CN109395079B - 一种多功能纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多功能纳米探针及其制备方法和应用，包括以可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒作为载体，同时装载氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2和光敏剂分子Ce6，其制备方法包括先通过介孔模板和硅源合成带有二硫键的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，然后修饰上氨基；含有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒与含有羧基的光敏剂分子Ce6进行氨基‑羧基缩合反应，从而修饰上Ce6；再通过静电吸附反应与[(Ru(dpp)3)]Cl2相连接，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON‑Ce6‑[(Ru(dpp)3)]Cl2。本发明合成方法简单易行，可重复性高；并且将光动力治疗和氧气检测整合于同一体系，可以实现实时、活体监测光动力治疗过程中氧气变化情况。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能纳米探针及其制备方法和应用，属于生化领域。
背景技术
光动力治疗是在波长合适的激光照射下利用光敏剂将氧气转变成细胞毒性活性氧，从而杀伤肿瘤细胞。相较于传统的肿瘤治疗方式，光动力治疗具有创伤性小、可重复性好、空间选择性高、副作用少等优点。氧气作为光动力治疗的三大要素之一，与治疗效果密切相关，因而准确及时地检测光动力治疗中氧气变化有利于预测治疗反应和优化治疗方案。
氧气电极法(oxygen electrode method)是目前检测氧气浓度的金标准，但是这种方法过程复杂且具有创伤性，不适合重复测量。设计无创、简便、可重复的氧气检测方法会更加有利于临床诊疗。荧光成像具有安全性好、成本低廉、空间分辨率和敏感性较高、可实时检测、成像试剂丰富多样等优点，因此低氧敏感的荧光探针被广泛研究用于肿瘤乏氧的荧光成像。
目前已有商业化的荧光染料可用于检测氧气分子，但是较差的水溶性、潜在的毒性以及较低的探针递送效率等缺点阻碍了这些荧光染料的临床应用。此外这些荧光染料尚无法实现实时、活体检测光动力治疗中氧气变化。随着化学和纳米技术的迅速发展，形态多样、功能丰富的纳米材料被设计合成用于医学领域。
发明内容
发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种利用纳米材料同时装载氧气敏感的荧光染料和光敏剂分子的多功能纳米探针,本发明不仅可以保护荧光染料免于干扰、利用纳米颗粒EPR(enhanced permeability and retention)效应提高探针的递送效率、改善探针水溶性并降低其毒性。此外，纳米颗粒的多功能性还体现在能实现氧气检测联合光动力治疗，在治疗过程中及时检测氧气变化有利于调整治疗方案，实施个体化治疗。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明的一种多功能纳米探针，以可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒作为载体，同时装载氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2和光敏剂分子Ce6；
所述可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过介孔模板和硅源合成，再经氢氧化钠刻蚀形成中空结构；
所述介孔模板为十六烷基三甲基溴化铵，所述硅源为四乙氧基硅烷和(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物。
可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒英文缩写为HMON，其呈一种塌陷样的纳米胶囊状，尺寸较为均一，大约为213±26nm，具有较大的表面积和孔径，表面积为401m2g-1，孔径为5.4nm。
介孔有机氧化硅(periodic mesoporous organosilica,PMO)是一类有前景的介孔纳米材料，它们的结构中均匀地掺杂了有机和无机成分。PMO具有规则有序的介孔、易于调整的形态和尺寸、较大的表面积和孔径以及较好的生物相容性和生物可降解性，有利于发展其生物医药领域方面的应用。与具有坚固交联结构的普通PMO相比，可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒(hollow mesoporous organosilica nanoparticles,HMON)更具吸引力，这种材料不仅具有PMO的共性优点，而且由于可形变的结构特点，能充分的与生物组织相互作用，增加药物和成像分子的细胞摄取量，从而提高治疗效果和成像敏感性。
进一步地，可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒为含有二硫键的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，
上述多功能纳米探针的制备方法为：先通过介孔模板和硅源合成带有二硫键,此二硫键为硅源中自带的的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，所述中空介孔有机氧化硅纳米颗粒经氢氧化钠刻蚀形成中空结构,此中空结构一是增加装载空间，二是使结构柔软、可形变；
所述二硫键通过三苯基膦还原成巯基，所述巯基通过与N-氨基甲酰马来酰亚胺反应使纳米颗粒修饰上氨基。因为巯基与马来酰亚胺基团反应更简单容易，本发明中使用的N-氨基甲酰马来酰亚胺就是通过巯基与马来酰亚胺基团反应修饰上氨基。
含有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒与含有羧基的光敏剂分子Ce6进行氨基-羧基缩合反应，从而修饰上光敏剂分子Ce6；
