CN112451659A - 一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可德兰多糖‑季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方法和应用，属于疫苗佐剂制备技术领域。本发明制备得到一种性质稳定、能够很好地吸附抗原的可德兰多糖‑季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒，该纳米颗粒形态均一，稳定性佳，能够长期保存；同时，其能够荷载流感抗原到达作用部位，并达到免疫佐剂的效果，提高疫苗的免疫效果。因此，可作为黏膜(如鼻腔)流感疫苗等的免疫佐剂使用，具有良好的实际生产和应用之价值。

Description

一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于疫苗佐剂制备技术领域，具体涉及一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
流行性感冒是由流感病毒引起的一种高传染性急性呼吸道疾病。据世界卫生组织估计，全球每年由于季节性流感导致患严重疾病的人高达350万，并导致29万-65万人死亡。流感病毒具有高致病性、高致死率以及容易发生抗原漂移等特点，现今还未研发出有效治疗其感染的抗病毒药物。因此，进行疫苗接种仍然是流感防治的最主要手段。
目前，国际上上市使用的流感疫苗大多都是流感灭活疫苗。虽然灭活疫苗具有较好安全性，但是其免疫效果差，需要多次接种，使用的抗原量大。由于流感病毒主要通过呼吸道黏膜部位感染人体，鼻腔免疫疫苗能够模拟机体自然感染过程，从第一防线抵御病毒感染，能够同时诱导黏膜免疫应答和系统免疫应答，这使鼻腔免疫疫苗也成为了流感疫苗主要研究方向。但是，这些疫苗研发过程中存在着鼻腔免疫效果差且免疫原性差，这需要合适的免疫佐剂来辅助疫苗产生免疫效果。现有常于流感疫苗的佐剂在新型疫苗研究中存在许多问题，铝佐剂在鼻腔免疫时不能充分激发抗原的免疫反应或者免疫效果差，副作用明显，这些都影响了其在流感疫苗中的使用。因此，开发新型的佐剂以弥补传统佐剂的不足已迫在眉睫。大量研究证明，多糖能够作用于免疫系统，引起强而广泛的免疫应答，并且具良好的生物相容性，低毒。某些多糖更具有良好的载体性能，可以很好地荷载抗原进入机体。因此，多糖佐剂为鼻腔免疫流感疫苗的研究提供了更多可能。
可德兰多糖(curdlan)能刺激巨噬细胞NF-κB的活化，但是其溶解性较差。前期研究表明，将水溶性的硫酸化可德兰多糖和6-O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(OHTCC)制备形成纳米粒在体外实验中能够提高免疫细胞的功能，引起交叉递呈。荷载模式抗原OVA对小鼠滴鼻给药后，能够很好的提高免疫应答和血清中IgG、IgA的水平，改善OVA引发的Th2型免疫偏差。但是，发明人发现，这种纳米颗粒需要现配现用，稳定性不易保障。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明制备得到一种性质稳定、能够很好地吸附抗原的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒，从而可将其应用于鼻部流感疫苗，经试验证明，可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒可以能够稳定长期保存并且荷载流感抗原到达作用部位，并达到免疫佐剂的效果，提高疫苗的免疫效果。基于上述研究结果，从而完成本发明。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：将6-O-季铵化壳聚糖加入(优选采用滴加方式进行)活化后的琥珀酰化可德兰多糖中混合均匀纯化后得可德兰多糖-季铵化壳聚糖(C-O)结合物固体。
本发明的第二个方面，提供上述制备方法制得的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。经试验证明，该纳米颗粒的粒径为190.53±4.22nm，PDI为0.216±0.032，形态比较均一；Zeta电位为15.93±1.29mV，能稳定存在6周，因此具有较好的稳定性。
本发明的第三个方面，提供上述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒在制备疫苗中的应用。
