CN111437385B - 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111437385B CN111437385B CN202010304066.5A CN202010304066A CN111437385B CN 111437385 B CN111437385 B CN 111437385B CN 202010304066 A CN202010304066 A CN 202010304066A CN 111437385 B CN111437385 B CN 111437385B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitosan
- derivative
- nanoparticles
- antigen
- derivatives
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
- A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55583—Polysaccharides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Abstract
本发明属于海洋生物技术领域,具体涉及一种具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒及其制备和应用。通过不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物,以聚电解质复合法获得粒径153.33nm‑320.90nm、电位17.1mV‑39.30mV的壳聚糖衍生物纳米粒;所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25‑10:1‑4的比例混合。通过激光共聚焦测定表明细胞对纳米粒具有一定摄取作用,从而发挥免疫效果。为近年来壳聚糖衍生物作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和指导。
Description
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域,具体涉及一种具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒及其制备和应用。
背景技术
壳聚糖是自然界唯一带有正电荷的天然多糖。由氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成。由于壳聚糖来源丰富,且安全无毒具有良好的生物兼容性,与人体细胞有良好的相容性,在食品医药,农业,材料科学领域具有很大的应用潜力。但壳聚糖本身难溶于水的特点限制了其应用与发展,对其进行衍生化修饰增加其溶解性等将使其应用更加广泛。纳米粒的研究是近年来研究热点之一,利用纳米粒作为药物载体是目前医学上多种药物的重要研究方向。壳聚糖本身具有较好的生物相容性,在生物体内无毒副作用能够被生物体所降解,而所制备出的纳米粒一方面发挥着载体作用,因此以壳聚糖为基础材料作为疫苗免疫佐剂的开发具有一定优势。
发明内容
本发明考虑以上问题,提供一种具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒及其制备和应用。
为实现上述目的,本实验采用的技术方案为:
一种壳聚糖衍生物纳米粒,通过不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物,以聚电解质复合法获得粒径153.33nm-320.90nm、电位17.1mV-39.30mV的壳聚糖衍生物纳米粒;所述不同分子量的壳聚糖正电荷和不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物按质量比为6.25-10:1-4的比例混合。
所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物为不同分子量和不同取代位点的壳聚糖硫酸酯化衍生物;不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物为不同分子量壳聚糖季铵化衍生物;
所述不同分子量和不同取代位点的壳聚糖硫酸酯化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的C2,3,6-位、C6-位、C3,6-位、C3-位、C2-位,C2、3-位或C2、6-位的壳聚糖硫酸酯;优选为分子量为180-200kDa的C2,3,6-位硫酸酯,1780-1800K Da的C6-位硫酸酯,以及48-51kDa的C3,6-位硫酸酯。
所述不同分子量壳聚糖季铵化衍生物为分子量范围为3k-1800kDa的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖衍生物。优选为分子量为180-200kDa、1780-1800kDa、48-51kDa的壳聚糖季铵化衍生物。