含有光敏剂分子Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，带有负电荷，通过静电吸附反应与氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2，其带有正电荷相连接，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2。
进一步地，所述的通过介孔模板和硅源合成带有二硫键的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒的方法，具体包括如下步骤：
步骤1-1、将0.16g十六烷基三甲基溴化铵、30mL乙醇、75mL纯水、1mL浓氨水充分混合后在磁力搅拌器460rpm、室温为35℃的条件下反应1h；得到反应体系A；
步骤1-2、将250μL四乙氧基硅烷和100μL(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物，充分混匀之后快速加入步骤1-1得到的反应体系A中，继续反应24h；得到产物A；(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物中含有丰富的二硫键。
步骤1-3、将产物A经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，随后用乙醇洗涤三次；得到纳米颗粒；
步骤1-4、将步骤1-3中所得到的纳米颗粒溶解于含有30mL纯水和1.5mL氢氧化钠溶液的混合溶液A中，保持温度为25℃，在500rpm转速搅拌下刻蚀30min；其中氢氧化钠溶液浓度为10mol L-1，得到产物B；
步骤1-5、将步骤1-4中得到的产物B经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，用纯水和乙醇各洗涤一次，得到产物C；
步骤1-6、将步骤1-5中得到的产物C分散于50mL含有浓盐酸和乙醇的混合溶液B中，其中混合溶液B的体积比为浓盐酸：乙醇＝1:500，在60℃水浴中萃取3h；
步骤1-7、重复步骤1-6三次，随后用乙醇洗涤混合溶液B三次，得到可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
进一步地，在中空介孔有机氧化硅纳米颗粒修饰上光敏剂分子Ce6的方法，具体包括如下步骤：
步骤2-1、将18mg中空介孔有机氧化硅纳米颗粒、0.1g三苯基膦、0.9mL纯水和3.3mL二噁烷混匀加热至40℃，滴入20μL浓盐酸并通入氮气，在500rpm搅拌下反应2h，其中三苯基膦作为还原剂，得到产物D；
步骤2-2、将产物D经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，用乙醇洗涤三遍后得到带有巯基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-3、将步骤2-2得到的带有巯基的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒和36mg N-氨基甲酰马来酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺，得到混合溶液C；
步骤2-4、将混合溶液C在室温中摇晃持续反应24h，得到产物E；
步骤2-5、将产物E经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，纯水洗涤三次后得到带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-6、将1.44mL Ce6(0.5mg mL-1)、0.864mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1mg mL-1)和1.008mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(1mg mL-1)充分混合后于室温下避光摇晃2h以活化Ce6分子中的羧基，得到反应体系B，将步骤2-5中得到的带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒加入反应体系B中，继续在室温下避光摇晃反应24h，经离心洗涤之后得到带有Ce6的可形变中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
进一步地，带有Ce6的可形变中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过静电吸附反应与氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2相连接的方法，具体包括如下步骤：
步骤3-1、9mg带有Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，其带有负电荷和0.9mg[(Ru(dpp)3)]Cl2，其带有正电荷，溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中；
步骤3-2、将步骤3-1中得到的溶液在室温下避光摇晃反应24h，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2。
一种多功能纳米探针的应用，可监测光动力治疗过程中氧气浓度的变化，本发明的原理在于：氧气敏感分子和光敏剂同时装载于一体，光敏剂消耗氧气，同时存在的氧气敏感分子就可以检测氧气变化，氧气的变化以荧光强度变化来反映，具体包括如下步骤：
步骤1、将T98G细胞接种于96孔板中，作为培养基，其中每孔含有1×104个细胞，将96孔板分为两组，每组设3个复孔，其中：①为HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；②为HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；
