CN102382313B

CN102382313B - N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/n,o-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法

Info

Publication number: CN102382313B
Application number: CN2011103792579A
Authority: CN
Inventors: 赵凯; 金政; 张旭; 陈刚; 吴昊
Original assignee: Heilongjiang University
Current assignee: Heilongjiang Kaizheng Lihua Biochemical Technology Co., Ltd
Priority date: 2011-11-24
Filing date: 2011-11-24
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2031-11-24
Also published as: CN102382313A

Abstract

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，它涉及壳聚糖纳米粒的制备方法。方法：一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，向其中滴加N，O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下磁力搅拌，获得溶液A；二、溶液A离心，沉淀经去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥即得。本发明制备所得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒，与壳聚糖纳米粒相比，粒径容易控制、粒径分布均匀，具有良好的生物相容性、稳定性强等优点，而且还具有很好的水溶性，带正电性等特点，在制备纳米粒的过程中安全无毒、制备工艺简单、操作简单、制备条件温和、成本较低、易于规模化生产。

Description

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法

技术领域

本发明涉及壳聚糖纳米粒的制备方法。

背景技术

可生物降解高分子材料纳米粒是近年来随着纳米技术的飞速发展应运而生的新型药物载体形式。纳米粒的粒径通常在1-1000nm，是一类由高分子物质组成的固态胶体粒子，可分散在水中形成近似胶体的溶液。

纳米粒的制备方法很多，主要有乳化溶剂挥发法、共价交联法、离子交联法、复凝聚法、聚电解质复合法、沉淀析出法等。常用来制备纳米粒的高分子材料主要有壳聚糖及其衍生物、海藻酸及其盐类、明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、聚D，L-丙交酯、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)等，现如今应用较多的有聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物和壳聚糖。

壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的产物，是一种天然可再生资源。壳聚糖的化学名称为聚(2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)。一般而言，甲壳素脱乙酰度在55％以上就可称为壳聚糖。甲壳素广泛存在于低等动植物，特别是节肢动物的甲壳中，世界每年可生物合成甲壳素达100亿吨之多，被誉为仅次于纤维素的第二大天然高分子聚合物。因此，壳聚糖是一种总量很大，目前尚未得到完全充分利用的天然资源。

壳聚糖作为自然界唯一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、可降解性以及抗菌等特殊功能，然而，壳聚糖只能溶于酸性溶液的性能缺陷使其在这一领域的应用受到了极大限制。因此，对壳聚糖进行化学改性，改善其水溶性，可拓展其应用范围。在更为理想的纳米载药粒子制备的设计中，寻求壳聚糖的水溶性途径已成为能否将其成功用作纳米载药粒子基质物质的关键。

目前，通常采用离子交联法或乳化交联法制备壳聚糖或其衍生物纳米粒，制备时需使用有毒试剂合成原料，且纳米粒制备工艺条件苛刻，操作繁琐，制备过程中需要加入交联剂或乳化剂，且加入的交联剂或乳化剂不易清洗干净，使纳米粒的应用范围受到了极大的限制。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有壳聚糖纳米粒制备中存在工艺条件苛刻、操作繁琐、制备过程中需要加入交联剂或乳化剂、且加入的交联剂或乳化剂不易清洗干净的问题，而提供N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法。

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，按以下步骤实现：

一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成；

三、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以900～1300r/min的速度磁力搅拌10～40min，获得溶液A；

四、溶液A于4℃、12000r/min离心2min，沉淀经去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒(简称为N-2-HACC/N，O-CMC-NPs)。

本发明制备所得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒，与壳聚糖纳米粒相比，粒径容易控制、粒径分布均匀，N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的粒径为100～500nm，N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的Zeta电位为15～60mV。

本发明制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒具有独特的优势，不仅具有良好的生物相容性、稳定性强等优点，而且还由于N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N，O-羧甲基壳聚糖均具有很好的水溶性，带正电性等特点，使得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的应用范围得到了极大的扩展。

本发明中制备N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒时，所采用的原料N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和N，O-羧甲基壳聚糖在合成过程中安全无毒，且在制备纳米粒的过程中安全无毒、制备工艺简单、操作简单、制备条件温和、成本较低、易于规模化生产。