一种壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法,所述不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物,通过以聚电解质复合形成纳米粒子;其中,正电荷和负电荷衍生物按质量比为6.25-10:1-4的比例混合。
所述正负电荷衍生物在室温,以500r-700r磁力搅拌20-40min,过滤后得到纳米粒溶液,4℃保存。
一种壳聚糖衍生物纳米粒的应用,其特征在于:所述壳聚糖衍生物纳米粒在制备作为疫苗免疫佐剂中的应用。
一种包裹抗原的免疫疫苗,疫苗佐剂为所述壳聚糖衍生物纳米粒,佐剂与抗原按质量比为0.5-2:1的比例混合。
进一步的说将带正电的壳聚糖衍生物与抗原混合均匀后,加入带负电的壳聚糖衍生物,通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
所述抗原为能够引起机体免疫反应的物质,例如模式抗原OVA以及灭活病毒抗原。
一种包裹抗原的免疫疫苗的制备方法,将带正电的壳聚糖衍生物与抗原混合均匀后,加入带负电的壳聚糖衍生物,通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
进一步的说,利用所述壳聚糖衍生物纳米粒,采用对树突状细胞的免疫活性进行测定。通过对未包裹抗原纳米粒的细胞毒性测定,确定其对细胞无毒的纳米粒最大浓度为100μg/mL。通过对免疫因子表达量和细胞免疫因子分泌量的测定,优选分子量均为180~200kDa的C2,3,6-位硫酸酯壳聚糖作为负离子壳聚糖衍生物,季铵盐壳聚糖作为正离子壳聚糖衍生物,此时制备纳米粒条件硫酸酯浓度为1.5mg/mL,季铵盐浓度为1.0mg/mL,纳米粒具有最好的免疫效果。
本发明所具有的优点:
1.本发明使用壳聚糖的正负离子衍生物,在不引入交联剂的条件下进行纳米粒的制备,去除了交联剂的毒副作用,保证其在生物体内的安全,经细胞毒性试验检测,其在适当的浓度下,具有生物安全性。
2.本发明所制备的纳米粒可作为免疫佐剂,将其具有使用于小鼠DCS细胞进行免疫效果验证,结果表明多数纳米粒能够促进小鼠四种细胞因子的表达及分泌量,证明所制备纳米粒具有一定免疫效果。在制备高效且无副反应免疫佐剂方面具有良好应用价值。
附图说明
图1A-E为本发明实施例1中获得的不同分子量壳聚糖测定结果的HPLC图谱;其中,A为1kDa分子量、B为3kDa分子量、C为5kDa分子量、D为50kDa分子量、E为200kDa分子量。
图2为本发明实施例3中获得的不同位点壳聚糖硫酸酯衍生物的红外图谱。
图3为本发明实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的电位(A)和粒径(B)表征图。
图4为本发明实施例4中获得的壳聚糖衍生物纳米粒的扫描电镜图。
图5为本发明实施例获得的DC细胞对壳聚糖衍生物纳米粒的摄取图。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明,并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
本发明以壳聚糖为基础,进行纳米粒的制备并对其免疫活性进行测定,最终得具有免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒。
具体方法如下:将不同分子量不同取代位点的带有壳聚糖负电荷的衍生物和不同分子量季铵盐衍生物通过聚电解质复合法进行纳米粒的制备,通过细胞实验,得出具有最佳免疫活性的壳聚糖衍生物纳米粒,由以上原料和条件下所制备的壳聚糖纳米粒,无毒副作用,且经过小鼠树突细胞实验证明能够促进树突细胞IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ四种免疫因子基因表达量的提高,且促进了这四类细胞因子分泌量的增加。通过激光共聚焦测定表明细胞对纳米粒具有一定摄取作用,从而发挥免疫效果。为近年来壳聚糖衍生物作为免疫佐剂的研究提供一定的方法和指导。
实施例1不同分子量壳聚糖的制备
取6g分子量为1820kDa原料壳聚糖加入98mL H2O,2mL醋酸,45℃条件下,搅拌速度为200r/min,搅拌1h后向其中加入壳聚糖酶1g,43h后测定其分子量为3000Da。
按照上述方法,采用不同分子量的原料壳聚糖使用壳聚糖酶进行降解,仅改变壳聚糖酶的加入量以及反应时间和温度,即可得不同分子量的壳聚糖及其分子量测定结果如下表1和图1;其中,在为保证降解得到壳聚糖具有相同脱乙酰度,一般使用同一批次壳聚糖进行降解。
表1壳聚糖的分子量测定结果
反应温度(℃) | 反应时间(h) | 加酶量(g) | 分子量(Da) |
0 | 0 | 0 | 1820000 |
0 | 0 | 0 | 210000 |
45 | 1 | 0.5 | 57000 |
45 | 36 | 1.0 | 5138 |
45 | 43 | 1.0 | 3020 |
48 | 40 | 1.0 | 1800 |
注:其中1820000Da和210000Da壳聚糖为购买所得,即为原料壳聚糖。
实施例2不同分子量壳聚糖季铵盐的制备
取5g上述实施例制备获不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为3020Da的壳聚糖)和10g 2、3-环氧丙基三甲基氯化铵。并向其中加入70mL蒸馏水,80℃水浴、转速为200r/min条件下进行搅拌,反应时间为24h。将得到的反应液在透析袋中使用蒸馏水透析72h,后在冻干机中-80℃条件下冻干,得到样品a。