具体的，所述应用为：将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒作为佐剂使用。经试验证明，本发明制得的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒能够荷载流感抗原到达作用部位，并达到免疫佐剂的效果，提高疫苗的免疫效果。
所述疫苗可以为流感疫苗、新冠肺炎疫苗、严重急性呼吸综合征(SARS)疫苗等预防病毒、细菌感染性疾病的疫苗，更具体为黏膜免疫疫苗。
本发明的第四个方面，提供一种鼻腔流感疫苗，所述鼻腔流感疫苗包含上述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次报道制备得到一种性质稳定、能够很好地吸附抗原的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒，该纳米颗粒形态均一、稳定性好、能够长期保存；同时，其能够荷载流感抗原到达作用部位，并达到免疫佐剂的效果，提高疫苗的免疫效果。因此，可作为流感疫苗等的免疫佐剂使用，具有良好的实际生产和应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中OHTCC红外光谱图；a为壳聚糖；b为反应物A；c为反应物B；d为OHTCC；
图2为本发明实施例中OHTCC、琥珀酰化可德兰多糖(C-C)和C-O的红外扫描图谱；
图3为本发明实施例中C-O的1H NMR谱图；
图4为本发明实施例中C-O纳米颗粒的形态、粒径、电位和稳定性；其中，A.透射电子显微镜观察；B.粒径分布；C.电位分布；D.稳定性；
图5为本发明实施例中C-O纳米粒对重组HA免疫小鼠血清中anti-H1N1s水平的影响；其中，A.采用间接ELISA法对鼻腔免疫后7天、14天和28天小鼠血清进行H1N1特异性IgG检测；B.首次免疫第28天后各组对IgG1/IgG2a表达的影响；C.首次免疫第28天后各组对IgG1表达水平的影响；D.首次免疫第28天后各组对IgG2a表达水平的影响；与PBS对照组相比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与Alum+HA组相比较，！p<0.05,！！p<0.01；与HA组相比较，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001(n＝7)；
图6为本发明实施例中C-O纳米粒对小鼠脾淋巴细胞活性的影响；其中，A.CD3+CD4+淋巴细胞比例变化；B.CD3+CD8+淋巴细胞比例变化；C.CD3+CD4+淋巴细胞比例统计；D.CD3+CD8+淋巴细胞比例统计；E.CD4+CD69+淋巴细胞比例统计。与PBS对照组相比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与Alum+HA组相比较，！p<0.05；与HA组相比较，##p<0.05，##p<0.01(n＝3)；
图7为本发明实施例中C-O纳米粒对APCs活性的影响；其中，A.F4/80+巨噬细胞占比B.CD11c+细胞平均荧光强度C.CD11c+CD86+细胞在脾细胞中占比D.CD11c+CD86+细胞在脾细胞中占比E.CD11c+CD80+细胞在脾细胞中占比F.CD11c+MHCII+细胞在脾细胞中占比。与PBS对照组相比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与Alum+HA组相比较，！p<0.05,！！p<0.01；与HA组相比较，#p<0.05，##p<0.01(n＝3)。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
如前所述，将水溶性的硫酸化可德兰多糖和6-O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(OHTCC)制备形成纳米粒在体外实验中能够提高免疫细胞的功能，引起交叉递呈。荷载模式抗原OVA对小鼠滴鼻给药后，能够很好的提高免疫应答和血清中IgG、IgA的水平，改善OVA引发的Th2型免疫偏差。但是这种纳米颗粒需要现配现用，稳定性不易保障。因此，寻找新的方法对纳米颗粒进行改进，以制备性能稳定的多糖免疫佐剂。
有鉴于此，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括：将6-O-季铵化壳聚糖加入(优选采用滴加方式进行)活化后的琥珀酰化可德兰多糖中混合均匀纯化后得可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物(C-O)固体。
本发明的又一具体实施方式中，6-O-季铵化壳聚糖与琥珀酰化可德兰多糖的质量比为1～10:1，优选为5:1。
本发明的又一具体实施方式中，反应在水溶液中进行，因此6-O-季铵化壳聚糖与琥珀酰化可德兰多糖均溶于水中，控制琥珀酰化可德兰多糖的浓度为1～3mg/mL。
本发明的又一具体实施方式中，所述活化处理可采用EDC/NHS进行活化处理；具体活化处理方法为：将EDC和NHS加入琥珀酰化可德兰多糖溶液中，低温活化处理10～60min，优选为4℃活化处理40min。
本发明的又一具体实施方式中，所述混合均匀采用搅拌方式进行，具体为在室温下搅拌处理20～30h，优选为24h。
本发明的又一具体实施方式中，所述纯化步骤具体为：将反应液透析纯化，冷冻干燥后即得可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物(C-O)固体。
本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物固体通过超声分散的方式制备可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒，具体的，所述方法包括：将C-O固体溶于酸液中，并用碱液调节pH至中性，然后溶于磷酸盐缓冲溶液中进行低温超声处理。
本发明的又一具体实施方式中，所述酸液为盐酸溶液，pH为6。
所述超声处理采用间隔处理方式，超声处理具体方法为：超声处理2-4min，中间间隔1-2min，共超声处理2～4次，通过采用多次间隔超声处理的方式，有利于将可德兰多糖-季铵化壳聚糖固体分散为纳米颗粒。
本发明的又一具体实施方式中，所述琥珀酰化可德兰多糖可采用如下方法获得：
将无水DMSO加入可德兰多糖中得可德兰多糖溶液，然后向其中加入琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，加热并冷凝回流处理，反应后加入无水乙醇，纯化即得。
本发明的又一具体实施方式中，反应过程中应避免水的引入。
本发明的又一具体实施方式中，可德兰多糖、琥珀酸酐与4-二甲氨基吡啶的质量比为1000:200-500:100-300；优选为1000:370:160；通过控制各原料的加入用量和比例，从而控制可德兰多糖的琥珀酰化程度。
本发明的又一具体实施方式中，加热并冷凝回流处理具体方法为：加热至40-60℃(优选为50℃)，冷凝回流处理5-10h(优选为8h)。
本发明的又一具体实施方式中，加入无水乙醇处理具体方法为：加入无水乙醇后剧烈搅拌处理0.5～2h(优选为1h)。
本发明的又一具体实施方式中，所述纯化方法包括：将经无水乙醇处理后的溶液过滤得白色沉淀，加水透析纯化，冷冻干燥后即得。
所述6-O-季铵化壳聚糖可采用现有已公开的方法获得，在本发明的一个具体实施方式中，提供如下方法：
将壳聚糖溶于醋酸水溶液中搅拌充分溶胀过夜；
向壳聚糖溶液中加入苯甲醛搅拌得乳白色反应液，调节pH至中性，收集沉淀，纯化得N-苯亚甲基壳聚糖(A)；
将反应物A粉碎后加入异丙醇溶解升温后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，搅拌反应，纯化后得6-O-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖(B)；
将反应物B溶于盐酸乙醇溶液中搅拌处理去除大部分溶剂，加入水，并用丙酮沉淀过夜，收集沉淀后纯化即得。
本发明的又一具体实施方式中，壳聚糖与苯甲醛的质量比为1～3:6～10；优选为1.5:7.9；
本发明的又一具体实施方式中，向壳聚糖溶液中加入苯甲醛后搅拌处理0.5～3h，优选为1h；
本发明的又一具体实施方式中，纯化得N-苯亚甲基壳聚糖(A)中纯化具体方法为：甲醇洗涤沉淀，烘干。
本发明的又一具体实施方式中，壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1～3:1～20；优选为1.5:13.5；
本发明的又一具体实施方式中，搅拌反应具体为：10～20h，优选为16h；
本发明的又一具体实施方式中，纯化后得6-O-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖(B)中纯化具体方法为：甲醇洗涤沉淀，烘干。