步骤2、待12h后吸除步骤1中的培养基，用新鲜培养基分别配制10μg mL-1的HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液，浓度是指两种材料中[(Ru(dpp)3)]Cl2的含量，将两种溶液按照组别分别加入孔板中，继续孵育24h；
步骤3、将经过步骤2处理的孔板用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤一遍，再加入100μL磷酸缓冲盐溶液；
步骤4、先用660nm激光照射经历步骤1-3后的孔板中的细胞，激光设置的功率为1Wcm-2，累计照射时间为0、1、3、5、7、10min，并且在同时刻采用多功能酶标仪(Microplatereader，Tecan，瑞士)于相应时间点检测细胞在463nm激发下620nm处的荧光发射强度，并记录；此记录反映随着光照时间的延长，各组细胞中氧气浓度的变化。
有益效果：(1)本发明利用可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒结构中掺杂的二硫键连接光敏剂分子，再通过静电吸附作用装载氧气敏感试剂，合成方法简单易行，可重复性高；
(2)本发明中多功能纳米探针将光动力治疗和氧气检测整合于同一体系，可以实现实时、活体监测光动力治疗过程中氧气变化情况；
(3)细胞及动物实验结果均显示该多功能探针可以灵敏且及时地检测光动力治疗过程中氧气的变化情况，有利于实时监测和评估光动力治疗效果。
(4)动物重要器官病理分析显示该纳米探针具有良好的生物可相容性。
附图说明
图1为可形变的中空介孔有机氧化硅(HMON)纳米颗粒的电镜图片；
图2a为HMON、HMON-Ce6和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2的溶液图片；
图2b为HMON、[(Ru(dpp)3)]Cl2、Ce6和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2的紫外-可见光(UV-vis)光谱；
图3a为T98G细胞分别与HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2孵育后，在660nm(1W cm-2)激光照射不同时间，细胞在620nm波长处的相对荧光发射强度变化；
图3b为T98G细胞分别与HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2孵育后，在660nm(1W cm-2)激光照射不同时间后细胞内活性氧的生成情况；
图4为荷瘤裸鼠肿瘤内光动力治疗过程中氧气变化；
图5为静脉注射HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2后裸鼠重要器官的H&E染色分析。
具体实施方式
试剂来源：
十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyltrimethyl ammonium bromide)，缩写为CTAB，购置于国药集团化学试剂有限公司；
四乙氧基硅烷(Tetraethyl orthosilicate)，缩写为TEOS，购置于国药集团化学试剂有限公司；
(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物(bis(triethoxysily)propanetetrasulfide)，缩写为TESPTS，购置于Sigma-Aldrich公司；
二甲基甲酰胺(N,N-dimethylformamide)，缩写为DMF，购置于南京化学试剂有限公司；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
(N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride)，缩写为EDC，购置于Sigma-Aldrich公司；
N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt)，缩写为NHS，购置于Sigma-Aldrich公司；
二氢卟吩e6(Chlorin e6)，缩写为Ce6，购置于Sigma-Aldrich公司；
2’-7’-双氯荧光黄乙酸乙酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate)，缩写为DCFH-DA，购置于Sigma-Aldrich公司；
三(4,7-联苯-1,10-邻菲啰啉)二氯化钌
(Tris(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)rutheniuM(II)dichloride)，缩写为[Ru(dpp)3]Cl2，购置于上海迈瑞尔化学技术有限公司；
磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，缩写为PBS，购置于南京凯基生物科技发展有限公司。
下面通过具体的实施例详细说明本发明。
实施例1：一种多功能纳米探针
本发明的一种多功能纳米探针，以可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒作为载体，同时装载氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2和光敏剂分子Ce6；所述可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过介孔模板和硅源合成，再经氢氧化钠刻蚀形成中空结构；所述介孔模板为十六烷基三甲基溴化铵，所述硅源为四乙氧基硅烷和(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物。可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒为含有二硫键的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒英文缩写为HMON，其呈一种塌陷样的纳米胶囊状，尺寸较为均一，大约为213±26nm，具有较大的表面积和孔径，表面积为401m2g-1，孔径为5.4nm。
采用HT700高倍透射电子显微镜分析显示HMON的形貌特征和大小尺寸，参见图1。
实施例2：一种可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒的制备方法
本发明制备的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，其电镜图参见图1，其制备方法包括以下步骤：
步骤1-1、将0.16g十六烷基三甲基溴化铵、30mL乙醇、75mL纯水、1mL浓氨水充分混合后在磁力搅拌器460rpm、室温为35℃的条件下反应1h；得到反应体系A；
步骤1-2、将250μL四乙氧基硅烷和100μL(三乙氧基甲硅烷基)丙烷四硫化物充分混匀之后快速加入步骤1-1得到的反应体系A中，继续反应24h；得到产物A；
步骤1-3、将产物A经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，随后用乙醇洗涤三次；得到纳米颗粒；
步骤1-4、将步骤1-3中所得到的纳米颗粒溶解于含有30mL纯水和1.5mL氢氧化钠溶液的混合溶液A中，保持温度为25℃，在500rpm转速搅拌下刻蚀30min；其中氢氧化钠溶液浓度为10mol L-1，得到产物B；
步骤1-5、将步骤1-4中得到的产物B经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，用纯水和乙醇各洗涤一次，得到产物C；
步骤1-6、将步骤1-5中得到的产物C分散于50mL含有浓盐酸和乙醇的混合溶液B中，其中混合溶液B的体积比为浓盐酸：乙醇＝1:500，在60℃水浴中萃取3h；
步骤1-7、重复步骤1-6三次，随后用乙醇洗涤混合溶液B三次，得到可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
实施例3：一种多功能纳米探针的制备方法
本实施例提供了一种多功能纳米探针的制备方法，本发明中的多功能纳米探针同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2，其具体制备步骤如下：
步骤2-1、将18mg中空介孔有机氧化硅纳米颗粒、0.1g三苯基膦、0.9mL纯水和3.3mL二噁烷混匀加热至40℃，滴入20μL浓盐酸并通入氮气，在500rpm搅拌下反应2h，其中三苯基膦作为还原剂，得到产物D；
步骤2-2、将产物D经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，用乙醇洗涤三遍后得到带有巯基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-3、将步骤2-2得到的带有巯基的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒和36mg N-氨基甲酰马来酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺，得到混合溶液C；
步骤2-4、将混合溶液C在室温中摇晃持续反应24h，得到产物E；
步骤2-5、将产物E经离心收集，离心机转速设置为11000rpm，离心10min，纯水洗涤三次后得到带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-6、将1.44mL Ce6(0.5mg mL-1)、0.864mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1mg mL-1)和1.008mL N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(1mg mL-1)充分混合后于室温下避光摇晃2h以活化Ce6分子中的羧基，得到反应体系B，将步骤2-5中得到的带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒加入反应体系B中，继续在室温下避光摇晃反应24h，经离心洗涤之后得到带有Ce6的可形变中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
带有Ce6的可形变中空介孔有机氧化硅纳米颗粒(带负电荷)通过静电吸附反应与氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2(带正电荷)相连接的方法，具体包括如下步骤：
步骤3-1、9mg带有Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒和0.9mg[(Ru(dpp)3)]Cl2溶解于1.5mL二甲基甲酰胺中；
步骤3-2、将步骤3-1中得到的溶液在室温下避光摇晃反应24h，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2。
图2a是HMON、HMON-Ce6和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2的溶液图片，材料颜色的变化提示不同分子成功偶联；图2b是HMON、[(Ru(dpp)3)]Cl2、Ce6和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2的紫外-可见光(UV-vis)光谱,特征峰的出现证明HMON成功偶联光敏剂分子Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2。
实施例4：一种多功能纳米探针的应用
本实施例提供一种多功能纳米探针的应用，可监测光动力治疗过程中氧气浓度的变化，具体包括如下步骤：
步骤1、将T98G细胞接种于96孔板中，作为培养基，其中每孔含有1×104个细胞，将96孔板分为两组，每组设3个复孔，其中：①为HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；②为HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；