同样方法改变壳聚糖分子量与2、3-环氧丙基三甲基氯化铵按照上述的过程即可制备获得不同分子量产物壳聚糖季铵盐,所得不同分子量产物壳聚糖季铵盐的分子量测定结果如下表2。
表2季铵盐的分子量测定结果
实施例3不同分子量不同取代位点壳聚糖硫酸酯的制备
1)不同分子量C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯的制备
取2g上述实施例制备获得不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖),加入50mL甲酰胺溶剂,将上述混合物搅拌均匀后,加入5mL甲酸,50磺化剂DMF·SO3,在50℃温度下搅拌反应1.5h,然后将上述反应液用其3倍体积量的无水乙醇沉淀,放到4℃冷藏柜中沉化约30min,得到的沉淀物即是壳聚糖硫酸酯的粗产品。将上述沉淀物抽滤,滤饼用蒸馏水溶解,2N NaOH溶液将其中和,透析,透析液浓缩,冷冻干燥得淡黄色样品b,即得不同分子量的C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯的分子量为4550Da,其,红外表征如图2);
同样方法改变壳聚糖分子量,使用实施例1中获得的不同分子量壳聚糖按照上述记载的方式进行同样衍生得到产物分子量结果如下表3。
表3C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯的分子量测定结果
2)不同分子量C3,6-位壳聚糖硫酸酯的制备
将4克上述实施例制备获得不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)、100mL甲酰胺、5克邻苯二甲酸酐、3mL乙二醇混合均匀后,在90℃反应2.5h,反应完毕,将温度降至55℃,然后慢慢滴,80mL磺化试剂,反应2.5h,反应完毕,将其倒入冰水中,用2N NaOH中和可得透明溶液,蒸馏水透析,浓缩,冷冻干燥得2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯产物。再将2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯脱去邻苯二甲酸酐保护基,3克2-苯二甲酰亚氨基壳聚糖硫酸酯,用100mL水充分溶解后,加入20mL水合肼,在70℃下反应4h,反应完毕加入100mL蒸馏水浓缩,如此反复四次,用蒸馏水透析,浓缩,冷冻干燥得白色棉花状固体d。即得到不同分子量的C3,6-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得分子量为4840Da的C3,6-位壳聚糖硫酸酯,其红外表征如图2)
同样方法改变壳聚糖分子量,使用实施例1中获得的不同分子量壳聚糖按照上述记载的方式进行同样衍生得到产物分子量结果如下表4。
表4C3,6-位壳聚糖硫酸酯的分子量测定结果
3)不同分子量C3-位壳聚糖硫酸酯的制备
取2克上述步骤2)获得不同分子量的C3,6–位壳聚糖硫酸酯(本实施例选分子量为50990Da C3,6–位壳聚糖硫酸酯),用50mL水溶解后,加入160mL N-甲基-2-吡咯烷酮,混匀后,在90℃下反应6h,反应完毕用NaOH调节pH值到9,透析,浓缩,冷冻干燥得淡黄色粉末状产品c;即得到不同分子量的C3-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得分子量为50400Da的C3-位壳聚糖硫酸酯,其红外表征如图2);
同样方法改变壳聚糖分子量,使用实施例2步骤2)中获得的不同分子量的C3,6–位壳聚糖硫酸酯按照上述记载的方式进行同样衍生得到产物分子量结果如下表5。
表5C3-位壳聚糖硫酸酯的分子量测定结果
4)不同分子量C6-位壳聚糖硫酸酯的制备
首先制备不同分子量的C2,3-位壳聚糖铜螯合物:将3克上述实施例制备获得不同分子量的壳聚糖(本实施例采用分子量为5138Da的壳聚糖)加入到80mL 1%的甲酸中,使其溶解成粘稠状态,取10mL蒸馏水溶解4.65克CuSO4·5H2O慢慢滴加到上述粘溶液中,室温搅拌3h。然后用氨水调节PH值至6.0-6.5,室温继续搅拌3h。搅拌后用1:1的无水乙醇与丙酮混合溶剂沉淀螯合物,放置少许时间,抽滤,烘干,粉碎待用。
后进行磺化反应,取2g上述壳聚糖铜螯合物,加入50mL甲酰胺溶剂,30mL磺化剂DMF·SO3,在55℃温度下搅拌反应1.5h,然后将上述反应液用3倍体积量的无水乙醇沉淀,放到4℃冷藏柜中沉化约30min,得到白色絮状沉淀。将上述沉淀物抽滤,滤饼用蒸馏水溶解得蓝色溶液,2N NaOH溶液将其中和,透析,透析液浓缩,冷冻干燥得蓝色壳聚糖铜螯合物的硫酸酯化产品。最后进行脱铜处理,将壳聚糖铜鳌合物的磺化产物用蒸馏水溶解后,通过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱,溶液颜色由蓝色变为黄色,Cu即被脱掉,用2N NaOH中和,浓缩,透析,冷冻干燥得样品e,即不同分子量的C6-位壳聚糖硫酸酯(本实施例获得分子量为4150Da C6-位壳聚糖硫酸酯,其红外表征如图2)。
