CN108295049B - 一种负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载抗原的水溶性胺化β‑1,3‑D‑葡聚糖纳米粒子及其制备方法和应用。所述纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：水溶性胺化β‑1,3‑D‑葡聚糖3.5~5.5份；离子交联剂0.06~1.19份；抗原蛋白0.3~0.7份；其中，离子交联剂为低分子量阴离子交联剂。本发明所述负载抗原的水溶性胺化β‑1,3‑D‑葡聚糖纳米粒子的粒径较小，为100～1200nm；水溶性好，抗原蛋白的包封率高，最高能达到86.5%；能保持抗原蛋白的结构和免疫原性的稳定，并且能够持续释放抗原蛋白，蛋白持续释放时间超过125h，5h内释放率低于40%；能明显提高动物体内IgG1和IgG2a抗体的滴度。同时，所述纳米粒子的制备方法简单，反应条件温和，反应效率较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，更具体地，涉及一种负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子及其制备方法和应用。
背景技术
β-1,3-D-葡聚糖主要存在于细菌、真菌、酵母和海藻的细胞壁中，相关研究主要有两个方面，一是对酵母多糖免疫调节活性的研究，另一个是对食用蘑菇多糖抗肿瘤活性的研究。虽然上述研究针对不同原材料，但随着对它们有效成分的分离，关注点都集中于β-1,3-D-葡聚糖。人们发现β-1,3-D-葡聚糖具有许多生理活性，例如：抗传染性疾病和肿瘤的免疫调节活性；刺激造血功能和辐射后保护作用；保护组织器官免受氧化损伤；在治疗高胆固醇血症、糖尿病、高血压、急性鼻炎、关节炎和促进伤口愈合方面的作用等。在众多的生理活性中，免疫调节活性最受关注，其它活性均与免疫调节活性有关。免疫调节机制的研究结果认为，β-1,3-D-葡聚糖是通过与细胞表面一些模式识别受体的特异性识别，再经过一系列的信号途径产生相应的生理反应。
由于β-1,3-D-葡聚糖具有良好的免疫调节活性，又兼有生物兼容性和生物降解性，因此具有作为疫苗佐剂应用的潜力。虽然已有相关研究报道了酵母β-1,3-D-葡聚糖作为疫苗佐剂具有增强免疫的作用。然而，酵母葡聚糖颗粒的尺寸大小受限于酵母细胞，且不是纯的β-1,3-D-葡聚糖，不利于更大程度的发挥β-1,3-D-葡聚糖所具有的功效。
鉴于此，如何采用β-1,3-D-葡聚糖为原料，更好的发挥和利用β-1,3-D-葡聚糖原有的功效，是当前利用β-1,3-D-葡聚糖制备纳米疫苗迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子。本发明所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的粒径较小，为100～1200nm，水溶性好，抗原蛋白的包封率高，最高能达到86.5%；能保持抗原蛋白的结构和免疫原性的稳定，并且能够持续释放抗原蛋白，蛋白持续释放时间超过125h，5h内释放率低于40%；能明显提高动物体内IgG1和IgG2a抗体的滴度。
本发明的另一目的在于提供所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的应用。
本发明的上述目的是通过一下方案予以实现的：
一种负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子，所述纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
离子交联剂 0.06～1.19份；
抗原蛋白 0.3～0.7份；
其中，所述离子交联剂为低分子量阴离子交联剂。
本发明所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米的粒径为100～1200nm，抗原蛋白的包封率为30.4～86.5%，在pH值为7水溶液中37℃以200rpm震荡速度下，蛋白持续释放时间超过125h，5h内释放率低于40%。
优选地，所述离子交联剂为三聚磷酸钠或CpG-OND寡核苷酸。
优选地，所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
三聚磷酸钠 0.4～0.9份；
抗原蛋白 0.3～0.7份。
本发明以三聚磷酸钠为离子交联剂制备的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子分散性好，抗原的包封率高，Zeta电位均在10Mv以上，有利于纳米粒子与细胞间的相互识别和相互作用。
更优选地，所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～4.5份；
