CN111333748B - 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途 - Google Patents

一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111333748B
CN111333748B CN202010187802.3A CN202010187802A CN111333748B CN 111333748 B CN111333748 B CN 111333748B CN 202010187802 A CN202010187802 A CN 202010187802A CN 111333748 B CN111333748 B CN 111333748B
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucuronic acid
beta
liquid
curdlan
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010187802.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111333748A (zh
Inventor
张真庆
郝杰
易琳
郁倩文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou University
Original Assignee
Suzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou University filed Critical Suzhou University
Priority to CN202010187802.3A priority Critical patent/CN111333748B/zh
Publication of CN111333748A publication Critical patent/CN111333748A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111333748B publication Critical patent/CN111333748B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于医药领域。本发明提供一种β‑1,3‑葡萄糖醛酸寡糖、其制备方法及用途。本发明提供具有式I表示结构的β‑1,3‑葡萄糖醛酸寡糖，其中M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1‑6烷基；和n为选自0‑200的一个或多个整数。本发明所述β‑1,3‑葡萄糖醛酸寡糖具有显著的治疗缺血性脑疾病的活性。
Figure DDA0002414808520000011

Description

一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途
本申请是申请日为2017年1月4日、申请号为201710004470.9、名称为“一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于医药领域，尤其涉及一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、其制备方法及用途。
背景技术
凝胶多糖(Curdlan)为β1→3连接的线性葡聚糖，由日本大阪大学Harada教授等于1966年从来源于土壤的细菌Agrobacterium biovar 1
(Alcaligenes faecalis var.myxogenes strain 10C3)的发酵产物中首次发现。凝胶多糖不溶于水。凝胶多糖经加热后可形成凝胶。凝胶多糖是继黄原胶、结冷胶之后，第三种经FDA批准可直接用作食品添加剂的微生物胞外多糖。此外，凝胶多糖还可作为增稠剂、稳定剂、成型剂。凝胶多糖被广泛的应用于保健、医药和建筑等领域。目前，日本、美国、加拿大等国家实现了工业化生产凝胶多糖。中国每年都要从国外进口多达上千吨的凝胶多糖。
葡萄糖醛酸是一种常见的糖类分子。葡萄糖醛酸在体内可作为糖胺聚糖的糖基部分的一部分，例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等；也可作为小分子糖苷的糖基部分。但是，自然界中不存在葡萄糖醛酸聚糖或葡萄糖醛酸寡糖。
近年来，随着公众生活水平的提高以及人口结构的日益老龄化，脑疾病的发病率和死亡率正上升趋势。在各种脑疾病中，缺血性脑疾病占主要部分。因此，存在研究新型治疗缺血性脑疾病的药物的需求。
发明内容
本发明提供一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、其制备方法及用途。本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖是凝胶多糖经氧化、水解后的产物。优选地，本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖包含2-20个通过β-1,3方式连接的葡萄糖醛酸重复单元。本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖具有显著的治疗缺血性脑疾病的活性。
本发明还提供制备所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的方法，包含以下步骤：(a)氧化凝胶多糖；(b)水解上述经氧化的凝胶多糖。在本发明方法中，在步骤(a)中将凝胶多糖的6位伯羟基氧化成羧基，得到β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖；在步骤(b)中将β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖水解成为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖。
本发明还提供包含一种或多种所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物。本发明还提供一种药物，包含所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物、以及任选地药学上可接受载体。
本发明还提供所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物用于制备治疗缺血性脑疾病的药物的用途。本发明还提供用于治疗缺血性脑疾病的所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或用于治疗缺血性脑疾病的所述包含一种或多种所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物。本发明还提供一种治疗缺血性脑疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物。
发明详述
本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖是凝胶多糖经氧化、水解后的产物。优选地，本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖包含2-20个通过β-1,3方式连接的葡萄糖醛酸重复单元。本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖涵盖所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、或其盐、酯、立体异构体、水合物、衍生物。本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖还涵盖包含一种或多种本发明所述具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物。
在一个方面，本发明提供具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖：
Figure BDA0002414808500000031