同样方法改变壳聚糖分子量,使用实施例1中获得的不同分子量壳聚糖按照上述记载的方式进行同样衍生得到产物分子量结果如下表6。
表6C6-位壳聚糖硫酸酯的分子量测定结果
同时,按照现有技术记载还可以获得C2-位壳聚糖硫酸酯,C2、3-位壳聚糖硫酸酯,C2、6-位壳聚糖硫酸酯,同时在各制备过程中调整基团保护方法和保护剂,对不同位点进行保护和衍生。(Holme et al.,1997;Nishimura et al.,1998;Jayakumar et al.,2007)再使用实施案例1中获得的不同分子量壳聚糖进行同样衍生即可获得不同分子量的上述不同取代位壳聚糖硫酸酯。
实施例4包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒的制备
试剂:1.0mg/mL不同分子量壳聚糖季铵盐溶液a,1.5mg/mL的负电荷衍生物溶液(例,C2,3,6-位硫酸酯壳聚糖溶液)b以及2.0mg/mL标准抗原OVA溶液m;
取a溶液5mL在25毫升烧杯中,置于磁力搅拌器中转速为300r/min。向其中滴加2mL抗原m溶液,搅拌10min后向其中再滴加2mL的C2,3,6-位硫酸酯壳聚糖溶液b。继续搅拌至30min。即,正电荷衍生物(a)和不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物(b)的质量比为5:3。过滤后得到纳米粒溶液,4℃保存,获得包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒(参见表7),测定该纳米粒的粒径范围为:153.33nm~320.90nm,电位范围为17.1mV~39.30mV。
同时,将上述实施例1-3获得不同的不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物和不同分子量的壳聚糖正电荷衍生物按照上述记载方法获得的包裹抗原的不同壳聚糖衍生物纳米粒(参见表6)同时表格中分子量表示季铵盐的不同分子量,且季铵盐与硫酸酯壳聚糖分子量相同,其理化性质表征如表7所示。
表7不同分子量不同取代位点包裹OVA壳聚糖衍生物纳米粒的理化性质表征
由电位和粒径结果可知,为保证纳米粒稳定性以及更好在细胞和后续动物体内发挥更好载体和释放作用,得出粒径在150nm~350nm及电位在15mV~40mV的纳米粒。C3.6SCS—HACC 5kDa样品电荷量不符合条件,不再进行后续测定。
空白纳米粒(即,不包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒),所述正电荷衍生物和不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物的质量比为5:3;不包裹抗原纳米粒的理化性质如下:
实施例5壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞的免疫活性的影响
1)空白纳米粒(即,不包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒)和上述实施例获得包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒按照CCK-8法分别对DC细胞的毒性测试,如表8、表9和图5。
其中,空白纳米粒(即,不包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒),所述正电荷衍生物和不同分子量不同取代位点的壳聚糖负电荷衍生物的质量比为5:3。
表8空白纳米粒对DC细胞的毒性测试
注:分子量表示季铵盐分子量以及相同分子量的硫酸酯衍生物
表9包裹抗原壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞的毒性测试
注:分子量表示季铵盐分子量以及相同分子量的硫酸酯衍生物,抗原为OVA。
由表8和9结果表明空白纳米粒大部分在100μg/mL以内对细胞无毒,包裹抗原纳米粒多数在50μg/mL以内,少数在100μg/mL以内对细胞无毒;同时由图5可见纳米粒包载抗原能够进入到细胞体内发挥免疫作用。
2)将上述实施例4制备获得由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒通过荧光定量PCR对DC细胞四种免疫因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ基因表达量的影响测试,实验结果如表10。
所述荧光定量PCR:(首先使用RNA提取试剂盒进行总RNA的提取,提取完成后使用NanoDrop 2000超微量紫外\可见分光光度计测定其RNA含量和质量,再进行后续RNA反转以及定量测试,其中测试PCR测试条件为,Stage 2:95℃5s、60℃34s;Stage 3:95℃15s。)
表10由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒对DC细胞基因表达量的影响
注:分子量表示季铵盐分子量以及相同分子量的硫酸酯衍生物,抗原为OVA。