本发明的又一具体实施方式中，所述收集沉淀后纯化具体方法为：将沉淀溶于水后透析纯化，冷冻干燥后即得6-O-季铵化壳聚糖(OHTCC)。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方法制得的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。经试验证明，该纳米颗粒的粒径为190.53±4.22nm，PDI为0.216±0.032，形态比较均一；Zeta电位为15.93±1.29mV，能稳定存在6周，因此具有较好的稳定性。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒在制备疫苗中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述应用为：将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒作为佐剂使用；进一步作为黏膜给药疫苗佐剂使用。经试验证明，本发明制得的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒能够荷载流感抗原到达作用部位，并达到免疫佐剂的效果，提高疫苗的免疫效果。
本发明的又一具体实施方式中，所述疫苗为预防病毒、细菌感染性疾病的疫苗，包括但不限于流感疫苗、新冠肺炎疫苗和严重急性呼吸综合征(SARS)疫苗，更具体为黏膜免疫疫苗，进一步优选为鼻腔流感疫苗。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种鼻腔流感疫苗，所述鼻腔流感疫苗包含上述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
1.琥珀酰化可德兰多糖的制备方法
包括以下步骤:
(1)将可德兰多糖至于真空干燥箱37℃干燥24h。
(2)将分子筛4A至于圆底烧瓶中，放入马弗炉中在400℃下高温活化3～4h，冷却至100℃，将烧瓶内充氮气封口待其冷却至室温。将分子筛4A倒入DMSO和甲醇中，吸水干燥过夜。
(3)称取可德兰多糖1g至圆底烧瓶中，加入无水DMSO 100mL，边缓慢加入边剧烈搅拌。盖上瓶塞，室温搅拌过夜。
(4)称取琥珀酸酐370mg、DMAP 160mg，分别搅拌缓慢加入可德兰多糖溶液中，加热至50℃，冷凝回流反应8h。将反应后溶液中加入无水乙醇500mL，剧烈搅拌1h，过滤得到白色沉淀。将所得白色沉淀加水溶液，透析纯化48h。冷冻干燥得到琥珀酰化可德兰多糖(curdlan-COOH,C-C)。
2.6-O-季铵化壳聚糖的制备方法
包括步骤如下:
(1)取壳聚糖1.5g溶于10％的醋酸水溶液50mL中，40℃下搅拌充分溶胀过夜。
(2)向壳聚糖溶液中加入苯甲醛7.9g，搅拌反应1h，得到乳白色反应液。用1mol/LNaOH溶液调节反应液pH至中性，抽滤收集沉淀，用甲醇多次洗涤，烘干得N-苯亚甲基壳聚糖(A)。
(3)将反应物A研磨后，放入圆底烧瓶，加入异丙醇75mL，搅拌溶解。反应液加热到70℃，逐滴加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)13.5g，搅拌反应16h。将反应液抽滤，用甲醇洗涤两次，将其烘干得反应物6-O-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖(B)。
(4)将反应物B溶于0.25mol/L盐酸乙醇溶液50mL中，室温下搅拌24h。用旋转蒸发仪除去大部分的溶剂，加入少量的水，用丙酮250mL沉淀过夜，收集沉淀。将沉淀溶于水，透析纯化48h。透析后冷冻干燥，得到OHTCC。
结果：如图1所示，在OHTCC的制备工艺当中，首先用苯甲醛与壳聚糖的2位氨基形成schiff碱对氨基进行保护，在反应物A的红外光谱图中在690cm-1和760cm-1处出现芳环单取代的特征吸收峰，因此证明氨基上已被保护。将反应物A6位上的羟基进行性季铵化得到产物B，此时产物B不仅有芳环单取代的特征吸收峰，还在1480cm-1处出现了季铵基团上C-H的弯曲振动吸收峰，说明季铵基团被成功引入。将产物B放入酸性条件下脱保护，得到终产物OHTCC。在OHTCC红外图谱中，可以观察到芳环单取代的特征吸收峰消失，而1480cm-1处吸收峰保留，说明OHTCC制备成功。制得的OHTCC为白色絮状固体，产率为87.20％，按照文献计算其季铵化程度在30％左右。
3.可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒的制备方法
包括以下步骤:
(1)将可德兰多糖至于真空干燥箱37℃干燥24h。
(2)将分子筛4A至于圆底烧瓶中，放入马弗炉中在400℃下高温活化3～4h，冷却至100℃，将烧瓶内充氮气封口待其冷却至室温。将分子筛4A倒入DMSO和甲醇中，吸水干燥过夜。
(3)称取可德兰多糖1g至圆底烧瓶中，加入无水DMSO 100mL，边缓慢加入边剧烈搅拌。盖上瓶塞，室温搅拌过夜。
(4)称取琥珀酸酐370mg、DMAP 160mg，分别搅拌缓慢加入可德兰多糖溶液中，加热至50℃，冷凝回流反应8h。将反应后溶液中加入无水乙醇500mL，剧烈搅拌1h，过滤得到白色沉淀。将所得白色沉淀加水溶液，透析纯化48h。冷冻干燥得到琥珀酰化可德兰多糖(curdlan-COOH,C-C)，对其进行红外光谱和核磁共振(NMR)1H谱检测，并用氢氧化钠滴定法对其琥珀酰化程度进行检测。
(5)分别称取琥珀酰化可德兰多糖100mg、OHTCC 500mg，分别溶于去离子水50mL中。称取EDC 30mg和NHS 35mg加入到2mg/mL琥珀酰化可德兰多糖溶液中，4℃活化40min。用注射器吸取10mg/mL OHTCC溶液缓慢滴加到活化的琥珀酰化可德兰多糖溶液，并且室温搅拌反应24h。将反应液透析纯化48h，冷冻干燥后得到C-O固体，进行红外光谱和核磁共振(NMR)1H谱检测，利用元素分析法对所含琥珀酰化可德兰多糖和OHTCC的比例进行测定。
(6)称取C-O固体100mg溶于pH 6的盐酸溶液1mL中，用NaOH溶液调节pH至7，加入于0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)定容至50mL。将2mg/mL C-O溶液进行低温超声，每次超声3min，中间间隔1min，超声3次，制备得到C-O纳米粒。
结果：红外扫描图谱分析结果如图2所示，OHTCC在1480cm-1处可以观察到季铵盐基团上C-H的弯曲振动吸收峰，琥珀酰化可德兰多糖在1732cm-1处可以观察到可德兰多糖琥珀酰化以后的C＝O伸缩振动峰。同样，将琥珀酰化可德兰多糖与OHTCC连接形成的C-O中，也在1480cm-1处出现了季铵盐基团上C-H的弯曲振动吸收峰，1732cm-1处出现C＝O伸缩振动峰，同时在1573cm-1处观察到为琥珀酰化可德兰多糖琥珀酰基团上的羧基与OHTCC 2位上的氨基形成酰胺键上N-H的变形振动峰。证明琥珀酰化可德兰多糖已经连接到OHTCC上形成C-O。
C-O的1H NMR谱图如图3所示，其中δ＝3.5-4.0ppm信号峰是糖骨架上-CH-的化学位移。δ＝3.17ppm是季铵盐氮原子上甲基的质子的化学位移。位于两个羰基之间的-CH2CH2-的化学位移δ＝2.8-2.9ppm。进一步表明C-O制备成功。
可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒的具体理化性质研究：
对纳米颗粒进行电镜、粒径、电位、粒径稳定以及抗原吸附效率进行检测。
纳米粒粒径和电位检测：用Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪进行检测。
形态观察：将制备的纳米颗粒溶液滴加至通网上，用2％的磷钨酸进行染色30s，吸取多余染色液，自然挥干，置于透射电子显微镜下观察离子形态。
稳定性：将制备好的C-O纳米颗粒在4℃下放置14w，分别在第1、2、3、4、6、8、10、12、14w时对纳米颗粒的粒径进行测定，用粒径表示C-O纳米颗粒的长期稳定性。
结果：所述该纳米颗粒的粒径为190.53±4.22nm，PDI为0.216±0.032，形态比较均一；Zeta电位为15.93±1.29mV，能稳定存在6周，具有较好的稳定性。
可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米粒在鼻部给药流感疫苗中的应用:
(1)给药：将BALB/c小鼠随机分为7组，每组10只小鼠。分别设置PBS组、Alum+HA组、HA组、C-O/HA组、C-C/HA组、OHTCC/HA组和C/O/HA组。采用2次免疫接种，接种时间分别为第0天和第14天。接种时，用微量加样器缓慢进行鼻腔给药，左右鼻孔每次给药各5μL，分两次给药，两次间隔5min，共20μL。具体给药剂量见表。
Figure BDA0002807357080000151
(2)血清中H1N1特异性IgG、IgG亚型及IgG抗体检测：在首免疫后的第7、14、28天采用断尾取血，每次取血约200μL，室温静置30min后4000r/min离心15min，小心吸取血清，分装保存于-80℃。采用间接ELISA法检测血清中H1N1特异性IgG、IgG亚型抗体水平。
