CN103524760B - 一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法,属于生物纳米材料技术领域。以脱氧胆酸、氧化可德兰多糖为原料,脱氧胆酸的羧基经1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)首先活化再与氧化可德兰多糖反应合成,得到的两亲性共聚物经探头超声法制备自组装纳米粒子。本发明得到的自组装纳米粒子,制备方法简单,重现性好,易于工业化生产,可作为抗肿瘤药物载体使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法,特指将水不溶性的可德兰多糖用4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基进行选择性氧化,再用活化的脱氧胆酸与氧化可德兰多糖偶联形成脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖共聚物,以及该共聚物多糖纳米粒子的制备方法,属于生物纳米材料技术领域。
背景技术
肿瘤是对人类健康和生命威胁最大的疾病之一,但是由于传统的抗肿瘤药物缺乏选择性,在治疗肿瘤的同时也对正常组织造成一定的毒副作用,从而限制了抗肿瘤药物的临床使用剂量。为了有效地治疗肿瘤,理想的抗肿瘤制剂必须有选择性,保证一定的药物治疗浓度并能够降低毒副作用等。随着纳米科学技术研究的不断深入,负载抗肿瘤药物的纳米给药系统正成为攻克这一难题的有效手段。
随着新材料、新方法、新技术的不断涌现,基于合成聚合物和天然高分子材料(尤其是可生物降解的多糖)制备纳米粒子得到广泛的关注。多糖是自然界丰富的天然高分子聚合物,许多多糖还具有抗肿瘤、免疫调节、抗病毒和抗氧化等多种生理活性,因此对多糖及其衍生物进行修饰形成两亲性共聚物在医药和生物技术领域有着广泛的应用。可德兰多糖(Curdlan)作为一种天然高分子聚合物,有着良好的生物相容性、可生物降解性、无毒性等特点,可通过化学反应引入各种改性基团,形成不同化学结构、不同性质和功能的衍生物。羧甲基取代是提高许多多糖水溶性和功能特性的方法,可德兰多糖的羧甲基衍生物有着良好的水溶性和抗肿瘤活性。目前,国内外科技工作者已通过疏水改性制备了两亲性羧甲基可德兰多糖衍生物(Carboxymethylcurdlan)共聚物,并制备了纳米粒子用于抗肿瘤药物载体。然而,在可德兰多糖进行羧甲基化反应过程中使用的氯乙酸为易挥发、有毒的有机试剂,不符合“绿色”化学的要求。
近年来,利用稳定的2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)及其衍生物来催化伯位羟基的氧化,已成为选择性氧化多糖伯羟基的一种重要的新方法。利用该氧化体系已经成功地制备了高水溶性和高羧基含量的C-6位氧化的可德兰多糖衍生物(Tamuraetal.,CarbohydratePolymers,2010,81:592-598.)。脱氧胆酸是一种内源性生理物质,生物相溶性好,具有两亲性,在水中可自组装形成胶束。但是,脱氧胆酸与氧化可德兰多糖共聚物,通过超声法制备纳米粒子作为抗肿瘤药物载体的研究尚未见任何文献或专利报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法。本发明是一种新型,绿色,价廉易得,可规模化生产的纳米载体,并可用于抗肿瘤药物的包载,降低毒副作用,提高靶向性。
本发明提供的一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子,它是以氧化可德兰多糖、脱氧胆酸为原料,脱氧胆酸的羧基经1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)首先活化再与氧化可德兰多糖反应合成。
以醋酸钠缓冲液为可德兰多糖和4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基反应,反应液在过量95%乙醇中沉淀,离心收集沉淀,水中溶解,透析,冷冻干燥得到氧化可德兰多糖;脱氧胆酸在无水二甲基亚砜中用1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化,再与氧化可德兰多糖反应,产物在95%乙醇中沉淀,离心收集沉淀,水中溶解,透析,冷冻干燥;最后水中分散,振摇,超声,经微孔滤膜过滤,即得自组装纳米粒子。
本发明提供的一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法,按照下述步骤进行:
1)将可德兰多糖、4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基和氯酸钠置于容器中,然后加入0.2mol/L醋酸钠缓冲液,用磁力搅拌器充分混匀,置于35℃恒温水浴中,迅速加入次氯酸钠,反应4h,加入过量95%乙醇沉淀,离心收集沉淀,水中溶解,透析,冷冻干燥,得到氧化可德兰多糖;其中所述的可德兰多糖、4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶、氯酸钠、次氯酸钠的摩尔比为6.0:0.45:6.0:1.0。
2)将脱氧胆酸溶于无水二甲基亚砜中,加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化剂进行羧基活化反应,室温下搅拌30min;其中所述的脱氧胆酸、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1.0:2.5:2.0。
3)氧化可德兰多糖通过加热搅拌溶于无水二甲基亚砜中,加入活化的脱氧胆酸混合液,继续在室温下反应48h,将混合液倒入95%乙醇中沉淀,离心并收集沉淀,水中溶解,透析,冷冻干燥,得到白色絮状物质;其中所述氧化可德兰多糖重复糖单元、活化脱氧胆酸的摩尔比为1:0.5。
4)将脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖分散于水中,37℃恒温水浴振荡锅中摇晃12~24h,然后用探头超声仪100W超声2min,采用间歇脉冲工作方式,超声过程在冰浴中进行,重复两次,经微孔滤膜过滤,即得脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子。
所述的脱氧胆酸(疏水基团)可用胆酸、5β-去羟基胆酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、软脂酸等替换。
所述的可德兰多糖的分子量为890000Da。