表明所制备的由不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原的壳聚糖衍生物纳米粒,对四种细胞因子表达量都具有一定促进作用。但是不同纳米粒表达量有所差异,其中分子量为200k Da的C2.3.6SCS—HACC、200k Da的C3.6SCS—HACC、50k Da的C6SCS—HACC纳米粒最佳。
3)由上述实施例4制备不同分子量和不同取代位点壳聚糖衍生物获得包裹抗原(抗原为OVA)的壳聚糖衍生物纳米粒在不同浓度下通过使用Elisa试剂盒(abcam小鼠专用试剂盒)进行酶联免疫吸附测定其在450nm处吸光度值,测定其,对细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ分泌量的检测(参见表11-13)
表11C2.3.6SCS—HACC(包裹抗原)纳米粒不同浓度下细胞因子分泌量
浓度(μg/mL) | IL-6(pg/mL) | TNF-α(pg/mL) | IL-1β(pg/mL) | IFN-γ(pg/mL) |
0 | 3913.49 | 408.50 | 0.33 | 6.15 |
6.25 | 4730.33 | 419.33 | 0.47 | 8.67 |
12.5 | 4771.99 | 430.50 | 0.78 | 11.94 |
50 | 4813.25 | 425.17 | 1.62 | 23.70 |
100 | 5164.39 | 496.75 | 1.92 | 19.48 |
表12C3.6SCS—HACC(包裹抗原)纳米粒不同浓度下细胞因子分泌量
浓度(μg/mL) | IL-6(pg/mL) | TNF-α(pg/mL) | IL-1β(pg/mL) | IFN-γ(pg/mL) |
0 | 3894.81 | 408.50 | 0.33 | 6.15 |
6.25 | 4546.27 | 531.00 | 0.64 | 6.55 |
12.5 | 4682.02 | 536.58 | 1.40 | 12.03 |
50 | 4788.02 | 535.25 | 1.04 | 21.39 |
100 | 5064.38 | 561.33 | 1.87 | 24.64 |
表13C6SCS—HACC(包裹抗原)纳米粒不同浓度下细胞因子分泌量
浓度(μg/mL) | IL-6(pg/mL) | TNF-α(pg/mL) | IL-1β(pg/mL) | IFN-γ(pg/mL) |
0 | 3894.81 | 408.50 | 0.33 | 6.15 |
6.25 | 4541.87 | 445.00 | 1.16 | 14.82 |
12.5 | 4690.86 | 535.50 | 1.17 | 15.27 |
50 | 4699.24 | 560.25 | 1.28 | 17.76 |
100 | 5164.39 | 623.33 | 1.41 | 19.03 |
由上述实验结果如表11-13,出示了三种基因表达量较高的纳米粒不同浓度下对细胞因子分泌量的影响,都表现出一定的剂量依赖性,其中C2.3.6SCS—HACC最佳。
Claims (7)
1.一种具有疫苗免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒,其特征在于:通过壳聚糖负电荷衍生物和壳聚糖正电荷衍生物,以聚电解质复合法获得壳聚糖衍生物纳米粒;所述正电荷和负电荷衍生物按质量比为5:3的比例混合;
所述壳聚糖负电荷衍生物为200k Da的C2,3,6-位壳聚糖硫酸酯,壳聚糖正电荷衍生物为200k Da的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖;
或所述壳聚糖负电荷衍生物为200k Da的C3,6-位壳聚糖硫酸酯,壳聚糖正电荷衍生物为200k Da的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖;
或所述壳聚糖负电荷衍生物为50k Da的C6-位壳聚糖硫酸酯,壳聚糖正电荷衍生物为50k Da的2、3-环氧丙基三甲基氯化铵壳聚糖。
2.一种权利要求1所述的具有疫苗免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法,其特征在于:所述壳聚糖负电荷衍生物和壳聚糖正电荷衍生物,通过以聚电解质复合形成纳米粒子;其中,正电荷和负电荷衍生物按质量比为5:3的比例混合。
3.按权利要求2所述的具有疫苗免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒的制备方法,其特征在于:所述正负电荷衍生物在室温,以500r-700r磁力搅拌20-40min,过滤后得到纳米粒溶液,4℃保存。
4.一种权利要求1所述的具有疫苗免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒的应用,其特征在于:所述壳聚糖衍生物纳米粒在制备疫苗免疫佐剂中的应用。
5.一种包裹抗原的免疫疫苗,其特征在于:疫苗佐剂为权利要求1所述具有疫苗免疫佐剂作用的壳聚糖衍生物纳米粒,佐剂与抗原按质量比为0.5-2:1的比例混合。
6.按权利要求5所述的包裹抗原的免疫疫苗,其特征在于:将带正电的壳聚糖衍生物与抗原混合均匀后,加入带负电的壳聚糖衍生物,通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