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
在另一个方面，本发明提供一种组合物，包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖：
Figure BDA0002414808500000032
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
在还有另一个方面，本发明提供一种药物，包含所述具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物，以及任选地药学上可接受载体。在另一个方面，本发明提供一种药物，包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖：
Figure BDA0002414808500000041
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数；和
任选地药学上可接受载体。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
本发明还提供具有式II所示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖：
Figure BDA0002414808500000042
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；和
p为选自100-500的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述p为选自200-500的一个或多个整数；优选地，p为选自300-500的一个或多个整数；更优选地，p为选自400-500的一个或多个整数。
本发明还提供制备所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的方法，包含以下步骤：(a)氧化凝胶多糖；(b)水解上述经氧化的凝胶多糖。
本发明方法使用凝胶多糖作为原料。所述凝胶多糖是指β-1,3-葡萄糖聚糖，其可以是商业上可获得的凝胶多糖，也可以是采用本领域已知方法制备的凝胶多糖，其具有式III的结构：
Figure BDA0002414808500000051
其中p为选自1000-15000的一个或多个整数。步骤(a)中的氧化包括在氧化剂存在下进行氧化、或在金属催化剂存在下进行催化氧化。所述氧化剂包括选自H2O2、高锰酸盐、CrO3、硝酸、含溴氧化剂、含氯氧化剂、氮氧化物的氧化剂；优选地，所述氧化剂包含溴化钠、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy，TEMPO)和次氯酸钠。所述金属催化剂包括包含选自铂、钯、铑和锇的一种或多种的催化剂。步骤(b)中的水解包括在酸的存在下进行水解。所述酸选自无机酸或有机酸；优选为盐酸、硫酸或三氟乙酸。
在一个方面，本发明所述制备β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的方法包括以下步骤：(a)在包含溴化钠、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(2,2,6,6-Tetramethylpiperidinooxy，TEMPO)和次氯酸钠的氧化剂的存在下氧化凝胶多糖；(b)在酸的存在下水解上述经氧化的凝胶多糖。
在另一个方面，本发明所述制备β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的方法包括以下步骤：
(1)在任选搅拌条件下，将凝胶多糖加入到水性溶剂中，得到含有凝胶多糖的悬浮液；
(2)向步骤(1)所得悬浮液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和溴化钠、接着将所述悬浮液的pH值调节至碱性、然后再向其中加入次氯酸钠溶液，在0～50℃温度下持续反应1-6小时，得到含经氧化的凝胶多糖的液体；
(3)向步骤(2)所得含经氧化的凝胶多糖的液体中加入有机溶剂以猝灭反应、接着调节所述液体的pH值至酸性，使用透析袋对所得酸性液体进行透析，得到透析过的液体。
(4)向步骤(3)所得透析过的液体加入酸，在任选搅拌条件下持续反应5～10小时；或者可选择地，可将步骤(3)所得透析过的液体浓缩、干燥(优选冻干)以得到固体物质，接着将所述固体物质与酸接触，在任选搅拌条件下持续反应5～10小时；
(5)任选地除酸后，使用透析袋进行透析，得到透析过的液体；
(6)任选地浓缩和/或离心步骤(5)所得透析过的液体以得到固体；任选进一步地对所述固体进行分离纯化。
在步骤(1)中，凝胶多糖与水性溶剂的用量没有特别限制。凝胶多糖与水性溶剂的质量与体积比优选为1:10-100g/mL，更优选为1:25-75g/mL，最优选为1:50g/mL。在步骤(1)中，所述水性溶剂是水。
在步骤(2)中，2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、溴化钠和次氯酸钠的用量没有特别限制。优选地，2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基与溴化钠的质量比大于1:10。在步骤(2)中，所述碱性优选是指pH值为9-12，更优选是指pH值为10-11。在步骤(2)中，使用本领域已知方法例如使用碱金属盐或碱土金属盐调节pH值至碱性；优选使用LiOH、NaOH或KOH调节pH值至碱性；最优选使用20％的NaOH或KOH水溶液调节pH值至碱性。
在步骤(3)中，用于淬灭反应的有机溶剂没有特别的限制。所述有机溶剂可选自：无水乙醇、甲醇、丙酮、DMSO或二氯甲烷等。在步骤(3)中，所述酸性优选是指pH值为2.5-6.5；更优选pH值为4-6；最优选pH值为5。在步骤(3)中，使用本领域已知方法例如使用无机酸或有机酸调节pH值至酸性。所述无机酸包括但不限于：盐酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、偏磷酸、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等；所述有机酸包括但不限于：甲酸、乙酸、草酸、羟基乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、丁二酸、戊酸、丙烯酸、草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、甲磺酸、乳酸、水杨酸、乙酰水杨酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、羟基丁酸、己二酸、邻苯二甲酸、扁桃酸、苯甲酸、硼酸等。优选地，在步骤(3)中使用盐酸调节pH值至酸性。
在步骤(4)中，所述酸包括但不限于：盐酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、偏磷酸、亚磷酸、次磷酸、焦磷酸、多聚磷酸等。在步骤(4)中，所述酸选自无机酸或有机酸；优选为盐酸、硫酸或三氟乙酸；更优选为三氟乙酸。
在步骤(3)和/或(5)中，所述透析袋是用来除去小分子量物质，例如盐、或酸等不期望的物质。所述透析袋优选为300-700Da的透析袋，更优选为400-600Da的透析袋，最优选为500Da的透析袋。以500Da的透析袋为例，分子量大于500Da的物质不能通过所述透析袋，然而分子量小于500Da的物质则能通过所述透析袋。本发明所述透析过的液体是指含有期望物质的透析过的液体。
在步骤(6)中，所述“任选地浓缩和/或离心步骤(5)所得透析过的液体以得到固体”优选包括以下步骤：将步骤(5)所得透析过的液体浓缩得到浓缩的液体；超滤离心所述浓缩的液体并收集下层溶液；冻干所述下层溶液以得到固体。所述“任选进一步地对所述固体进行分离纯化”是指采用本领域已知的分离方法(例如色谱法)对所述固体进行分离纯化，以得到分离的其中n为单个整数的具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖，例如分离的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖2糖、3糖、4糖、5糖、6糖、7糖、8糖、9糖或10糖。