三聚磷酸钠 0.4～0.75份；
抗原蛋白 0.3～0.6份。
优选地，所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
CpG-OND寡核苷酸 0.06～1.19份；
抗原蛋白 0.3～0.7份。
CpG-OND寡核苷酸是一种已知作用受体的免疫佐剂，但其单独使用的效果并不好，且因为其容易降解，易导致自身免疫的不良反应发生。而本发明将其作为离子交联剂与β-1,3-D-葡聚糖共同使用，使制备得到的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子不仅能与细胞表面发生特异性作用刺激免疫细胞，进入细胞后又可通过CpG-OND寡核苷酸与内含体的特异性受体作用，进一步增强免疫刺激作用，从而使疫苗达到最佳的作用效果。
更优选地，所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5份；
CpG-OND寡核苷酸 0.06～1.19份；
抗原蛋白 0.3份。
上述配方中，CpG-OND寡核苷酸和水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖的氮磷比为5～100；氮磷比在此范围内制备的纳米粒子的抗原包封率和CpG-OND寡核苷酸包封率均较高，抗原的包封率均高于60%，CpG-OND寡核苷酸包封率均在85%以上；而且所制备的纳米粒子均带正电荷，有利于其与细胞的相互识别和相互作用。
优选地，所述抗原蛋白为鸡卵清白蛋白。
本发明同时还保护所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的制备方法，所述纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
S1. 将β-1,3-D-葡聚糖进行降解纯化得到水溶性β-1,3-D-葡聚糖；然后再进行胺化得到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖；
S2. 向步骤S1的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖溶液中滴加上述配方量的抗原蛋白和离子交联剂，反应得到负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子。
因不纯的β-1,3-D-葡聚糖易导致无法很好的发挥其原有的免疫调节功效，且其水溶性不好，不利于水溶性疫苗的制备。因此，本发明先将β-1,3-D-葡聚糖进行纯化，再经过胺化，得到水溶性的胺化β-1,3-D-葡聚糖。
上述步骤S1制备的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖的含氮量为7.97%～10.3%，有利于抗原的包封，且没有毒性。
优选地，步骤S1的具体过程如下：
S11：用甲酸纯化β-1,3-D-葡聚糖；
S12：将纯化的β-1,3-D-葡聚糖溶于溶剂，再加入N'N-羰基二咪唑，在氮气保护下室温反应1.5h，反应结束后析出、洗涤、干燥；其中，N'N-羰基二咪唑和β-1,3-D-葡聚糖的质量比为0.167～0.5︰0.162～0.486；
S13：将步骤S1-2得到的干燥样品溶于溶剂，再与少量的三乙胺混合，将得到的混合液滴加到过量的乙二胺溶液中，滴加时间不少于1.5h，滴加完毕室温继续反应5h，随后析出、洗涤，用1kDa分子量透析袋透析3天后将透析袋中的保留液冷冻干燥，得到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖。
更优选地，步骤S1的具体过程如下：
S11’. 将纯度为70%～80%的β-1,3-D-葡聚糖用甲酸降解纯化后用乙醇析出并洗涤、冷冻、干燥，将冷冻干燥的样品按质量/体积比为1g/50～100mL溶于去离子水中，90℃磁力搅拌回流3～4h；反应完毕将去离子水旋转蒸发至少量，冷却至室温后在搅拌的情况下按去离子水和乙醇1︰2～5的体积比加入无水乙醇，析出沉淀后离心去除上清液，将沉淀进行冷冻干燥；
S12’. 将S11’中冷冻干燥的样品溶于无水二甲基亚砜，加入N'N-羰基二咪唑，葡聚糖和N'N-羰基二咪唑的质量比为0.162～0.486︰0.167～0.5，在氮气保护下室温反应1.5h；反应结束后，按二甲基亚砜和乙醇1︰2～5的体积比加入无水乙醇，析出沉淀后离心去除上清液，并对沉淀进行5～8次洗涤，然后将沉淀在室温进行晾干；
S13’. 晾干的样品溶于二甲基亚砜后加入少量的三乙胺，将混合液滴加到过量的乙二胺二甲基亚砜溶液中，滴加时间不少于1.5h，滴加完毕室温继续反应5h；反应结束后按二甲基亚砜和乙醇1︰2～5的体积比加入无水乙醇，析出沉淀后离心去除上清液，并对沉淀进行5～8次的洗涤，用1kDa分子量透析袋透析3天后将透析袋中保留液冷冻干燥，得到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖。
本发明所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的制备方法，不仅反应条件温和，反应效率较高；而且制备的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子易溶于水、氨基的接枝率较高，且保留了β-1,3-D-葡聚糖的基本化学链结构及其生理活性；纳米粒子稳定性好，抗原包封率高，不需要有毒溶剂。
优选地，步骤S2的具体过程如下：
S21：将水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖加水配成浓度为0.7～1.1mg/mL，pH值为6～7的溶液；
S22：分别配置离子交联剂水溶液和抗原蛋白水溶液，浓度分别为0.1～2.38mg/mL和0.6～1.4mg/mL；
S23：将离子交联剂水溶液和抗原蛋白水溶液等体积混匀，将其逐滴滴加到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖溶液中并混匀，即可获得负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子。
更优选地，步骤S21中水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖的浓度为0.7～0.9mg/mL。
更优选地，步骤S22中所述离子交联剂的水溶液为三聚磷酸钠水溶液，溶度为0.8～1.8mg/mL或者CpG-OND寡核苷酸水溶液，浓度为0.1～2.38mg/mL。
本发明还保护所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
本发明公开了一种纳米颗粒疫苗，所述疫苗佐剂包含有上述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的粒径较小，为100～1200nm，水溶性好，抗原蛋白的包封率高，最高能达到86.5%；能保持抗原蛋白的结构和免疫原性的稳定，并且能够持续释放抗原蛋白，蛋白持续释放时间超过125h，5h内释放率低于40%；能明显提高动物体内IgG1和IgG2a抗体的滴度。同时，β-1,3-D-葡聚糖既起到抗原载体的作用，又作为免疫增强剂起作用，而且β-1,3-D-葡聚糖与离子交联剂发挥协同作用，使得负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的免疫效果更好。
（2）本发明所述水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖制备方法简单，反应条件温和，反应效率较高。所得到的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖，氨基的接枝率较高，易溶于水，且保留了β-1,3-D-葡聚糖的基本化学链结构及其生理活性；负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的制备方法简单，条件温和，保持抗原蛋白的结构和免疫原性的稳定，纳米粒子的抗原包封率高，并且能够持续释放抗原蛋白。
附图说明
图1为所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子制备过程示意图。
图2为β-1,3-D-葡聚糖样品纯化前后的形貌图。其中，图2（A）为β-1,3-D-葡聚糖样品纯化前的形貌图；图2（B）为β-1,3-D-葡聚糖样品纯化后的形貌图。
图3为实施例1制备的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的扫描电镜图。其中，图3（A）为表1中添加三聚磷酸钠作为离子交联剂的配方三制备的TPP-AG-OVA纳米粒子的扫描电镜图；图3（B）为添加CpG-OND寡核苷酸作为离子交联剂的氮磷比为5制备的CpG-OND-AG-OVA纳米粒子的扫描电镜图。
图4为负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的抗原体外释放曲线。其中，TPP-AG-OVA为配方三制备得到，CpG-OND-AG-OVA为氮磷比为5制备得到。
图5为负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子与对比例处理组中动物体内IgG1滴度结果。
图6为负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子与对比例处理组中动物体内IgG2滴度结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子的制备
1、水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖的制备
（1）称取5g纯度为70%～80%的β-1,3-D-葡聚糖，倒入烧瓶，加入200mL甲酸，90℃磁力搅拌回流4h；反应完毕将甲酸旋转蒸发至少量，冷却至室温搅拌，按甲酸和乙醇1︰4的体积比加入无水乙醇，析出沉淀，离心分离，用无水乙醇对沉淀进行6次的洗涤，然后冷冻干燥。将冷冻干燥后的样品2g，倒入烧瓶，加入200mL去离子水，90℃磁力搅拌回流4h；再将去离子水旋转蒸发至少量，冷却至室温，按去离子水和乙醇1:4的体积比加入无水乙醇，析出沉淀，离心分离，沉淀冷冻干燥即得到纯化β-1,3-D-葡聚糖。
（2）称取0.162g纯化β-1,3-D-葡聚糖溶于30mL无水二甲基亚砜，加入0.5g N'N-羰基二咪唑，在氮气保护下室温反应1.5h；随后加入120mL无水乙醇，析出沉淀，离心分离，并用无水乙醇洗涤沉淀6次，室温下自然干燥；再将样品溶于10mL二甲基亚砜，加入0.5mL的三乙胺，将混合液滴加到20mL的乙二胺中，滴加时间不少于1.5h，滴加完毕室温下继续反应5h；反应结束后加入120mL无水乙醇，析出沉淀，离心分离，用无水乙醇洗涤沉淀6次，用1kDa分子量透析袋透析3天，将透析袋中保留液冷冻干燥，得到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖，所得水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖含氮量为8.42%。
β-1,3-D-葡聚糖样品经甲酸纯化后，样品的分散性更好，从图2可看出样品纯化后颜色由淡黄色变为纯白色，并且葡聚糖的纯度达到98.6%。
、负载抗原过程
（1）离子交联剂为三聚磷酸钠的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子（TPP-AG-OVA）：
将水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖溶于去离子水中，配置溶液的浓度为0.7～1.1mg/mL，调节pH至6～7.0；取5mL上述胺化β-1,3-D-葡聚糖溶液，在1200rpm磁力搅拌下逐滴滴加入鸡卵清白蛋白水溶液（0.5mL，0.6～1.4mg/mL，即按照糖与鸡卵清蛋白质量比8～12︰1）和三聚磷酸钠水溶液（0.5mL，0.8～1.8mg/mL，即按照糖与三聚磷酸钠质量比6～8︰1）混合液，室温搅拌10min，形成负载抗原蛋白的胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子溶液。
按照表1中的配方调整上述原料的用量，制备得到不同的TPP-AG-OVA。
表1制备TPP-AG-OVA的配方
（2）离子交联剂为CpG-OND寡核苷酸的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子（CpG-OND-AG-OVA）：
将水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖溶于去离子水中，配置溶液的浓度为0.7mg/mL，调节pH至7.0；取5mL上述胺化β-1,3-D-葡聚糖溶液，在1200rpm磁力搅拌下逐滴滴加入鸡卵清白蛋白水溶液（0.5mL，0.6mg/mL）和CpG-OND寡核苷酸水溶液（0.5mL，0.1～23.8mg/mL，即N/P比0.5～100）的混合液，室温搅拌10min，形成负载抗原蛋白的胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子溶液。
通过控制水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖和CpG-OND寡核苷酸的用量，将其氮磷比控制在0.5～100，制备得到不同的CpG-OND-AG-OVA。
性能测试
1、基本物理性质测试
（1）外观和粒径大小
将制备得到的TPP-AG-OVA和CpG-OND-AG-OVA进行电镜扫描，得到的扫描图如图3所示，其中图3（A）为表1中添加三聚磷酸钠作为离子交联剂的配方三制备的TPP-AG-OVA纳米粒子的扫描电镜图；图3（B）为添加CpG-OND寡核苷酸作为离子交联剂的氮磷比为5制备的CpG-OND-AG-OVA纳米粒子的扫描电镜图。
当配方不同时，纳米粒子的粒径有所轻微的变化，其变化范围为100～1200nm。
（2）抗原的包封率
包封率的测试方法和计算方法参考文献“A novel antigen delivery systeminduces strong humoral and CTL immune responses”（Biomaterials 134 (2017) 51-63. Z. Yang, M. Xu, Z. Jia, Y. Zhang, L. Wang, H. Zhang, et al.）。具体步骤为：首先测定加入的OVA蛋白的总质量，待粒子形成后12000rpm离心，测定上清中OVA的质量。负载入粒子中的抗原质量等于加入的OVA蛋白总质量减去离心后上清中的OVA质量，包封率的计算公式如下：
包封率的计算公式为：包封率=负载入粒子中的抗原质量*100%/加入的抗原总质量。所述纳米粒子抗原包封率为30.4～86.5%。
（3）分散性和Zeta电位
样品的分散系数越小，代表样品粒径越均一；样品的Zeta电位为正电荷时，所带电荷越多，越有利于纳米粒子与带负电荷的细胞膜相互作用；但电荷过多时，导致纳米粒子带有毒性。
实施例1中制备的TPP-AG-OVA纳米粒子的分散性、Zeta电位和抗原的包封率结果见表2所示。
表2 不同配方TPP-AG-OVA纳米粒子的结构参数
从表2中可知，上述配方所制备的TPP-AG-OVA纳米粒子均带正电荷，有利于其与带负电荷的细胞膜相互作用，同时抗原的包封率较好，最高能达到86.50%。当纯化β-1,3-D-葡聚糖的浓度在0.7～0.9 mg/mL，即水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖的用量在3.5～4.5mg时，TPP-AG-OVA纳米粒子中抗原的包封率更优。
实施例1中制备的CpG-OND-AG-OVA纳米粒子的分散性、Zeta电位和抗原的包封率结果见表3所示。
表3 不同配方CpG-OND-AG-OVA纳米粒子的结构参数
从表3中可知，当水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖和CpG-OND寡核苷酸的氮磷比为5～100时，所制备的纳米粒子均带正电荷，有利于其与带负电荷的细胞膜相互作用。而当水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖和CpG-OND寡核苷酸的氮磷比为0.5～1时，制备的纳米粒子不仅带负电荷，不利于其与细胞膜的相互作用，而且抗原和CpG-OND寡核苷酸的包封率均较低，降低了其免疫调节能力。因此，当水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖和CpG-OND寡核苷酸的氮磷比为0.5～1时，不适合制备本发明所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子（CpG-OND-AG-OVA）。
、测试TPP-AG-OVA和CpG-OND-AG-OVA两种纳米粒子体外释放抗原的情况
取实施例1中配方三制备的TPP-AG-OVA和N/P为5的CpG-OND-AG-OVA两种类型的纳米粒子分散于1mL PBS，随后将分散液置于37℃，200rpm恒温振荡器中振荡，间隔不同时间将分散液于12000rpm离心，取0.1mL上清液测蛋白的浓度，同时向离心后的样品中补加0.1mL PBS，并用涡旋振荡器将沉淀与溶液混合均匀后，继续于恒温振荡器中振荡释放。重复上述实验过程，获得两种类型的负载鸡卵清白蛋白的纳米粒子体外释放结果。
两种纳米粒子的抗原体外释放曲线如图4所示。从图中可知配方三制备的TPP-AG-OVA在体外持续释放抗原长达125h，且5h内的释放率低于30%。N/P为5的CpG-OND-AG-OVA在体外持续释放抗原的时间在125h以上，且5h内的释放率低于40%。以上结果说明本发明制备的TPP-AG-OVA和CpG-OND-AG-OVA两种类型的纳米粒子的稳定性较好，且能长时间的持续释放抗原，有利于持续地产生免疫反应，可以减少疫苗的使用剂量和注射次数。
3、TPP-AG-OVA和CpG-OND-AG-OVA两种纳米粒子对小鼠体内抗体滴度的影响
选取6-8周龄SPF Balb/C小鼠42只，分成7组，每组6只。第一组为不加佐剂的鸡卵清白蛋白组（OVA，对比例1），第二组为水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖和鸡卵清白蛋白共混组（AG+OVA，对比例2），第三组为CpG-OND寡核苷酸和鸡卵清白蛋白共混组（CpG-OND+OVA，对比例3），第四组为负载鸡卵清白蛋白的三聚磷酸钠交联胺化水溶性β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子组（TPP-AG-OVA，实施例1中配方三），第五组为负载鸡卵清白蛋白的CpG-OND寡核苷酸交联胺化水溶性β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子组（CpG-OND-AG-OVA，实施例1中N/P为5），第六组为鸡卵清白蛋白铝佐剂阳性对照组（Alum，对比例4），第七组为鸡卵清白蛋白弗氏佐剂阳性对照组（Freund's adjuvant，对比例5）。每只小鼠皮下注射0.2mL，免疫三次，每次间隔两周，免疫前和最后一次免疫两周后取血，测定各组抗原特异性IgG1和IgG2a抗体滴度，结果见图5和图6所示。
从图5和图6中可知，与对比例1～3组相比，经TPP-AG-OVA和CpG-OND-AG-OVA处理后小鼠体内的IgG1和IgG2滴度明显上升，特别是CpG-OND-AG-OVA处理组，其小鼠体内IgG1和IgG2滴度基本与对比例4和5中的阳性对照持平，甚至IgG2滴度远远高于对比例4中的阳性对照；可见，本发明提供的负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子可明显提高小鼠体内IgG1和IgG2滴度，特别是当离子交联剂为CpG-OND寡核苷酸时，可明显增强小鼠的免疫活力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
离子交联剂 0.06～1.19份；
抗原蛋白 0.3～0.7份；
其中，所述离子交联剂为低分子量阴离子交联剂；
所述离子交联剂为三聚磷酸钠或CpG-OND寡核苷酸；
所述抗原蛋白为鸡卵清白蛋白；
所述纳米粒子的制备方法包括以下步骤：
S11：用甲酸纯化β-1,3-D-葡聚糖；
S12：将纯化的β-1,3-D-葡聚糖溶于溶剂，再加入N'N-羰基二咪唑，在氮气保护下室温反应1.5h，反应结束后析出、洗涤、干燥；其中，N'N-羰基二咪唑和β-1,3-D-葡聚糖的质量比为0.167～0.5︰0.162～0.486；
S13：将步骤S1-2得到的干燥样品溶于溶剂，再与少量的三乙胺混合，将得到的混合液滴加到过量的乙二胺溶液中，滴加时间不少于1.5h，滴加完毕室温继续反应5h，随后析出、洗涤，用1kDa分子量透析袋透析3天后将透析袋中的保留液冷冻干燥，得到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖；
S21：将水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖加水配成浓度为0.7～1.1mg/mL，pH值为6～7的溶液；
S22：分别配置离子交联剂水溶液和抗原蛋白水溶液，浓度分别为0.1～2.38mg/mL和0.6～1.4mg/mL；
S23：将离子交联剂水溶液和抗原蛋白水溶液等体积混匀，将其逐滴滴加到水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖溶液中并混匀，即可获得负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子；
步骤S22中所述离子交联剂的水溶液为三聚磷酸钠水溶液，浓度 为0.8～1.8mg/mL或者CpG-OND寡核苷酸水溶液，浓度为0.1～2.38mg/mL。
2.根据权利要求1所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
三聚磷酸钠 0.4～0.9份；
抗原蛋白 0.3～0.7份。
3.根据权利要求1所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子，其特征在于，所述纳米粒子包括以下重量份数的原料组成：
水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖 3.5～5.5份；
CpG-OND寡核苷酸 0.06～1.19份；
抗原蛋白 0.3～0.7份。
4.权利要求1～3任一所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子在制备纳米颗粒疫苗中的应用。
5.一种纳米颗粒疫苗，其特征在于，包含有权利要求1～3任一所述负载抗原的水溶性胺化β-1,3-D-葡聚糖纳米粒子。
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| 生物材料用水溶性胺化酵母葡聚糖的制备;金静维等;《2015 年全国高分子学术论文报告会论文摘要集》;20151021;参见全文 * |
| 葡聚糖-精胺作为CpG ODN 输送载体效果的初步探究;陈磊等;《基因组学与应用生物学》;20161231;第35卷(第7期);参见第1738-1739页前言部分 * |
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