CN109152793B

CN109152793B - 免疫学产品

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Publication number: CN109152793B
Application number: CN201780017269.2A
Authority: CN
Inventors: 伊戈尔.波利亚科夫; 柳德米拉.伊万诺娃
Original assignee: Liu DemilaYiwannuowa; Yi GeerBoliyakefu
Current assignee: Liu DemilaYiwannuowa; Yi GeerBoliyakefu
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2017-03-15
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2037-03-15
Also published as: WO2017158040A1; RS61885B1; MX2018010495A; ES2878071T3; AU2017234986C1; US20190125846A1; US11173193B2; PL3429600T3; IL261780A; CY1124290T1; HRP20210801T1; EP3429600A1; EA201891934A1; IL261780B; CN109152793A; EA037516B1; CA3017673A1; PT3429600T; HUE054207T2; LT3429600T

Abstract

本发明涉及包括将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育的步骤的方法、可通过本发明的方法获得的改性壳聚糖、水胶体、式[X]n的化合物、包含根据本发明的改性壳聚糖、水胶体或化合物的组合物、用于人和/或兽医药物的根据本发明的改性壳聚糖、水胶体、化合物或组合物和用于在以下方法中使用的根据本发明的改性壳聚糖、水胶体、化合物或组合物，所述方法用于在受试者中治疗和/或预防乳腺炎，优选潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎、子宫内膜炎，优选慢性、急性和/或化脓性卡他性子宫内膜炎、蹄和爪病、跛、指间隙病变、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝组织炎、毛癣菌病、小孢子菌病、皮肤真菌病、变态反应、以及并发变态反应的疾病，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病，特别是皮炎、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病或疣，特别是寻常性疣，以及用于调节受试者的免疫应答和/或用于增强生殖效率，优选动物育种中的繁殖效率。

Description

免疫学产品

本发明涉及包括将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育的步骤的方法、可通过本发明的方法获得的改性壳聚糖、水胶体、式[X]n的化合物、包含根据本发明的改性壳聚糖、水胶体或化合物的组合物、用于人和/或兽医药物的改性壳聚糖、水胶体、化合物或组合物和用于在以下方法中使用的根据本发明的改性壳聚糖、水胶体、化合物或组合物，所述方法用于在受试者中治疗和/或预防乳腺炎，优选潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎、子宫内膜炎，优选慢性、急性和/或化脓性卡他性子宫内膜炎、蹄和爪病、跛、指间隙病变、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝组织炎、毛癣菌病、小孢子菌病、皮肤真菌病 (mycosis of skin)、变态反应、以及并发变态反应的疾病，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病，特别是皮炎、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病(dermatophytosis)或疣，特别是寻常性疣，以及用于调节受试者的免疫应答和/或用于增强生殖效率，优选动物育种中的繁殖效率。

牛的乳腺炎在世界范围内分布并且在农业中造成广泛的经济损害。由乳腺炎引起的损害特别是由产奶量降低和牛奶质量下降引起。乳腺炎引起动物乳汁减少和无乳。分泌性上皮细胞的各部分的丧失导致结缔组织的再生和乳房的受累部分的萎缩。

子宫内膜炎是子宫粘膜的炎症，其随后是子宫内膜的或多或少的显著变化和健康或再生的子宫腺体的活动增加。最常见地，子宫炎继之以多形性微生物区系的繁殖。慢性子宫内膜炎是一种非常普遍的妇科疾病：它在不孕牛中占12-40％。

约15-25％的母牛患有临床上明显和隐藏的乳腺炎，特别是产奶量很高的牛最暴露于此种疾病。恢复期的母牛的乳衰竭占农场一般奶产量的20％。现有的乳腺炎控制方法和治疗方法不可避免地导致动物和乳汁的高损失。包含子宫内膜炎为最常见疾病的母牛的产后疾病带来巨大的经济损失。子宫内膜炎有多种原因。由兽医的治疗是费时且消耗成本的。

最常见的乳腺炎形式是隐藏性(亚临床)乳腺炎。母牛的隐藏性乳腺炎继之以轻微进行的炎症过程，只有少数或没有乳腺炎的临床体征。治疗具有此种乳腺炎形式的动物是复杂的。此种形式在大型乳制品单元中非常常见，并且通常仅在每月对挤奶兽群的隐藏性乳腺炎形式进行的检查中诊断出来。在机器挤奶期间，约15％的泌乳母牛受潜伏性乳腺炎的影响。隐藏性乳腺炎形成的原因是多方面的。由于机器挤奶操作员不遵守兽医健康规定，由于错误的开始和不遵守乳腺炎动物治疗过程，通常出现隐藏性乳腺炎。同时，慢性子宫内膜炎是一种非常常见的妇科疾病：它在不育母牛中占12-40％。

健康母牛乳房的客观指标是牛奶中含有的体细胞的数目。牛乳中的体细胞由白细胞和乳腺上皮呈现。上皮细胞在健康母牛的乳汁分泌中占主导地位。在自然衰老和组织再生过程期间，在乳房组织中形成上皮细胞。在乳腺炎期间，炎症区域中自细胞的迁移增加，最终导致乳汁中的体细胞急剧增加。来自临床健康母牛的1ml牛奶含有20-25万个体细胞。在乳腺炎期间，它们的数目增加到90万甚至更多。

来自受隐藏性乳腺炎形式影响的母牛的乳汁具有酸减低，因为包含增加的氯化物、白蛋白和球蛋白含量。细胞元素的数目增加数倍，尤其是白细胞的数目。同时，固体(酪蛋白、乳糖、钙和磷)的含量降低。当将来自受隐藏性乳腺炎形式影响的母牛中的奶与健康母牛的奶组合时，奶的整体质量降低。它不能用于奶酪制备和酸奶产品，并且对人体健康有极端不利影响。

目前，抗生素、磺胺制剂或其混合物用于治疗乳腺炎和子宫内膜炎的各种形式。还使用包含具有抗微生物作用的精油的植物提取物。近年来，使用包含益生菌(probiotics)和干扰素的酶制剂和免疫生物学产品。

存在有许多用于治疗具有临床体征的乳腺炎的方法和试剂，但治疗性隐藏性乳腺炎形式的方法是复杂的，并且此种乳腺炎形式的分布远远高于其他形式。已知有通过物理疗法(应用地蜡、石蜡、加温绷带、敷布、灯solux加温、乳房上的红外辐射)治疗亚临床乳腺炎的方法，以及应用各种改进的激光装置的使用。治疗过程由3-4个时段组成，其中每天仅进行一个时段。这些方法的效率在60-85％之间，但是它们非常费时和消耗成本的。已知的是肌肉内施用抗生素的方法：在3天内每天一次8-10ml Tilozin 200的剂量，每天两次0.5ml/10kg体重的Bilozin 200的剂量(在7天期间奶不能用于食物用途)，在 2-3天期间1ml/50kg体重的Efikur的皮下剂量。当使用抗生素时，需要初步检查来自乳房的受影响的象限(quarter)的激活剂对抗生素的敏感性。此外，在几天或一周内不能使用来自经处理的动物的奶和屠宰产品。也已知含有土霉素、新霉素、杆菌肽和泼尼松龙的塑料注射器中的制剂Mastiyet-forte的乳房内应用的方法。该制剂是非常有效的，但是在几天内不能使用来自经处理的动物的奶和屠宰产品。根据D.D.Logvinov，也已知通过普鲁卡因阻断乳房来治疗亚临床乳腺炎的方式。每48小时进行0.5％普鲁卡因溶液的注射。使用此方法，恢复持续3-5天。此种方法的缺点在于它是劳动密集型的并且它具有由注射引起的微生物污染的风险。也已知通过使用1％胶体银(collargol)溶液和包含银的制剂来治疗病牛的方式。将制剂注射到腹主动脉中。若必要的话，48小时后重复注射。包含银的制剂具有高抗细菌活性并且可以用于治疗任何病因性乳腺炎。然而，此种方法是劳动密集型的。也已知在2-3天期间每天1-2次使用乳房内导入含有大量溶菌酶(自健康母牛接受)的配对奶的方法。方法不是非常有效，但是在此处理后可以使用奶和屠宰产品而没有任何限制。也已知使用基于包含嗜热链球菌(Str.thermophilus)和其它双歧杆菌-乳酸杆菌(bifido-lactobacilli)培养物的益生菌的制剂治疗亚临床乳腺炎的方法。这些药物每天在池内注射1-2次。在隐藏性乳腺炎处，1-2次注射2-3天后开始恢复。此方法的缺点是对奶的偶然的细菌污染，出现对乳腺的薄壁组织的新刺激，以及因此病理过程的潜在恶化。也已知通过使用干扰素溶液治疗母牛乳房炎的方法。这些溶液增加了大量存在于乳腺炎动物乳汁中的白细胞的保护功能。该溶液含有装在10g注射器中的至少1000单位的重组牛干扰素。该溶液每天两次在池内以8-14小时间隔使用3天或直至完全恢复。恢复时间为 4-12天。此方法的优点是来自经处理的动物的奶和肉的使用没有任何限制，它不会导致病原性生物体的抗性，并且它没有局部刺激性和吸收性-毒性特征。此种方法的缺点是重复应用制剂的必要性和可引起变应性反应的蛋白质成分的存在。

DD、ID和IP(它们是最常见的传染性蹄和爪病)在世界范围内偶尔分布，但特别是在集约化牛肉或母牛生产单元中可能是地方病的。发病率特别取决于天气、一年中的季节、放牧期和圈养系统。DD通常导致跛以及体重显著下降、生育力丧失和产奶量减少。发病率可以在5％至30％之间。在第一次流行病例中，约30％至80％的动物可以显示该疾病的临床表现。然而，IP平均仅占爪病的15％。

令人惊讶的是许多研究者提出DD、ID和IP的病因学因素是相同的微生物，如结节双螯菌(Dichelobacter nodosus)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necroforun)和梭杆菌属物种(Fusobacterium，spp)，其首先破坏表皮并允许从密螺旋体属物种(Treponema spp)，如蚀疮溃疡密螺旋体(T.phagedenis)、文氏密螺旋体(T.vincentii)和齿垢密螺旋体(T.denticola)进入更深层组织，以形成 DD的临床表现。从受DD、ID和IP影响的组织的病理材料中分离的其他细菌物种是弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes) 和普雷沃菌属物种(Prevotella spp)。此外，提出病毒在疾病的发病机制中起重要作用。

DD、ID和IP的典型治疗策略是应用抗生素、抗菌制剂和具有抗生素、防腐剂和收敛剂的局部应用垫。所有已知的疫苗通常都不能引发足够的免疫反应并保护动物免于趾间皮炎和趾间蜂窝织炎。没有针对趾皮炎的有效疫苗。

变态反应的许多治疗方法是已知的并且取决于变态反应的临床情况。对于急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹和/或特应性湿疹的治疗，通常使用包含糖皮质激素、抗微生物物质、抗炎药和/或钙的亲脂性乳膏。对于其他变应性皮炎的治疗，已经局部或胃肠外应用各种化合物，例如从微生物中分离的类固醇制剂、水杨酸盐，油或肽。所有上述方法仅治疗症状而非变态反应的原因。也已知用于治疗变态反应的试剂，其包含来自喜角质性真菌和酵母的抗原性物质，如WO 97/07232中所述。WO 97/07232中公开的抗原性物质包括从喜角质性真菌和酵母中获得的多糖和/或糖肽。抗原制剂可以用作药物组合物以及疫苗，用于治疗动物和人，尤其用于治疗变态反应和用于调节免疫应答。它们可以具有免疫学和药理学效用。

本发明的目的是提供更有效的免疫生物学产品/制剂。本发明的另一个目的还提供用于兽医和/或人药物的新试剂。本发明的另一个目的是提供新试剂，用于治疗和/或预防乳腺炎，优选潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎、子宫内膜炎，优选慢性、急性和/或化脓性卡他性子宫内膜炎(purulent-catarrhal endometritis)、蹄和爪病(hoof-and clawdiseases)、跛(lameness)、指间隙病变、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝组织炎、毛癣菌病、小孢子菌病、皮肤真菌病、变态反应、以及并发变态反应的疾病，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病，特别是皮炎、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病或疣，特别是寻常性疣，以及用于调节受试者的免疫应答和/或用于增强生殖效率，优选动物育种中的繁殖效率。

这些目的通过权利要求书中限定的主题解决。

以下附图用于说明本发明。

图1显示了1，3-β-D-葡聚糖定量的标准曲线。显示了在已知浓度[pg/ml] 的1，3-β-D-葡聚糖标准溶液上绘制的平均光密度变化速率。对于标准曲线生成，按制造商的建议制备100pg/ml、50pg/ml、25pg/ml、12.5pg/ml和6.25pg/ml 的1，3-β-D-葡聚糖溶液溶液。测量曲线在整个范围内呈线性，并且符合质量控制接受标准(R²＞0.980)。

图2显示了在应用根据实施例41制备的组合物后(实验组)和在没有接种疫苗的情况下(对照组)马中变应性支气管炎的临床症状强度的动力学。以4 天的间隔注射组合物3次。临床症状评分如下：0＝无症状；1＝弱喘息，无咳嗽；2＝弱喘息，咳嗽；3＝急速喘息(expressed wheeze)；4＝急速喘息伴有抑郁的临床症状。

图3显示了在应用根据实施例41制备的组合物后(实验组)和在没有接种疫苗的情况下(对照组)马中慢性阻塞性肺疾病的临床症状强度的动力学。以4 天的间隔注射组合物3次。临床症状评分如下：0＝无症状；1＝弱喘息，无咳嗽；2＝弱喘息，咳嗽；3＝急速喘息；4＝急速喘息伴有抑郁的临床症状。

