5)，静止15-30分钟，
(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒(摩尔比800：1)，55℃下混合15-30分钟。
其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
(b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，
(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
(d)超声至形成所述脂质体囊泡。
试验方法：实验采用雌性裸鼠(年龄6-8周，重量18-20g)，植入黑色素瘤细胞后1-2周，采用肿瘤原位注射的方式。实验组分为8组，每组四只。给药16天，每两天给药一次，每只每次注射10μg。注射后3小时激光照射20分钟。
试验结果如图3，本发明所提供方法可以达到较好的转染效果，能更好的起到对肿瘤的治疗效果。肿瘤的体积和重量，与对照组相比，有明显的降低。
试验例2：
本试验例用于说明发明提供的金纳米-脂质体复合纳米颗粒使用不同照射时间和激光强度的体外转染对比。
采用实施例12制备的复合纳米颗粒进行试验。
具体实验方法如下：
(1)按照配比，将质粒，穿膜肽与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液(质粒，金纳米颗粒与穿膜肽摩尔比10000：1：80)，静止15-30分钟，
(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液(摩尔比2：5)，静止15-30分钟，
(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒(摩尔比200：1)，55℃下混合15-30分钟。
其中，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
(b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，旋转蒸发温度为30-35℃，
(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水，
(d)超声至形成所述脂质体囊泡。
实验分别采用sgPLK-1a的质粒。514nm激光器照射不同时间以及不同功率之后，培养箱中转染3小时，质粒浓度1μg/mL。
试验结果如图4，从试验结果可见，与没有激光照射的实验组相比，经过激光照射，可以提高转染效率。
尽管在此，已对本发明进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，所属领域技术人员可进行各个条件的适当变化。可以理解的是，本发明不限于所述实施方案概括和具体实例，其权利归于权利要求的范围，并包括所述每个因素的等同替换。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 金纳米-脂质体复合纳米颗粒及其药物组合物和应用
<130> YZDI-160075
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11546
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 1
agtggcgcgc aggcttttgt aacgttccca gcgccgcgtt tgaattcggg gaggagcgga 60
gcggtgcgga ggctctgctc ggatcgaggt ctgcagcgca gcttcgggag catgagtgct 120
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ggagttgcag ctcccggagc tccggcggcg gctccaccgg cgaaagagat cccggaggtc 240
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agttggagcc agacttcggg ccttccgggg gagatacgag tcaggaaagg gatctggtgc 960
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agtaggagaa ggggtgctgc gaatggttgt ggacagtgtt aaggcagggt ccagatgccg 1080
ctgtgctgga gaaggaatgg ggtgggggca tagggaagga gagaaaccca ccaagacccc 1140
tctttcatcc cttgggagtc cagagtccag tcctgtgctt cctttgcctg gtaaccctct 1200
cccttcccca ccggcctcaa tccacctccc catccctcct gccctctcct tcccacccac 1260
agtctctcct ggagctgcac aagaggagga aagccctgac tgagcctgag gcccgatact 1320
acctacggca aattgtgctt ggctgccagt acctgcaccg aaaccgagtt attcatcgag 1380
acctcaagct gggcaacctt ttcctgaatg aagatctgga ggtgaaaata ggtgagttgc 1440
tgagcctgca ggggtgcttg acatcactac aagaggctgg aatttggagg aggctgggag 1500
aaaggaagga gacaacccac aagtcagtat cttgcctaca gatgcattat ttttttgtgc 1560
cccaatgcaa tatttttttt ttacaaagaa tttgaatttg tttttatttt ttaaattgga 1620
aggtttgatt gaacaaaaag tttgattcag aactcctttt aaacaggtga aagcttcagt 1680
aatacgagga cagcattttc ttagggcagc cctttgctgg gctggaaaac agctgtcccc 1740
ttcagacttc tttgccacag tctctactcc tccctattct tcacagactt gccaagtctt 1800
ggaggttaac ttgcttgatc cttgaaggca ttggagtttt actatccctg tcagttcctg 1860
tttcaaagca tagccccttt ctaaaaggag gggtgagaag tgtcactgga ggcacctccc 1920
tggtgtcagc atgggaggaa gattcctggg caagccttgc tacatacaag gagcagaggc 1980
ttgtgggatc agatggccct ggttctggat ggtcaaacct taactagcct tctgcattga 2040
cagatgtcag aggctggcat ctaagtacca actcttcctc cctctgtccc aggggatttt 2100
ggactggcaa ccaaagtcga atatgacggg gagaggaaga agaccctgtg tgggactcct 2160
aattacatag ctcccgaggt gctgagcaag aaagggcaca gtttcgaggt ggatgtgtgg 2220
tccattgggt gtatcatgta agttgggagt tgtctctgga ccaacctggt ctcagcaggg 2280
gcaactttgg gacatcctac ctggctgacc ttttctgtgg acctttcggc ctgctttaca 2340
gaaagcctac tccaagggac aagtcatccc caaacaaagc ctaattgtca tatctttccc 2400
tgtcactggt gtatcctgtc ggatttctgc agcctaggtc atgggtacag cggaggagga 2460
ggagggagag tctccacaac cttactgtag tcctttgcta gagttgtcca cagggcagca 2520
tcaccatcat ctgggaactt gtatacacaa tctcaggacc cagactactt actggatcag 2580
aatctggatt tttaacaagg tcccttggtg attcccttgc acaataaggt cttaaacacc 2640
gatgagcatt agcatggtgg gggaaattag gccaggagtt acagatggaa agatgatgtg 2700
ccagtggtct gtctggatta agaccatcag cagcggttgg tggcaggcag aggcttgggc 2760
cttttcaggt gttatctttc ttgttttggg cctaggtact ggagagttag aaatgagttg 2820
tagcaatggc tttcatacgt ctttgcagtg gggttttttc aaatgaaaac ttgaagactt 2880
aagtacagaa ctgctaaagg tggagctgct tctgtaagcg caggtagccc tttgacctgt 2940
tttgcatgac aggcagcatc tgaggccctt gcacagagtc ctagatgacc acaggctata 3000
gctaaaaaat cactggccct taagaatcct ggtctcacca tgtgtattct gctgagggct 3060
tattctagcc aatgtcatgg cttctggggc tgctcagtgg acttagggat tgtcttcagg 3120
ggccccagag ttagagtgag tgtccagagg atgcctgacc tttgttctga ccctgagatg 3180
atttctctca tgtctgggtt gtggctggga gactggtgcc aaatcctacc ttgtgcttac 3240
aggtatacct tgttagtggg caaaccacct tttgagactt cttgcctaaa agagacctac 3300
ctccggatca agaagaatga atacagtatt cccaaggtga ctaatgatgc tttaagttta 3360
catttatttt gttttcccca gaagctgttt atggagccca gcaatatcct aggaccagaa 3420
ataggtctat cccacctcta aggtagccac agagcttgag agggcctgtg tctgaaattg 3480
catacagaac ttgacatgta tgtgcacata agcatttttt ctagggggag agagttggca 3540
gattctcaag agattgggta acccaaaagt tgtgtaaaaa gcaaaaaaca aaggaggtag 3600
gaaggagtag gaggcaaaag tgcttaatct ttagaaatgg tttatcttaa ttcaaatgga 3660
ttctgccact tagcgagatc acattgggca aatggcctgc atcttttttt tttttttttt 3720
tatttgaggt ggagttttgc tcttgttgcc cagtgcagtg gcatgatctt gactcactgc 3780
aacctccacc tcccaggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt 3840
acaggcaccc accacctcgc ctggcttttt tttttttttt ttgtattttt agtagagacg 3900
gggtttcacc atgttggcca ggctggtctc gaactcctga cctcaggtga tccacccgcc 3960
ttggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtgagccacc atacccagcc tggcctgcat 4020
cttctgaacc atagtttcca tatataaagt ggagttcctg ccttggagca cctcacagag 4080
tgccttgcat gtggtgagtg ctctcagaat tatgaatcac tgtgaatccc agggcttcct 4140
aatggcatag ttgtgtgcat tttctttttt tttttttttt tttttttgag atggagtctc 4200
gctctgtcgc ccaggctgga atgcagtggt acaatctcgg ctcactgcaa gctctgcctc 4260
ccaggttcat ggcattctcc cgcctcagcc tcctgagtag ctggaactac aggcaccagc 4320
caccatgccc ggcttctttt ttctgtattt gtggtagaga cagggtttga ccgtgttagc 4380
caggatggtc tcgatctcct gaccttgtga tccacctgct tcggactccc taagtgctga 4440
gattacaggc gtgagccacc gcgcccggcc atggtgtgca ttttcacaac caccaacaga 4500
aatacattta aaggaatagc tggttcctgc agaagcctag cacacagcca gtttgaagtg 4560
tagtgtcctt gtgtgaagcc aggaggcctg tcaccataag gacagacata gtaaatccat 4620
cacaaagtgt cagttcactg tcagagacag catggaatca agccagctag acaaggcctt 4680
caccctctct gtgcctcact ttcctcctct gtgaaaaagg gatgataata gatccccacc 4740
ccttagatga gttggtgagg gctaagtgag ctaaacacag gagtgcttag aatgctttcc 4800
tggcacatag tgagtgctag gaaagtgagt tggtgttcgg ccacagtcca ttgacccttc 4860
tgtcaatggt gctcagtaaa gctgacagtg gagaacttgg cattgaacca agttgtgaac 4920
cactgacctg tggtgtattt gagactgggg gctgcatgtg ggctggggac ctgcagctcc 4980
tttgaggccg tactgtactc caggtcccct tcacattctg cttatggctg tccctctctc 5040
tgccccagca catcaacccc gtggccgcct ccctcatcca gaagatgctt cagacagatc 5100
ccactgcccg cccaaccatt aacgagctgc ttaatgacga gttctttact tctggctata 5160
tccctgcccg tctccccatc acctgcctga ccattccacc aaggttttcg attgctccca 5220
gcagcctgga ccccagcaac cggaagcccc tcacagtcct caataaaggt acaacaaggg 5280
tctgggtaag agagcagacc ccccagagaa agcccaggtt gtaggggtgt gtgcagctta 5340
gtccctggcc ctgagagctc aggtgtggag taggacaggc ctctgtcctt caatccgtgg 5400
ttccaatgcc catctgcttc tcggccctgc caggaaagac tgaccttacc atggctggat 5460
aaacgtacca tgcccaagaa gaagaaaatg gattgaatgc caagcctgaa aaattctttc 5520
aaatcacttt aattaattta attttttgga gacagggtct ctcctctatt ttccaggttg 5580
gagtgcagag gcacaatcac agctcactgc agctttcaac tctagggctc aattgatcct 5640
cccatctcag cctcccaagt agctgggact gtcaggcatg caccaccatg cctggctgac 5700
ttttctaatt tttgtagaga cagtgttttg ccatgttgcc caggctggtc ttggaactcc 5760
tgggctcaag cgatcctttc acctccacca aagtgttggg atgacaggca tgagctgcta 5820
catctggcct ttaaaaaaat ttctaacact ttttcatgat tcattgaaaa acataaaaat 5880
ttcctttttt ttgtggcgtg atcccggctc actgcaagct ctgcctcccg ggttcacgcc 5940
gttctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggactacagg cgcccaccac catgcccggc 6000
tgtttttttg tatcttttag tagagacggg gtttcactgt gttagccagg atggtctcaa 6060
tctcctgacc tcgtgatccg cctgcctcgg cctcccaaag ggctgagatt acaggcgtga 6120
accaccaggc ccggcctttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttga 6180
gacagggtct ggctctgtct cctaggctgg aggggagtgg tatgatctcg atttcactaa 6240
ggatacatag ttttaaaaag tcacttgaaa tacttttttt ctctgtggat atatcaccaa 6300
tttgatgtac aacttcagtt catttttcag ttttcaattt ttaggtattg gtttttctta 6360
aacttcattt tggaataatt ttaggcttat acagaaaagt tgcaacaaca acaaaaaact 6420
ccccagagtt cctacatacc ttgcagcaat tattacagtg gaattttttt tgagacaggt 6480
ctcaggactt gctgtcaccc aggctggaat gcagtggctc actcatagct tactgcagcc 6540
ccaacatcct gggctcaaac agtccccctg ccttaccctc cagagtagct aggactacag 6600
gcatgtgcca ccatacccag ctaattaaaa aatttttttc tttgggaggc cgaggtgggt 6660
ggattgcccg agctcaggag ttcgagatca gcctgggcaa catggcgaaa cgctgtctct 6720
actaaaaata caaaagacta gccgggcgtg gtggtgtgca cctgtaatct cagctactcg 6780
ggacactgag gcacaagaat cacttgaacc tggaaggcgg aggttgcagt gagccgaggt 6840
ctcaccactg cactccagcc tgggcaacag agcgagactc tgtctcaaaa aaaaaaaaaa 6900
attttttttt tgtaaagaca agatctcact atgtcgacca ggcttatctc aaactcctgc 6960
cctcaagtga tcctcctcgg cctcccaaag tgttaggatt tacaggtgtg agccactgtg 7020
ccctgcctag aatgatgttc taatggtaat ttttcttttc ctcacttttt ttgcatttaa 7080
taattggaat tcttctgtaa ggaagagctg ttccttctct ccgattgatt tatttatttg 7140
gttatgtctg aaatagactc atggatattt ttattctttg ggctatattt taaaggatta 7200
cttatttctc tgcttttatt tattttttta aatttgagac agggtcttgc tctgtctccc 7260
gggctggagt gcagtggcac agtcgtacct cacagtagct ttgatctcct gggctcaagt 7320
gatcctccag cctcagcctc ccaagtagtt gagactttag gcatgtgcca ccgcgtctga 7380
ccaattttta aatttttggt agagatgagg tcttgcccac actggtctca aactcctgag 7440
ctcaagtgat cctcctgcct cagactccta ctttttttct ttcagtttta attttttata 7500
tagcatttta aaaacttaag gaaattttca gttacccgaa ggtggagaga actgtatgat 7560
gagtcccatg tttcatctat ttttactagt tatcaacatt tggacagact gttttattta 7620
ttccagcctc ctgccttttt tgttaccggt gttttaaaaa attattattt actatttatt 7680
attatttatt tgagacattc ttgctttgtt gcccaggctg gagtgctgtg gcaagatcat 7740
ggctcactgc agcctccacc tcctgcgttc aagtgactct cccacctcag cctcccaagt 7800
agctaggact acaggtgtgc caccatgtcc agctagtttc tgtattttta gtaaagacag 7860
ggttttgcca tgttgctcag gctggtctca aactcctgag ctcaaacaat ctacctgcct 7920
cggtctctca tagtgttggg attacaagtg tgagccactg ggcctggcct tgctggagtg 7980
tttaaagcaa atccctaata tcttattatt tcatacccaa gtccctatca tgacatcgtt 8040
ttttaattga aaacttaaac attttatatt atacaaggag aattagcaca tggtggtggg 8100
ggaataaata aataaggaaa aagacaataa gaataatctg tgtttctact gcccagatat 8160
aatcagcgtt aaaatttcat gttatctttt caagcttttt tggttataaa taagcatata 8220
aagcaaattt tggggtggaa aaaaatttct tgtgttttta tttaaatgcc tactgaatcc 8280
attctgtgga tgaactgaac tactcagccc ttccatctgc ctggatgctg aagatgcttt 8340
ccattctttg ctcaaagctg ggcagctctg agctgctggt gccttcaagc tgtttgcctg 8400
agtggcaggt catcctgcag ggccacaccg ttgggtcaga ggccacggct tctgaagatc 8460
tgttgcctca cagtgagcac tatgtgcctg tcacctgagc atggcagctg ctgctctagt 8520
aaccaggcac tgattcagtt tccccaaagc agtggtagct aagagaattt ttctttcgga 8580
agagtttcag ctgtggcagg ggagtcccgt gcccttccca acgcccctgt ttttgtcacc 8640
ttcctaggct tggagaaccc cctgcctgag cgtccccggg aaaaagaaga accagtggtt 8700
cgagagacag gtgaggtggt cgactgccac ctcagtgaca tgctgcagca gctgcacagt 8760
gtcaatgcct ccaagccctc ggagcgtggg ctggtcaggc aaggtgggta ctgcggggcc 8820
ctgggcgggg caggattgct tggggcatct ggaaaaggca ggaggaggct tggccaacaa 8880
agcactggtg acttgttcag gccctgtctg cataggacca ttggtttccc catttcctga 8940
tatccaaggc cctgcttccg tggctcctgc cgccttttct gatccgtctt ttttactcta 9000
gcacctcgat gtgccacctt catacgctgt ttcttttgct cagtaagttc ctattgtatc 9060
ttcaagaccc ttgaaataac agacccagat gtactgcagc ctcagggctt tctccctggt 9120
cctggcacga aagcacttct tccagacacc acatggctca cactgtggcc tccttcaagt 9180
gtctgctcca gtgtcagctc tgtgagcatc tccctggccc ctctgctggt gcttctcatc 9240
ctcttgccca ctgcatagtt ctccataaca cttctcaccc aacatagtcc aacatgtcct 9300
tctttgttta ttggatttaa attaaggggt ttgttgcatg cactgaacgt aacattttga 9360
tgtgtttgca actggcttct gtcttcacag tttcttaatt actccaaact ggaaaactag 9420
atgcctctga ctcttaccat gatagaagtc actgatattt tgcccatact taaattgatt 9480
agtctttgcc cctacaacca cagtgtaagc tccgtggagg ctggggtttt gtctgttgct 9540
cactgaacct gcaacagtgc ctggcacggt aggccttcag taaatgggtc agtggaatga 9600
aggagtgagt ggaacttggt gcgctgtgct gagactttct ctgcagagat atctgtgctg 9660
ctgcttgtct gagcctgctg gcagcagagg ccctgctttg ctcttctctg gggccctagg 9720
cctctcaact gagcccaggt ggggtgccca gcaggcttcc ctgttccctg gtgtgggcca 9780
catgtgtgga gcagagggga agaggctggt cctgaccaac taactgtctg tctgtttctg 9840
tctcagagga ggctgaggat cctgcctgca tccccatctt ctgggtcagc aagtgggtgg 9900
actattcgga caagtacggc cttggtaggt ttcttccaga acaggtgggt gactcaggca 9960
cagccaggtg accttttcag ttgttacaga ctctggcctt tttgagctcc caggtactgt 10020
tctcagtgcc ctcctctctc catcccaggc ctcccagttc cagctcccag tgctccctga 10080
ctccccagct tttttttttt ccagagacag ggtcctgctc tgtagcccag gctggagtgc 10140
agtggcacaa tcatggctca ctgcagcctc aaactcccag gcccctaagt agctgtgact 10200
acaggcgtgc accattatgc tcagctaatt tttaaaatat tttgtagaga tggggtctca 10260
ttacgttgcc caggctggtc tcaaactcct gggctcaaac aatcctcctc cctcagcctc 10320
ccaaagtgct ggaatcacag gcatgtgcca ccacgcccgg tcccactccc cactttctat 10380
tccccctttc tgagacctct ctccaccgat ccctagggta tcagctctgt gataacagcg 10440
tgggggtgct cttcaatgac tcaacacgcc tcatcctcta caatgatggt gacagcctgc 10500
agtacataga gcgtgacggc actgagtcct acctcaccgt gagttcccat cccaactcct 10560
tgatgaagaa ggtgagtgcc gtccggccca tggggggtgg tgttgcagaa gtgggacctg 10620
tgctggagga tcagactcta attctggaac cccttaccta cttttcatcc agatcaccct 10680
ccttaaatat ttccgcaatt acatgagcga gcacttgctg aaggcaggtg ccaacatcac 10740
gccgcgcgaa ggtgatgagc tcgcccggct gccctaccta cggacctggt tccgcacccg 10800
cagcgccatc atcctgcacc tcagcaacgg cagcgtgcag atcaacttct tccaggtgag 10860
ctggaggtca ccaggcgcag gagagagctg gggtaggctc cgcatgcctg gcagtggccc 10920
atgtgggttg aatgtggagt gagcggctca ggtacctata acctgttgtg tcttccctct 10980
actccctaac atacactggc ctctgggatc gccaacccct gctgctcttc tcttgcagga 11040
tcacaccaag ctcatcttgt gcccactgat ggcagccgtg acctacatcg acgagaagcg 11100
ggacttccgc acataccgcc tgagtctcct ggaggagtac ggctgctgca aggagctggc 11160
cagccggctc cgctacgccc gcactatggt ggacaagctg ctgagctcac gctcggccag 11220
caaccgtctc aaggcctcct aatagctgcc ctcccctccg gactggtgcc ctcctcactc 11280
ccacctgcat ctggggccca tactggttgg ctcccgcggt gccatgtctg cagtgtgccc 11340
cccagccccg gtggctgggc agagctgcat catccttgca ggtgggggtt gctgtataag 11400
ttatttttgt acatgttcgg gtgtgggttc tacagccttg tccccctccc cctcaacccc 11460
accatatgaa ttgtacagaa tatttctatt gaattcggaa ctgtcctttc cttggcttta 11520
tgcacattaa acagatgtga atattc 11546

Claims (10)

1.一种金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒为由脂质体囊泡包裹的金纳米颗粒，所述脂质体囊泡的表面修饰有二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，所述金纳米颗粒表面修饰有穿膜肽和质粒，所述脂质体囊泡由二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇组成。
2.根据权利要求1所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其特征在于，金纳米颗粒表面修饰的所述穿膜肽为HIV-1-transactivator转录肽。
3.根据权利要求1或2所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其特征在于，所述金纳米颗粒的粒径为10～20nm。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其特征在于，所述金纳米颗粒和所述质粒的摩尔比为0.1～1000：0.1～10000000，优选为0.1～100：1～100000，更优选为0.1～10:5000～100000，还优选为1～1000：50000。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒，其特征在于，所述脂质体囊泡中的二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇摩尔比为0.1～4：0.1～8：0.1～9，优选为0.2～4：0.1～5：0.1～6。
6.一种权利要求1至5中任一项所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)按照配比，将质粒，穿膜肽与金纳米颗粒混合后静止获得第一混合液，
(2)按照配比，将步骤(1)获得的第一混合液与脂质体囊泡混合后静止获得第二混合液，
(3)按照配比，将步骤(2)获得的第二混合液与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇混合获得所述脂质体纳米颗粒；
优选地，步骤(1)、(2)的静止时间和/或(3)的混合时间为15-30分钟。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的所述脂质体囊泡的制备方法包括：
(a)按照配比，将二油酰磷脂酰乙醇胺、2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵和胆固醇溶于氯仿与甲醇的混合液中，
(b)旋转蒸发步骤(a)获得的所述混合液至只剩磷脂膜，
(c)在步骤(b)获得的所述磷脂膜中加入水、PBS或葡萄糖，
(d)超声至形成所述脂质体囊泡；
优选地，步骤(b)中的旋转蒸发温度为30-35℃。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括治疗肿瘤的药物和权利要求1至5中任一项所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒；优选地，所述治疗肿瘤的药物选自以下的一种或多种：核苷酸、核苷酸衍生物、核酸、核酸衍生物、多肽和蛋白。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗肿瘤的药物包括核酸时，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的或如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列，优选地，所述核酸选自脱氧核糖核酸、小干扰核糖核酸和导向核糖核酸中的一种或多种；
所述治疗肿瘤的药物包括蛋白时，所述蛋白为Cas9。
10.权利要求1至5中任一项所述的金纳米-脂质体复合纳米颗粒或权利要求8至9中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤的药品或医疗产品中的应用；优选地，所述肿瘤为黑色素瘤、前列腺癌或乳腺癌。
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