附图说明

图1是具体实施方式一合成N，O-羧甲基壳聚糖的主要反应过程图；图2是具体实施方式一的实施例中合成的N，O-羧甲基壳聚糖的傅立叶转换红外线光谱分析图；图3是具体实施方式一的实施例中合成的N，O-羧甲基壳聚糖的¹H NMR谱图；图4是具体实施方式一的实施例中合成的N，O-羧甲基壳聚糖的取代度测定图；图5是具体实施方式一的实施例中合成的N，O-羧甲基壳聚糖的透光率对pH的依赖关系图；图6是具体实施方式一的实施例中制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图7是具体实施方式一的实施例中制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的Zeta电位图；图8是具体实施方式一的实施例中制备的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的粒径分布图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，按以下步骤实现：

本实施方式步骤二中涤粗产品2～4次，目的是除去醋酸钠、氯化钠等盐类。

本实施方式中合成N，O-羧甲基壳聚糖的主要反应过程如图1所示；

本实施方式中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，来自名称为“N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法(申请号：201110333845.9，申请日：2011年10月28日)”的专利，所述N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：

一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90～120℃下回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5～8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；

二、将2～3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100～150mL体积浓度为1～3％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500～1000r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1～2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8～9并有白色沉淀析出，浸泡8h后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15～20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；

三、在N2保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75～85℃，每隔2h逐滴加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8～14h后将烧瓶冷却至室温，加入150～300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h，完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；

四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；

其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15％～40％，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10～30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2～27g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。

实施例1：

一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡2h后加入60mL浓度为30mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在70℃下反应8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成；

三、取5mL浓度为1mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为1mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以1200r/min的速度磁力搅拌30min，获得溶液A；

本实施例合成的N，O-羧甲基壳聚糖，其傅立叶转换红外线光谱分析如图2所示，可见出现了N，O-羧甲基壳聚糖的特征吸收峰。N，O-羧甲基壳聚糖的¹H NMR谱图如图3所示，表明出现了N，O-羧甲基壳聚糖的特征质子信号。N，O-羧甲基壳聚糖的取代度测定如图4所示，表明随NaOH体积的增加，电导率呈现先下降，再稳定，最后再上升的趋势，两个拐点间的体积差即为取代度。N，O-羧甲基壳聚糖的透光率对pH的依赖关系如图5所示，表明其为两性聚合物，等电点为5.5左右。

本实施例制备所得N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的透射电镜图如图6所示，可见有粒径大小均一、形态规则、外形圆整、分散性好等优点；

本实施例制备所得N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的Zeta电位图如图7所示，可见有电位为正值，且电位值较大，有利于吸附在细胞表面；

本实施例制备所得N-2-HACC/N，O-CMC-NPs的粒径分布图如图8所示，可见有粒径分布均匀、尺寸适中，为100～500nm。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中浸泡4h后加入60mL浓度为20mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡5h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中然后在70℃下反应6h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中于50℃下真空干燥10h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤三中取5mL浓度为1～15mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为1～2.5mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以1000～1250r/min的速度磁力搅拌15～35min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤三中取5mL浓度为10mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为2mg/mL的N，O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以1200r/min的速度磁力搅拌30min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤三中滴加的速度为0.05mL/s。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

Claims

1.N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于制备方法按以下步骤实现：一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1～12h后加入60mL浓度为10～40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；

二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，在搅拌状态下分5次加入到碱化壳聚糖中，每次间隔10min，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1%的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95%的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N,O-羧甲基壳聚糖的合成；

三、取5mL浓度为0.5～20mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为0.5～3.0mg/mL的N,O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以900～1300r/min的速度磁力搅拌10～40min，获得溶液A；

四、溶液A于4℃、12000r/min离心2min，沉淀经去离子水洗三次，然后真空冷冻干燥24h，即得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒。

2.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤一中浸泡4h后加入60mL浓度为20mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡5h。

3.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中在70℃下反应6h。

4.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤二中于50℃下真空干燥10h。

5.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中取5mL浓度为1～15mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为1～2.5mg/mL的N,O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以1000～1250r/min的速度磁力搅拌15～35min。

6.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中取5mL浓度为10mg/mL的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液，然后向其中滴加2mL浓度为2mg/mL的N,O-羧甲基壳聚糖溶液，在室温、无菌条件下以1200r/min的速度磁力搅拌30min。

7.根据权利要求1所述的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/N,O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤三中滴加的速度为0.05mL/s。