7.一种权利要求5所述的包裹抗原的免疫疫苗的制备方法,其特征在于:将带正电的壳聚糖衍生物与抗原混合均匀后,加入带负电的壳聚糖衍生物,通过静电吸附作用制备包裹抗原的免疫疫苗。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2019109622633 | 2019-10-11 | ||
CN201910962263.3A CN110812475A (zh) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111437385A CN111437385A (zh) | 2020-07-24 |
CN111437385B true CN111437385B (zh) | 2022-09-30 |
Family
ID=69549183
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910962263.3A Pending CN110812475A (zh) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 |
CN202010304066.5A Active CN111437385B (zh) | 2019-10-11 | 2020-04-17 | 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910962263.3A Pending CN110812475A (zh) | 2019-10-11 | 2019-10-11 | 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN110812475A (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111544586A (zh) * | 2020-04-29 | 2020-08-18 | 中国科学院海洋研究所 | 一种带负电荷的纳米粒作为免疫调节剂的应用 |
CN112294752B (zh) * | 2020-06-02 | 2021-12-24 | 南京工业大学 | AgNPs@CSSCS纳米凝胶载药体系及其制备 |
CN112402621A (zh) * | 2020-11-27 | 2021-02-26 | 中国科学院海洋研究所 | 一种硫酸酯-季铵盐壳聚糖纳米粒作为载体的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105949352A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-09-21 | 中国科学院海洋研究所 | 一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物及其制备方法 |
CN107625961A (zh) * | 2017-08-21 | 2018-01-26 | 山东大学 | 硫酸化可德兰多糖/6‑o‑季铵化壳聚糖纳米粒及其在黏膜疫苗中的应用 |
-
2019
- 2019-10-11 CN CN201910962263.3A patent/CN110812475A/zh active Pending
-
2020
- 2020-04-17 CN CN202010304066.5A patent/CN111437385B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105949352A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-09-21 | 中国科学院海洋研究所 | 一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物及其制备方法 |
CN107625961A (zh) * | 2017-08-21 | 2018-01-26 | 山东大学 | 硫酸化可德兰多糖/6‑o‑季铵化壳聚糖纳米粒及其在黏膜疫苗中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Antimicrobial activity and cytotoxicity of N-2-HACC and characterization of nanoparticles with N-2-HACC and CMC as a vaccine carrier;Jin et al.;《Chemical Engineering Journal》;20130213;第221卷;摘要、2材料和方法、3结果和讨论、表2-3 * |
Jin et al..Antimicrobial activity and cytotoxicity of N-2-HACC and characterization of nanoparticles with N-2-HACC and CMC as a vaccine carrier.《Chemical Engineering Journal》.2013,第221卷第331-341页. * |
壳聚糖衍生物的免疫调节机制及作为新城疫疫苗佐剂的研究;杨悦;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20190815(第8期);摘要、第35-39页2.3不同分子量的C-2,3,6-壳聚糖硫酸酯的制备、第69-70页本章小结 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110812475A (zh) | 2020-02-21 |
CN111437385A (zh) | 2020-07-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111437385B (zh) | 壳聚糖衍生物纳米粒及其制备方法和应用 | |
Stoica et al. | PREPARATION OF CHITOSAN-TRIPOLYPHOSPHATE NANOPARTICLES FOR THE ENCAPSULATION OF POLYPHENOLS EXTRACTED FROM ROSE HIPS. | |
Fernández-Díaz et al. | Polymer chitosan nanoparticles functionalized with Ulva ohnoi extracts boost in vitro ulvan immunostimulant effect in Solea senegalensis macrophages | |
CN111317135A (zh) | 多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米粒子包埋缓释姜黄素的方法 | |
Huang et al. | Chemical modifications and biological activities of polysaccharides | |
AU2021106295A4 (en) | A hyaluronic acid-astaxanthin self-assembled nano system and the preparation method and its application | |
Sandeep et al. | A brief overview on chitosan applications | |
CN108524946B (zh) | 三元复合物纳米药物及其制备方法以及在制备光可控释放纳米递送体系中的应用 | |
CN108653211A (zh) | 一种黄芪多糖脂质体的制备方法 | |
Gorshkova et al. | Water-soluble modified chitosan and its interaction with a polystyrenesulfonate anion | |
CN109988314B (zh) | 一种超支化聚壳多糖及其制备方法和应用 | |
CN109908084B (zh) | 一种铂交联喜树碱前药胶束纳米药物及其制备方法和应用 | |
Lan et al. | Rational design of food-grade polyelectrolyte complex coacervate for encapsulation and enhanced oral delivery of oenothein B | |
CN111281859B (zh) | 具有增强抗原提呈细胞提呈抗原作用的壳聚糖衍生物纳米粒及制备 | |
Zhang et al. | Optimization of fermentation of Fomes fomentarius extracellular polysaccharide and antioxidation of derivatized polysaccharides | |
CN115028754B (zh) | 硫酸化猴头菌子实体β-葡聚糖、硫酸化β-葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒及其制备方法和应用 | |
CN112569367A (zh) | 一种5-氟尿嘧啶-介孔二氧化硅-海藻酸钠药物传递系统及其制备方法 | |
CN111544586A (zh) | 一种带负电荷的纳米粒作为免疫调节剂的应用 | |
CN114106216A (zh) | 一种透明质酸-虾青素纳米复合物及其制备方法与应用 | |
CN101891837A (zh) | 一种羧甲基化双歧杆菌胞外多糖及其制备方法和应用 | |
CN109096118B (zh) | 胺基富勒烯衍生物及其制备方法和应用 | |
CN111150050B (zh) | 白藜芦醇微胶囊的制备方法 | |
Bai et al. | Separation of lacquer polysaccharides and interaction with poly-l-lysine | |
CN110772498A (zh) | 新型负载岩藻黄质的岩藻聚糖硫酸酯纳米粒子的制备方法 | |
CN113717294A (zh) | 一种菊粉型党参果聚糖cpw1及其制备方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |