CN105949352A - 一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种不同分子量β‑C‑6‑硫酸酯‑壳聚糖类化合物及其制备方法。不同分子量β‑C‑6‑硫酸酯‑壳聚糖类化合物结构式如下，其中n为聚合度：2‑400；该化合物的活性基团为硫酸酯基(OSO3 －)，硫含量为12‑21％。本发明制备方法属均相反应，原料利用率高。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物技术领域，具体讲是一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物及其制备方法。
背景技术
甲壳素是世界第二大纤维素资源，由于来源不同，其构型可分为α-甲壳素、β-甲壳素、γ-甲壳素，目前研究最多的为α-甲壳素，为反平行结构，其次为β-甲壳素，为平行结构，不同构型的甲壳素可能显示不同的功效。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰得到的产物，其生物相容性好，但由于其难溶于水和大部分有机溶剂而限制了其应用；天然制备的β-壳聚糖分子量通常在2000kDa以上，因而粘度很大不方便应用，其衍生化产物得到了越来越大的重视与关注。许多研究报道表明，硫酸多糖具有非常好的活性，而硫酸酯基的位点和硫酸多糖的分子量又决定了其不同的活性。因此，本发明设计合成了不同分子量的C6位硫酸酯化的β-壳聚糖硫酸酯，该产物具有非常好的水溶性，使其应用范围更加广泛。且硫酸酯基的引入使得壳聚糖在许多活性方面如抑菌、促生长、免疫调节等方面显示了不同的活性，因而本发明制备了定位β-壳聚糖硫酸酯，从而改善其生物活性。
发明内容
本发明的目的是要提供一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物：不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物结构式为：
其中，n为聚合度：2-400；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 －)，硫含量为12-21％。
不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的制备方法：
(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却， 然后在搅拌下滴加氯磺酸，使其在0-5℃进行磺化反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)β-C-2,3-位壳聚糖铜螯合物的制备：以β-壳聚糖原料加入甲酸溶液(使溶液中甲酸溶液终浓度为1-3％(体积))，搅拌使其溶解呈粘稠状，然后加入原料壳聚糖1.5-2倍质量的CuSO4·5H2O(CuSO4·5H2O经蒸馏水溶解后加入)，并在室温下搅拌3h-4h，反应结束后调节PH值至6.0－6.5，再于室温下继续搅拌3h-4h，搅拌后用无水乙醇与丙酮混合溶剂沉淀得螯合物；其中，甲酸溶液与β-壳聚糖的体积重量比为：6～30:1；
其中，无水乙醇与丙酮按1:1的体积混合；
(3)不同分子量β-C-2,3-β-壳聚糖铜螯合物的磺化反应：取上述获得β-C-2,3-位壳聚糖铜螯合物，加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂并搅拌均匀，再加入上述磺化剂，在40-70℃下搅拌反应0.5-3小时，反应完毕后加入反应液2-4倍体积量的无水乙醇进行醇沉，而后于4℃冷藏沉化30-60min，得到白色絮状沉淀，将上述沉淀物抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，用2M NaOH溶液将其中和得蓝色溶液，透析、浓缩得不同分子量的蓝色壳聚糖铜螯合物的磺化产物；
(4)脱铜制备β-C-6-壳聚糖硫酸酯：将上述获得不同分子量的壳聚糖铜鳌合物的磺化产物用蒸馏水溶解后，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱吸附，溶液颜色由蓝色变为黄色，Cu即被脱掉，用2M的NaOH溶液中和，浓缩，透析，冷冻干燥即得不同分子量白色C6位β-壳聚糖硫酸酯。
所述β-壳聚糖原料的分子量为2000-4574kDa。
本发明所具有的优点：
本发明将粘度极大的β-壳聚糖最终反应生成不同分子量的β-壳聚糖硫酸酯类化合物，是壳聚糖经定位磺化后所得6位壳聚糖硫酸酯衍生物，具有强聚阴离子性质。同时本发明采用的壳聚糖硫酸酯类化合物的含硫量高，对壳聚糖原料利用率高，活性得到了显著提高；制备过程采用均相反应，制备方法简单快速，操作成本低，污染少。
附图说明
图1为β-壳聚糖的红外表征谱图。在1652cm-1附近，β-壳聚糖只有一个氨基峰，而另一氨基峰则位于1558cm-1附近，符合β-壳聚糖结构特征。
图2为β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的红外表征谱图，在1212.81cm-1处出现了S＝O的非对称伸缩振动，在804.19cm-1处出现了C-O-S的对称伸缩振动，证明了分子中硫酸酯基(-OSO3 -)的存在。
图3为β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的核磁共振氢谱。可以看出，壳聚糖的C6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使H的化学 位移明显向低场漂移。
图4为β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的的核磁共振碳谱。可以看出，在壳聚糖的C6位引入硫酸酯基后，由于硫酸酯基的去屏蔽作用使C6的化学位移由59.83ppm明显向低场漂移至66.55ppm，而C2-N-位和C3-O-位的化学位移无明显变化。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1
β-壳聚糖的制备
将日本枪乌贼软骨表面的组织残留物洗净、烘干，称取97g鱿鱼骨置于过量的4％的盐酸中浸泡7h，用蒸馏水洗至中性；然后置于过量的1％的氢氧化钠溶液中，90℃水浴反应2h，用蒸馏水洗净至中性并烘干，即得β-甲壳素，称重为30.7g，产率为31.6％。称取31.6gβ-甲壳素，将其粉碎后与45(wt)％的氢氧化钠溶液按照质量体积比1:8的比例混合95℃反应6小时,获得26.1gβ-壳聚糖，产率为85.02％，紫外光谱法测定脱乙酰度为87.58％、高效液相法测定分子量为4574KDa。
实施例2
β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的制备：
(1)酯化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌下缓慢滴加氯磺酸，使其在小于5℃的温度下进行磺化反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)C-2,3-位壳聚糖铜螯合物的制备：称取适量β-壳聚糖原料，加3％的甲酸溶液，使其与β-壳聚糖的体积(ml)/重量(g)比为26:1，搅拌使其溶解成粘稠状，然后将适量蒸馏水溶解(10-15ml)的4.65克CuSO4·5H2O慢慢滴加到上述粘溶液中，并在室温下搅拌3h。然后用氨水调节PH值至6.0－6.5，室温继续搅拌3h。搅拌后用1:1体积比的无水乙醇与丙酮混合溶剂沉淀螯合物，于4℃冷藏柜中放置少许时间，抽滤，烘干，粉碎待用。
(3)C-2,3-β-壳聚糖铜螯合物的磺化反应
取一定量的β-壳聚糖铜螯合物，加入30-80mL甲酰胺溶剂并搅拌均匀，然后加入适量磺化剂，在45-65℃下搅拌反应0.5-3小时，反应完毕后将上述反应液用2-4倍体积量的无水乙醇沉淀，放到4℃冷藏柜中沉化约30min，得到白色絮状沉淀。将上述沉淀物抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，用2M NaOH溶液将其中和得蓝色溶液，透析，透析液浓缩，冷冻干燥得蓝色壳聚糖铜螯合物的硫酸酯化产品。
(4)脱铜制备C-6-β-壳聚糖硫酸酯
将壳聚糖铜鳌合物的磺化产物用蒸馏水溶解后，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱吸附，溶液颜色由蓝色变为黄色，Cu即被脱掉，用2M的NaOH溶液中和，浓缩，透析，冷冻干燥即得白色C6位β-壳聚糖硫酸酯产品。
表1 50℃各反应时间下,甲酸对硫含量和分子量的影响
表2 不同温度对磺化产物的影响(反应时间1.5小时)
表3 不同时间对磺化产物的影响(反应温度50℃)
实施例3
将上述获得不同分子量的C6位β-壳聚糖硫酸酯，进行免疫增强活性的检测，其中以巨噬细胞为模型，具体为：
取处于对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞浓度1×106个/mL，96孔板每孔接种100ul。在5％的CO2培养箱中培养24h后，加入不同浓度褐藻多糖硫酸酯各100uL，使其终浓度分别为0，6.25，12.5，25，50，100，200ug/mL，LPS做阳性对照，终浓度为1ug/ml，均设置3个复孔。将96孔板继续培养24h后，每孔取100ul上清液到新的96孔板，加入等体积的Griess试剂，室温避光放置10min，酶联免疫检测仪570nm下测吸光度，平行重复3次，代入标准曲线求出NO量。(参见表4)
表4：β-C-6-硫酸酯-壳聚糖对NO表达量的影响分子量
| 分子量 | NO表达量(uM) |
| 75kDa | 17.74±3.99 |
| 空白对照 | 1.99±0.49 |
不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖均具有非常好的水溶性，且由于硫酸酯基的加入，尤其是壳聚糖分子中硫酸酯基、氨基和羟基的同时存在，使其具有非常好的免疫增强活性。具体从上表4可以看出，β-C-6-硫酸酯-壳聚糖促进细胞产生的NO量远远高于空白对照，表明其具有良好的免疫增强活性。
Claims (3)
1.一种不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物，其特征在于：不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖类化合物结构式为：
其中，n为聚合度：2-400；该化合物的活性基团——硫酸酯基(OSO3 －)，硫含量为12-21％。
2.按权利要求1所述的不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的制备方法，其特征在于：
(1)磺化试剂的制备：将N,N－二甲基甲酰胺在冰水浴中冷却，然后在搅拌下滴加氯磺酸，使其在0-5℃磺化反应；其中N,N－二甲基甲酰胺与氯磺酸的体积比为(5：1)-(10：1)；
(2)β-C-2,3-位壳聚糖铜螯合物的制备：以β-壳聚糖原料加入甲酸溶液，搅拌使其溶解呈粘稠状，然后加入原料壳聚糖1.5-2倍质量的CuSO4·5H2O，并在室温下搅拌3h-4h，反应结束后调节pH值至6.0－6.5，再于室温下继续搅拌3h-4h，搅拌后用无水乙醇与丙酮混合溶剂沉淀得螯合物；其中，甲酸溶液与β-壳聚糖的体积重量比为：6～30:1；
(3)不同分子量β-C-2,3-β-壳聚糖铜螯合物的磺化反应：取上述获得β-C-2,3-位壳聚糖铜螯合物，加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂并搅拌均匀，再加入上述磺化剂，在40-70℃下搅拌反应0.5-3小时，反应完毕后加入反应液2-4倍体积量的无水乙醇进行醇沉，而后于4℃冷藏沉化30-60min，得到白色絮状沉淀，将上述沉淀物抽滤，滤饼用蒸馏水溶解，用2M NaOH溶液将其中和得蓝色溶液，透析、浓缩得不同分子量的蓝色壳聚糖铜螯合物的磺化产物；
(4)脱铜制备β-C-6-壳聚糖硫酸酯：将上述获得不同分子量的壳聚糖铜鳌合物的磺化产物用蒸馏水溶解后，用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱吸附，溶液颜色由蓝色变为黄色，Cu即被脱掉，用2M的NaOH溶液中和，浓缩，透析，冷冻干燥即得不同分子量白色C6位β-壳聚糖硫酸酯。
3.按权利要求2所述的不同分子量β-C-6-硫酸酯-壳聚糖的制备方法，其特征在于：所述β-壳聚糖原料的分子量为2000-4574kDa。
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