在一些实施方式中，本发明还提供一种所述具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物用于制备治疗缺血性脑疾病的药物的用途，所述式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖为：
Figure BDA0002414808500000081
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
在一些实施方式中，本发明还提供用于治疗缺血性脑疾病的所述具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或用于治疗缺血性脑疾病的所述包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物，所述式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖为：
Figure BDA0002414808500000082
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
在一些实施方式中，本发明还提供一种治疗缺血性脑疾病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的所述具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或所述包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物，所述式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖为：
Figure BDA0002414808500000091
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；
n为选自0-200的一个或多个整数。
在进一步的实施方式中，上述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。上述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
在本发明所述的具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖中，由M表示的所述阳离子包括但不限于：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子、锶离子。当M为氢时，本发明所述的具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖还可以与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的碱性加成盐。所述C1-6烷基包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基。本领域技术人员能够通过本领域常用成盐手段将式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖中(用M表示的)氢转化为阳离子。
本发明所述药物可以是片剂、含片、丸剂、胶囊剂(例如硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂)、酏剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂(肌肉内、静脉内、腹膜内)、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液、分散剂和用于口服或非口服给药的缓释制剂的形式。
本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于阿拉伯胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。
制备各种含有各种比例活性成分的药物的方法是已知的，或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。以已知的方法制造本发明所述药物，包括常规的混合、溶解或冻干方法。
本发明的药物以适于选定的施用方式的各种途径施用，例如口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。
在本发明所述药物中，活性成分的比例可以变化，可占给定的单位剂型重量的大约0.01％至大约99％。在这种治疗有用的药物制剂中，活性成分的量使得能够获得有效剂量水平。
本发明所述的片剂、含片、丸剂、胶囊剂等可以包含：粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸氢二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；和甜味剂，如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦；或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时，除了上面类型的材料，它还可以包含液体载体，如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在，作为包衣，或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性成分，蔗糖或果糖作为甜味剂，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然，用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外，活性成分可以掺入缓释制剂和缓释装置中。
活性成分也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性成分或其盐的水溶液，任选可混和无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下，最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液体分散介质，包括，例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性，例如，通过脂质体的形成，通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小，或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。
通过将合适的溶剂中的需要量的活性成分与需要的上面列举的各种其他成分结合，然后进行过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这会产生活性成分加上任何另外需要的无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。
有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物，本发明的药物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。
增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等，直接用于使用者的皮肤上。
化合物或其活性盐或衍生物的治疗有效量，不仅取决于选择的特定的盐，而且取决于施药方式、待治疗的疾病的性质和患者的年龄和状态，最终取决于在场医师或临床医生的决定。
上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在大约0.01到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
本发明使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。
本发明所述“缺血性脑疾病”是指由脑部(包括大脑、小脑或脑干局部或多部位)供血不足引起脑部神经系统缺乏养分(例如氧气和/或葡萄糖)进而导致脑部神经系统损伤的疾病。所述“缺血性脑疾病”包括但不限于：短暂性脑缺血发作、脑卒中、缺血性脑卒中、脑梗死、烟雾病、或血管性痴呆。
在本发明全部实施方式中，本发明所述的具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖还包括包含一种或多种具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的混合物。例如，n还可以是选自各自所述数值范围内的多个整数。
另一方面，在本发明的全部实施方式中，本发明所述数值范围意在涵盖所述范围内的任意整数。例如，在本发明的全部实施方式中，具有式Ⅰ表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖中n可以是0-200范围内的一个或多个的任意整数、或其间任意整数组成的子范围，比如n可以是选自0-100的一个或多个整数；或选自0-50的一个或多个整数；或选自选自0-18的一个或多个整数，例如选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18的一个或多个整数。式II结构式中p可以是100-500范围内的一个或多个的任意整数、或其间任意整数组成的子范围；式III结构式中p可以是1000-15000范围内的一个或多个的任意整数、或其间任意整数组成的子范围。在式II结构式的一种实施方式中，p可以为选自100-400的一个或多个整数；优选地，p为选自100-300的一个或多个整数；更优选地，p为选自100-200的一个或多个整数；在进一步的实施方式中，p还可以是选自150-200的一个或多个整数；例如，p可以是选自100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200的一个或多个整数。在式II结构式的另一种实施方式中，p为选自200-500的一个或多个整数；优选地，p为选自300-500的一个或多个整数；更优选地，p为选自400-500的一个或多个整数。在进一步的实施方式中，p还可以是选自420-480的一个或多个整数；或选自440-460的一个或多个整数；例如，p可以是选自400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500的一个或多个整数。除非特别指定，本发明所述的百分含量是指重量百分含量。
本发明所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖具有显著的治疗缺血性脑疾病的活性。本发明所述的方法使用凝胶多糖作为制备β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的原料。本发明所述方法操作简单，条件温和，成本较低，易于产业化。
附图说明
图1：A为实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖在210nm下的液相色谱图；B为实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖总离子流图。
图2为图1峰1的一级质谱图，即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖2糖质谱图。
图3为图1峰2的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖3糖质谱图。
图4为图1峰3的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖4糖质谱图。
图5为图1峰4的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖5糖质谱图。
图6为图1峰5的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖6糖质谱图。
图7为图1峰6的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖7糖质谱图。
图8为图1中峰7的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖8糖质谱图。
图9为图1中峰8的一级质谱图即β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖9糖质谱图。
图10为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖10糖-20糖的平均质谱图。
图11：a为凝胶多糖的13C-NMR图谱；b为β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖的13C-NMR图谱。
图12为β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖的1H-NMR图谱。
图13为β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖的HSQC图谱。
图14为经历不同水解时间所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图。
图15：A为经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖在210nm下的液相色谱图；B为经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的总离子流图。
图16为实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对正常小鼠海马神经元细胞的作用。
图17为实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对缺糖缺氧小鼠海马神经元细胞的作用；###表示与正常组比较p<0.001(LSD检验)；***表示与OGD组比较p<0.001(LSD检验)。
图18为经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对正常小鼠海马神经元细胞的作用。
图19为经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对缺糖缺氧小鼠海马神经元细胞的作用；###表示与正常组比较p<0.001(LSD检验)；**表示与OGD组比较p<0.001(LSD检验)。
具体实施方式
下面，本发明将通过实施例展示本发明的有益效果。本领域技术人员会知道，这些实施例是示例性的，而不是限制性的。这些实施例不会以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：制备β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖
(1)称取1g凝胶多糖、并将所述凝胶多糖加入到烧瓶内的50ml水中，将所述烧瓶置于磁力搅拌器上并在常温搅拌，得到含有凝胶多糖的悬浮液。
(2)向步骤(1)中所得悬浮液中依次加入32mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和320mg的溴化钠，接着用20％NaOH溶液将所述悬浮液的pH值调节至10，然后再向其中加入8ml次氯酸钠溶液(5％活性氯)，在25℃条件下持续反应4小时，得到含经氧化的凝胶多糖的液体。
(3)向步骤(2)所得含经氧化的凝胶多糖的液体中加入无水乙醇以猝灭反应，接着用4M HCl调节所述液体的pH值至5，使用500Da的透析袋对所得酸性液体进行透析，得到透析过的液体。
(4)将步骤(3)所得透析过的液体在45℃条件下浓缩、冻干得到固体物质。将所述固体物质溶解于1M三氟乙酸中，得到浓度为10mg/ml的溶液。然后，将所述溶液置于100℃鼓风干燥箱中反应5小时。
(5)将步骤(4)得到的反应过的液体在45℃条件下浓缩除酸，使用500Da的透析袋中透析，得到透析过的液体。
(6)将步骤(5)所得透析过的液体在不超过45℃的温度下稍加浓缩从而得到浓缩的液体。将所述浓缩的液体置于3K超滤离心管中在高速冷冻离心机中于4500rpm的转速、15℃的温度下离心40分钟；在将上层液体完全离下后收集下层溶液。冻干所述下层溶液，得到呈固体状的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(产率21.2％)。
实施例2：β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖核磁结构确认
2.1方法
准确称取实施例1步骤(1)所使用的凝胶多糖和实施例1步骤(4)所得固体物质各70mg，分别用0.8ml氘代DMSO(D≥99.9％)、重水(D≥99.9％)溶解。使用Agilent 600MHz核磁共振仪进行一维和二维核磁共振分析(NMR)。核磁共振分析条件为：氢谱扫描时间为1小时，试验温度为室温；碳谱扫描时间为5小时，试验温度为室温。
2.2核磁共振分析结果
实施例1步骤(1)所使用的凝胶多糖和实施例1步骤(4)所得固体物质的核磁共振分析结果如图11-13所示。
图11a是实施例1步骤(1)所使用的凝胶多糖的13C-NMR，其中化学位移102.92ppm、86.10ppm、76.22ppm、72.74ppm、68.29ppm和60.77ppm处的峰分别表示葡萄糖环中C1、C3、C5、C2、C4和C6。
图11b是实施例1步骤(4)所得固体物质的13C-NMR。与图11a相比，图11b中化学位移为101.98ppm(C1)、82.92ppm(C3)、75.58ppm(C5)、73.31ppm(C2)和70.09ppm(C4)处的峰保持不变；然而在图11b中不存在化学位移60.77ppm处的峰，但增加了化学位移为175.27ppm处的峰。这表明实施例1步骤(1)所使用的凝胶多糖(即β-1,3-葡萄糖聚糖)的所有糖环的C6位伯羟基被完全氧化成羧基，实施例1步骤(4)所得固体物质为β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖。
实施例1步骤(4)所得固体物质即β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖的1H-NMR和HSQC分别如图12和图13所示。结合图12和图13，β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖分子结构中各氢归属为：4.89ppm为β1→3连接H1；3.84ppm为H3；3.82ppm为H5；3.64ppm为H4；3.61ppm为H2。
核磁共振分析结果表明，凝胶多糖结构中的6位伯羟基完全被氧化成羧基，即葡萄糖单元被完全氧化成葡萄糖醛酸单元。
实施例3：β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的制备方法的检测
3.1方法
称取2mg的实施例1步骤(6)所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖，将其用200μl的纯水溶解后使用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后进行超高效液相串联四级杆飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)分析。UPLC/Q-TOF-MS分析使用Agilent 6540UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(安捷伦公司，美国)系统。色谱条件如下：ACQUITY UPLC BEH125分子排阻色谱柱(4.6×300mm，Waters)；检测波长：210nm；流动相：A为50mM乙酸铵水溶液，B为甲醇，比例为80％A；流速：0.1ml/min。质谱条件如下：负离子模式；扫描范围：100～3000；干燥气温度：350℃；干燥气流速：8L/min；毛细管电压：3500V；碎裂电压：120V。
3.2UPLC/Q-TOF-MS结果
经UPLC/Q-TOF-MS分析后，得到β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图(图1A)和总离子流图(图1B)。从图1A和图1B中(尤其是图1A中)可以看出，各峰呈规则的波浪状分布。这是因为UPLC/Q-TOF-MS分析使用的是分子排阻色谱柱，波浪峰是按照聚合度的大小依次分布的。
对图1A中色谱峰1-8对应物质进行进一步的一级质谱分析，得到图1A中色谱峰1-8分别对应的一级质谱图(图2-9)。通过解析一级质谱图(图2～9)，可知图1A中色谱峰1-8分别对应的结构：图2为峰1的一级质谱图，其中m/z 369.0762对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖2糖，m/z 739.1401为其[2M-H]-存在形式；图3为峰2的一级质谱图，m/z545.0983对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖3糖，m/z 1091.2039为其[2M-H]-存在形式此外；图4为峰3的一级质谱图，m/z 721.1345对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖4糖，m/z 1443.2644为其[2M-H]-存在形式,m/z 360.0700为[M-2H]2-存在形式；图5为峰4的一级质谱图，m/z897.1681对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖5糖，m/z 448.0793为[M-2H]2-存在形式；图6为峰5的一级质谱图，m/z 1073.1989对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖6糖，m/z536.0972为[M-2H]2-存在形式；图7为峰6的一级质谱图，m/z 1249.2269对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖7糖，m/z 624.1119为[M-2H]2-存在形式,m/z 415.7455为[M-3H]3-存在形式；图8为峰7的一级质谱图，m/z 1425.2565对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖8糖，m/z 712.1272为[M-2H]2-存在形式,m/z 474.4237为[M-3H]3-存在形式；图9为峰8的一级质谱图，m/z 1601.2862对应的结构为β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖9糖，m/z 800.1429为[M-2H]2-存在形式,m/z 533.1022为[M-3H]3-存在形式。
图10为图1A中色谱峰1-8对应物质之后的剩余物质的平均质谱图。经过解析，可知图10对应的是β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的10糖到20糖的质谱图。从图10中可以看出，10糖到20糖的含量较低，但具有较好的质谱响应。
经UPLC/Q-TOF-MS分析可知，凝胶多糖(即β-1,3-葡萄糖聚糖)的所有葡萄糖单元的C6位伯羟基被完全氧化成羧基，即葡萄糖单元均被完全氧化成葡萄糖醛酸单元。UPLC/Q-TOF-MS分析进一步验证了核磁共振的分析结果。
因此，实施例2和实施例3的数据证实，实施例1步骤(6)所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖是包含多种具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物：
Figure BDA0002414808500000191
其中
M为氢；和
n为0-18。
而且，经由UPLC/Q-TOF-MS或类似色谱法，实施例1步骤(6)所得的包含多种具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物(出于简便的目的，也称为所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖)可被分离为相应单糖。
实施例4：β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的分子量分布
4.1方法
采用凝胶渗透色谱串联多角度激光散射系统(GPC-MALLS)，测定实施例1步骤(6)所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖样品的分子量分布。所述GPC-MALLS系统包括：Agilent 1260高效液相色谱仪(CA，USA)和18角度激光散射检测器(Wyatt，USA)。所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖样品的分离采用ACQUITY UPLC@BEH125 SEC色谱柱(1.7μm,4.6×300mm,Waters,USA)。流动相为80％80mM乙酸铵和20％甲醇，流速为0.1ml/min，进样量为20μl，柱温25℃。数据处理使用ASTRA软件，dn/dc值设定为0.138ml/g。
4.2结果
经测定，实施例1步骤(6)所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的重均分子量(Mw)为2.9kDa、数均分子量为(Mn)为2.1kDa、聚分散指数为1.4。
实施例5：经历不同水解时间所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖
本实施例研究了凝胶多糖经历不同水解时间所得的产物。本实施例重复实施例1的方法，区别在于步骤(4)用三氟乙酸水解的时间分别调整为1小时、10小时、15小时和24小时，得到经历不同水解时间的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(产率分别为14.7％、45.2％、26.1％和22.8％)。
采用与实施例3相同的方案，对所得经历不同水解时间的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖进行液相色谱分析(图14)。图14B所示的经历5小时水解的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图使用的是图1A的数据。
从图14可以看出，经历1小时、10小时、15小时和24小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖与实施例1中经历5小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图非常相似。这表明在不同的水解条件下，可以得到具有相似组成的包含多种具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物。
采用与实施例3相同的方案，对经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖进行了总离子流分析(图15B)。图15A所示的经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图使用的是图14C的数据。
从图15和图1的比较同样可以看出，经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖与经历5小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的液相色谱图和总离子流图非常相似。这提示二者具有相似的组成。
经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的重均分子量(Mw)为2.1kDa、数均分子量为(Mn)为1.5kDa、聚分散指数为1.4。
实施例6：β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对缺氧缺糖模型(oxygen and glucosedeprivation,OGD)中对小鼠海马神经元细胞(HT-22细胞)的作用
5.1OGD模型的建立及实验分组
在OGD模型中，细胞的养分供应被剥夺，因而该模型能够用于研究药物对缺氧缺糖条件下细胞的保护作用。
正常条件下培养：取正常培养的HT-22细胞，调整细胞数目至2×104个/ml；按100μl/孔将所述细胞接种在96孔培养板上。将细胞分组为低剂量组、中剂量组、高剂量组、和正常组；每组各设4个平行组(n＝4)。用高糖培养液将细胞预培养12小时。向低剂量组、中剂量组、高剂量组分别加入10μl的用PBS配置的浓度分别为0.25μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(5小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖)或实施例5所述经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(10小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖)，向正常组加入相同体积的PBS。然后，将培养板置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养12小时。
缺氧缺糖条件下培养：取正常培养的HT-22细胞，调整细胞数目至2×104个/ml；按100μl/孔将所述细胞接种在96孔培养板上。将细胞分组为低剂量组、中剂量组、高剂量组、和OGD组；每组各设4个平行组(n＝4)。用高糖培养液将细胞预培养12小时。然后，吸去所述高糖培养液，用无糖DMEM培养液洗涤细胞、并最终用DMEM培养液替换高糖培养液。向低剂量组、中剂量组、高剂量组分别加入10μl的用PBS配置的浓度分别为0.25μg/ml、1μg/ml、10μg/ml的实施例1所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(5小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖)或实施例5所述经历10小时水解所得β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖(10小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖)，向OGD组加入相同体积的PBS。将培养板置于缺氧罐中(95％N2、5％CO2)、37℃恒温培养12小时。
5.2CCK-8法测定细胞存活率
待上述各组细胞培养完毕后，向每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4小时。然后，在450nm下使用分光光度计测定各组的光密度(optical density，OD)值，并计算出细胞存活率。
5.3结果
通过CCK-8法计算出的各组细胞存活率示于图16-19。
从图16中可以看出，低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞存活率与正常组相比都没有显著性差异。这表明5小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对HT-22细胞没有毒性。
图17中的正常组数据使用的是图16正常组的数据。从图17中可以看出，OGD组的HT-22细胞存活率与正常组相比显著降低(p<0.001)。这表明缺氧缺糖条件显著抑制细胞存活，提示造模成功。低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞存活率与OGD组相比显著升高(p<0.05)，且低剂量组、中剂量组、高剂量组显示出良好的剂量依赖关系。这表明5小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对缺氧缺糖条件下的HT-22细胞具有明显的保护作用，可用于治疗缺血性脑疾病。
从图18中可以看出，低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞存活率与正常组相比都没有显著性差异。这表明10小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对HT-22细胞也没有毒性。
图19中的正常组数据使用的是图18正常组的数据。从图19中可以看出，低剂量组、中剂量组、高剂量组的细胞存活率与OGD组相比显著升高(p<0.05)，且低剂量组、中剂量组、高剂量组显示出良好的剂量依赖关系。这表明10小时β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖对缺氧缺糖条件下的HT-22细胞也具有明显的保护作用，可用于治疗缺血性脑疾病。
以上结果证明，本发明的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖无毒且具有治疗缺血性脑疾病的作用。
本申请还涉及以下项目。
1、具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖：
Figure BDA0002414808500000221
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；和
n为选自0-200的一个或多个整数。
2、组合物，包含一种或多种具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖：
Figure BDA0002414808500000222
Figure BDA0002414808500000231
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；和
n为选自0-200的一个或多个整数。
3、如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物，其中所述阳离子包含选自以下的一种或多种：锂离子、钠离子、钾离子、铍离子、镁离子、钙离子、铁离子、亚铁离子、锌离子、硒离子、钒离子、锡离子或锶离子。
4、如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物，其中所述n为选自0-100的一个或多个整数；优选n为选自0-50的一个或多个整数；更优选n为选自0-18的一个或多个整数；最优选n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
5、药物，包含如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物，以及任选地药学上可接受载体。
6、具有式II表示的β-1,3-葡萄糖醛酸聚糖：
Figure BDA0002414808500000232
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；和
p为选自100-500的一个或多个整数。
7、如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物用于制备治疗缺血性脑疾病的药物中的用途。
8、用于治疗缺血性脑疾病的如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物。
9、一种治疗缺血性脑疾病的方法，包括向有需要的受试者施用如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物。
10、如项目7-9所述的用途、β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或组合物、或方法，其中所述缺血性脑疾病选自短暂性脑缺血发作、脑卒中、缺血性脑卒中、脑梗死、烟雾病、或血管性痴呆。
11、一种制备如项目1所述的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖或如项目2所述的组合物的方法，包含以下步骤：(a)氧化凝胶多糖；和(b)水解上述经氧化的凝胶多糖。
12、如项目11所述的方法，其中：步骤(a)所述氧化是在包含溴化钠、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和次氯酸钠的氧化剂存在下进行；和步骤(b)所述水解是在酸的存在下进行。
13、如项目12所述的方法，其中所述酸为盐酸、硫酸或三氟乙酸。
等同物
前述实施例仅用于阐述本发明，而不应看作是对本发明的范围的任何限制。显然，可以对上述本发明具体实施方案和实施例中所述的内容做出的许多修饰和变化，而并不会背离本发明的原理。所有这样的修饰和变化均被本申请所涵盖。

Claims (7)

1.β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖用于制备治疗缺血性脑疾病的药物中的用途：
所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖通过包括如下步骤的方法制备：
(1)将凝胶多糖加入到水性溶剂中，得到含有凝胶多糖的悬浮液；
(2)向步骤(1)所得悬浮液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和溴化钠、接着将所述悬浮液的pH值调节至碱性、然后再向其中加入次氯酸钠溶液，在0～50℃温度下持续反应1-6小时，得到含经氧化的凝胶多糖的液体；
(3)向步骤(2)所得含经氧化的凝胶多糖的液体中加入有机溶剂以猝灭反应、接着调节所述液体的pH值至酸性，使用透析袋对所得酸性液体进行透析，得到透析过的液体；
(4)向步骤(3)所得透析过的液体加入酸，持续反应5～10小时；或者将步骤(3)所得透析过的液体浓缩、干燥以得到固体物质，接着将所述固体物质与酸接触，持续反应5～10小时；
(5)除酸后，使用透析袋进行透析，得到透析过的液体；
(6)浓缩和离心步骤(5)所得透析过的液体以得到所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖。
2.包含一种或多种具有式I表示结构的β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖的组合物用于制备治疗缺血性脑疾病的药物中的用途：
Figure FDA0003532221870000021
其中，
M在其每一次出现时，独立地选自氢、阳离子、或C1-6烷基；和
n为选自0-200的一个或多个整数；
其中所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖通过包括如下步骤的方法制备：
(1)将凝胶多糖加入到水性溶剂中，得到含有凝胶多糖的悬浮液；
(2)向步骤(1)所得悬浮液中加入2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基和溴化钠、接着将所述悬浮液的pH值调节至碱性、然后再向其中加入次氯酸钠溶液，在0～50℃温度下持续反应1-6小时，得到含经氧化的凝胶多糖的液体；
(3)向步骤(2)所得含经氧化的凝胶多糖的液体中加入有机溶剂以猝灭反应、接着调节所述液体的pH值至酸性，使用透析袋对所得酸性液体进行透析，得到透析过的液体；
(4)向步骤(3)所得透析过的液体加入酸，持续反应5～10小时；或者将步骤(3)所得透析过的液体浓缩、干燥以得到固体物质，接着将所述固体物质与酸接触，持续反应5～10小时；
(5)除酸后，使用透析袋进行透析，得到透析过的液体；
(6)浓缩和离心步骤(5)所得透析过的液体以得到所述β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖。
3.如权利要求2所述的用途，其中所述n为选自0-100的一个或多个整数。
4.如权利要求2所述的用途，其中所述n为选自0-50的一个或多个整数。
5.如权利要求2所述的用途，其中所述n为选自0-18的一个或多个整数。
6.如权利要求2所述的用途，其中所述n为选自0、1、2、3、4、5、6、7和8的一个或多个整数。
7.如权利要求1或2所述的用途，其中所述缺血性脑疾病选自短暂性脑缺血发作、脑卒中、脑梗死、烟雾病、或血管性痴呆。
CN202010187802.3A 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途 Active CN111333748B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010187802.3A CN111333748B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010187802.3A CN111333748B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途
CN201710004470.9A CN108264577B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710004470.9A Division CN108264577B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111333748A CN111333748A (zh) 2020-06-26
CN111333748B true CN111333748B (zh) 2022-06-21

Family

ID=62771618

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710004470.9A Active CN108264577B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途
CN202010187802.3A Active CN111333748B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710004470.9A Active CN108264577B (zh) 2017-01-04 2017-01-04 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN108264577B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1049017A (zh) * 1989-07-17 1991-02-06 武田药品工业株式会社 制备可热胶凝的β-1-3-葡聚糖的方法
CN102312021A (zh) * 2010-06-30 2012-01-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种可德兰寡糖的制备方法
CN103524760A (zh) * 2013-10-10 2014-01-22 江苏大学 一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法
CN104945448A (zh) * 2015-05-22 2015-09-30 苏州大学 一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途
CN105061632A (zh) * 2015-08-18 2015-11-18 泰兴市一鸣生物制品有限公司 一种可得然胶季铵盐的制备方法及抑菌性能
CN107922513A (zh) * 2015-05-22 2018-04-17 上海绿谷制药有限公司 一种氧化型α‑1,4‑寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1049017A (zh) * 1989-07-17 1991-02-06 武田药品工业株式会社 制备可热胶凝的β-1-3-葡聚糖的方法
CN102312021A (zh) * 2010-06-30 2012-01-11 中国科学院大连化学物理研究所 一种可德兰寡糖的制备方法
CN103524760A (zh) * 2013-10-10 2014-01-22 江苏大学 一种脱氧胆酸基-氧化可德兰多糖纳米粒子及制备方法
CN104945448A (zh) * 2015-05-22 2015-09-30 苏州大学 一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途
CN107922513A (zh) * 2015-05-22 2018-04-17 上海绿谷制药有限公司 一种氧化型α‑1,4‑寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途
CN105061632A (zh) * 2015-08-18 2015-11-18 泰兴市一鸣生物制品有限公司 一种可得然胶季铵盐的制备方法及抑菌性能

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Structural characteristics and antioxidant activities of different families of 4-acetamido-TEMPO-oxidised curdlan";Jing-Kun Yan等;《Food Chemistry》;20130808;第143卷;第530-535页 *
"TEMPO-mediated oxidation of(l→3)-β-D-g1ucans";Naoyuki Tamura 等;《Carbohydrate Polymers》;20090119;第77卷;第300-305页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108264577A (zh) 2018-07-10
CN111333748A (zh) 2020-06-26
CN108264577B (zh) 2020-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8686053B2 (en) Alginic acid with low molecular weight, its salts, uses, preparative methods, pharmaceutical compositions and foods
AU2017385332B2 (en) Composition of mannuronic dicarboxylic acid
JP6900414B2 (ja) 酸化型β−１，４−グルクロン酸オリゴマーおよびその製造方法と使用
CN107922513B (zh) 一种氧化型α-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途
CN106344595B (zh) 褐藻胶寡糖及其衍生物在制备治疗疼痛药物中的应用
CN111333748B (zh) 一种β-1,3-葡萄糖醛酸寡糖、及其制备方法和用途
EP3750923A1 (en) Separated saposhnikovia divaricata polysaccharide and use thereof
KR100457270B1 (ko) 효모변이주 아이에스투 유래 수용성 글루칸 올리고머를함유하는 면역활성용 또는 암질환 예방 및 치료용 조성물,및 이의 제조방법
CN111670038A (zh) 糖胺聚糖衍生物及其制备方法和用途
CN113024681B (zh) 黄精半乳聚糖及其制备方法和应用
US11406652B2 (en) Use of mannuronic diacid composition in treatment of diabetes
CN106349298B (zh) 褐藻胶寡糖及其衍生物在改善睡眠障碍中的应用
US20020115158A1 (en) Novel microorganism isolated from chinese elm (Ulmus sp.) and process for preparing exopolysaccharides by employing the microorganism
JPH01103601A (ja) 新規な抗ウィルス剤
CN108938653B (zh) 氧化型1,4-β-D-葡萄糖醛酸寡糖在制备治疗阿尔茨海默病的药物中的应用
JP4500008B2 (ja) 新規な二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法
CN117384308A (zh) 一种基于桑黄菌发酵制备的三叶青多糖及其用途
CN115536732A (zh) 一种β-葡聚糖胸腺五肽偶联物、制备方法及其在免疫调节和抗肿瘤药物、保健品的应用
JPS59164728A (ja) 薬理活性化合物とシクロデキストリン含有重合体との複合体
NZ754947B2 (en) Composition of mannuronic diacid
JPS63239216A (ja) 抗腫瘍剤
JPS6041050B2 (ja) オルト又はメタアミノ安息香酸誘導体を含有する血圧降下剤

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant