CN107625961A - 硫酸化可德兰多糖/6‑o‑季铵化壳聚糖纳米粒及其在黏膜疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明首次采用硫酸化可德兰多糖和6‑O‑季铵化壳聚糖通过离子凝聚法制备纳米粒，该方法简单便捷，绿色安全无污染，同时通过对实验步骤和参数的控制，从而使得制备得到的硫酸化可德兰多糖/6‑O‑季铵化壳聚糖纳米粒尺寸均匀、稳定性好。通过对于硫酸化可德兰多糖/6‑O‑季铵化壳聚糖纳米粒的透膜能力、免疫调节能力及黏膜佐剂作用进行评价表明，纳米粒荷正电的特性使其更容易通过黏膜上皮，作用于有效部位，从而发挥其免疫增强剂的作用，并帮助抗原到达有效部位并起到较好的免疫佐剂作用，具有巨大的工业应用之价值。

Description

硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒及其在黏膜疫 苗中的应用

技术领域

本发明属于制药领域，具体涉及一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒及其在黏膜疫苗中的应用。

背景技术

疫苗免疫是预防和控制传染性疾病蔓延的最为有效的措施。然而，目前FDA和CFDA批准的用于人用疫苗的佐剂仍然只有传统铝盐。铝佐剂具有成分简单、费用低廉等优势，但同时也存在容易在注射部位发生沉积，并且只能诱导机体产生Th2型免疫应答而对Th1型免疫应答基本无作用等缺陷。因此，新型人用佐剂的研制日益成为研究的热点。

多糖作为疫苗佐剂具有低毒安全、能够诱导机体产生免疫应答等优势，一系列从植物、细菌、酵母及动物体内提取分离或通过化学合成途径得到的多糖成为了疫苗的新一代佐剂候选者。

可德兰多糖(curdlan)是一种产碱杆菌发酵产生的、由β-1,3-D-葡萄糖所组成的直链胞外多糖，聚合度在250以上。Li PL等(参见Carbohydrate Polymers,2014.102:p.852-61.)制备得到的硫酸化可德兰多糖(CS)不仅改善了其溶解性，而且可以通过与免疫细胞表面的dectin-1受体结合激活下游的MAPKs通路，从而活化核转录因子NF-κB，发挥调节免疫的作用。然而，前期实验发现，单独使用CS作为鼻黏膜疫苗佐剂时对于小鼠机体的体液免疫的增强作用微弱，其主要原因是水溶性的多糖和蛋白容易被鼻纤毛的摆动作用清除，并且大分子蛋白质类抗原难以通过致密的黏膜层。因此，寻找并研发新的以多糖为基础的黏膜疫苗佐剂具有极为重要的科研及应用价值。

发明内容

针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒并应用于黏膜疫苗中。经试验验证，制备得到的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒不仅可以作为蛋白质类抗原的运输载体，帮助抗原到达有效部位并起到较好的免疫佐剂作用，同时能提高机体的细胞免疫和体液免疫水平。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将硫酸化可德兰多糖(CS)置于去离子水中溶解、过滤、稀释得溶液A；

2)将6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)置于去离子水中溶解、过滤、稀释得溶液B；

3)向溶液A中在搅拌下缓慢加入溶液B并继续搅拌一段时间即得硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液；

优选的，步骤1)和步骤2)中过滤均采用直径为0.22μm的滤膜处理；

优选的，硫酸化可德兰多糖的分子量为50kD～150kD(最优103kD)，6-O-季铵化壳聚糖的分子量为100kD～200kD(最优选为100kD)，季铵化度不小于30％；

发明人在实验中发现，原料分子量大小对制备得硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒影响甚大，分子量过大或过小导致其带电荷不同，从而影响二者的凝聚性；同时，硫酸化可德兰多糖在100kD时活性好，有利于增强机体对疫苗抗原的免疫应答反应；同时发明人发现6-O-季铵化壳聚糖分子量小于100kD时，其细胞毒性显著升高，易引发疫苗毒副作用。

优选的，所述溶液A与溶液B的浓度比为1:4～6(最优选为1:5)，所述溶液A的浓度范围为0.01～1mg/mL；

优选的，所述搅拌转速为300～500r/min(优选为400r/min)，搅拌时间为10～30min；

发明人在实验中发现，溶液浓度和搅拌速度同样影响制备获得硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，脱离本发明溶液优选浓度，则硫酸化可德兰多糖和6-O-季铵化壳聚糖易发生凝聚现象，形成大小不一的凝结团，成粒性显著降低；同时，发明人意外发现，溶液的添加顺序对试验结果同样影响甚大，如将硫酸化可德兰多糖溶液滴加至6-O-季铵化壳聚糖溶液中，则受电荷密度影响，二者非常容易凝结成团，其成粒性同样不佳。

本发明的第二个方面，提供一种硫酸化可德兰多糖的制备方法，包括步骤如下：

1)将干燥处理后的可德兰多糖置于DMSO溶液中搅拌溶解；

2)将步骤1)溶液加热处理(优选溶液处理温度不小于65℃)，将SO₃-吡啶粉末加入加热后的溶液中回流反应；

3)待反应液冷却至室温后加入含5％醋酸钠的甲醇溶液室温静置，过滤去除溶剂，将白色析出物用无水甲醇洗涤；

4)将洗涤后的白色析出物溶于去离子水中，采用直径0.22μm滤膜过滤溶液，收集滤液后采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤处理，截留液经冷冻干燥即得硫酸化可德兰多糖。

优选的，步骤1)中干燥处理方式具体为将可德兰多糖样品置于真空干燥箱中37℃干燥24h；

DMSO溶液预先采用活化的分子筛4A过夜干燥处理；

所述可德兰多糖、DMSO溶液和SO₃-吡啶粉末的质量体积比为1g:400～500mL:2.5g(优选为1g：400mL：2.5g)；

本发明的第三个方面，提供一种6-O-季铵化壳聚糖的制备方法，包括步骤如下：

1)将壳聚糖溶于质量浓度为10％的醋酸水溶液中，加热搅拌至彻底溶胀；

2)向步骤1)中缓慢加入苯甲醛，继续搅拌反应制得乳白色反应液，调节pH至中性，过滤收集沉淀，洗涤干燥得反应物A；

3)将反应物A研磨至粉末置于异丙醇中搅拌溶解后将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)逐滴加入反应液中，油浴回流处理，将反应液过滤得到的沉淀洗涤干燥得反应物B；

4)将反应物B研磨为粉末置于盐酸乙醇溶液(优选浓度为0.25mol/L)中，去除溶剂后用去离子水溶解，采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤除去小分子杂质，截留液经冷冻干燥得到6-O-季铵化壳聚糖；

其中，步骤1)中加热处理温度为40℃；

所述壳聚糖、苯甲醛和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量体积比为3g：15.8g：8～10g(优选为3g：15.8g：9g)；

所述油浴回流控制反应温度为70℃，搅拌反应16h；

本发明的第四个方面，提供一种由上述制备方法制备得到的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，所述纳米粒平均直径为167±10nm，分散度(PDI)为0.12±0.10，Zeta电位为50±1.0mV，表明其具有较好的稳定性。

本发明的第五个方面，公开了上述硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒在黏膜疫苗中的应用。

其中，所述应用具体为硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒作为疫苗的佐剂；具体的，所述黏膜疫苗为鼻黏膜疫苗或阴道黏膜疫苗；

根据所述应用，公开了一种荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，所述荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法为：

将卵清蛋白(OVA)溶液缓慢滴加至硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液中，搅拌反应10～30min纯化即得。

其中，所述卵清蛋白(OVA)溶液、硫酸化可德兰多糖溶液和6-O-季铵化壳聚糖溶液的浓度比为4:1:4～6(最优选为4:1:5)。

本发明的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒通过实验验证，可以高效荷载模式抗原OVA，形成荷正电的OVA/CS/O-HTCC纳米粒，并具有缓释效果。体外实验表明，OVA/CS/O-HTCC纳米粒可以被上皮样细胞Calu-3所摄取。采用滴鼻方式对野生型Balb/c小鼠进行免疫处理，实验发现OVA/CS/O-HTCC纳米粒给药组可以有效地刺激淋巴细胞的增殖和分化，促进抗原递呈细胞的活化，从而提高机体细胞免疫水平。对于小鼠血清中OVA特异性抗体水平进行检测发现，与OVA单独免疫组及OVA与铝胶佐剂混合免疫组相比，OVA/CS/O-HTCC纳米粒给药后机体产生的IgG和IgA浓度明显升高。OVA/CS/O-HTCC纳米粒给药组的唾液和阴道灌洗液中检测出高水平的OVA特异性的分泌型IgA，说明OVA/CS/O-HTCC鼻腔给药后，不仅可以引起近端黏膜免疫应答，还可以诱发远端免疫应答。因此，本发明的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒不仅可以作为蛋白质类抗原的运输载体，帮助抗原到达有效部位；而且能发挥免疫增强活性，提高机体的细胞免疫和体液免疫水平。硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒可以作为黏膜疫苗佐剂尤其是鼻黏膜疫苗佐剂，用于治疗和预防通过呼吸道传播的传染性疾病。

本发明有益效果：本发明首次采用硫酸化可德兰多糖和6-O-季铵化壳聚糖通过离子凝聚法制备纳米粒，该方法简单便捷，绿色安全无污染，同时通过对实验步骤和参数的控制，从而使得制备得到的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒尺寸均匀、稳定性好，同时对于硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的透膜能力及免疫调节能力进行评价表明，纳米粒荷正电的特性使其更容易通过黏膜上皮，作用于有效部位，从而发挥其免疫增强剂的作用，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1为硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒及荷载卵清蛋白OVA的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法示意图。

图2为硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒(CS/O-HTCC)、6-O-季铵化壳聚糖与卵清蛋白混合物(OVA/O-HTCC)和荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒(OVA/CS/O-HTCC)的电镜图。

图3为采用荧光显微镜检测荷载FITC标记的OVA的各药物处理Calu-3细胞后OVA的入胞情况。

图4为经过3次滴鼻免疫之后，各药物处理组小鼠脾细胞中，CD3⁺CD4⁺淋巴细胞在总脾淋巴细胞中所占比值。采用One-way ANOVA进行数据处理，与PBS组相比，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

图5为经过3次滴鼻免疫之后，各药物处理组小鼠脾细胞中CD3⁺CD8⁺淋巴细胞在总脾淋巴细胞中所占比值。采用One-way ANOVA进行数据处理，与PBS组相比，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001。

图6为经过滴鼻免疫之后，采用ELISA检测各药物处理组小鼠血清中IgG、IgA及IgG亚型(IgG1和IgG2a)的含量。(A)三次免疫后IgG的含量；(B)三次免疫后IgA的含量；(C)第三次免疫后IgG1和IgG2a的含量及两者之间的比值。其中，P/N值表示实验组与阴性对照组OD₅₄₀之间的比值。采用One-way ANOVA进行数据处理，与PBS组相比，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001；与OVA组相比，#表示p＜0.05，##表示p＜0.01，###表示p＜0.001；与OVA+AL组相比，！表示p＜0.05，！！表示p＜0.01。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式。此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，单独使用硫酸化可德兰多糖作为黏膜疫苗佐剂时，对于小鼠机体的体液免疫增强作用微弱，其主要原因是水溶性的多糖和蛋白质容易被鼻纤毛的摆动作用清除，并且大分子蛋白质类抗原难以通过致密的黏膜层。

有鉴于此，本发明的一种具体实施方式中，提供了一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，所述纳米粒平均直径为167±10nm，分散度(PDI)为0.12±0.10，Zeta电位为50±1.0mV，表明其具有较好的稳定性。

具体的，所述纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将硫酸化可德兰多糖(CS)置于去离子水中，溶解、过滤、稀释得溶液A；

2)将6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)置于去离子水中，溶解、过滤、稀释得溶液B；

3)在搅拌下向溶液A中缓慢加入溶液B，并继续搅拌一段时间，即得硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液；

优选的，步骤1)和步骤2)中过滤均采用直径为0.22μm的滤膜处理；

优选的，硫酸化可德兰多糖的分子量为103kD，6-O-季铵化壳聚糖的分子量为100kD～200kD(最优选为100kD)，季铵化度不小于30％；

优选的，所述溶液A与溶液B的浓度比为1:4～6(最优选为1:5)，所述溶液A的浓度范围为0.01～1mg/mL；

优选的，所述搅拌转速为300～500r/min(优选为400r/min)，搅拌时间为10～30min；

本发明的又一具体实施方式中，提供一种硫酸化可德兰多糖的制备方法，包括步骤如下：

1)取可得兰多糖样品4g置于真空干燥箱中37℃干燥24h。采用活化的分子筛4A过夜干燥DMSO及无水乙醇溶液；

2)量取干燥处理的DMSO溶液400mL，在剧烈搅拌条件下，缓慢加入干燥的可得兰多糖4g，室温搅拌至基本溶解；

3)待温度升至65℃后，称取SO₃-吡啶粉末10g，缓慢加入到上述反应液中，回流反应1h；

4)反应液冷却至室温后倒入500mL含5％醋酸钠的甲醇溶液中，室温静置3～4h，过滤除去大部分溶剂后，将白色析出物用无水甲醇洗涤两次；

5)将沉淀溶于500mL去离子水，采用直径0.22μm滤膜过滤溶液，收集滤液；

6)采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤去除小分子杂质，截留液经冷冻干燥得到硫酸化可得兰多糖。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种6-O-季铵化壳聚糖的制备方法，包括步骤如下：

1)取壳聚糖9g溶于300mL质量浓度为10％的醋酸水溶液中，40℃条件下搅拌至彻底溶胀；

2)向上述反应液中缓慢加入苯甲醛47.4g，继续搅拌反应1h，制得乳白色反应液，采用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至中性，过滤收集沉淀，采用无水甲醇洗涤沉淀两遍，烘干得到反应物A；

3)将反应物A研磨为粉末置于150mL异丙醇中，搅拌溶解后将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)27g逐滴加入到反应液中，油浴回流控制反应温度稳定在70℃，搅拌反应16h，反应液过滤得到的沉淀采用无水甲醇洗涤两遍，烘干得到反应物B；

4)将反应物B研磨为粉末置于150mL 0.25mol/L的盐酸乙醇溶液中，室温下搅拌反应24h，除去大部分溶剂后用少量去离子水溶解，采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤除去小分子杂质，截留液经冷冻干燥得到6-O-季铵化壳聚糖；

本发明的又一具体实施方式中，公开了上述硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒在制备疫苗佐剂中的应用。

其中，所述疫苗为黏膜疫苗，进一步优选为鼻黏膜疫苗或阴道黏膜疫苗；

本发明的又一具体实施方式中，根据所述应用，公开了一种荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，所述荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法为：

在室温条件下，将0.04～4mg/mL卵清蛋白(OVA)溶液缓慢逐滴加入到上述硫酸化可得兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液中，500r/min搅拌反应10～30min。

其中，卵清蛋白、硫酸化可得兰多糖和6-O-季铵化壳聚糖以质量比为4:1:5等体积混合。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 OVA/CS/O-HTCC纳米粒的制备

制备流程如图1所示，硫酸化可得兰多糖10mg溶于10mL去离子水中，制得1mg/mL硫酸化可得兰多糖母液。采用直径0.22μm滤膜过滤后，取硫酸化可得兰多糖母液100μL用去离子水900μL稀释得到100μg/mL硫酸化可得兰多糖溶液；取6-O-季铵化壳聚糖10mg溶于去离子水10mL中，制得1mg/mL6-O-季铵化壳聚糖母液。采用直径0.22μm滤膜过滤后，将1mg/mL6-O-季铵化壳聚糖母液500μL用去离子水500μL稀释得到500μg/mL6-O-季铵化壳聚糖溶液。

取100μg/mL硫酸化可得兰多糖溶液500mL在400r/min搅拌条件下，逐滴加入前期配制好的500μg/mL 6-O-季铵化壳聚糖500mL。继续反应10min后，调节搅拌速度为500r/min，将卵清蛋白溶液(400μg/mL)500mL缓慢逐滴加入到反应液中，搅拌反应10min后，即得到OVA/CS/O-HTCC纳米粒溶液。分别将新制备的CS/O-HTCC纳米粒、OVA/CS/O-HTCC纳米粒及OVA/O-HTCC混合物溶液滴至专用铜网上，用2.0％磷钨酸染色后，自然晾干，于投射电子显微镜下观察粒子形态，并采用Zetasizer 3000激光粒度分析仪测定，得平均粒径及多分散系数、zeta电势。

电镜结果见图2，OVA/CS/O-HTCC纳米粒呈球状，相比于CS/O-HTCC纳米粒颗粒直径有所增加，表面更加圆滑；而OVA和O-HTCC混合液颗粒大小不一，出现明显的聚合情况，可见单独混合成粒性差。通过对于粒径和电位的检测，如表1所示，CS/O-HTCC纳米粒带有较强正电荷，颗粒大小较为均一。荷载OVA后，纳米粒中和了一定的正电荷，且颗粒直径有一定的增加；而OVA/O-HTCC混合颗粒均一度差，颗粒直径明显较高。