所述的透析袋的截留分子量为8000~12000Da。
本发明公开了一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖的合成及其纳米粒子的制备方法。首先通过对可德兰多糖进行选择性氧化增强其水溶性,然后用活化的脱氧胆酸对其进行疏水改性,以得到一种两亲性的共聚物,以利于纳米粒子的制备。探头超声法制备自组装纳米粒子方法简单,重现性好,易于工业化生产。
本发明所述的脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子形态呈球形,粒径呈单峰分布。本载体由脱氧胆酸和氧化可德兰多糖经化学结合而成,结构稳定,能够用作抗肿瘤药物载体,实现药物缓释和降低药物毒副作用;该材料具有良好的生物相容性、可降解性,而且各种原料廉价易得,制备工艺简单方便、条件温和,是一种理想的抗肿瘤药物的载体材料。
附图说明
图1为氧化可德兰多糖的13C-NMR谱图。
图2为脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖共聚物的1H-NMR谱图。
图3为脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子的透射电镜照片。
图4为脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子的粒径分布图。
具体实施方式
实施例1:氧化可德兰多糖的化学合成
分别称取1.4g氯酸钠、0.2g4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基和2.0g分子量为890000Da的可德兰多糖置于250mL具塞锥形瓶中,加入200mL0.2mol/L的醋酸钠缓冲液,充分溶解后,置于35℃恒温水浴中,迅速加入1.2mL次氯酸钠,反应4h,加入过量95%乙醇沉淀,产物离心收集,蒸馏水透析三天,冷冻干燥得白色絮状物质。电导滴定法测得羧基含量为2.1mmol/g。
氧化可德兰多糖的碳核磁共振光谱(13C-NMR)见图1(溶剂:氘代重水:D2O):与可德兰多糖相比,在δ175ppm出现羧基的碳信号峰,表明可德兰多糖发生氧化。
实施例2:脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖共聚物的合成
将100mg脱氧胆酸溶于20mL无水二甲基亚砜中,加入120mg1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和60mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS),室温下搅拌30min。然后将溶有0.2g氧化可德兰多糖的无水二甲基亚砜(DMSO)溶液20mL,加入到上述脱氧胆酸的混合液中,室温下继续反应48h,反应后将混合液倒入过量95%乙醇沉淀,离心收集沉淀,产物溶于水,蒸馏水透析三天,冷冻干燥得白色絮状物质,即为脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖共聚物。紫外分光光度法测得脱氧胆酸的取代度为5.0%。
所得的脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖的氢核磁共振光谱(1H-NMR)见图2(溶剂:氘代重水:氘代二甲基亚砜,D2O/DMSO-d6,3/1,v/v);与氧化可德兰多糖相比在δ0.6-2.0ppm处出现脱氧胆酸的特征峰,表明脱氧胆酸通过酯键连接到氧化可德兰多糖上。
实施例3:脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子的制备
取10mg脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖分散于10mL蒸馏水中,于37℃恒温水浴振荡锅中轻轻摇晃12~24h,然后用探头超声仪100W超声2min,超声采用脉冲工作方式,超声重复两次,微孔滤膜过滤即得脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖自组装纳米粒子。该纳米粒子形态呈均匀的球形,见图3;粒径呈单峰分布,见图4。
Claims (3)
1.一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子的制备方法,其特征在于按照下述步骤进行:
1)将可德兰多糖、4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基和氯酸钠置于容器中,然后加入0.2mol/L醋酸钠缓冲液,用磁力搅拌器充分混匀,置于35℃恒温水浴中,迅速加入次氯酸钠,反应4h,加入过量95%乙醇沉淀,离心收集沉淀,水中溶解,透析,冷冻干燥,得到氧化可德兰多糖;其中所述的可德兰多糖、4-乙酰胺-2,2,6,6-四甲基哌啶、氯酸钠、次氯酸钠的摩尔比为6.0:0.45:6.0:1.0;
2)将脱氧胆酸溶于无水二甲基亚砜中,加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化剂进行羧基活化反应,室温下搅拌30min;其中所述的脱氧胆酸、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1.0:2.5:2.0;
3)氧化可德兰多糖通过加热搅拌溶于无水二甲基亚砜中,分别加入步骤2)中活化的脱氧胆酸混合液,继续在室温下反应48h,将混合液倒入过量95%乙醇中沉淀,离心并收集沉淀,水中溶解,透析袋透析,冷冻干燥,得到白色絮状物质;其中所述氧化可德兰多糖重复糖单元、活化脱氧胆酸的摩尔比为1:0.5;
4)将脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖分散于水中,37℃恒温水浴振荡锅中摇晃12~24h,然后用探头超声仪100W超声2min,采用间歇脉冲工作方式,超声过程在冰浴中进行,重复两次,经微孔滤膜过滤,即得脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子的制备方法,其特征在于步骤1)所述的可德兰多糖的分子量为890000Da。
3.根据权利要求1所述的一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子的制备方法,其特征在于步骤3)所述的透析袋的截留分子量为8000~12000Da。
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