发明内容
本发明提供了N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。
本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现:
一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中,在90~120℃下回流搅拌反应1h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,然后分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中,继续回流搅拌反应1.5~8h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,获得脱乙酰处理的壳聚糖;
二、将2~3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100~150mL体积浓度为1~3%乙酸溶液中,搅拌溶解,真空抽滤,滤去不溶物,获得壳聚糖溶液,然后在500~1000r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1~2mol/L NaOH溶液,调节壳聚糖溶液pH至8~9并有白色沉淀析出,浸泡8h后抽滤,去离子水洗至滤液呈中性,抽干水分,然后向滤饼中加入15~20mL异丙醇,搅拌30min后倒入三口烧瓶,完成壳聚糖的浸泡处理;
三、在N2保护条件下,将步骤二中的三口烧瓶升温至75~85℃,每隔2h逐滴加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液,每次滴定时间30min,共滴加三次,反应8~14h后将烧瓶冷却至室温,加入150~300mL冷藏处理的无水乙醇,浸泡0.5h后抽滤,冷冻干燥24h,完成壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应,获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖;
四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水,应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀,然后真空抽滤,滤饼分散后冷冻干燥24h,即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成;
其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15%~40%,异丁醇的量为每克壳聚糖加入10~30mL异丁醇;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2~27g;步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。
用上述方法合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现:
一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0.5~2mg/mL的溶液,然后取5mL并滴加1.25~7.5mL新城疫病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
二、溶液A在室温、无菌条件下以900~1300r/min磁力搅拌30s,然后滴加2.5mL浓度为0.5~3mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,获得溶液B;
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入15mL浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,再加入2mL质量浓度为1%海藻糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC-NPs),即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒;
其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液,蛋白含量为620μg/mL,血凝价为1∶1024,病毒粒子的粒径为20~300nm;步骤二中司班-80在1400r/min下乳化30min。
本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成,是将2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)连接到壳聚糖的氨基上,具有原料易得(2,3-环氧丙基三甲基氯化铵已实现工业化生产)、操作简单、成本低等优点。
本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒,使其作为口服递送载体,具备了永久正电性和生理环境下的水溶性,可有效地降低跨上皮细胞电阻,打开上皮细胞的紧密连接,通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运,提高纳米粒的摄取率。
与壳聚糖纳米粒子相比,本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒,其粒径容易控制,制备的载药纳米粒粒径小,包封率高(40%~90%)、载药量大(20%~70%)、制备条件温和、药物毒副作用低、缓释时间长。本发明制备工艺简单,生产成本较低,易于规模化生产。
本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒,其中病毒含量为106..5EID50/0.1mL,符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗用毒液标准。本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒可用于鸡新城疫免疫,经口服给药,给药量为每只鸡0.5mL。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式,还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一:本实施方式N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现:
一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中,在90~120℃下回流搅拌反应1h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,然后分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中,继续回流搅拌反应1.5~8h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,获得脱乙酰处理的壳聚糖;
二、将2~3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100~150mL体积浓度为1~3%乙酸溶液中,搅拌溶解,真空抽滤,滤去不溶物,获得壳聚糖溶液,然后在500~1000r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1~2mol/L的NaOH溶液,调节壳聚糖溶液pH值至8~9并有白色沉淀析出,浸泡8h后抽滤,去离子水洗至滤液呈中性,抽干水分,然后向滤饼中加入15~20mL异丙醇,搅拌30min后倒入三口烧瓶,完成壳聚糖的浸泡处理;
三、在N2保护条件下,将步骤二中的三口烧瓶升温至75~85℃,每隔2h逐滴加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液,每次滴定时间30min,共滴加三次,反应8~14h后将烧瓶冷却至室温,加入150~300mL冷藏处理的无水乙醇,浸泡0.5h后抽滤,冷冻干燥24h,完成壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应,获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖;
四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水,应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀,然后真空抽滤,滤饼分散后冷冻干燥24h,即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成;
其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15%~40%,异丁醇的量为每克壳聚糖加入10~30mL异丁醇;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2~27g;步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。
本实施方式步骤四中完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成后可进行分装,充入N2密封室温保存。
本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的主要反应过程如图1所示;
本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与现有壳聚糖相比较,其傅立叶转换红外线光谱分析如图2所示,可见N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的氨基的伸缩振动峰减弱,在1480cm-1处出现-CH3的C-H弯曲振动强吸收峰,表明引入了羟丙基三甲基氯化铵的季铵盐侧链。壳聚糖的1H NMR谱图如图3所示,N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的1H NMR谱图如图4所示,N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的13C NMR谱图如图5所示,表明其结构与预期结构相符。
实施例1:
N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现:
一、将50g脱乙酰度为85%的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中,在110℃下回流搅拌反应1h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,然后分散在200mLNaOH的异丁醇溶液中,继续回流搅拌反应1.5h,去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性,获得脱乙酰处理的壳聚糖;
二、将3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于150mL体积浓度为2%乙酸溶液中,搅拌溶解,真空抽滤,滤去不溶物,获得壳聚糖溶液,然后在750r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1mol/L的NaOH溶液,调节壳聚糖溶液pH值至8.8并有白色沉淀析出,浸泡8h后抽滤,去离子水洗至滤液呈中性,抽干水分,然后向滤饼中加入20mL异丙醇,搅拌30min后倒入三口烧瓶,完成壳聚糖的浸泡处理;
三、在N2保护条件下,将步骤二中的三口烧瓶升温至80℃,每隔2h逐滴加入2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液,每次滴定时间30min,共滴加三次,反应12h后将烧瓶冷却至室温,加入300mL冷藏处理的无水乙醇,浸泡0.5h后抽滤,冷冻干燥24h,完成壳聚糖与2,3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应,获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖;
四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水,应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀,然后真空抽滤,滤饼分散后冷冻干燥24h,即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成;
其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为20%,异丁醇的量为每克壳聚糖加入20mL异丁醇;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL;步骤三中2,3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为3g;步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。
本实施方式步骤一中获得脱乙酰处理的壳聚糖的脱乙酰度为95%。
本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖,经取代度测定,取代度为34%。合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系如6所示,结果表明,壳聚糖在酸溶液中溶解性良好,但在pH>6.5的溶液中急剧下降,而N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在水中的溶解性随pH变化较小,说明壳聚糖改性为N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖后其溶解性得到了改善。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中壳聚糖的分子量为71.3。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中将2.5g脱乙酰处理的壳聚糖溶于120mL体积浓度为2%乙酸溶液中。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤三中冷藏处理的无水乙醇的温度为4℃。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式五:本实施方式用具体实施方式一合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现:
一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0.5~2mg/mL的溶液,然后取5mL并滴加1.25~7.5mL新城疫病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
二、溶液A在室温、无菌条件下以900~1300r/min磁力搅拌30s,然后滴加2.5mL浓度为0.5~3mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌8~30min,获得溶液B;
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入15mL浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,再加入2mL质量浓度为1%的海藻糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC-NPs),即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒;
其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液,蛋白含量为620μg/mL,血凝价为1∶1024,病毒粒子的粒径为20~300nm;步骤二中司班-80在1400r/min下乳化30min。
本实施方式步骤二中三聚磷酸钠作为交联剂使用。
本实施方式步骤二中滴加1mL的PBS,使其在溶液B中的终浓度为0.01mol/L;步骤二中滴加1mL的司班-80,使其在溶液B中的含量为1/104。
本实施方式中新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的最大包封率可达90%,最大载药量为70%。
本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒,其Zeta电位为35~70mV,粒径为200~900nm。
实施例2:
N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现:
一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1mg/mL的溶液,然后取5mL并滴加6.25mL新城疫病毒液,磁力搅拌3min,获得溶液A;
二、溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s,然后滴加2.5mL浓度为1mg/mL的三聚磷酸钠,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5min,再滴加1mL的PBS,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5min,然后滴加1mL的司班-80,维持在5min内匀速滴完,继续磁力搅拌5min,获得溶液B;
三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min,取沉淀并用PBS洗三次,然后加入15mL浓度为0.01mol/L的PBS悬浮,再加入2mL质量浓度为1%海藻糖脱脂奶,真空冷冻干燥24h,获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为NDV-N-2-HACC-NPs),即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒;
其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液,蛋白含量为620μg/mL,血凝价为1∶1024,病毒粒子的粒径为20~300nm;步骤二中司班-80在1400r/min下乳化30min。
本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒,其透射电镜图见图7和8;Zeta电位见图9,Zeta电位为43~46mV;粒径分布图见图10,粒径为250~600nm。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式五的不同是步骤一中取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1.5mg/mL的溶液,然后取5mL并滴加7mL新城疫病毒液。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式五的不同是步骤二中溶液A在室温、无菌条件下以1100r/min磁力搅拌30s,然后滴加2.5mL浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠。其它步骤及参数与具体实施方式五相同。