表1

实施例2 FITC标记的OVA/CS/O-HTCC纳米粒的摄取能力检测

考察OVA/CS/O-HTCC纳米粒被上皮细胞所摄取的能力，选用具有鼻腔上皮细胞特性的Calu-3细胞系作为实验模型，具体实施步骤如下：

将1mg/mL FITC溶液1mL滴加到OVA溶液(10mg/mL)1mL中，4℃条件下，搅拌反应过夜，加入氯化铵7mg终止反应。反应液采用截留分子量为1kD的透析袋避光透析48h，冷冻干燥得到FITC-OVA。

取对数生长期的Calu-3细胞，以1×10⁵个/皿的密度接种到培养皿中，细胞培养箱中培养4天，吸弃培养基，加入FITC-OVA、FITC-OVA与CS的混合液、FITC-OVA与O-HTCC的混合液或FITC-OVA/CS/O-HTCC溶液1mL，37℃孵育2h，孵育结束后冷PBS洗涤3次，用10μg/mL的Hoechst33342溶液孵育20min，经冷PBS洗涤后再用2μg/mL的Dil溶液孵育10min，冷PBS洗涤3次，荧光显微镜下观察、拍照(放大倍数为10×40)。

实验结果见图3，由于O-HTCC荷正电的性质，FITC-OVA/O-HTCC混合组和FITC-OVA/CS/O-HTCC纳米粒组加药处理后，与FITC-OVA单独处理组相比，荧光强度明显增高，说明O-HTCC可以明显增强Calu-3细胞的摄取能力。

实施例3采用OVA/CS/O-HTCC纳米粒进行鼻腔免疫后小鼠细胞免疫水平的研究

(1)小鼠免疫：如表2所示，Balb/c小鼠随机分为阴性对照组、OVA滴鼻给药组、OVA+AL滴鼻给药组、OVA+CS滴鼻给药组、OVA+O-HTCC滴鼻给药组、CS/O-HTCC滴鼻给药组、OVA/CS/O-HTCC滴鼻给药组7组，每组10只。采用间隔2周加强免疫的方式，共免疫3次。

(2)样品采集：采用内眦取血收集初次免疫后2、4、6周的新鲜血液，室温静置2h后3000r/min离心10min，取上清，得到免疫血清。取初次免疫后6周的唾液和阴道灌洗液，3000r/min离心10min，除去固体杂质。将小鼠断颈处死后，无菌条件下取脾脏，经研磨后，采用200目筛网过滤得到脾细胞悬液，加入红细胞裂解液裂解细胞5min后1500r/min离心5min，得到脾淋巴细胞。

(3)采用流式细胞术检测免疫后小鼠脾脏中T淋巴细胞分群的影响：将小鼠脾淋巴细胞重悬于缓冲液中，以1×10⁶/mL的细胞密度均分到1.5mL的EP管中，加入相应抗体标记，4℃避光孵育1h。用PBS洗涤两遍后，用PBS 100μL重悬细胞并转移到流式管中，流式细胞仪检测淋巴细胞表面标记CD3、CD4和CD8的表达。

(4)结果：小鼠脾脏中T淋巴细胞亚群CD4⁺细胞(辅助性T细胞)和CD8⁺(细胞毒性T细胞)的占比情况如图4和图5所示，采用OVA单独滴鼻免疫或采用OVA与铝胶佐剂混合滴鼻免疫与PBS阴性对照组相比并不会明显改变T淋巴细胞亚群的数量；而OVA/CS/O-HTCC滴鼻免疫后，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞占总脾淋巴细胞的比例明显增大(与PBS阴性对照组相比，p＜0.001)，分别为25.93％和13.15％。可见，OVA/CS/O-HTCC纳米粒滴鼻免疫小鼠后可以明显增加辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的占比，促进机体的细胞免疫。

表2

实施例4采用ELISA检测免疫后小鼠血清中OVA特异性抗体的含量

免疫血清采用PBS进行梯度稀释后采用间接ELISA法检测OVA特异性的IgG和IgA的含量。采用同样的方法检测稀释10倍的初次免疫6周的免疫血清中IgG亚型IgG1及IgG2a的含量。

从图6A可以看出铝胶佐剂在初次免疫后并未明显提高OVA特异性IgG的浓度。与铝胶佐剂相比，CS/O-HTCC纳米粒荷载OVA后可以增强IgG抗体滴度(p＜0.01)。对图6B的数据分析表明，二免后铝胶、O-HTCC和CS/O-HTCC都可以提高血清中OVA特异性的IgA抗体滴度，但是与铝胶相比，CS/O-HTCC纳米粒表现出更好的刺激效果(p＜0.01)。对IgG亚型浓度检测结果(图6C)分析表明，铝胶、硫酸化可得兰多糖、6-O-季铵化壳聚糖和CS/O-HTCC纳米粒作为疫苗佐剂都可以增强IgG1和IgG2a的抗体产生。然而通过计算IgG1和IgG2a吸光度之间的比值，硫酸化可得兰多糖、6-O-季铵化壳聚糖和CS/O-HTCC可以降低OVA所引起的比值异常增高的现象，表明硫酸化可得兰多糖、6-O-季铵化壳聚糖和CS/O-HTCC能够促进OVA免疫小鼠的免疫类型向Th1型方向发展。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将硫酸化可德兰多糖(CS)置于去离子水中，溶解、过滤、稀释得溶液A；

2)将6-O-季铵化壳聚糖(O-HTCC)置于去离子水中，溶解、过滤、稀释得溶液B；

3)在搅拌下向溶液A中缓慢加入溶液B，并继续搅拌一段时间，即得硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液。

2.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中过滤均采用直径为0.22μm的滤膜处理。

3.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述硫酸化可德兰多糖分子量为50kD～150kD(最优103kD)；所述6-O-季铵化壳聚糖的分子量为100kD～200kD(最优选为100kD)，季铵化度不小于30％。

4.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述溶液A与溶液B的浓度比为1:4～6(最优选为1:5)，所述溶液A的浓度范围为0.01～1mg/mL。

5.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述搅拌转速为300～500r/min(优选为400r/min)，搅拌时间为10～30min。

6.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述硫酸化可德兰多糖的制备方法包括步骤如下：

1)将干燥处理后的可德兰多糖置于DMSO溶液中搅拌溶解；

2)将步骤1)溶液加热处理(优选溶液处理温度不小于65℃)，将SO₃-吡啶粉末加入加热后的溶液中回流反应；

3)待反应液冷却至室温后加入含5％醋酸钠的甲醇溶液室温静置，过滤去除溶剂，将白色析出物用无水甲醇洗涤；

4)将洗涤后的白色析出物溶于去离子水中，采用直径0.22μm滤膜过滤溶液，收集滤液后采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤处理，截留液经冷冻干燥即得硫酸化可德兰多糖；

优选的，步骤1)中干燥处理方式具体为将可德兰多糖样品置于真空干燥箱中37℃干燥24h；

DMSO溶液预先采用活化的分子筛4A过夜干燥处理；

所述可德兰多糖、DMSO溶液和SO₃-吡啶粉末的质量体积比为1g:400～500mL:2.5g(优选为1g：400mL：2.5g)。

7.如权利要求1所述的一种硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，所述6-O-季铵化壳聚糖的制备方法，包括步骤如下：

1)将壳聚糖溶于质量浓度为10％的醋酸水溶液中，加热搅拌至彻底溶胀；

2)向步骤1)中缓慢加入苯甲醛，继续搅拌反应制得乳白色反应液，调节pH至中性，过滤收集沉淀，洗涤干燥得反应物A；

3)将反应物A研磨至粉末置于异丙醇中搅拌溶解后将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)逐滴加入反应液中，油浴回流处理，将反应液过滤得到的沉淀洗涤干燥得反应物B；

4)将反应物B研磨为粉末置于盐酸乙醇溶液(优选浓度为0.25mol/L)中，去除溶剂后用去离子水溶解，采用截留分子量为5kD的滤膜进行超滤除去小分子杂质，截留液经冷冻干燥得到6-O-季铵化壳聚糖；

优选的，步骤1)中加热处理温度为40℃；

所述壳聚糖、苯甲醛和2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量体积比为3g：15.8g：8～10g(优选为3g：15.8g：9g)；

所述油浴回流控制反应温度为70℃，搅拌反应16h。

8.权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒。

9.权利要求8所述硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒在黏膜疫苗中的应用；

优选的，所述应用为硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒作为黏膜疫苗的佐剂；进一步优选的，所述黏膜疫苗为鼻黏膜疫苗或阴道黏膜疫苗。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，提供一种荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒，所述荷载卵清蛋白的硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒的制备方法为：

将卵清蛋白(OVA)溶液缓慢滴加至硫酸化可德兰多糖/6-O-季铵化壳聚糖纳米粒溶液中，搅拌反应10～30min纯化即得；

其中，所述卵清蛋白(OVA)溶液、硫酸化可德兰多糖溶液和6-O-季铵化壳聚糖溶液的浓度比为4:1:4～6(优选为4:1:5)。