CN101721710A

CN101721710A - 胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子及制备方法

Info

Publication number: CN101721710A
Application number: CN 200910228301
Authority: CN
Inventors: 张其清; 李磊; 白永刚; 张彤; 唐洪波; 刘玲蓉; 李学敏; 周志敏
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2009-11-18
Filing date: 2009-11-18
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2029-11-18
Also published as: CN101721710B

Abstract

本发明涉及一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子及制备方法。它是以胆固醇、羧甲基可德兰多糖为原料，羧甲基可德兰的羧基经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)首先活化再与胆固醇反应合成，摩尔配比：羧甲基可德兰多糖∶胆固醇∶EDC∶NHS＝1∶0.2～0.5∶1∶0.5。本发明得到两亲性的聚合物，有利于纳米粒子的制备及疏水药物的包载，制备方法简单，重现性好，载药率高，易于工业化生产，且载药纳米粒子能大大延长药物在体内的作用时间，并能明显改变药物在不同脏器的分布，达到降低毒副作用、延长体内循环时间、提高药物的生物利用率的作用。

Description

胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子及制备方法

技术领域：

本发明涉及一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子及制备方法，即将水不溶性的可德兰多糖用氯乙酸进行亲水改性，再用胆固醇与羧甲基可德兰交联形成胆固醇基-羧甲基可德兰多糖偶合物，以及该聚合物多糖作为抗肿瘤药物载体包载药物的制备方法及其在动物体内的作用。

背景技术：

药物传递系统(drug delivery system，DDS)是国内外医药领域的重要研究方向，特别是与抗癌药物组成的纳米控缓释系统，运用特殊的载体将药物转变成稳定的纳米粒子，其突出优点是纳米微粒体积小，可在血液中自由运行，具有穿过靶组织内皮细胞的能力，可越过许多生物屏障到达病灶部位，可被肿瘤细胞摄取进入细胞内，将所包含的药物在细胞和/或亚细胞水平释放，在降低副作用的同时大大提高了药物疗效，还可提高难溶性药物的溶解性，增加药物与胃肠道液体的有效接触面积，有利于提高药物利用率。

作为药物载体，基于天然高分子材料制备自聚集纳米粒子得到更加广泛的关注。多糖是自然界比较丰富的天然高分子聚合物，许多多糖还具有抗肿瘤及免疫调节活性，因此对多糖及其衍生物进行修饰形成两亲性接枝共聚物在医药和生物技术领域有着广泛的应用。如壳聚糖、葡聚糖、普鲁兰，可德兰多糖等，其生物相容性好、毒性低，并具有纳米粒载体表面的修饰功能，能明显延长药物在体内的保留时间，避免吞噬细胞的吞噬，增加药物疗效。其中可德兰多糖(Curdlan)是粪产碱杆菌通过发酵产生的一种细菌性多糖，由1，3-β连接的D-葡萄糖单元构成的线性多糖，它有潜在的抑制艾滋病病毒感染、抗肿瘤活性、抗凝血活性，并且在体外和体内低毒。由于可德兰在温度升高到一定程度时有形成弹性凝胶的作用，并且它有强大的生物学活性，因此它常常被用作食品添加剂，具有良好的生物相容性，体内可降解，是一种良好的药物载体材料。可德兰不溶于水，这样限制了它的生物学应用。羧甲基取代是提高许多多糖功能特性的方法，可德兰的羧甲基衍生物有良好的水溶性和生物活性。研究表明，羧甲基可德兰有抗肿瘤活性，尽管它的这种抗肿瘤作用机制还不完全清楚(Sasaki T，et al：Cancer Res，1978，38：379-384)。羧甲基可德兰也许不是直接作用于肿瘤细胞，文献(Ohya Y，et al：Carbohydr Polym，1994，23：47-54)报道了胞壁酰二肽类似物(GADP)羧甲基可德兰偶联物的免疫增强活性，表明这种免疫增强活性不仅仅是使GADP具有了聚合物的特征，而且是因为GADP和具有免疫活性的多糖——可德兰的杂化引起的。

目前，对可德兰衍生物进行修饰的研究比较少，主要有磺酰脲修饰的羧甲基可德兰(Na K，et al：J Control Release，2000，69：225-236)；脱氧胆酸修饰的羧甲基可德兰(Gao F P，et al：Carbohydr Poly，2008，71：606-613)等等。胆固醇具有良好的生物相容性，有潜在的与细胞表面的胆固醇受体结合的作用(Yeagle PL，Biochimie，1991，73：1303-1310)，且有很强的促进胆固醇偶合物自聚集的作用(Yusa S，et al：Langmuir，1998，14：6059-6067)。但是，迄今为止，胆固醇与羧甲基可德兰多糖偶合物，通过透析加探头超声法制备纳米粒子作为抗肿瘤药物载体的研究尚未见任何文献或专利报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子及制备方法。本发明是一种新型，价廉易得，可大规模生产的纳米载体，并可提高纳米载体的靶向性，降低抗肿瘤药物的毒副作用，克服现有药物载体的一些不足。

本发明提供的一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子，它是以胆固醇、羧甲基可德兰多糖为原料，羧甲基可德兰的羧基经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)首先活化再与胆固醇反应合成，摩尔配比：羧甲基可德兰多糖∶胆固醇∶EDC∶NHS＝1∶0.2～0.5∶1∶0.5，具体步骤：

以异丙醇溶剂为可德兰多糖与氯乙酸反应，反应液在乙醚中沉淀，洗涤，干燥得到羧甲基可德兰多糖；羧甲基可德兰多糖在无水二甲基亚砜中用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化，再与胆固醇反应，产物在丙酮中沉淀，四氢呋喃洗涤，水中溶解，透析，冻干；最后生理盐水中透析，超声，经微孔滤膜过滤，即得自聚集纳米粒子。

所述的胆固醇(疏水基团)可以用胆酸、脱氧胆酸、5β-去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、十六酸、磺酰脲衍生物等替换。

所述的可德兰多糖分子量范围为8,000～2,000,000。

本发明提供的一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子的制备方法包括的步骤：

1)将可德兰多糖与异丙醇混合，室温下搅拌30min，然后加入30％氢氧化钠，至碱性，室温下搅拌90min得到均一溶液，然后加入氯乙酸，在50～60℃下反应5h；反应液倒入乙醚中使产物沉淀；沉淀分别用甲醇-乙酸(7∶3，v/v)，甲醇-水(4∶1，V/V)，甲醇，丙酮洗涤，干燥得羧甲基可德兰多糖，可德兰多糖与氯乙酸的摩尔比：(1∶0.75)；

2)羧甲基可德兰多糖通过水浴超声溶于无水二甲基亚砜中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化剂进行活化反应，室温下搅拌30min；

3)将溶有胆固醇的四氢呋喃溶液加入到羧甲基可德兰多糖溶液中，继续在45℃下反应48h，将反应混合物倒入丙酮中沉淀，过滤并收集沉淀，分别用水-四氢呋喃(1∶5，V/V)和四氢呋喃洗涤几次，最后将产物溶于水，用蒸馏水透析三天后冻干，得白色絮状物质。

4)将胆固醇基-羧甲基可德兰多糖溶于二甲基亚砜-水(1∶1，V/V)中，于生理盐水中透析24h，然后用探头超声仪40W超声2min，超声也采用脉冲工作方式，超声重复两次，经微孔滤膜过滤，即得胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子。

本发明提供的一种包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子，它是以胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子为载体，用硫酸铵梯度法包载抗肿瘤药物，载药纳米粒子的粒径为290～510nm。

所述的抗肿瘤药物与胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子的质量比为：1～5∶5。所述的包载药物为：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、全反式维甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱等。

本发明提供的包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子载药纳米粒子的制备方法包括的步骤：

1)将胆固醇基-羧甲基可德兰多糖分散于0.15mol/L的硫酸铵溶液，于37℃、50rpm的条件下振荡24h，用探头超声仪40W超声2min，然后置于透析袋中，在生理盐水中透析4h，即得空白胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子。

2)将抗肿瘤药物与载体材料按比例混合，避光下放置24h，采用超滤法(5000rpm，10mim)除去游离的药物，收集超滤管上层，冷冻干燥即得载药纳米粒子。

所述的透析袋的截留分子量为8～12kDa。

所述的超滤法中的超滤管的截留分子量为10kDa。

本发明公开了一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖的合成及其自聚集纳米粒的制备方法，以该复合物为载体的载药纳米粒的制备以及该载药纳米粒在动物体内的作用。首先通过对可德兰进行羧甲基化增强其水溶性，然后用胆固醇对其进行疏水改性，以得到一种两亲性的聚合物，以有利于纳米粒子的制备及疏水药物的包载。以表阿霉素为模型药物采用硫酸铵梯度法制备载药纳米粒子，并通过对大鼠体内的药代动力学和组织分布实验评价载药纳米粒子的作用。结果表明，用硫酸铵梯度梯度法制备载药纳米粒子方法简单，重现性好，载药率高，易于工业化生产，且载药纳米粒子能大大延长药物在体内的作用时间，并能明显改变药物在不同脏器的分布，达到降低毒副作用、延长体内循环时间、提高药物的生物利用率的作用。

本发明所述的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子形态呈球形，粒径呈单峰分布。本载体由胆固醇与羧甲基可德兰多糖经化学结合而成，结构稳定，能够包载双亲性和疏水性的抗肿瘤药物，延长药物在体内的循环时间，对药物有缓慢释放的作用，从而实现药物缓释、降低药物毒副作用；该材料具有良好的生物相容性、可降解性和无免疫原性，而且各种原料廉价易得，制备工艺简单方便、条件温和，是一种较好的抗肿瘤药物的载体材料。

附图说明

图1为羧甲基可德兰的¹H-NMR谱图。

图2为胆固醇偶联的羧甲基可德兰的¹H-NMR谱图。

图3为空白胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子的透射电镜照片。

图4为空白胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子的粒径分布图。

图5为包载表阿霉素的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子的透射电镜照片。

图6为包载表阿霉素的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子在大鼠体内的药物释放图。

图7为包载表阿霉素的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子在大鼠体内的组织分布图。

具体实施方式

实施例1：羧甲基可德兰(CMC)的化学合成

将分子量为81,000的可德兰多糖3g加入到80mL异丙醇中，室温下搅拌30min，然后加入8mL 30％氢氧化钠至上述反应液中，室温下继续搅拌90min。将3.6g氯乙酸加入上述反应液中，混合物继续在50～60℃搅拌5h，产物过滤收集，并分别用甲醇-乙酸(7∶3，v/v)混合溶剂，甲醇-水(4∶1，v/v)混合溶剂，甲醇，丙酮洗涤，除去未反应完全的氯乙酸，最后将沉淀溶于水，用蒸馏水透析三天，低压冻干，得到白色粉末。核磁法和电位滴定法测得羧甲基的取代度为75％。

羧甲基可德兰的氢核磁光谱(¹H-NMR)见图1(溶剂：氘代重水：D₂O)；与可德兰多糖相比，在δ4.5ppm出现羧甲基的质子信号峰，表明羧甲基连接于可德兰上。

实施例2：胆固醇基-羧甲基可德兰多糖偶合物(CCMC)的合成

将0.8g蓬松的羧甲基可德兰(CMC)(羧基含量：3mmoL)通过水浴超声溶于40mL无水二甲基亚砜(DMSO)，加入0.57g(3mmoL)碳二亚胺(EDC)和0.17g(1.5mmoL)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)室温下搅拌30min。然后将溶有0.35g(0.9mmoL)胆固醇的四氢呋喃溶液10mL加入到上述羧甲基可德兰多糖溶液中，继续在45℃下反应，48h后将反应混合物倒入200mL丙酮中沉淀，过滤并收集沉淀，分别用水-四氢呋喃(1∶5，V/V)、四氢呋喃洗涤3次，最后将产物溶于水，用蒸馏水透析三天后冻干，得白色絮状物质，即为胆固醇基-羧甲基可德兰多糖偶合物。高效液相法测得胆固醇的取代度为3.5％。

所得的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖的氢核磁光谱(¹H-NMR)见图1(溶剂：氘代二甲基亚砜∶氘代重水，DMSO-d6/D₂O，5/1，v/v)；与羧甲基可德兰相比在δ0.99～3.15ppm处出现胆固醇的特征峰，表明胆固醇是通过化学键连接在羧甲基可德兰上。

实施例3：包载表阿霉素的CCMC纳米粒子的制备

将胆固醇基-羧甲基可德兰多糖溶于二甲基亚砜-水(1∶1，V/V)中，于生理盐水中透析24h，然后用探头超声仪40W超声2min，超声也采用脉冲工作方式，超声重复两次，经微孔滤膜过滤，即得CCMC自聚集纳米粒子。CCMC自聚集纳米粒子形态呈均匀的球形，见图3；粒径呈单峰分布，见图4。

将20mg胆固醇基-羧甲基可德兰多糖分散于8mL硫酸铵溶液(0.15mol/L)中，于37℃、50rpm的条件下振荡24h，用探头超声仪40W超声2min，然后置于透析袋中，在生理盐水中透析4h，即得空白胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子，调整溶液浓度为2.0mg/mL。将20mg表阿霉素溶解于10mL生理盐水中，将药物/材料溶液按0.3∶1的体积比混合，避光下室温放置24h，采用超滤法除去游离的药物，收集超滤管上层。将沉淀重新分散，可得到载药纳米悬液。取200μL纳米悬液于10mL容量瓶中，加入DMSO使纳米粒溶解，在荧光分光光度计在λ_em 589nm测定吸收度。根据表阿霉素在DMSO中的标准曲线求出表阿霉素浓度，并计算出载药量和包封率。CCMC纳米粒子的载药量可以达到39.6％，最高包封率达73.8％。载药纳米粒子呈均匀的球形，见图5。

实施例4：包载表阿霉素的CCMC纳米粒子在动物体内的药代动力学和组织分布

采用Wister大鼠，通过尾静脉注射游离药物和载药纳米粒子，用高效液相法或荧光检测法分析药物在大鼠血液中的代谢情况，以及在大鼠不同脏器中的分布情况，评价载体材料的优缺点。

具体实施步骤：

将成年雄性Wister大鼠12只(中国医学科学院放射医学研究所提供)随机分为两组，通过尾静脉注射，按10mg/kg的药物剂量分别注射游离表阿霉素和包载表阿霉素的CCMC纳米粒子。给药后分别在第2，5，10，15，30min，1，2，4，8，12，24，36，48，96，168h通过外眼眶取血，每次0.3～0.5mL，加至含20μL肝素的2mL Eppendorf管中，离心分离血浆。然后加入氯仿-甲醇(4∶1)萃取液1.0mL，涡旋振荡2min，置于高速离心机中，4℃，10000r/min离心10min，将有机层全部转移至另一离心管中，重复提取两次，合并有机相，于37℃下氮气吹干，残渣加100μL色谱甲醇溶解，取20μL进高效液相检测。通过血药浓度标准曲线计算各时间点的血药浓度。结果见图6。结果表明包载表阿霉素的CCMC纳米粒子在体内的作用时间更长且呈现较高的药物浓度，能起到长循环和缓释作用。