步骤2、待12h后吸除步骤1中的培养基，用新鲜培养基分别配制10μg mL-1的HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液，浓度是指两种材料中[(Ru(dpp)3)]Cl2的含量(不是指材料本身的浓度，是[(Ru(dpp)3)]Cl2的浓度)，将两种溶液按照组别分别加入孔板中，继续孵育24h；
步骤3、将经过步骤2处理的孔板用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤一遍，再加入100μL磷酸缓冲盐溶液；
步骤4、先用660nm激光照射经历步骤1-3后的孔板中的细胞，激光设置的功率为1Wcm-2，累计照射时间为0、1、3、5、7、10min，并且在同时刻采用多功能酶标仪于相应时间点检测细胞在463nm激发下620nm处的荧光发射强度，并记录；此记录反映随着光照时间的延长，各组细胞中氧气浓度的变化
利用紫外分光光度计检测HMON、HMON-Ce6、[(Ru(dpp)3)]Cl2、HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2的紫外见光吸收光谱。材料在404nm和463nm波长处的吸收峰分别代表Ce6和[(Ru(dpp)3)]Cl2的成功偶联(参见图2b)。为了定量[(Ru(dpp)3)]Cl2的装载量，将制得的纳米颗粒溶解在纯水中，用多功能酶标仪测量溶液在463nm处的吸光度值，调节浓度在标准曲线适用的范围内，通过标准曲线法计算溶液的含量，从而计算出纳米颗粒对[(Ru(dpp)3)]Cl2的装载量。
光动力过程中氧气消耗应伴随着活性氧的生成，为了辅助证明本实施例设计的探针的检测准确性，我们采用活性氧检测试剂DCFH-DA试剂评价细胞水平活性氧的生成情况。具体步骤同上述监测光动力治疗过程中氧气浓度变化的方法，不同的是在材料孵育24h后移除含材料的培养基，加入含DCFH-DA的培养基继续培养4h，细胞用PBS洗涤之后采用多功能酶标仪于相应时间点检测溶液在485nm光激发下525nm处的荧光发射强度，反映随着光照时间延长，各组细胞中活性氧的变化。
图3a是人胶质母细胞瘤T98G细胞分别与HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2孵育后，在660nm(1W cm-2)激光照射不同时间，细胞在620nm波长处的相对荧光发射强度变化，激发光波长为463nm；图3b是T98G细胞分别与HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2孵育后，在660nm(1W cm-2)激光照射不同时间后细胞内活性氧的生成情况，利用DCFH-DA(20μmol L-1)作为细胞内活性氧的检测试剂，485nm激光激发下525nm波长处的相对荧光强度反映活性氧的量。结果显示细胞内活性氧的产生趋势和该探针检测的氧气变化相吻合，进一步证明该探针检测光动力治疗中氧气变化的准确性。
实施例5：检测荷瘤裸鼠肿瘤内光动力治疗过程中氧气变化
本实施例提供的检测荷瘤裸鼠肿瘤内光动力治疗过程中氧气变化，具体方法如下：
用生理盐水分别配制12μg mL-1HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2,浓度是指两种材料中[(Ru(dpp)3)]Cl2的浓度。用异氟烷麻醉裸鼠之后，将50μL HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2或HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2缓慢注射到裸鼠肿瘤内。随后将裸鼠放入小动物光学成像系统中成像，得到激光照射前的荧光图像。异氟烷维持麻醉，用660nm激光照射裸鼠的肿瘤部位，功率为0.6W cm-2，照射时间为3min。再次将荷瘤裸鼠放入小动物光学成像系统采集激光照射后的荧光图像。
为了评价纳米材料在活体的生物安全性，将100μL HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2(12μg mL-1)经尾静脉注射到裸鼠体内，14天后处死裸鼠，收集其心、肝、脾、肺、肾等重要器官，经甲醛固定、石蜡包埋、H&E染色，分析相应器官组织有无病理改变。
由图4可见，注射HMON-Ce6-[Ru(dpp)3]Cl2的裸鼠接受光照后，与光照前相比，肿瘤部位荧光强度明显增强；而对照组裸鼠注射HMON-[Ru(dpp)3]Cl2，光照前后肿瘤部位荧光强度未见明显变化。
静脉注射HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2后裸鼠重要器官的H&E染色分析，由图5可见，裸鼠的重要器官的病理切片未见明显病理改变，说明该纳米探针具有良好的活体生物相容性。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种多功能纳米探针，其特征在于：以可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒作为载体，同时装载氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2和光敏剂分子Ce6；
所述可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过介孔模板和硅源合成，再经氢氧化钠刻蚀形成中空结构；
所述介孔模板为十六烷基三甲基溴化铵，所述硅源为四乙氧基硅烷和（三乙氧基甲硅烷基）丙烷四硫化物；
所述可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒为含有二硫键的可形变的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
2.一种多功能纳米探针的制备方法，其特征在于：先通过介孔模板和硅源合成带有二硫键的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒，所述中空介孔有机氧化硅纳米颗粒经氢氧化钠刻蚀形成中空结构；
所述二硫键通过三苯基膦还原成巯基，所述巯基通过与N-氨基甲酰马来酰亚胺反应使纳米颗粒修饰上氨基；