(3)流式细胞术检测脾细胞的表面标记：在首次免疫后第28天，每组取3只小鼠的脾细胞分别计数，调整细胞密度到2×107cells/孔。将细胞分装的EP管中，加入大鼠血清4℃条件下封闭30min，向各管中加入FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8a、PE-F4/80、PE-CD69、APC-CD80、PE-CD86、FITC-C11c、FITC-MHC II抗体，4℃避光孵育30min。用含有1％FBS的PBS洗涤细胞三遍并将细胞重悬。过200目筛布，收集细胞到10mL流式管中，采用流式细胞仪检测。结果：
采用间接ELISA法对鼻腔免疫后7天、14天和28天小鼠血清进行H1N1特异性IgG，结果如图5，A所示。随着时间的增加各实验组小鼠血清中IgG的含量有不同程度的上升。HA单独给药组对IgG的作用并不明显。在第28天时，与PBS对照组、Alum+HA组以及HA组相比，C-O/HA组能显著性的提高重组H1N1 HA特异性IgG的含量(***p<0.001，！！p<0.01，##p<0.01)，说明C-O纳米粒能提高HA免疫小鼠的特异性IgG水平。C/O/HA组也具有显著提高IgG的水平(**p<0.01，#p<0.05)。
检测首次免疫后28天小鼠血清中所含的H1N1特异性IgG亚型。如图5，C、D所示，Alum+HA及HA单独给药在提高IgG1和IgG2a的水平方面没有显现出显著作用。而C-O/HA和C/O/HA不仅能够显著性提高IgG1的水平(***p<0.001，**p<0.01)，也能显著性的提高IgG2a的水平(***p<0.001，**p<0.01)。OHTCC能够更为显著性的提高IgG2a的分泌水平(**p<0.01)。计算IgG1/IgG2a比值，发现铝佐剂能引起比值的显著提升(***p<0.001)。与Alum+HA组相比，C-O纳米粒、琥珀酰化可德兰多糖以及OHTCC能显著性的降低IgG1/IgG2a比值。与HA组相比，C-O也能降低IgG1/IgG2a比值，但是并没有显著性差异。
采用流式细胞术对首次免疫后28天的脾淋巴细胞的分群情况检测。用CD3抗体来标记T淋巴细胞，用CD4和CD8抗体标记CD4+T细胞和CD8+T细胞。滴鼻给药后T淋巴细胞亚群比例变化如图6，发现单独给HA不能引起CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例发生显著性的变化。C-O/HA、OHTCC/HA和C/O/HA均能显著性提高脾中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例，而C-C/HA能显著性提高CD8+T细胞的比例。并且C-O/HA促进CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例的效果优于其他各组。也研究了用CD69分子来标记CD4+T细胞的活化情况，结果如图6，E，发现C-O/HA组能显著性的提高CD4+CD69+阳性细胞的比例，证明C-O纳米粒不仅仅能够促进CD4+T细胞的比例，还能够有效促进CD4+T细胞的进一步活化。
用F4/80作为巨噬细胞的标志分子对脾脏内的巨噬细胞比例进行流式检测，结果如图7，A所示。与PBS对照组和HA单独给药组相比，C-O纳米粒荷载HA能显著提高小鼠脾脏中巨噬细胞的比例(**p<0.01，#p<0.05)。而其他各组并不能都够显著性募集巨噬细胞迁移到脾脏中。也对脾脏中DCs的比例和表型活化进行了检测，如图7，B，用CD11c标记DCs检测其平均荧光强度，发现C-O纳米粒能显著性提高脾脏中树突状细胞的数量(*p<0.05)。也对DCs细胞活化的表面标志分子进行检测，发现其与PBS对照组、Alum+HA组和HA组进行比较，均能使CD80、CD86以及MHC II的表达明显上调，说明C-O纳米粒能够促进H1N1 HA诱导的树突状细胞的活化，促进其成熟。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将6-O-季铵化壳聚糖加入活化后的琥珀酰化可德兰多糖中混合均匀纯化后得可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，6-O-季铵化壳聚糖与琥珀酰化可德兰多糖的质量比为1～10:1，优选为5:1；
优选的，反应在水溶液中进行，控制琥珀酰化可德兰多糖的浓度为1～3mg/mL。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活化处理采用EDC/NHS进行；
优选的，活化处理方法为：将EDC和NHS加入琥珀酰化可德兰多糖溶液中，低温活化处理10～60min，进一步优选为4℃活化处理40min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合均匀采用搅拌方式进行；优选为在室温下搅拌处理20～30h，进一步优选为24h。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤具体为：将反应液透析纯化，冷冻干燥后即得可德兰多糖-季铵化壳聚糖固体。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物通过超声分散的方式制备可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒；
优选的，所述方法包括：将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物溶于酸液中，并用碱液调节pH至中性，然后溶于磷酸盐缓冲溶液中进行低温超声处理；
所述酸液为盐酸溶液，pH为6；
所述超声处理采用间隔处理方式，超声处理具体方法为：超声处理2-4min，中间间隔1-2min，共超声处理2～4次。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述琥珀酰化可德兰多糖采用如下方法获得：
将无水DMSO加入可德兰多糖中得可德兰多糖溶液，然后向其中加入琥珀酸酐、4-二甲氨基吡啶，加热并冷凝回流处理，反应后加入无水乙醇，纯化即得；
优选的，反应过程中避免水的引入；
优选的，可德兰多糖、琥珀酸酐与4-二甲氨基吡啶的质量比为1000:200-500:100-300；优选为1000:370:160；
优选的，加热并冷凝回流处理具体方法为：加热至40-60℃(优选为50℃)，冷凝回流处理5-10h(优选为8h)；
优选的，加入无水乙醇处理具体方法为：加入无水乙醇后剧烈搅拌处理0.5～2h(优选为1h)；
优选的，所述纯化方法包括：将经无水乙醇处理后的溶液过滤得白色沉淀，加水透析纯化，冷冻干燥后即得；
所述6-O-季铵化壳聚糖，其制备方法包括：
将壳聚糖溶于醋酸水溶液中搅拌充分溶胀过夜；
向壳聚糖溶液中加入苯甲醛搅拌得乳白色反应液，调节pH至中性，收集沉淀，纯化得N-苯亚甲基壳聚糖(A)；
将反应物A粉碎后加入异丙醇溶解升温后加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，搅拌反应，纯化后得6-O-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖(B)；
将反应物B溶于盐酸乙醇溶液中搅拌处理去除大部分溶剂，加入水，并用丙酮沉淀过夜，收集沉淀后纯化即得；
优选的，壳聚糖与苯甲醛的质量比为1～3:6～10；优选为1.5:7.9；
优选的，向壳聚糖溶液中加入苯甲醛后搅拌处理0.5～3h，优选为1h；
优选的，纯化得N-苯亚甲基壳聚糖(A)中纯化具体方法为：甲醇洗涤沉淀，烘干；
优选的，壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1～3:1～20；优选为1.5:13.5；
优选的，搅拌反应具体为：10～20h，优选为16h；
优选的，纯化后得6-O-羟丙基三甲基氯化铵-N-苯亚甲基壳聚糖中纯化具体方法为：甲醇洗涤沉淀，烘干；
优选的，所述收集沉淀后纯化具体方法为：将沉淀溶于水后透析纯化，冷冻干燥后即得6-O-季铵化壳聚糖。
8.权利要求1-7任一项所述制备方法制得的可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。
9.权利要求8所述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒在制备疫苗中的应用；
优选的，所述应用为：将可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒作为疫苗佐剂使用；进一步优选为黏膜给药疫苗佐剂；
优选的，所述疫苗为预防病毒、细菌感染性疾病的疫苗，包括流感疫苗、新冠肺炎疫苗和严重急性呼吸综合征疫苗，更具体为黏膜免疫疫苗，进一步优选为鼻腔流感疫苗。
10.一种鼻腔流感疫苗，其特征在于，所述鼻腔流感疫苗包含权利要求8所述可德兰多糖-季铵化壳聚糖结合物纳米颗粒。
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