将成年雌性Wister大鼠24只(中国医学科学院放射医学研究所提供)随机分为两组，每组设四个时间点，每个时间点有3只大鼠。通过尾静脉注射，按8mg/kg的药物剂量分别注射游离表阿霉素和包载表阿霉素的CCMC纳米粒子。给药后分别在第30min，8，24和72h处死大鼠，收集心、肝、脾、肺和肾等脏器，生理盐水清洗并用滤纸擦干，分别称取一定量脏器于1mL PBS(pH7.4)中匀浆，然后加入氯仿-甲醇(4∶1)萃取液1.0mL，涡旋振荡2min，置于高速离心机中，4℃，10000r/min离心10min，将有机层全部转移至另一离心管中，重复提取两次，合并有机相，于37℃下氮气吹干，残渣加100μL色谱甲醇溶解，用荧光分光光度计在λ_em 589nm下检测。通过组织脏器荧光浓度标准曲线计算各时间点的药物浓度。结果见图7。结果表明包载表阿霉素的CCMC纳米粒子能显著改变药物在体内的分布，大大降低药物在心脏和肾脏中的分布，提高药物在肝脏中的分布，从而显著降低了药物对心脏的毒副作用并减少了肾小球对药物的过滤作用，从而表明了胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子是一种有效的药物载体，具有临床应用价值。

Claims

1.一种胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子，其特征在于它是以胆固醇、羧甲基可德兰多糖为原料，羧甲基可德兰的羧基经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)首先活化再与胆固醇反应合成，摩尔配比：羧甲基可德兰多糖∶胆固醇∶EDC∶NHS＝1∶0.2～0.5∶1∶0.5，具体步骤：

2.按照权利要求1所述的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子，其特征在于所述的胆固醇用胆酸、5β-去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、十六酸或磺酰脲衍生物替换。

3.按照权利要求1所述的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子，其特征在于所述的可德兰多糖分子量范围为8,000～2,000,000。

4一种权利要求1所述的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖纳米粒子的制备方法，其特征在于包括的步骤：

1)将可德兰多糖与异丙醇混合，室温下搅拌30min，然后加入30％氢氧化钠至碱性，室温下搅拌90min得到均一溶液，然后加入氯乙酸，在50～60℃下反应5h；反应液倒入乙醚中使产物沉淀；沉淀分别用甲醇-乙酸(7∶3，v/v)，甲醇-水(4∶1，V/V)，甲醇，丙酮洗涤，干燥得羧甲基可德兰多糖，可德兰多糖与氯乙酸的摩尔比：(1∶0.75)；

3)将溶有胆固醇的四氢呋喃溶液加入到羧甲基可德兰多糖溶液中，继续在45℃下反应48h，将反应混合物倒入丙酮中沉淀，过滤并收集沉淀，分别用水-四氢呋喃(1∶5，V/V)和四氢呋喃洗涤3-4次，最后将产物溶于水，用蒸馏水透析三天后冻干，得白色絮状物质，得胆固醇基-羧甲基可德兰多糖；

4)将上述制得的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖溶于二甲基亚砜-水(1∶1，V/V)中，于生理盐水中透析24h，然后用探头超声仪40W超声2min，超声也采用脉冲工作方式，超声重复两次，经微孔滤膜过滤，即得胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子。

5.一种包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子，其特征在于它是以胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子为载体，用硫酸铵梯度法包载抗肿瘤药物，载药纳米粒子的粒径为290～510nm，所述的抗肿瘤药物与胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子的质量比为：1～5∶5。

6.按照权利要求5所述的包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子，其特征在于所述的包载抗肿瘤药物为：表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、全反式维甲酸、紫杉醇、甲氨蝶呤、喜树碱。

7.按照权利要求5所述的包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子，其特征在于所述的包载抗肿瘤药物为表阿霉素。

8.按照权利要求5所述的包载抗肿瘤药物的胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子载药纳米粒子的制备方法，其特征在于包括的步骤：

1)将胆固醇基-羧甲基可德兰多糖分散于0.15mol/L的硫酸铵溶液，于37℃、50rpm的条件下振荡24h，用探头超声仪40W超声2min，然后置于透析袋中，在生理盐水中透析4h，即得空白胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子；

2)将抗肿瘤药物与载体材料按比例混合，避光下放置24h，采用超滤法(5000rpm，10mim)除去游离的药物，收集超滤管上层，冷冻干燥即得载药胆固醇基-羧甲基可德兰多糖自聚集纳米粒子。

9.按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的透析袋的截留分子量为8～12kDa。

10.按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的超滤法中的超滤管的截留分子量为10kDa。