含有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒与含有羧基的光敏剂分子Ce6进行氨基-羧基缩合反应，从而修饰上光敏剂分子Ce6；
含有光敏剂分子Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过静电吸附反应与氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2相连接，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2。
3.根据权利要求2所述的一种多功能纳米探针的制备方法，其特征在于所述的通过介孔模板和硅源合成带有二硫键的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒的方法，具体包括如下步骤：
步骤1-1、将0.16 g 十六烷基三甲基溴化铵、30 mL乙醇、75 mL纯水、1 mL浓氨水充分混合后在磁力搅拌器460 rpm、室温为35 ℃下反应1 h；得到反应体系A;
步骤1-2、将250 μL 四乙氧基硅烷和100 μL （三乙氧基甲硅烷基）丙烷四硫化物充分混匀之后快速加入步骤1-1得到的反应体系A中，继续反应24h；得到产物A；
步骤1-3、将产物A经离心收集，用乙醇洗涤三次；得到纳米颗粒；
步骤1-4、将步骤1-3中所得到的纳米颗粒溶解于含有30 mL纯水和1.5 mL氢氧化钠溶液的混合溶液A中，保持温度为25℃，在500 rpm转速搅拌下刻蚀30 min；其中氢氧化钠溶液浓度为10 mol L-1，得到产物B；
步骤1-5、将步骤1-4中得到的产物B经离心收集，用纯水和乙醇各洗涤一次，得到产物C；
步骤1-6、将步骤1-5中得到的产物C分散于50 mL含有浓盐酸和乙醇的混合溶液B中，其中混合溶液B的体积比为浓盐酸：乙醇=1:500，在60℃水浴中萃取3 h；
步骤1-7、重复步骤1-6三次，随后用乙醇洗涤混合溶液B三次，得到中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
4.根据权利要求2所述的一种多功能纳米探针的制备方法，其特征在于在中空介孔有机氧化硅纳米颗粒修饰上光敏剂分子Ce6的方法，具体包括如下步骤：
步骤2-1、将18 mg中空介孔有机氧化硅纳米颗粒、0.1 g 三苯基膦、0.9 mL 纯水和3.3mL二噁烷混匀加热至40℃，滴入20 μL浓盐酸并通入氮气，在500 rpm搅拌下反应2 h，得到产物D；
步骤2-2、将产物D经离心收集用乙醇洗涤三遍后得到带有巯基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-3、将步骤2-2得到的带有巯基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒和36 mg N-氨基甲酰马来酰亚胺溶解于二甲基甲酰胺，得到混合溶液C；
步骤2-4、将混合溶液C在室温中摇晃持续反应24 h，得到产物E；
步骤2-5、将产物E经离心收集，纯水洗涤三次后得到带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒；
步骤2-6、将浓度为0.5 mg mL-1的Ce6 1.44 mL、浓度为1 mg mL-1的1-(3- 二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐0.864 mL和浓度为1 mg mL-1的N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐1.008 mL充分混合后于室温下避光摇晃2 h，得到反应体系B，将步骤2-5中得到的带有氨基的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒加入反应体系B中，继续在室温下避光摇晃反应24h，经离心洗涤之后得到带有Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒。
5.根据权利要求2所述的一种多功能纳米探针的制备方法，其特征在于带有Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒通过静电吸附反应与氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2相连接的方法，具体包括如下步骤：
步骤3-1、9 mg带有Ce6的中空介孔有机氧化硅纳米颗粒和0.9 mg [(Ru(dpp)3)]Cl2 溶解于1.5 mL二甲基甲酰胺中；
步骤3-2、将步骤3-1中得到的溶液在室温下避光摇晃反应24 h，得到同时装载有光敏剂Ce6和氧气敏感分子[(Ru(dpp)3)]Cl2的多功能纳米探针HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2。
6.一种如权利要求2所述方法制备的多功能纳米探针的应用，其特征在于监测光动力治疗过程中氧气浓度的变化，具体包括如下步骤：
步骤1、将T98G细胞接种于96孔板中，作为培养基，其中每孔含有1 × 104个细胞，将96孔板分为两组，每组设3个复孔，其中：①为HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；②为HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2组；
步骤2、待12h后吸除步骤1中的培养基，用新鲜培养基分别配制10 μg mL-1的HMON-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液和HMON-Ce6-[(Ru(dpp)3)]Cl2溶液，将两种溶液按照组别分别加入孔板中，继续孵育24 h；
步骤3、将经过步骤2处理的孔板用磷酸缓冲盐溶液涤一遍，再加入100 μL 磷酸缓冲盐溶液；
步骤4、先用660 nm激光照射孔板中的细胞，再采用多功能酶标仪于相应时间点检测细胞在463 nm激发下620 nm处的荧光发射强度，并记录，荧光发射的强度即反映氧气浓度的变化。
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