图4显示了以0.5ml和1.0ml剂量用根据实施例42的组合物免疫的狗中的皮肤病临床体征的动力学(显示每组中临床症状的平均得分；n＝10)。以7天的间隔注射组合物3次。临床症状评分如下：0＝无症状；1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落；2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥(rejection of crusts)； 3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂；4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛；5＝炎症应答，坏死性痂。

图5显示了以0.5ml剂量用根据实施例50的组合物免疫的狗中的皮肤病临床体征的动力学。(显示每组中临床症状的平均得分；接种疫苗者中n＝15 和对照组中n＝15)。以3至4天间隔将组合物注射3次。临床症状评分如下：0 ＝无症状；1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落；2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥；3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂；4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛；5＝炎症应答，坏死性痂。

图6显示了以0.5ml剂量用根据实施例41和43的组合物免疫的狗中的皮肤病的临床体征的动力学(显示了每组中临床症状的平均得分；n＝10)。临床症状评分如下：0＝无症状；1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落；2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥；3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂；4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛；5＝炎症应答，坏死性痂。

图7显示了用根据实施例42制备的组合物治疗的猫中的鼻炎临床体征的动力学。用组合物治疗猫的实验组。完成每天用对鼻的1-2滴的根据研究方案的两个过程。症状评分如下：0＝无症状；1＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀； 2＝从鼻的轻微流出；3＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的流出；4＝呼吸困难，鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的大量流出；5＝动物死亡。

图8显示了用根据实施例43制备的组合物治疗的狗中的鼻炎的临床体征的动力学。用组合物处理狗的实验组。完成每天用对鼻的1-2滴的根据研究方案的两个过程。症状评分如下：0＝无症状；1＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀； 2＝从鼻的轻微流出；3＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的流出；4＝呼吸困难，鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的大量流出；5＝动物死亡

图9显示了用根据实施例54制备的组合物治疗的猫中的结膜炎的临床体征的动力学。每天通过在结膜上滴注1-2滴根据研究方案用组合物处理猫的实验组。症状评分如下：0＝无症状；1＝结膜充血和/或肿胀；2＝轻微的流泪；从眼中流出；3＝结膜充血和/或肿胀，从眼的流出；4＝结膜充血和肿胀，从眼的大量流出；5＝眼球的破坏。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，使用词语“一种”或“一个”可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或超过一个/种”的含义一致。

术语“约”意指涵盖叙述值±叙述值的5％，或用于测量给定值的标准误差。

如本文所用，术语“包含”不应解释为限于意指“由...组成”(即排除另外的其他物质的存在)。相反，“包含”意味着可选地可以存在另外的物质。术语“包含”涵盖如特别设想的实施方案，其落入其范围“由...组成”(即排除存在另外的其他物质)和“包含但不由...组成”(即，需要存在另外的其他物质)，前者更优选。

如本文所用，术语“壳聚糖”是指2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖的共聚物，其中脱乙酰化度超过50％，优选更多超过60％、70％、80％或90％。壳聚糖可以以化学方式源自几丁质，其是聚 -1，4-β-N-乙酰基-D-葡糖胺，更特别是通过脱乙酰化得到的N-乙酰基-1，4-β-D- 吡喃葡糖胺。典型的壳聚糖制剂随制造方法而具有不同的分子量。

如本文所用，术语“乳腺炎”是指乳房和乳房组织的炎症。它优选包括潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎。潜伏性乳腺炎也可称为隐藏性乳腺炎和/或亚临床乳腺炎。优选地，可以通过用2％的mastidin溶液的本领域公知的方法诊断潜伏性乳腺炎。急性乳腺炎也可以是纤维蛋白性、卡他性、化脓性-卡他性、出血性乳腺炎，具有视觉典型的疾病临床症状。

如本文所用，术语“子宫内膜炎”是指子宫内膜的炎症。更优选地，它指子宫粘膜的炎症，其后可以是子宫内膜的或多或少的显著变化和健康或再生的子宫腺体的活性增加。优选地，它包括慢性子宫内膜炎、亚急性、急性和亚临床(隐藏性)子宫内膜炎。炎症的性质分为卡他性、卡他性-化脓性、化脓性、纤维性和隐藏性。子宫内膜炎也可称为子宫炎。最常见地，子宫炎继之以多形性微生物区系的繁殖。

如本文所用，术语“毛癣菌病”是指由来自毛癣菌属的真菌感染引起的疾病。牛通常被疣状毛癣菌感染，而人、狗、猫、马、毛皮动物和其他动物通常被须毛癣菌感染。人类也可以被红色毛癣菌感染。它也可以称为毛癣菌病。

如本文所用，术语“小孢子菌病”或“犬小孢子菌病”是指由小孢子菌属，更优选为犬小孢子菌感染引起的疾病。通常，猫、狗、马和其他动物被此疾病感染。它在猪中特别常见，猪主要被矮小孢子菌(Microsporum nanum) 感染。

如本文所用，术语“疣”通常是指类似于花椰菜的小的粗糙生长或固体疱。通常，疣是由病毒感染引起的。优选地，术语“疣”是指寻常性疣，特别是寻常疣(verrucaevolgares)和甲沟疣(paronychial warts)。

如本文所用，术语“蹄和爪病”特别是指牛科和/或猪中的传染性蹄病和爪病。所述疾病特别是由细菌、真菌和/或病毒引起。特别地，术语“蹄和爪病”指趾皮炎、趾间皮炎和趾间蜂窝织炎。

如本文所用，术语“牛科”特别是指偶蹄类反刍哺乳动物，包括野牛、非洲水牛、水牛、羚羊、瞪羚、绵羊、山羊、麝香鼠(muskoxen)和牛。

如本文所用，术语“跛”特别是指由于感染和组织损伤导致的跛。特别地，术语“跛”是指由于蹄和爪病，更特别地是由于趾皮炎(DD)、趾间皮炎 (ID)和趾间蜂窝织炎(IP)引起的跛。

现在令人惊讶地发现，包含通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖的组合物刺激免疫应答并且可以用于治疗和/或预防许多不同疾病的方法中。此外，令人惊讶地发现，若已知的活性剂与本发明的改性壳聚糖组合施用，则所述活性剂可以以低至多50倍的剂量使用。

因此，本发明涉及通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。优选地，改性壳聚糖是透明凝胶，其缺乏乙酸气味或具有微弱的乙酸气味。本发明的改性壳聚糖优选具有约50Da至约700kDa，特别是约15kDa至约500kDa，更特别是约 15kDa至约150kDa，或约80kDa至约200kDa，约150kDa至约300kDa，约100kDa 至约250kDa或约300kDa至约700kDa的分子量或平均分子量。根据本发明的改性壳聚糖的灰分的质量含量优选为约0.2至2％，更优选约0.8至约1.2％，最优选0.22％。根据本发明的改性壳聚糖也可称为壳聚糖衍生物或壳聚糖变体。

优选地，改性壳聚糖具有每100kDa壳聚糖约100至约500量的反应性氨基基团。根据本发明的改性壳聚糖优选具有约62％至约98％，更优选约80％至约95％，更优选约89％至约93％，或约89％至约98％，约93％至约98％，约93％至95％或约95％至98％的脱乙酰化度。

在本发明的一个优选实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是式[X]n的化合物，其中n表示约1至约5000的整数，特别是约300至约 4000的整数，并且X具有以下式(1)：

其中通过乙酰化改性构成所述化合物的X残基的约2％至约38％，并且其中通过有机羧酸或其盐改性构成所述化合物的所有或部分X残基。

因此，本发明还涉及式[X]n的化合物，其中n表示约1至约5000的整数，特别是约300至约4000的整数，并且X具有下式(1)：

其中通过乙酰化改性构成所述化合物的X残基的约2％至约38％，更优选约5％至约20％，并且其中通过有机羧酸或其盐改性构成所述化合物的全部或部分 X残基。

式X分别指脱乙酰化的2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖单元和D-葡糖胺单元，它是100％脱乙酰化壳聚糖的单体。因此，式X还可以指下式(2)的方括号中表示的式，表示脱乙酰化度为100％的壳聚糖的结构式：

如上概述，n表示约1至约5000的整数。在该限度内，n优选为至少约10、约50、约80、约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900或约1000和/或至多约4000、约3000、约2500、约2000或约1500。在本发明的进一步优选的实施方案中，n代表约50至约2500的整数，特别是约50 至约1000、或约300至约1500、约1000至约2000、约400至约1700、约50至约 1700或约1000至约5000的整数。

在本发明的进一步优选的实施方案中，通过乙酰化改性构成如上定义的化合物的X残基的约5％至约35％，更优选约5％至约20％，更优选约7％至约 11％或约2％至约7％，约5％至7％或约2％至约5％，这意味着它们被乙酰化。通过乙酰化的改性是指将乙酰基官能团引入根据式(1)的残基中，这产生N- 乙酰基-D-葡糖胺残基。

在本发明的一个优选实施方案中，有机羧酸具有约2至约5，更优选约2.3 至约4.9的pK。更优选地，有机羧酸或其盐选自下组：戊酸、戊酸氯化物(valeric acid chloride)、对氨基苯甲酸、葡糖醛酸和乳酸。用有机羧酸或其盐的改性优选通过与所述有机羧酸或其盐或包含所述有机羧酸或其盐的水溶液接触或反应获得。优选地，改性通过与包含约0.2M至约22.5M的所述有机羧酸或其盐的水溶液接触，或在包含约1mM至约100mM的有机羧酸或其盐，更优选约1mM至约10mM的水溶液中接触发生。

在本申请的一个优选实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是聚氨基糖胶体，优选水胶体。在本申请的一个优选实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体或壳聚糖- 对氨基苯甲酸-水胶体或壳聚糖-戊酸-水胶体。在本申请的另一个优选实施方案中，壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体具有化学式：(C₆H₁₁O₄N)_x(C₈H₁₃O₅N_y (C₆H₁₀O₇)_z(H₂O)_m.。优选地，壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体具有以下分子量： x*(161)+y*(203)+z*(194.14)+m*(18)。在本申请的另一个优选实施方案中，壳聚糖-对氨基苯甲酸-水胶体具有化学式：(C₆H₁₁O₄N)_x(C₈H₁₃O₅N)_y (C₇H₇O₂N)_z(H₂O)_m。优选地，壳聚糖-对氨基苯甲酸-水胶体具有以下分子量： x*(161)+y*(203)+z*(137.14)+m*(18)。在本申请的另一个优选实施方案中，壳聚糖-戊酸-水胶体具有化学式：(C₆H₁₁O₄N)_x(C₈H₁₃O₅N)_y(C₅H₁₀O₂)_z(HCl)_z (H₂O)_m。优选地，壳聚糖-戊酸-水胶体具有以下分子量：x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36.5)+m*(18)。

因此，本申请还涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至5％(w/v)壳聚糖和0.001至5％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物或

(ii)0.1％至5％(w/w)壳聚糖和0.001至5％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。

本发明的优选实施方案涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至3％(w/v)壳聚糖和0.001至2％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物，或

(ii)0.1％至3％(w/w)壳聚糖和0.001至2％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。

本发明的另一个优选实施方案涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至1.2％(w/v)壳聚糖和0.001至1％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物，或

(ii)0.1至1.2％(w/w)壳聚糖和0.001至1％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。

本发明的另一个优选实施方案涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至1.2％(w/v)壳聚糖和

(ii)0.01至0.44％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物。

本发明的另一个优选实施方案涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至1.2％(w/w)壳聚糖和

(ii)0.001至0.6％(w/w)葡糖醛酸或其盐。

本发明的另一个优选实施方案涉及水胶体，其包含：

(i)0.1％至1.2％的壳聚糖和

(ii)0.006至1％(w/w)对氨基苯甲酸或其盐。

优选地，水胶体的壳聚糖是式[X]n的化合物，其中n表示约1至约5000的整数，特别是约300至约4000的整数，并且X具有下式(1)：

其中构成所述化合物的X残基的约2％至约38％，更优选约5％至约20％通过乙酰化改性，并且其中构成所述化合物的全部或部分X残基通过有机羧酸或其盐改性。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的水胶体的剩余百分比由分散介质，优选水或水和氯化氢(HCl)提供。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的水胶体用作稀释液，优选以0 至10倍的稀释。

在本申请的另一个优选实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是天然白色至微黄色粘性液体。优选地，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体具有典型的羧酸气味，优选典型的戊酸气味。

在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体含有约0.2％的戊酰氯(pentanoly chloride)，或0.2％的葡糖醛酸，或0.2％的对氨基苯甲酸。

在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体含有来自干燥壳聚糖的1％壳聚糖残余物。

在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体具有约10至约1000mOsmol，优选约10至约200mOsmol，最优选约 100mOsmol。

在本发明的一个优选实施方案中，通过无机酸进一步改性改性壳聚糖。所述改性可以源自与所述无机酸或包含所述无机酸的水溶液的接触或反应。所述无机酸优选为HCl或H₂SO₄。优选地，通过将经改性壳聚糖在包含约 0.05M至约1M所述无机酸，优选HCl或H₂SO₄的水溶液中温育发生改性。

本发明还涉及包含根据本发明的改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体或水胶体的组合物。优选地，包含所述改性壳聚糖的组合物是缺乏乙酸气味或具有微弱的乙酸气味的透明凝胶，其可溶于水和1％乙酸溶液。该组合物优选具有约50Da至约700kDa，特别是约15kDa至约500kDa，更特别是约 15kDa至约150kDa，或约80kDa至约200kDa，约150kDa至约300kDa，约100kDa 至约250kDa或约300kDa至约700kDa的分子量或平均分子量。根据本发明的组合物的灰分的质量含量为0.1至2％，优选约0.8至约1.2％，更优选约0.22％。

优选地，所述组合物的改性壳聚糖具有每100kDa壳聚糖约100至约500 的反应性氨基基团。根据本发明的组合物的改性壳聚糖优选具有约65％至约 98％，更优选约80％至约95％，更优选约89％至约93％，或约89％至约98％，约93％至约98％，约93％至约95％或约95％至约98％的脱乙酰化度。

在本发明的进一步优选的实施方案中，该组合物另外包含无机酸。所述无机酸支持改性壳聚糖的溶解度和/或可以进一步改性壳聚糖。所述无机酸优选为HCl或H₂5O₄。水溶液优选包含0.05M至约1M的无机酸，优选HCL或 H₂SO₄。

根据本发明的改性壳聚糖优选可通过使壳聚糖与有机羧酸或其盐接触而获得。所述接触优选通过将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育来进行，更优选通过将壳聚糖在戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸氯化物的水溶液中温育进行。优选地，所述温育通过混合和/或搅拌进行。

因此，本发明涉及可通过包括以下的方法获得的改性壳聚糖：

(a)将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育。

本发明还涉及方法，包括以下步骤：

(a)将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育。

在一个优选的实施方案中，首先将壳聚糖在酸性水性条件下溶解，然后通过将pH值增加至约8.0至约8.5的pH值进行沉淀，然后如上所述在有机羧酸或其盐的水溶液中温育它。

因此，本发明还涉及可通过包括以下的方法获得的改性壳聚糖：

(i)将壳聚糖溶解在酸的水溶液中；

(ii)增加pH值直至壳聚糖沉淀；

(iii)回收沉淀的壳聚糖，并且

(a)将步骤(iii)的回收的壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育。

本发明还涉及方法，包括以下步骤：

(i)将壳聚糖溶解在酸的水溶液中；

(ii)增加pH值直至壳聚糖沉淀；

(iii)回收沉淀的壳聚糖，并且

步骤(a)的有机羧酸或其盐优选具有约2至约5，更优选约2.3至约4.9的 pK。更优选地，所述有机羧酸是戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸的氯化物。所述羧酸有机酸或其盐优选以约0.2M至约22.5M 的浓度使用。壳聚糖和步骤(iii)的回收的壳聚糖分别温育，以及步骤(a)中概述的有机羧酸或其盐的水溶液导致壳聚糖的溶解、壳聚糖的改性和/或凝胶的形成。优选地，步骤(a)中的水溶液的pH值为约5至约6或约5.0、5.1、5.2、5.3、 5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。优选地，壳聚糖的改性在包含约1mM至约100mM有机羧酸或其盐的水溶液，更优选约1mM至约10mM中发生。

优选地，进行步骤(a)直至将壳聚糖改性和溶解。它优选通过将壳聚糖与有机羧酸或其盐的水溶液混合或通过在水性条件下悬浮壳聚糖并将有机羧酸加入悬浮液中来进行。它优选在搅拌下进行约1-约72小时，更优选约24- 约48小时。步骤(a)可以包括添加另外的酸，或者可以在存在另外的酸的情况下进行。所述另外的酸优选为无机酸、有机酸或所述无机酸或有机酸的盐。优选地，无机酸是HCl或H₂SO₄，并且有机酸是谷氨酸、对氨基苯甲酸或乳酸。优选地，无机酸或有机酸以将步骤(a)的混合物的pH值调节至约5至约6 或约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0的pH值的量加入或存在。添加另外的酸可以支持壳聚糖的溶解和/或改性，例如，通过减少溶解改性壳聚糖必需的时间。

步骤(a)中或者(若该方法包括步骤(i))对于步骤(i)的壳聚糖的浓度优选是每升约1g至约20g壳聚糖，更优选每升约5g至约15g壳聚糖，最优选每升约8 至约10g壳聚糖。

用于步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖可以是商品化的壳聚糖或从包含壳聚糖的任何天然来源，例如包含壳聚糖的生物质分离的壳聚糖。或者，可以使用几丁质，其在步骤(a)之前或者(若该方法包括步骤(i))在步骤(i)之前脱乙酰化以获得壳聚糖。所述几丁质可以是商品化的，或者它可以从包含几丁质的天然来源，例如包含几丁质的生物质分离。用于几丁质和/或壳聚糖分离的生物质优选是真菌、昆虫和/或甲壳类动物的生物质。

几丁质的脱乙酰化可以通过本领域已知的方法进行，例如，通过使用过量的氢氧化钠(NaOH)作为试剂和水作为溶剂或通过酶法进行。从天然来源中分离壳聚糖和/或几丁质也可以通过本领域已知的方法和本发明实施例中描述的方法进行。

用于步骤(a)，或(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约 62％至约95％，更优选约80％至约94％，更优选约89％至约93％或约93％至约 98％，约93％至95％，约95％至约98％，或至少60％，更优选至少70％，80％， 90％或95％的脱乙酰化度，或约60％至约100％，更优选约80％至约95％，甚至更优选约90％至约95％，最优选约77％至约80％的脱乙酰化度。

用于步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约50至400MPas，更优选约70至约150MPas或约151至约350MPas的粘度。

用于步骤(a)，或(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约 50Da至约700kDa，特别是约15kDa至约500kDa，更特别是约15kDa至约150kDa，或约80kDa至约200kDa，约150kDa至约300kDa，约100kDa至约 250kDa或约300kDa至约700kDa的分子量或平均分子量。

在步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))步骤(i)中使用壳聚糖之前，可以通过高压灭菌对壳聚糖进行灭菌。所述灭菌可以导致根据本发明的改性壳聚糖是毒性较低的，任何受试者较好耐受和/或导致较少的无意副作用。

优选地，通过使用弱酸水溶液，优选通过有机酸或其盐，更优选通过乙酸、戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸的氯化物进行步骤(i)。优选地，以约0.8％至约2％的浓度使用酸。步骤(i)优选在搅拌下进行。搅拌可以进行约2小时至约24小时。优选地，进行步骤(i)直至获得凝胶或凝胶悬浮液。可以除去未溶解的颗粒，例如通过过滤。例如，具有200μm 至300μm的单元的金属网格可以用于此类过滤。

优选地，通过增加步骤(i)中获得的凝胶或凝胶悬浮液的pH值进行步骤 (ii)，直至形成沉淀物。优选地，它在搅拌下进行。优选地，它通过在水性碱性条件下处理壳聚糖来进行，更优选在包含约0.1至约25.0％碱的水性碱性条件下进行。在优选的实施方案中，碱是NaOH。优选地，所述步骤在约4℃至约55℃的温度下进行。优选地，处理进行约20分钟至约2小时，更优选约30 分钟至约70分钟，但它也可以需要长达约24小时。优选地，通过将碱加入步骤(i)的凝胶或凝胶悬浮液中来增加pH值。优选地，增加pH值以获得约8.0至约8.5的pH。步骤(ii)可以导致壳聚糖的进一步脱乙酰化。它还可以导致根据本发明的改性壳聚糖是毒性较小的，任何受试者较好耐受和/或导致较少的无意副作用。

步骤(iii)优选通过离心步骤(ii)中获得的混合物或悬浮液来进行。离心优选以约4000至约6000转/分钟进行，更优选以约5000转/分钟进行。离心优选进行长达60分钟。

可获得本发明的改性壳聚糖的方法和本发明的方法可以包括另外的步骤。例如，可以将步骤(ii)中获得的产物均质化。优选地，均质化步骤在封闭的无菌匀浆物器中进行。

或者或另外，可以透析步骤(a)中获得的产物。透析优选在封闭系统中进行，以除去盐的游离离子和低分子量化合物。优选地，通过错流过滤(cross filtration)约1至约6小时，或者通过对馏出水进行膜过滤约24至约48小时进行透析。

或者或另外，可获得本发明的改性壳聚糖的方法和本发明的方法可以包括制备终产物的进一步步骤。终产物的制备可以包括稀释获得的产物。优选地，通过加入水，更优选无菌注射用水稀释产物。然而，产物也可以在任何其它合适的水溶液中稀释。或者或另外，终产物的制备可以包括添加一种或多种另外的化合物，例如稀释剂、防腐剂、抗生素、另外的活性物质和/或来自微生物的抗原性物质和/或酶。合适的防腐剂是例如氯甲酚、硫柳汞和福尔马林。合适的抗生素是例如新霉素、青霉素、庆大霉素、氯唑西林、头孢匹林和头孢菌素。最后，可以灭菌终产物。优选地，通过在约65℃至约80℃的温度下加热，优选进行约40至50分钟来进行灭菌。优选地，将所述灭菌重复一次、两次、三次、四次或五次。

优选地，终产物具有每升约0.02g至约2g改性壳聚糖，更优选每升约0.04 至约1g改性壳聚糖的浓度。

在一个优选的实施方案中，可获得本发明的改性壳聚糖的方法和本发明的方法包括如实施例中描述的步骤。例如，该方法可以包括以下步骤：

-任选地对壳聚糖进行灭菌，例如，通过高压灭菌，

(i)将壳聚糖溶解在酸的水溶液中，特别是在存在乙酸的情况下，

-任选地除去未溶解的颗粒，例如通过过滤，

(ii)增加pH值直至壳聚糖沉淀，

(iii)回收沉淀的壳聚糖，

-任选地在水性条件下均质化回收的壳聚糖，

(a)将步骤(iii)的回收的壳聚糖或均质化的回收的壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育，任选地在存在另外的无机酸或有机酸的情况下，

-任选地透析步骤(a)中获得的产物，

-任选地添加另外的化合物，例如稀释剂、防腐剂、抗生素、另外的活性化合物，例如化学治疗制剂，和/或来自微生物的抗原性物质和/或酶，和

-任选地对终产物进行灭菌，例如，通过加热。

优选地，如上概述的步骤的顺序对应于如上文列出的顺序。然而，如本领域技术人员所知，只要实现相同的效果，可以改变单一步骤的顺序。例如，可以在如上所述的方法的各个阶段中添加稀释剂如水。

若对于如上文所述的方法步骤没有给出特定的温度范围，则步骤优选在室温和/或约10℃至约40℃的范围内进行，更优选在约20℃至约30℃的范围内进行。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及可通过本发明的任何方法获得的改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体和/或包含改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体或水胶体的组合物。

在进一步优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体或水胶体的组合物。

此外，本发明的组合物可以包含其他活性物质。优选地，本发明的组合物可以另外包含化学治疗制剂，特别是若其用于治疗乳腺炎。

在本发明的进一步优选的实施方案，本发明的组合物可以另外包含来自微生物的抗原性材料和/或酶，特别是喜角质性(keratinophilic)真菌和/或喜角质性酵母样真菌和/或酵母的抗原性材料。

喜角质性真菌或酵母的抗原性物质可以源自包含抗原的喜角质性真菌或酵母的任何部分，诸如来自菌丝、关节孢子(artrospores)、皮肤真菌 (dermatophyte)小分生孢子、酵母芽生孢子等。抗原优选是多糖和/或糖肽。喜角质性真菌或酵母的抗原性物质选自下组：均质化灭活的皮肤真菌小分生孢子、均质化灭活的酵母芽生孢子、酵母芽生孢子的抗原性物质和皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质。因此，本发明的组合物可以另外包含均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或均质化的灭活的酵母芽生孢子和/或酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质。

喜角质性酵母，特别是酵母芽生孢子的抗原性物质优选属于念珠菌属，更优选属于白色念珠菌物种。喜角质性皮肤真菌，特别是皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质优选属于毛癣菌属、小孢子菌属和/或Chrisporium。更优选地，皮肤真菌小分生孢子属于物种疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、马毛癣菌(Trichophytonequinum)， Trichophyton sarkisovii，红色毛癣菌(Trichophytonrubrum)、须毛癣菌、犬小孢子菌(Microsporum canis)、石膏样小孢子菌(Microsporumgypseum)和/或 Chrisporium tropicum。特别地，犬小孢子菌物种可以是犬小孢子菌obesum变种(Microsporum canis var.obesum)和/或犬小孢子菌歪斜变种(Microsporumcanis var.distortum)。

在本发明的一个优选实施方案中，酵母芽生孢子和皮肤真菌小分生孢子从上述物种的菌株中获得，所述菌株已经通过基于孢子产生和/或减毒的定向选择获得。高度优选使用与其来源的任何体表附生株相比在营养培养基中生长更快，分别产生更多的小分生孢子和芽生孢子，在其肌肉内应用后具有更低的毒力和/或无不良反应的菌株。此类菌株的实例是须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458、白色念珠菌DSM-9459、 Chrisporium tropicum DSM-28405和犬小孢子菌BINO 483。因此，在本发明的特别优选的实施方案中，酵母芽生孢子和皮肤真菌小分生孢子获得菌株须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458、白色念珠菌 DSM-9459、Chrisporium tropicum DSM-28405和犬小孢子菌BINO 483。

菌株红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌 DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌 DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458和白色念珠菌DSM-9459已根据布达佩斯条约在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen“(DSM)， Mascheroder Weg 1B，W-38124Braunschweig，Germany(其目前名称和地址为“Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH”(DMSZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig， GERMANY)于1994年10月5日由Basotherm GmbH，Eichendorffweg 5，88396 Biberach an der Riss保藏。所述菌株的当前保藏者是申请人，即Dr.Igor Polyakov和Dr.sc.Dr.Liudmila Ivanova，Eberhardtstr.40，89073Ulm。

红色毛癣菌，No.DSM-9469

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9469保藏。该菌株通过基于1985年在人的皮肤上鉴定的体表附生菌株No.533的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.： Dermatophytes，theirrecognition and identification，3rd Print，University of Miami Press.CoralGables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表A中。菌株No.DSM-9469与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。

表A

红色毛癣菌，No.DSM-9470

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9470保藏。该菌株通过基于1990年在人的皮肤上鉴定的体表附生菌株No.535的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognitionand identification，3rd Print，University of Miami Press.Coral Gables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表B中。菌株No.DSM-9470与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。

表B

红色毛癣菌，No.DSM-9471

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9471保藏。该菌株通过基于1990年在人的指甲上鉴定的体表附生菌株No.620的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.： Dermatophytes，theirrecognition and identification，3rd Print，University of Miami Press.CoralGables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表C中。菌株No.DSM-9471与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。

表C

红色毛癣菌，No.DSM-9472

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9472保藏。该菌株通过基于1990年在人的指甲上鉴定的体表附生菌株No.754的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.： Dermatophytes，theirrecognition and identification，3rd Print，University of Miami Press.CoralGables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表D中。菌株No.DSM-9472与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。

表D

红色毛癣菌，No.DSM-9456

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9456保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.008-L的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：A Taxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表E中。菌株No.DSM-9456与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。

表E

红色毛癣菌，No.DSM-9457

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9457保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.012的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：A Taxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表F中。菌株No.DSM-9457与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。

表F

红色毛癣菌，No.DSM-9458

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9458保藏。该菌株通过基于1989年在人上鉴定的流行性菌株No.047的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：A Taxonomic Smdy.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表G中。菌株No.DSM-9458与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。

表G

红色毛癣菌，No.DSM-9459

该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9459保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.158的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：A Taxonomic Smdy.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表H中。菌株No.DSM-9459与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。

表H

须毛癣菌No.VKPGF-930/1032，No.DSM-7279

菌株须毛癣菌DSM-7279根据布达佩斯条约在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen“(DSM)，Mascheroder Weg 1B，W-38124Braunschweig，Germany(其目前的名称和地址是“Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DMSZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，GERMANY)于1992年10月1 日由Boehringer Ingelheim VetmedicaGmbH，6507Ingelheim am Rhein(其目前的地址是Boehringer Ingelheim VetmedicaGmbH，55216Ingelheim am Rhein) 保藏。所述菌株的当前保藏者是申请人，即Dr.IgorPolyakov和Dr.sc.Dr. Liudmila Ivanova，Eberhardtstr.40，89073Ulm。

疣状毛癣菌，No.DSM-28406

菌株疣状毛癣菌BINO348由Binomed GmbH(Einsteinstraβe 59，89077 Ulm)根据布达佩斯条约在Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen undZellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig，Germany以流水号DSM-28406于2014年2月12日保藏。保藏者已授权申请人提及申请中的保藏生物材料，并已根据EPC第31条规定，无保留且不可撤销地同意向公众提供保藏材料。通过基于在1997年从牛中分离的体表附生菌株Nr.348的孢子产生和减毒的定向选择获得菌株。使用 Rebell-Taplin关键词(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognition andidentification，1978)并根据Kashkin，P.N.et.al.(opredelitel patogennykh，toksigenykh vrednykh dlya cheloveka gribov，1979)鉴定菌株。该菌株的生物学性质列于表J。菌株BINO348-DSM 28406与体表附生菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生、更低的毒力和肌内应用抗原后缺乏任何不良反应。

表J.

Chrisporium tropicum，No.DSM-28405

菌株Chrisporium tropicum BINO 122由Binomed GmbH(Einsteinstraβe 59，89077Ulm)根据布达佩斯条约在Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung vonMicroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig，Germany以流水号DSM-28405于2014年2月12日保藏。保藏者已授权申请人提及申请中的保藏生物材料，并根据EPC第31条规定，无保留且不可撤销地同意向公众提供保藏材料。通过基于1993年从土壤中分离的田间菌株Nr.122的孢子产生的定向选择获得菌株。使用Rebell-Taplin关键词 (Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognition andidentification，1978) 并玮根据Carmichael，J.N.Chrysosporium and some otheraleuriosporic hyphomycetes.-Can.J.Bot.，1962，40，1137-1173鉴定菌株。该菌株的生物学特性记载于表K中。菌株BINO 122-DSM 28405与田间菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生、弱毒力和酶的产生。

表K.

犬小孢子菌BINO 483

菌株犬小孢子菌BINO 483由Binomed GmbH(Einsteinstraβe 59，89077 Ulm)根据布达佩斯条约在Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlungv on Microorganis menundZellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe7B，38124 Braunschweig，Germany以流水号No.DSM-32271于2016年2月25日保藏。保藏者已授权申请人提及申请中的保藏生物材料，并已根据EPC第31条规定，无保留且不可撤销地同意向公众提供保藏材料。通过基于1990年从牛分离的体表附生菌株Nr.483的孢子产生和减弱的定向选择获得菌株。使用 Rebell-Taplin关键词(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognition and identification，1978)并且根据Kashkin，P.N.et.al.(opredelitel patogennykh， toksigenykh vrednykhdlya cheloveka gribov，1979)鉴定菌株。该菌株的生物学特性记载于表L中。疫苗菌株483与体表附生菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生、更低的毒力以及肌内应用抗原后缺乏任何不良反应。

表L.

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种小分生孢子或两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的小分生孢子的混合物的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。在另一个优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。组合物可以另外包含皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质和/或酵母芽生孢子的抗原性物质。

在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种小分生孢子的抗原性材料或两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的皮肤真菌小分生孢子的抗原物质的混合物。在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的皮肤真菌小分生孢子的抗原物质和上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的酵母芽生孢子的抗原性物质的混合物。在进一步优选的实施方案中，该组合物包含上文列出的酵母之一或两种、三种或四种的混合物的酵母芽生孢子的抗原性材料。该组合物可以另外包含上文列出的皮肤真菌的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或上文列出的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的酵母芽生孢子。

在一个优选的实施方案中，用于本发明的用途的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、犬小孢子菌、犬小孢子菌 obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和石膏样小孢子菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。例如，疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；批发商：“Prostore”LLC，Moscow)是根据该实施方案并且可以包含在本发明的组合物中。Polivac-TM是一种针对诸如猫、狗、马等动物设计的疫苗。

在进一步优选的实施方案中，本发明的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。例如，疫苗Polivac-T(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；批发商：“Prostore”LLC，Moscow)是根据该实施方案并且可以包含在本发明的组合物中。Polivac-T是专为牛设计的疫苗。

若本发明的组合物包含仅一种菌株的皮肤真菌小分生孢子或仅一种菌株的酵母芽生孢子，则可以如下制备所述皮肤真菌小分生孢子或酵母芽生孢子：

(i)分别在合适的固体培养基上培养皮肤真菌和酵母，收获并均质化皮肤真菌，并且

(ii)灭活步骤(i)中获得的匀浆物。

若本发明的组合物包含皮肤真菌小分生孢子和/或酵母芽生孢子的混合物，则可以如下制备所述混合物：

(i)分别在合适的固体培养基上培养一种皮肤真菌菌株和两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的皮肤真菌菌株，收获每种培养物并分别均质化每种培养物，和

(ii)任选地，分别在合适的固体培养基上培养一种酵母菌株和两种、三种或四种不同的酵母菌株，收获每种培养物并分别均质化每种培养物，和

(iii)组合和灭活步骤(i)中获得的和在步骤(ii)中任选获得的匀浆物。

上文描述的制备方法的皮肤真菌的生长优选在培养瓶中的琼脂和麦芽汁上进行。优选地，培养进行约15至约30天。优选地，培养在约26℃至约28℃的温度下进行。上文描述的制备方法的酵母的生长优选在培养瓶中的麦芽提取物-琼脂或琼脂Sabouraud上进行。优选地，培养进行约4至约7天。优选地，培养在约28至约37℃的温度下进行。

培养后，分别将皮肤真菌和酵母均质化以得到细悬浮液。优选地，均质化在去离子水中，在包含约0.1至0.3％发酵水解肌肉蛋白或约0.1至1％大豆或猪肉蛋白胨与约5至6％葡萄糖和约0.1至1％酵母提取物组合的水溶液中，或在包含根据本发明的0.1-0.9％(w/v)改性壳聚糖的水溶液中进行。

用于均质化的合适体积为约100至500ml。优选地，分别将小分生孢子和芽生孢子的浓度分别调节至约3000至约9000万个小分生孢子和芽生孢子每 ml或约25万至约50万，更优选约25万至约40万个小分生孢子和芽生孢子每 ml。然后，可以任选地用蒸馏水，例如生理盐溶液，例如氯化钠或其他合适的溶液将悬浮液另外调节至分别为约4000、5000或6000万的小分生孢子和芽生孢子每ml，或分别调节至约25万至约50万，更优选至约25万至约40万个小分生孢子和芽生孢子每ml。在制备混合物的情况下，优选将单悬浮液分别调节至每ml的相同量的小分生孢子和芽生孢子，并将悬浮液中等体积的每种培养物在单个容器中混合。

优选地，通过使用硫柳汞、甲醛和/或2-丙内酯进行灭活。用于灭活的试剂可以直接添加到细胞悬浮液中。优选通过以约1∶11000至约1∶2500(w/v)的比率加入硫柳汞进行灭活。还优选通过加入甲醛以达到约0.2％至约0.4％(v/v) 的终浓度来灭活。随后，优选温育混合物。温育可以在约20℃至约37℃的温度下进行约1至30天。优选在室温下温育约1至3天，在37℃下温育约5至7天，在室温下温育约30天或在约26℃至28℃下温育约30天。

在一个优选的实施方案中，本发明组合物的小分生孢子处于肿胀状态和 /或具有芽管。更优选地，至少50％的芽生孢子和/或小分生孢子处于肿胀状态和/或具有芽管。皮肤真菌的肿胀状况和/或芽管可以例如通过第二温育步骤获得。所述第二温育步骤优选在均质化之后和如上所述灭活之前进行。为了进行第二培养步骤，将小分生孢子悬浮液置于含有第一温育步骤的相同培养基的单独容器中。第二培养步骤优选进行约10至约48小时。第二培养步骤优选在约28℃的温度下进行。优选地，继续第二培养步骤，直到至少50％的小分生孢子显示肿胀或发芽状态，并且不超过约7-10％的细胞显示第二菌丝体分支。与常规小分生孢子相比，肿胀且发芽的小分生孢子的直径增加约1.2

或更多。

酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质优选包含从喜角质性真菌或酵母中分离的多糖和/或糖肽。优选地，所述抗原性物质可以是抗原非可溶物质(ANMP)、抗原可溶物质(ASMP)或抗原外源物质(AEMP)。喜角质性真菌优选为毛癣菌或小孢子菌物种，更优选为疣状毛癣菌、须毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌和Chrisporium tropicum的真菌并且喜角质性酵母优选为念珠菌物种，更优选白色念珠菌的酵母。特别优选的是源自须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、Chrisporium tropicum DSM-28405、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌 DSM-9458和白色念珠菌DSM-9459的抗原性物质。例如，抗原性物质可通过 WO 97/07232中公开的方法获得。

通常，为了获得ANMP，属于喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在水性碱性条件下处理，将制备的固相和液相分离，并且分离后用无机酸或有机酸处理固相。在水性碱性条件下的处理优选在约20℃至150℃下用约0.1至5％(w/v) KOH或NaOH进行至多30小时。优选用0.2至1.5M有机酸或0.05至1M无机酸处理固相，并用水溶液洗涤。更具体地，喜角质性真菌或酵母优选在琼脂平板上培养。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。也可以使用其他能确保喜角质性真菌或酵母生长的培养基。将得到的真菌生物质提出并用碱的水溶液处理。随后，分离制备的固相和液相，例如通过离心、过滤或沉降。优选地，通过离心，例如以3500g离心进行分离。这允许良好分离真菌细胞碎片。在水性碱性条件下的处理和分离步骤两者可以重复几次。

碱处理后，在酸性水性条件下处理所得的上清液，如上文概述。例如，可以使用HCl或乙酸。用酸处理优选进行约0.5至约3小时。温度优选在约70至约 100℃的范围内。用于洗涤的水溶液优选为蒸馏水。有利地，洗涤重复约五次。最后，将固相提出并在注射用水中或在0.1-0.9％的根据本发明的改性壳聚糖、壳聚糖变体或壳聚糖衍生物的溶液中均质化。均质化优选以约100至约500ml的体积进行。然后优选将颗粒浓度调节至每ml约3000至9000万个颗粒。最后，可以将包含抗原性物质的制剂冻干并在干燥条件下储存。

通常可以如下获得ASMP：将喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在水性碱性条件下处理，将制备的固相和液相分离，分离后用无机酸或有机酸处理上清液，分离后从上清液中沉淀ASMP。更具体地，在琼脂平板上培养喜角质性真菌或酵母，例如如EP 0564620中所述。一种优选的培养基是例如来自 Oxoid的麦芽提取物琼脂。也可以使用其他能确保喜角质性真菌或酵母生长的培养基。将得到的真菌生物质提出并用碱的水溶液处理。优选的碱性水溶液是NaOH或KOH，优选浓度为0.1-5％(w/v)。碱处理优选在约20-150℃下进行最多30小时。在水性碱性条件下处理后，将制备的固相和液相分离，例如通过离心、过滤或沉降。优选地，通过离心实现分离，这确保了真菌细胞碎片的良好分离，例如，在约3500g的力下。在水性碱性条件下的处理以及分离步骤可以重复几次。碱处理和分离后，将所得上清液在酸性水性条件，例如0.2-1.5M有机酸或0.05-1M无机酸下处理。例如，可以使用HCl或乙酸，优选pH值为约pH 2.5至pH4.5。优选地，在水性酸性条件下的处理在约4至8℃的温度下进行约2至4小时，其中在分离固体和液体层之后发生。在水性酸性条件下的处理以及分离步骤可以重复几次，优选在如上文指出的条件下进行。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。优选地，通过添加合适的有机溶剂，例如醇，如低级链烷醇，例如甲醇或乙醇进行沉淀。一体积上清液与2-5体积醇的比率将导致抗原性物质的良好沉淀。也可以使用本领域技术人员已知的其他非醇沉淀方法，例如硫酸铵或其他盐沉淀。然后将固相进行进一步的分离步骤，优选在如上所述的条件下进行。回收所得的固相，并且若需要的话，将其溶解在水溶液中，优选在蒸馏水中，通常体积为约 25-100ml。最后，可以将ASMP制剂冻干并在干燥条件下储存延长的时间段。

通常可以如下获得AEMP：将喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在液体培养基中培养，将制备的固相和液相分离，分离后从上清液中沉淀AEMP。更具体地，喜角质性真菌或酵母可以在水溶液中温育或在液体培养基中培养。喜角质性真菌也可以在水溶液中与角蛋白一起温育。培养可以持续长达约 240至250小时。溶液或培养物的体积在此定义为初级体积(PV)。可以使用蒸馏水以及EP 0564620中描述的培养基。温育或培养后，例如通过离心、过滤或沉降，优选通过在如上文描述的条件下离心分离真菌细胞。任选地，然后将得到的上清液冻干，随后溶解在水溶液中，优选在水中。优选地，水的体积为初级体积(PV)的约0.1至0.2体积。然后将分离后得到的溶液或所得上清液进行沉淀步骤。优选地，通过添加合适的有机溶剂，例如醇，如低级链烷醇，例如甲醇或乙醇进行沉淀。一体积上清液与约1-5体积醇的比率将导致抗原性物质的良好沉淀。也可以使用本领域技术人员已知的其他非醇沉淀方法，例如硫酸铵或其他盐沉淀。回收所得沉淀物，并且若需要的话，将其溶于含水溶剂，优选蒸馏水中。优选地，将约0.5至50mg的沉淀物溶于1ml水性溶剂中。最后，可以将AEMP溶液冻干并在干燥条件下，优选在约2至10℃下储存延长的时间段。

在一个特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含须毛癣菌，特别是须毛癣菌DSM-7279的灭活的皮肤真菌小分生孢子。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含疣状毛癣菌，特别是疣状毛癣菌DSM-28406的灭活的皮肤真菌微小分生孢子。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的灭活的酵母芽生孢子。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的 ASMP。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的 ANMP。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含须毛癣菌、疣状毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、犬小孢子菌、犬小孢子菌obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和 Microsporum gypseum的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和任选地白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的ASMP的混合物。更优选地，本发明的组合物包含疫苗Polivac-TM和任选地白色念珠菌，特别是白色念珠菌 DSM-9456的ASMP。

在进一步特别优选的实施方案中，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体外，本发明的组合物还包含Chrisporium tropicum，特别是Chrisporium tropicum DSM-28405，或犬小孢子菌BINO 483的AEMP。

本发明的组合物中灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或酵母芽生孢子的浓度优选分别为约3000万至约9000万，更优选约4500至约8000万个小分生孢子和芽生孢子每ml或约25万至约50万，更优选约25万至约30万个小分生孢子和芽生孢子。本发明的组合物中ASMP的浓度优选为约50至约500μg/ml，更优选约100至约400μg/ml。本发明的组合物中ANMP的浓度优选为约3000万至约 9000万，更优选约4000万至约8000万/ml。本发明的组合物中的PoliVac-TM浓度优选为约4000万/ml至约5000万/ml，更优选约4000万/ml至约4500万/ml。本发明的组合物中的AEMP浓度优选为0.5至约2U/ml，更优选约1至约 1.2U/ml。

本发明的组合物优选是药物组合物，其包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。因此，本发明还涉及药物组合物，其包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体和药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。

在本发明的组合物或药物组合物中改性壳聚糖或水胶体的浓度优选为约0.1％至约2.0％(w/v)、更优选约0.1％至约1.4％(w/v)、更多优选约0.1％至约 1％(w/v)、更优选约0.1％至约0.5％(w/v)、更优选约0.1％至约0.3％(w/v)。

本发明的另一方面是用于人和/或兽医药物的本发明的化合物、改性壳聚糖、水胶体和/或组合物。优选地，本发明的化合物、改性壳聚糖、水胶体或组合物用作人和/或兽医药物中的疫苗。

本发明还涉及在以下方法中使用的本发明的化合物、改性壳聚糖、水胶体和/或组合物，所述方法在受试者中治疗和/或预防乳腺炎，优选潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎、子宫内膜炎，优选慢性、急性和/或化脓性卡他性子宫内膜炎、蹄和爪病、跛、指间隙病变、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝组织炎、毛癣菌病、小孢子菌病、皮肤真菌病、变态反应、以及并发变态反应的疾病，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病，特别是皮炎、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病或疣，特别是寻常性疣。

本发明还涉及本发明的化合物、改性壳聚糖、水胶体和/或组合物，其用于调节受试者的免疫应答和/或用于增强生殖效率，优选动物育种中的繁殖效率的方法。

受试者可以是例如人或动物，特别是哺乳动物，更优选牛科和/或猪，最优选牛，而且还有狗、猫或其他耕作动物或家畜。

在一个特别优选的实施方案中，本发明涉及组合物，其包含本发明的改性壳聚糖、水胶体或化合物和须毛癣菌，特别是须毛癣菌DSM-7279的灭活的皮肤真菌小分生孢子，用于治疗和治疗和/或预防动物，特别是牛科和/或猪，最优选牛中的趾间皮炎、趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和疣状毛癣菌，特别是疣状毛癣菌DSM-28406的灭活的皮肤真菌小分生孢子的组合物，用于治疗和治疗和/或预防动物，特别是牛科和/或猪，最优选牛中的趾间皮炎、趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的灭活的酵母芽生孢子的组合物，用于治疗和治疗和/或预防特别地牛科和/或猪，最优选牛中的趾间皮炎、趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的ASMP 的组合物，用于治疗和/或预防人和/或动物，特别是哺乳动物，更优选伴侣动物，最优选的是狗、猫和/或马，而且还有牛、猪或其他耕作动物或家畜中的变态反应，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病或疣，特别是寻常性疣，阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病，皮肤病，特别是皮炎，耳红斑，鼻炎或结膜炎的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的 ANMP的组合物，用于治疗和治疗/或预防动物，特别是牛科和/或猪，最优选牛中的趾间皮炎、趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及组合物，其包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和须毛癣菌、疣状毛癣菌、马毛癣菌、 Trichophytonsarkisovii、犬小孢子菌、犬小孢子菌obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和Microsporumgypseum的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和任选地白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的ASMP的混合物。更优选地，除了本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物之外，本发明的组合物还包含疫苗Polivac-TM和任选地白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的ASMP，用于治疗和/或预防动物，特别是牛科和/或猪，特别是牛中的毛癣菌病或皮真菌病的方法。

在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及组合物，其包含根据本发明的改性壳聚糖或水胶体或化合物和Chrisporium tropicum，特别是 Chrisporium tropicum DSM-28405或犬小孢子菌BINO 483的AEMP，用于治疗和/或预防人和/或动物，特别是哺乳动物，更优选牛科和/或猪，最优选牛或马，而且还有狗、猫或其它耕作动物或家畜中的变态反应，特别是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹、阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病、皮肤病、耳红斑、鼻炎、结膜炎、皮真菌病、皮肤真菌病或疣，特别是寻常性疣，阻塞性肺疾病，特别是慢性阻塞性肺疾病，皮肤病，特别是皮炎，耳红斑，鼻炎或结膜炎的方法。

本发明的改性壳聚糖、水胶体、化合物和组合物能够调节免疫系统，即它们具有免疫刺激性质。它们可以用作预防受试者免于如本文概述的疾病的疫苗。或者或另外，它们可以用于针对如本文概述的疾病治疗和治愈受试者。改性壳聚糖、水胶体和组合物可以通过已知的施用途径施用，例如口服、胃肠外、通过肌内注射、通过皮内注射、通过经皮注射、通过滴注、池内、宫内、直肠、皮下和/或局部，优选皮肤，更优选肌内注射和/或皮内注射和/或局部在皮肤上和/或局部在粘膜上施用。它们可以在缺乏或存在一种或多种另外的免疫刺激物质的情况下施用。在一个实施方案中，将所述一种或多种另外的免疫刺激物质分别施用于本发明的改性壳聚糖、化合物或组合物。在另一个实施方案中，一种或多种另外的免疫刺激物质包含在本发明的组合物中或添加到本发明的组合物中。

所述一种或多种免疫刺激物质优选为佐剂，优选选自下组：维生素E乙酸酯、o/w乳剂、磷酸铝、氧化铝、氢氧化铝/甲基纤维素凝胶、油乳剂、muramil- 二肽、弗氏佐剂和皂苷和/或至少一种细胞因子，优选选自下组：IL 2、IL 12 和INF-γ。

在优选的实施方案中，本发明的组合物是疫苗和/或用作疫苗。

在另一方面，本发明涉及用于通过疗法治疗动物和/或人体的方法的本发明的改性壳聚糖、水胶体、化合物或组合物。此类方法通常包括向受试者施用有效量的本发明的改性壳聚糖组合物，优选药物组合物或水胶体。受试者可以是例如人或动物，特别是哺乳动物，更多优选牛科和/或猪，最优选牛，而且还有狗、猫或其他耕作动物或家畜。特别地，本发明的改性壳聚糖、水胶体或组合物，特别是药物组合物可以用于治疗或预防如上文概述的疾病的方法中。治疗方法可以包括治疗和/或预防皮肤、耳、肺、鼻、腿、蹄、爪子、足后部和/或指间隙的细菌性、真菌性和/或病毒性感染。所述感染可以由结节双螯菌(Dichelobacternodosus)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necroforun)、梭杆菌属种(Fusobacterium spp)、密螺旋体属种(Treponema spp)诸如蚀疮溃疡密螺旋体(T.phagedenis)、文氏密螺旋体(T.vincentii)、和齿垢密螺旋体(T. denticola)、弯曲杆菌属种(Campylobacter spp)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)、普雷沃氏菌属种(Prevotella spp.)、毛癣菌属种(Trichophyton spp.)诸如疣状毛癣菌、须毛癣菌、T.sarkisovii、马毛癣菌、许兰毛癣菌(

)、红色毛癣菌、断发毛癣菌(T.tonsurans)、趾间毛癣菌(T.interdigitale)、和/或小孢子菌属种诸如犬小孢子菌、犬小孢子菌歪斜变种、犬小孢子菌obesum变种、M.gypseum、和/或马拉色菌属种(Malassezia spp.)、诸如厚皮马拉色菌(M.pachydermatitis)、糠秕马拉色菌(M.furfur)、皮炎马拉色菌(M.dermatitis)和/或来自乳头状瘤病毒属(Papillomavirus)乳多空病毒科(Papovaviridae)的HPV-人乳头瘤病毒诸如HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-6、 HPV-11引起。

在根据本发明的治疗和/或预防方法中使用的剂量和施用途径取决于待治疗的特定疾病/感染部位。施用途径可以是例如口服、肠胃外、通过肌内注射、通过皮内注射、通过经皮注射、通过滴注、池内、子宫内、直肠、皮下和/或局部，优选皮肤，更优选肌内注射和/或皮内注射和/或局部在皮肤上和 /或局部在粘膜上施用或任何其他施用途径。

本发明的组合物的优选剂量为约0.001至约0.5ml/kg，浓度为约0.1mg/ml 至约1.0mg/ml和/或约30x10⁶至约80x10⁶个小分生孢子和/或芽生孢子和/或 ANMP颗粒。优选地，将本发明的组合物施用约1至约5次。施用之间的间隔优选为约12小时至约21天。

以下实施例解释本发明，但不认为是限制性的。

实施例1

第一阶段。

壳聚糖的稀释(溶解)

通过高压灭菌将40g多糖壳聚糖灭菌，并在搅拌下加入8升用40ml 100％乙酸酸化的无菌注射用水以得到悬浮液。将悬浮液在无菌罐中混合24小时以获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向凝胶滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所得沉淀物的生物材料在其结构中包含二乙酰化壳聚糖。通过以4500转/分钟离心50分钟来收获沉淀物。

包含二乙酰化壳聚糖的生物材料的改性

将得到的悬浮物在密闭的无菌均质器中在7升无菌注射用水中均质化。在恒定搅拌下将8mL 98％戊酸氯化物(valerianic acid chloride)(戊酰氯(valeryl chloride)，戊酰基氯(pentanoyl chloride))滴加到悬浮液中。随后，将悬浮液搅拌24小时。为了支持片状物和未溶解颗粒的溶解，在搅拌下加入4N盐酸溶液直至悬浮液的pH为5.8。加入无菌注射用水以获得8升的最终体积。之后，使用改性多糖制备终产物。

获得的包含改性壳聚糖的生物材料的特征：

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将2升包含改性壳聚糖的生物材料调节至15升体积。然后向混合物中加入500ml含有 30克氯甲酚的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将所得悬浮液通过以24小时的间隔在72℃下加热45分钟灭菌三次。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例2

壳聚糖的稀释(溶解)

在搅拌下将4g多糖壳聚糖加入到0.8升无菌注射用水中以获得悬浮液。加入4ml100％乙酸，并且将悬浮液在无菌罐中混合24小时以得到凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向凝胶中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌40分钟。所得沉淀物的生物材料在其结构中包含二乙酰化壳聚糖。通过以4500转/分钟离心45分钟收获沉淀物。

包含二乙酰化壳聚糖的生物材料的改性

将获得的悬浮物质在封闭的无菌匀浆物器中在4升无菌注射用水中均质化。在恒定搅拌下将0.8mL的98％戊酸氯化物(戊酰氯，戊酰基氯)滴加到悬浮液中。随后，将悬浮液搅拌24小时。为了支持片状物和未溶解颗粒的溶解，在搅拌下加入4N盐酸溶液直至悬浮液的pH为5.5。之后，使用改性多糖制备终产物。

获得的包含改性壳聚糖的生物材料的特征：

第二阶段。为了获得终产物，将200ml改性壳聚糖再悬浮在1.5升无菌注射用水中，并在搅拌下加入50ml含有2g活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至2升的体积。将所得悬浮液通过以24小时的间隔在70℃下加热40分钟灭菌三次。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例3

壳聚糖的稀释(溶解)

通过高压灭菌将80g多糖壳聚糖灭菌，并在搅拌下加入用80ml 100％乙酸酸化的16升无菌注射用水以得到悬浮液。将悬浮液在无菌罐中混合24小时，以得到凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向凝胶中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌50分钟。所得沉淀物的生物材料在其结构中包含二乙酰化壳聚糖。通过以5000转/分钟离心60分钟收获沉淀物。

包含二乙酰化壳聚糖的生物材料的改性

将获得的悬浮物质在封闭的无菌匀浆物器中在4升无菌注射用水中均质化。在恒定搅拌下将16mL 98％戊酸氯化物(戊酰氯，戊酰基氯)滴加到悬浮液中。此外，加入4升无菌注射用水，并且在搅拌下加入3％谷氨酸溶液直至悬浮液的pH为5.0。加入无菌注射用水以获得8升的最终体积。此后将悬浮液搅拌24小时。之后，使用改性多糖制备终产物。

获得的包含改性壳聚糖的生物材料的特征

第二阶段。为了获得终产物，将4000ml改性壳聚糖再悬浮在30升无菌注射用水中，并在搅拌下加入50ml含有40g活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至40升的体积。将所得悬浮液通过以24小时的间隔在72℃下加热45 分钟灭菌三次。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例4

壳聚糖的稀释(溶解)

将16g多糖壳聚糖(脱乙酰化65％-72％，粘度151-350mPas，80-200kDa) 通过高压灭菌灭菌，并在搅拌下加入用164ml 100％乙酸酸化的3升无菌注射用水以获得悬浮液。将悬浮液在无菌罐中混合24小时以得到凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向凝胶中滴加 4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌 30分钟。所得沉淀物的生物材料在其结构中包含二乙酰化壳聚糖。通过以 5000转/分钟离心50分钟收获沉淀物。

包含二乙酰化壳聚糖的生物材料的改性

将得到的悬浮物在密闭的无菌均质器中在1升无菌注射用水中均质化。在恒定搅拌下将0.6mL的98％戊酸氯化物(戊酰氯，戊酰基氯)滴加到悬浮液中。此外，在搅拌下加入0.5％的对氨基苯甲酸溶液直至悬浮液的pH为5.4。加入无菌注射用水以获得1.6升的最终体积。此后，将悬浮液搅拌24小时。之后，使用改性多糖制备终产物。

获得的包含改性壳聚糖的生物材料的特征

第二阶段。为了获得终产物，将1000ml改性级分再悬浮在8升注射用无菌水中，并在搅拌下加入200ml含有10g活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至10升的体积。将所得悬浮液通过以24小时间隔在65℃下加热45分钟灭菌三次。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例5

从壳聚糖制备产物。在两个阶段中制备产物。第一阶段的目的是获得壳聚糖溶液；第二阶段的目的是获得终产物。

第一阶段。

将40g壳聚糖(脱乙酰化82％-87％，粘度151-350mPas，分子量150-300kDa) 通过高压灭菌灭菌，并在搅拌下加入3.5升无菌注射用水中。向所得悬浮液中加入40ml 100％乙酸，并且用注射用水将体积调节至终体积4升。将悬浮液在无菌容器中搅拌24小时，直至获得凝胶悬浮液。向所得悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所得沉淀物的生物材料在其结构中含有N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺 (glucopyranosamine)(壳聚糖)的线性二乙酰化多糖。通过以4500转/分钟离心 55分钟收获沉淀物。

壳聚糖的改性

将沉淀物悬浮在4升无菌注射用水中，并在搅拌下加入4N盐酸以获得5.4 的pH。将悬浮液搅拌24小时直至所有片状物溶解并获得凝胶悬浮液。使用凝胶悬浮液制备终产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，在搅拌下向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例6

从壳聚糖制备产物。在两个阶段中制备产物。第一阶段的目的是获得改性壳聚糖的溶液；第二阶段的目的是获得终产物。

第一阶段。使用具有脱乙酰化度62％-67％，粘度70-200mPas，分子量 100-250kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入40ml 100％乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌24小时直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm的单元尺寸的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。

向制备的悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所接收的生物材料在其结构中包含N- 乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺(壳聚糖)的线性二乙酰化多糖。通过以4500转/分钟离心60分钟收获沉淀物。

壳聚糖的改性

在恒定搅拌下向悬浮液中滴加4mL 98％的戊酸氯化物(valerian acidchloride)。将获得的悬浮物搅拌1小时。将片状物和未溶解的颗粒再悬浮在4 升无菌注射用水中，并在搅拌下加入4N盐酸以使pH为5.0。将悬浮液搅拌28 小时直至所有片状物溶解并获得凝胶悬浮液。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将得到的无菌产物在无菌条件下分配到小瓶中。

实施例7

第一阶段。使用具有脱乙酰化度77％-82％，粘度2700-3300mPas和分子量300-700kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入40ml 100％乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌30小时直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向所得悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所得生物材料在其结构中含有N-乙酰基 -1，4-β-D-吡喃葡糖胺(壳聚糖)的线性二乙酰化多糖。通过以5000转/分钟离心 45分钟收获沉淀物。

包含壳聚糖的生物材料的改性

在恒定搅拌下将8mL 90％乳酸滴加到悬浮液中。将获得的悬浮物搅拌1 小时。将片状物和未溶解的颗粒再悬浮在4升无菌注射用水中，并在搅拌下加入4N盐酸直至获得5.6的pH。将悬浮液搅拌48小时直至所有片状物溶解并获得凝胶悬浮液。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例8

从壳聚糖制备产物。在两个阶段中制备产物。第一阶段的目的是获得改性壳聚糖的溶液，第二阶段的目的是获得终产物。

第一阶段。使用具有脱乙酰化度82％-87％，粘度151-350mPas和分子量 150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入40ml 100％乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌36小时，直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向所得悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所得生物材料在其结构中含有N-乙酰基 -1，4-β-D-吡喃葡糖胺(壳聚糖)的线性二乙酰化多糖。通过以4500转/分钟离心 50分钟收获沉淀物。

包含壳聚糖的生物材料的改性

在恒定搅拌下将0.2％的对氨基苯甲酸溶液加入到沉淀物中至4升。将获得的悬浮物搅拌1小时。在对氨基苯甲酸溶液中悬浮片状物和未溶解的颗粒，并且在搅拌下加入4N盐酸直至获得5.6的pH。将悬浮液搅拌70小时直至所有片状物溶解并获得凝胶悬浮液。

实施例9

第一阶段。使用具有脱乙酰化度67％-72％，粘度为151-350mPas和分子量150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入40ml 100％乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌24小时，直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向所得悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH8.0。此后，白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。所得生物材料在其结构中含有N-乙酰基 -1，4-β-D-吡喃葡糖胺(壳聚糖)的线性二乙酰化多糖。通过以4500转/分钟离心 60分钟收获沉淀物。

包含壳聚糖的生物材料的改性

在恒定搅拌下将0.1％葡糖醛酸钠盐溶液加入沉淀物中至4升。将获得的悬浮物搅拌1小时。将片状物和未溶解的颗粒悬浮在葡糖醛酸溶液中，并在搅拌下加入4N盐酸直至获得5.6的pH。将悬浮液搅拌72小时直至所有片状物溶解并获得凝胶悬浮液。

实施例10

第一阶段。使用具有脱乙酰化度67％-72％，粘度151-350mPas和分子量 150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入8ml98％戊酸钠盐。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌48小时，直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。

实施例11

第一阶段。使用具有脱乙酰化度67％-72％，粘度151-350mPas和分子量 150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入到注射用水中的3.9升0.2％对氨基苯甲酸。在搅拌下加入4N盐酸溶液直至pH为5.6并获得凝胶悬浮液。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌72小时直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm 单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。

实施例12

第一阶段。使用具有脱乙酰化度67％-72％，粘度151-350mPas和分子量 150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入到3.5升0.1％葡糖醛酸钠盐溶液中。为了获得凝胶悬浮液，在搅拌下加入4N盐酸溶液直至pH为5.0。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌78小时，直至获得凝胶悬浮液。通过具有200μm-300μm 单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。

实施例13

第一阶段。使用具有脱乙酰化度67％-72％，粘度为151-350mPas和分子量150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入到3.5升注射用水中。向所得悬浮液中加入8ml90％乳酸。为了溶解片状物和颗粒，加入4N盐酸溶液直至pH为5.7。用注射用水将最终体积调节至4 升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌36小时直至获得凝胶悬浮液。通过具有 200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。

实施例14

通过以2升的体积进行实施例1的第一阶段并将其与2升根据实施例5制备的产物混合来制备产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至35升体积。然后，向混合物中加入500mL含有1.6克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至40升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例15

通过以2升的体积进行实施例5的第一阶段并将其与2升根据实施例6制备的产物混合来制备产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至35升体积。然后，向混合物中加入500mL含有2克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至40升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例16

通过以2升的体积进行实施例5的第一阶段并将其与2升根据实施例7制备的产物混合来制备产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至35升体积。然后，向混合物中加入500mL含有1.8克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至40升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例17

通过以2升的体积进行实施例5的第一阶段并将其与2升根据实施例8制备的产物混合来制备产物。

实施例18

通过以2升的体积进行实施例5的第一阶段并将其与2升根据实施例9制备的产物混合来制备产物。

实施例19

通过以2升的体积进行实施例6的第一阶段并将其与2升根据实施例9制备的产物混合来制备产物。

实施例20

通过以2升的体积进行实施例6的第一阶段并将其与2升根据实施例8制备的产物混合来制备产物。

实施例21

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至35升体积。然后，向混合物中加入500mL含有80mL活性物质的福尔马林。将所得悬浮液调节至40升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例22

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至35升体积。然后，向混合物中加入500mL含有85mL活性物质的福尔马林溶液。将所得悬浮液调节至40升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例23

根据实施例5制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有15克活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例24

根据实施例6制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有15克活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例25

根据实施例7制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有1.6克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例26

根据实施例8制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30mL活性物质的福尔马林溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例27

根据实施例9制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含0.6克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至 15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例28

根据实施例6制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至5升体积。然后，向混合物中加入500ml含有6克活性物质的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至 6升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例29

根据实施例7制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至5升体积。然后，向混合物中加入500ml含0.24克活性物质的硫柳汞。将所得悬浮液调节至6升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例30

根据实施例8制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至5升体积。然后，向混合物中加入500ml含有12mL活性物质的福尔马林溶液。将所得悬浮液调节至6升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例31

根据实施例9制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至5升体积。然后，向混合物中加入500ml含有0.24克活性物质的硫柳汞溶液。将所得悬浮液调节至6升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例32

根据实施例8制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有150g活性物质的新霉素溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例33

根据实施例8制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有300g(300.000.000UE)活性物质的青霉素钠和钾盐溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例34

根据实施例8制备产物，不同之处在于，在获得所得产物的第二制备阶段中，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后，向混合物中加入500ml含有300g(300.000.000UE)活性物质的青霉素钠和钾盐溶液和500ml含有150g活性物质的新霉素溶液。将所得悬浮液调节至15 升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例35

通过以2升的体积进行实施例7的第一阶段并将其与2升根据实施例8制备的产物混合来制备产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至15升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30mL活性物质的福尔马林溶液。将所得悬浮液调节至20升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例36

通过以2升的体积进行实施例7的第一阶段并将其与2升根据实施例6制备的产物混合来制备产物。

实施例37

通过以5升的体积进行实施例7的第一阶段来制备产物。

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将4升改性多糖调节至15升体积。然后向混合物中加入500ml含有30mL活性物质的福尔马林溶液。将所得悬浮液调节至20升的体积。在无菌条件下将所得无菌产物分配到小瓶中。

实施例38

将物种须毛癣菌DSM-7279的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在根据实施例6，但是在第二阶段中的以下差异的情况下获得的产物的水溶液(例如100-500ml)中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将得到的无菌产物加入到真菌悬浮液中，以得到每种匀浆物每ml 4500-8000万个小分生孢子的浓度。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中，使得细胞悬浮液最终含有0.2％(v/v)甲醛来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育5-7天。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎。

实施例39

将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在根据实施例8，但是在第二阶段中的以下差异的情况下获得的产物的水溶液(例如100-500ml)中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将得到的无菌产物加入到悬浮液中，以得到每种匀浆物每ml4500-8000万个的浓度。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中，使得细胞悬浮液最终含有0.4％(v/v)甲醛来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育 5-7天。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎和/或毛癣菌病(trihophytosis)。

实施例40

将物种白色念珠菌DSM-9456在麦芽提取物-琼脂或琼脂Sabouraud上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在28-37℃培养4-7天。用生理氯化钠溶液或另一种合适的溶液洗去芽生孢子。将皮肤真菌的真菌质量提出并在根据实施例9，但是在第二阶段中的以下差异的情况下获得的产物的水溶液(例如100-500ml)中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，向混合物中加入 500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将得到的无菌产物加入悬浮液中，以得到每ml匀浆物的浓度4000-9000万个小分生孢子。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中，使细胞悬浮液最终含有 0.3％(v/v)甲醛来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育5-7天。

实施例41

第一步：将物种白色念珠菌DSM-9456在来自Oxoidin 40Roux烧瓶的麦芽提取物琼脂上培养。如EP 0564620中描述，将培养物在28-37℃培养4-7天。将所得的真菌生物质提出并用浓度为3％(w/v)的NaOH水溶液处理。所述碱处理在80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在pH4.0的50％乙酸在4℃至8℃的温度下处理2小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。通过添加乙醇进行沉淀。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将 ASMP制剂冻干。最后，将固相提出并在根据实施例6，但是在第二阶段中的以下差异的情况下获得的产物中均质化：

第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将ASMP的浓度调节至400μg/ml。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗变态反应。

实施例42

第一步：将物种白色念珠菌DSM-9456在50个Roux烧瓶中的来自Oxoid 的麦芽提取物-琼脂上培养。如EP 0564620中所述，将培养物在28-37℃下培养4-7天。将所得的真菌生物质提取并用浓度为3％(w/v)的NaOH水溶液处理。碱处理在80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在pH4.0的50％乙酸在4℃至8℃的温度下2小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。通过添加乙醇进行沉淀。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将ASMP 制剂冻干。

最后，将固相提出并在根据实施例8，但在第二阶段具有以下差异的情况下获得的产物中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升体积。然后向混合物中加入500ml 含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将ASMP 的浓度调节至200μg/ml。

实施例43

第一步：将物种白色念珠菌DSM-9456在50个Roux烧瓶中的来自Oxoid 的麦芽提取物-琼脂上培养。如EP 0564620中所述，将培养物在28-37℃下培养4-7天。将所得的真菌生物质提出并用浓度为3％(w/v)的NaOH水溶液处理。碱处理在80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在pH4.0的50％乙酸在4℃至8℃的温度下2小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。通过添加乙醇进行沉淀。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将ASMP 制剂冻干。

最后，将固相提出并在根据实施例9，但在第二阶段具有以下差异的情况下获得的产物中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升的体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将ASMP的浓度调节至100μg/ml。

实施例44

根据该方法可制备的级分由根据PCT/EP96/03535的包含多糖和/或糖肽 (ANMP)的抗原性非可溶性材料组成。将白色念珠菌DSM-9456在50个Roux 烧瓶中在来自Oxoid的麦芽提取物-琼脂上培养。如EP 0564620中所述，将培养物在28-37℃下培养4-7天。将得到的真菌生物质提出并用浓度为 4％(w/v)NaOH的碱水溶液处理。处理在80℃下进行最多6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在约3500g的力下离心分离制备的固相和液相。碱处理后，用50％乙酸溶液处理固相。酸处理后，将固相用蒸馏水洗涤五次。最后，将固相提出并在根据实施例6，但在第二阶段具有以下差异的情况下获得的产物中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至25升的体积。然后，向混合物中加入500ml含有30 克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将颗粒浓度调节至每ml3000-9000万。

实施例45

将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在根据实施例6，但是在第二阶段的以下差异的情况下获得的产物的水溶液(例如100-500ml)中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性多糖调节至10升体积。然后向混合物中加入500ml含有30克活性成分的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至15升的体积。将得到的无菌产物加入到真菌悬浮液中，以得到每种匀浆物的每ml的4500-6000万个小分生孢子的浓度。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中，使细胞悬浮液最终含有0.2％(v/v)甲醛来使匀浆物灭活。将混合物在 37℃下温育5-7天。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗牛的毛癣菌病。

实施例46

将在其结构中含有通过0.2％对氨基苯甲酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖的生物材料溶液加入到针对动物皮真菌病的 Polivac-TM疫苗(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC， Moscow)以达到终浓度0.3％(w/v)。溶液的pH为约5.6。小分生孢子的浓度为 4000万/ml。

根据该方法可制备的疫苗可用于预防和治疗动物的皮真菌病。

实施例47

如EP 0564620中所述，在琼脂平板上培养白色念珠菌DSM-9456。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。将得到的真菌生物质提出并用浓度为3％(w/v)的NaOH水溶液处理。碱处理在80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在pH4.0的50％乙酸在 4℃至8℃的温度下处理2小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将ASMP制剂冻干。

将在其结构中含有通过0.5％对氨基苯甲酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖的生物材料溶液加入疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)以达到终浓度 0.3％(w/v)。溶液的pH为约5.8。小分生孢子的浓度为每ml 4000万。最后，将 ASMP的固相与改性的疫苗Polivac-TM混合。将ASMP的浓度调节至400μg/ ml。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物皮真菌病(dermatophytosis)。

实施例48

使用PROTEOS Biotech，14Almansa Street，02006Albacete，Spain生产的角蛋白酶Pure 70制备含有2U/ml的溶液。如EP 0564620中所述，在琼脂平板上培养DSD-9456。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。将得到的真菌生物质提出并用浓度为3％(w/v)的NaOH水溶液处理。碱处理在 80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在 pH4.0的50％乙酸在4℃至8℃的温度下处理2小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将ASMP制剂冻干。

将角蛋白酶Pure 70的溶液在0.3％的生物材料溶液溶液的水溶液(例如 100-500ml)中混合，所述生物材料在其结构中含有根据实施例8(第一阶段)制备的对氨基苯甲酸的改性N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将角蛋白酶Pure 70的浓度调节至1-1.2U/ml。加入福尔马林以在最终悬浮液中达到 0.2％(v/v)。将混合物在37℃下温育5-7天。最后，将ASMP的固相提出，并在 N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的改性线性多糖的水悬浮液中均质化。将 ASMP的浓度调节至200μg/ml。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物的皮真菌病。

实施例49

将物种犬小孢子菌BINO 483的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中在26-28℃培养21天。在具有角蛋白的培养基中培养小分生孢子的悬浮液，并且如下根据RF专利№2219945获得皮肤真菌外抗原：将具有40x10⁶至50x10⁶的小分生孢子浓度的获得的悬浮液在29℃的温度下搅拌培养7天。随后，加入福尔马林以获得0.4％的终浓度。通过三个过滤步骤分离液相：通过具有200μm-300μm单元的金属网格，然后通过Whatman 纸滤器No.4(尺寸20μm-25μm)，最终通过尺寸为0.22μm的尼龙滤器进行消毒，但在福尔马林防腐过程中，令人惊讶地发现所获得的级分(AEMP)的抗原活性增加。将皮肤真菌外抗原AEMP提出并且在0.2％生物材料溶液的水溶液(例如100-500ml)中均质化，所述生物材料在其结构中含有根据实施例8的对氨基苯甲酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将AEMP的浓度调节至1-1.2U/ml。加入福尔马林以在最终悬浮液中达到0.2％(v/v)。将混合物在37℃下温育5-7天。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物中的皮真菌病。

实施例50

将物种Chrisporium tropicum DSM-28405的真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中在26-28℃下培养21天。随后，将获得的小分生孢子悬浮液培养在具有角蛋白的培养基中，并且根据RF专利№2219945 如下制备外抗原：将具有50x10⁶至60x10⁶的小分生孢子浓度的获得的悬浮液在30℃的温度下搅拌培养7天。随后，加入0.4％的终浓度的福尔马林。通过三个过滤步骤分离液相：通过具有200μm-300μm单元的金属网格，然后通过 Whatman纸滤器No.4(尺寸20μm-25μm)，最终通过尺寸为0.22μm的尼龙滤器进行消毒，但在福尔马林防腐过程中，令人惊讶地发现外抗原级分(AEMP) 的抗原活性增加。将真菌的可溶性外抗原AEMP提出并且在0.2％生物材料溶液的水溶液(例如100-500ml)中均质化，所述生物材料在其结构中含有根据实施例8的对氨基苯甲酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将 AEMP的浓度调节至1-1.2U/ml。加入福尔马林以在最终悬浮液中达到 0.2％(v/v)。将混合物在37℃下温育5-7天。

根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物中的皮真菌病和变应性疾病。

实施例51

将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在0.2％生物材料溶液的水溶液(例如100-500ml)中均质化，所述生物材料在其结构中含有根据实施例6的通过戊酸氯化物改性的 N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将小分生孢子的浓度调节至25万 -30万/ml。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中以最终达到0.2％(v/v)来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育5-7天。

实施例52

将物种须毛癣菌DSM-7279的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在0.2％生物材料溶液的水溶液(例如100-500ml)中均质化，所述生物材料在其结构中含有根据实施例8的对氨基苯甲酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将小分生孢子的浓度调节至25万-30 万/ml。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中以最终达到0.2％(v/v)来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育5-7天。根据该方法可制备的疫苗可以例如用于预防和治疗动物的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝组织炎。

实施例53

将物种须毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在3-10个Roux烧瓶中培养。将培养物在26-28℃下培养15-30天。将皮肤真菌的真菌质量提出并在0.2％生物材料溶液的水溶液(例如100-500ml)中均质化，所述生物材料在其结构中含有根据实施例9的通过葡糖醛酸改性的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺的线性多糖。将小分生孢子的浓度调节至25万-30 万/ml。通过将甲醛直接加入细胞悬浮液中以最终达到0.1％(v/v)来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育5-7天。

实施例54

第一阶段。使用具有脱乙酰化67％-72％、粘度151-350mPas和分子量 150-300kDa的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入注射用水中的3.9升0.2％对氨基苯甲酸。为了获得凝胶悬浮液，在搅拌下加入4N盐酸溶液，得到pH 5.6。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌72小时直至获得凝胶悬浮液。通过具有 200μm-300μm单元的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。如EP 0564620中所述，在琼脂平板上培养白色念珠菌DSM-9456。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。将得到的真菌生物质提出并用浓度为3％(w/v) 的NaOH水溶液处理。碱处理在80℃下进行6小时。在水性碱性条件下处理后，通过在3500g下离心分离制备的固相和液相。在碱处理后，将所得上清液在酸性水性条件下处理，例如在pH4.0的50％乙酸在4℃至8℃的温度下处理2 小时，然后分离固体层和液体层。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。通过添加乙醇进行沉淀。一体积上清液与3体积醇的比率导致抗原性物质的良好沉淀。最后，将ASMP制备物冻干。将固相提出并在根据实施例6，但在第二阶段具有以下差异的情况下获得的产物中均质化：第二阶段。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将0.3升改性多糖调节至体积 2.5升。然后向混合物中加入500ml含有0.24克活性成分的硫柳汞溶液。将所得悬浮液调节至6升的体积。将ASMP的浓度调节至100μg/ml。

实施例55

进行葡聚糖存在的分析。

测试描述

1，3-β-D-分析(Cape Cod，USA)。如制造商中所述进行测试。使用针对血清说明的CE标记的

测定法来确定抗原样品中的葡聚糖含量。简而言之，该测试是基于蛋白酶酶原的比色测定法并且利用鲎阿米巴样细胞裂解物(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)途径的修改。修改Fungitell试剂以消除因子C，因此仅与1，3-β-D-葡聚糖反应。将未知样品与测定试剂混合，并在40 分钟间隔内对于所有数据点计算平均光密度变化速率。通过与平行生成的标准曲线比较，可以计算样品中1，3-β-D-葡聚糖的量。

在无菌ddH₂O中制备抗原No.1-13的测试溶液，随后在无热原的LAL试剂级水中制备进一步的稀释液。基于内毒素测试的结果，在Fungitell测定法中测量具有可检测凝胶凝固的最高稀释度和上方和下方的一次稀释。每个样品以20秒的间隔一式两份测量，总共40分钟。

检测结果

对于标准曲线生成，按照制造商的建议制备100pg/ml、50pg/ml、25 pg/ml、12.5pg/ml和6.25pg/ml的1，3-β-D-葡聚糖溶液(图1)。测量曲线在整个范围内呈线性，并且符合质量控制接受标准(R²＞0.980)。图1中显示了标准曲线。

表1。在上文显示的曲线的基础上，在分析样品的测试溶液中检测以下 1，3-β-D-葡聚糖含量：

mg＞μg＞ng＞pg

实施例56

进行内毒素存在的分析。

根据EP 2.6.14，使用胶-凝块法测定抗原样品中的内毒素含量。

在无菌H₂O中制备抗原No.1-7的测试溶液，随后在无热原的LAL试剂级水中制备1：10至1：10,000,000的稀释液。一式两份测量稀释度，并使用下式计算内毒素浓度：

内毒素浓度＝0.06IU/mlx具有至少一个胶-凝块形成的稀释因子，

半定量测定法的LAL灵敏度为0.06lU/ml。表4中显示了结果

检测结果

表2

IU，国际(内毒素)单位

实施例57

进行抗微生物活性的分析。

测试描述

根据以下程序通过“抗微生物防腐的功效测试”分析化合物的抗微生物活性。为了计数接种产品中的活微生物，使用用于初始培养各微生物的琼脂培养基。接种一系列待检产品的容器，每个容器具有测试生物体之一的悬浮液，以得到每毫升或每克制剂的10⁵-10⁶个微生物的接种物。接种物悬浮液的体积不超过产品体积的1％。为了确保均匀分布，将其彻底混合。将接种的产物保持在20-25℃，避光。根据产品的类型，在零时和适当的间隔从每个容器中取出合适的样品，通常为1mL或1g，并且通过平板计数或膜过滤(2.6.12) 确定活微生物的数目。确保通过稀释、通过过滤或通过使用特定的灭活剂消除产物的任何残留抗微生物活性。当使用稀释程序时，适当考虑到回收少量活微生物的灵敏度降低。当使用特定的灭活剂时，通过使用适当的对照确认系统支持测试生物体生长的能力。确认该程序以验证其证明所需要的活微生物计数减少的能力。

简而言之，各自用0.1ml(1％v/v)的测试微生物铜绿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)和巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis)接种4x10ml的测试溶液(用ddH₂0制备)。抽出6hpi(接种后小时)、24hpi，7dpi(接种后天数)和 14dpi样品，并且通过在琼脂平板上铺板稀释系列测定活微生物的数目。在测试性能之前证实通过稀释得到的测试化合物消除假定残留抗微生物活性。

表3

P.a.，铜绿假单胞菌；S.a.，金黄色葡萄球菌；C.a.，白色念珠菌；A.b.，巴西曲霉；括号中指示相对于0hpi的降低因子。

实施例58

对具有潜伏性(亚临床)乳腺炎的母牛进行治疗。通过常规程序用2％mastidin溶液进行诊断。将动物分成13组，每组6只动物。以24小时间隔将所有组的母牛用10ml制剂在池内处理两次。在第7天和第14天通过标准程序用 2％mastidin溶液再测试所有动物。

表4中显示了结果。

实施例59

对潜伏性(亚临床)乳腺炎的母牛进行治疗。通过常规程序用2％mastidin 溶液进行诊断。将动物分成14组，每组10只动物。以24小时间隔将所有组的母牛用10ml制剂在池内处理三次。在第5天通过标准程序用2％mastidin溶液再测试所有动物。

表5中显示了结果。

实施例60

对具有潜伏性(亚临床)、临床乳腺炎和化脓性-卡他性子宫内膜炎的母牛进行治疗。通过常规程序使用5％的dimastin溶液诊断乳腺炎和子宫内膜炎的临床症状。以24小时间隔在池内或子宫内对所有母牛施用10ml根据实施例13 制备的制剂两次或三次。在第7天通过标准程序和临床观察用5％的dimastin 溶液再测试所有动物。

表6中显示了结果。

实施例61

对具有潜伏性(亚临床)乳腺炎的母牛进行治疗。通过常规程序使用5％的dimastin溶液诊断乳腺炎和子宫内膜炎的临床症状。以24小时间隔在池内或子宫内对所有母牛施用10ml根据实施例26制备的制剂两次或三次。在第7天通过标准程序和临床观察用5％的dimastin溶液再测试所有动物。

表7中显示了结果。

因此，获得的免疫生物制剂使得治疗母牛的乳腺炎成为可能，其可广泛用于控制此种广泛的疾病。

实施例62

对具有潜伏性(亚临床)乳腺炎的母牛进行治疗。通过常规程序使用5％的dimastin溶液诊断乳腺炎和子宫内膜炎的临床症状。以24小时间隔在池内或子宫内对所有母牛施用10ml根据实施例26制备的制剂两次或三次。在第7天通过标准程序和临床观察用5％的dimastin溶液再测试所有动物。59％的动物在处理后恢复。

表8中显示了结果。

实施例63

用各种药物处理具有跛，趾间间隙的损伤(其对于DD、ID和IP是典型的) 的临床证据的母牛。疫苗的治疗应用：3次，间隔7天，剂量为5ml。根据实施例45、40和6制备疫苗。

疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表9中显示了结果。

未观察到应用后的常见且局部反应。疫苗接种的效力是约100％。

实施例64

用各种药物治疗具有跛的临床证据，趾间间隙的损伤(其对于DD、ID和 IP是典型的)的母牛。疫苗的治疗应用：根据实施例45制备的疫苗以10天的间隔3次。

疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表10中显示了结果。

未观察到应用后的常见和局部反应。在以5ml的剂量应用疫苗后，接种疫苗的效力为约80-100％。

实施例65

用各种药物治疗具有跛的临床证据，趾间间隙的损伤(其对于DD、ID和 IP是典型的)的母牛。疫苗的治疗应用：根据实施例45制备的疫苗以10天间隔的3次。

疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表11中显示了结果。

未观察到应用后的常见和局部反应。在以5ml剂量应用疫苗后，接种疫苗的效力为约60-63％。

实施例66

用各种药物治疗具有跛的临床证据，趾间间隙的损伤(其对于DD、ID和 IP是典型的)的母牛。疫苗的治疗应用：3次，间隔7天，剂量为5ml。根据实施例38、39、40和44制备疫苗。

疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表12中显示了结果。

未观察到应用后的常见和局部反应。在所有疫苗接种组中，接种疫苗的效力是约60％至70％。

实施例67

用各种药物治疗具有跛的临床证据，趾间间隙的损伤(其对于DD、ID和 IP是典型的)的母牛。疫苗的治疗应用：3次，0.4ml皮肤内，间隔7天。根据实施例51和52制备疫苗。

疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表13中显示了结果。

未观察到应用后的常见和局部反应。在所有接种疫苗组中，接种疫苗的效力为约60％至70％。

实施例68

剂量滴定研究。针对DD、ID和IP对母牛进行疫苗接种。疫苗的预防性应用：根据实施例6制备的疫苗以10天间隔的2次。

研究疾病的临床表现：

+恢复，或灰色，无疼痛

++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛

+++损伤＞2cm，黄色，中等疼痛

++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛

表14中显示了结果。

未观察到应用疫苗后的常见和局部反应。此时用剂量1 ml和2.5 ml的疫苗接种效力是约93％。来自对照组的45只动物(约21％)具有DD、ID和IP的临床症状。

表15中显示了结果。

此时用剂量1ml和2.5ml的疫苗接种效力是约87％-89％。来自对照组的 59只动物(约27％)具有DD、ID和IP的临床症状。

表16中显示了结果。

用剂量1ml的疫苗接种效力是约70％并且用剂量2.5ml的疫苗接种效力是约53％。来自对照组的154X动物(约72％)具有DD、ID和IP的临床症状。

此研究证明了用剂量1.0ml对动物的预防性疫苗接种。免疫的持续时间是约5.5个月。

实施例69

针对DD、ID和IP对母牛进行疫苗接种。疫苗的预防性应用：根据实施例51制备的疫苗以10天的间隔以0.4ml的剂量皮内3次。

研究概述：

对组1中的动物接种疫苗

接种疫苗后观察

动物计数/DD、ID和IP的临床表现 200/100

最后一次接种疫苗后的160至175天中

动物计数/跛肢的量 200/20

健康动物的量 180

接种疫苗的效力 90％

未对组2中的动物接种疫苗(对照)

接种疫苗后观察

动物计数/DD、ID和IP的临床表现 200/100

最后一次应用安慰剂后的160至175天中

动物计数/具有以下表现的动物计数

DD、ID和IP的临床表现 200/132

健康动物的量 68

观察时间期间患病动物的量 66％

通过局部应用防腐药物或抗生素处理具有疾病的临床症状的所有动物。在IP的情况下，使用抗生素的肌肉内注射。

实施例70

针对DD、ID和IP对母牛进行疫苗接种。疫苗的预防性应用：根据实施例52制备的疫苗以10天的间隔以0.4ml的剂量皮内3次。

研究概述：

对组1中的动物接种疫苗

接种疫苗后观察

动物计数/DD、ID和IP的临床表现 150/80

最后一次接种疫苗后的160至190天中

动物计数/跛肢的量 150/15

健康动物的量 135

接种疫苗的效力 90％

未对组2中的动物接种疫苗(对照)

接种疫苗后观察

动物计数/DD、ID和IP的临床表现 150/70

最后一次应用安慰剂后的160至175天中

动物计数/具有以下表现的动物计数

DD、ID和IP的临床表现 150/118

健康动物的量 32

观察时间期间患病动物的量 78.7％

实施例71

在豚鼠中毛癣菌和小孢子菌攻击后接种疫苗的功效(该方法记载于WO 98/15284)。

须毛癣菌和犬小孢子菌的攻击由对每只动物局部应用的10-20万个小分生孢子/cm²(30万-60万个小分生孢子)组成。疣状毛癣菌的攻击由对每只动物局部应用的50万个小分生孢子/cm²(150万个小分生孢子)组成。在攻击当天通过肌内注射施用单剂的1.0ml疫苗，并在7天后应用第二剂。在最初注射疫苗后持续观察4周。测试根据实施例38、39、46、47、48、49、50制备的疫苗(参见表17-30)。

在攻击当天通过肌内注射应用单剂的1.0ml疫苗，并在7天后应用第二剂。在最初注射疫苗后继续观察4周。

攻击菌株细胞的悬浮液

对于动物的感染，使用疣状毛癣菌(Tv)、须毛癣菌(Tm)和犬小孢子菌(Mc) 作为真菌病原体。关于这些菌株的数据如下所示：

真菌感染的评估

在研究的第7、第15、第22、第29和第36天，观察动物，并且基于以下评估系统评估临床症状：

0＝无症状

1＝真菌感染区域中的皮肤的充血

2＝单一脱皮点

3＝真菌感染区域中的皮肤脱皮

4＝真菌感染区域中的薄的小痂

5＝真菌感染区域中的结痂样痂(scab-like crusts)

治疗方案1

治疗方案2

治疗方案3

表17.豚鼠中疣状毛癣菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中疣状毛癣菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在29天和36天中具有更严重的临床症状。

表18.具有疣状毛癣菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

与对照组相比，更少的接种疫苗的动物在第29和36天具有临床症状。

表19.豚鼠中须毛癣菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中须毛癣菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在29和36天中具有更严重的临床症状。

表20.具有须毛癣菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

表21.豚鼠中的犬小孢子菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中犬小孢子菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在第36天具有更严重的临床症状。

表22.具有犬小孢子菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

与对照组相比，更少的接种疫苗的动物在第36天具有临床症状。

表23.豚鼠中的犬小孢子菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中犬小孢子菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在第29天和第36天具有更严重的临床症状。

表24.具有犬小孢子菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

与对照组相比，更少的接种疫苗的动物在第29天和第36天具有临床症状。

表25.豚鼠中的疣状毛癣菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中疣状毛癣菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在29和36天中具有更严重的临床症状。

表26.具有疣状毛癣菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

表27.豚鼠中的须毛癣菌疾病的临床症状

在不同观察期后显示经攻击的豚鼠中须毛癣菌感染的临床症状的严重性。与接种疫苗的动物相比，未接种疫苗的对照动物在第29天和第36天具有更严重的临床症状。

表28.具有须毛癣菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

表29.豚鼠中的犬小孢子菌疾病的临床症状

表30.具有犬小孢子菌疾病的临床症状的豚鼠的数目

(注意：具有临床症状的动物的数目/经攻击的数目)

实施例72

变应性疾病的治疗效力

表31.应用根据实施例41制备的疫苗后(实验组)和在不接种疫苗的情况下(对照组)马中的变应性支气管炎的临床症状的强度的动力学。以1.0ml的剂量以4天的间隔肌肉内注射疫苗3次。

临床症状的得分

0＝无症状

1＝弱喘息，无咳嗽

2＝弱喘息，咳嗽

3＝急速喘息

4＝急速喘息伴有抑郁的临床症状

图2中显示了马中的变应性支气管炎的临床症状的强度动力学。

表32.应用根据实施例41制备的疫苗后(实验组)和在不接种疫苗的情况下(对照组)马中的慢性阻塞性肺疾病的临床症状的强度的动力学。以1.0ml 的剂量以4天的间隔肌肉内注射疫苗3次。图3中也显示了结果。

临床症状的得分

0＝无症状

1＝弱喘息，无咳嗽

2＝弱喘息，咳嗽

3＝急速喘息

4＝急速喘息伴有抑郁的临床症状

表33.以0.5ml和1.0ml的剂量用根据实施例42的疫苗免疫的狗中的皮肤疾病的临床体征的动力学(显示了每组中的临床症状的均值得分；n＝10)。以1.0ml的剂量以7天的间隔肌肉内注射疫苗3次。图4中也显示了结果。

临床症状的得分

0＝无症状

1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落

2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥

3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂

4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛

5＝炎症应答，坏死性痂

表34.以0.5ml的剂量用根据实施例50的疫苗肌肉内免疫的狗中的皮肤疾病的临床体征的动力学(显示了每组中的临床症状的均值得分；在接种疫苗者中n＝15和在对照组中n＝15)。以3-4天的间隔注射疫苗3次。图5中也显示了结果。

临床症状的得分

0＝无症状

1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落

2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥

3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂

4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛

5＝炎症应答，坏死性痂

表35.小鼠的耳肿胀测试。

与用

H(皮质类固醇)处理相比，用根据实施例41的产物皮下接种疫苗的小鼠中对激发的反应。

表36.根据实施例41制备的疫苗的抗变应性活性

通过视觉检查和检测存在(+)或缺乏(-)符号确定耳红斑。

用微米测量所有动物中的对照和实验耳的厚度。分别对组中的右耳和左耳的表现测量求和(∑)。使用以下公式计算耳肿胀和活性系列的百分比：

1.

2.

3.疫苗活性％＝％对照组中的耳肿胀-％接种疫苗者中的耳肿胀

在实验的所有阶段中，观察到在经攻击的小鼠中接种疫苗和使用泼尼松龙-21-乙酰基后减少炎症应答的正动力学。最明显的对炎性反应的抑制在激发后24小时。应当注意的是，具有右耳(变应原激发部位)上血管注射的所有对照动物的红斑是起反应的。在接种疫苗的动物中，没有表达即时型变应性反应。未观察到应用变应原后耳上的强烈红斑。耳水肿强度在对照动物中比在接种疫苗的小鼠中显著更高，并且大于10％的阈值。此外，应当注意的是，在接种疫苗的动物中比在用泼尼松龙-21-乙酸酯处理者中更强的抑制激发。对照组和测试组中未反应动物的量范围为56-80％，其是该方法所允许的。

表37.小鼠的耳肿胀测试。

对用不同剂量的根据实施例41的产物皮下接种疫苗的小鼠中对激发的反应。

表38.根据实施例41制备的疫苗的抗变应性活性。

应当注意的是，尽管对照和以剂量0.1ml和0.5ml接种疫苗的小鼠在攻击后2小时耳厚度差异较小，但所有对照动物显示右耳上具有注射血管的红斑 (变应原激发)。在接种疫苗的动物中，没有表现变应性反应的即现型。

由于对照和以1.0ml剂量以0.1ml稀释疫苗和未稀释疫苗的剂量接种疫苗者中的激发，观察到变应性反应24和48小时。以剂量0.1ml和0.5ml接种疫苗的小鼠中的变应性反应的激发后的反应缺乏或弱表现。耳水肿的强度在对照动物中和用稀释疫苗和疫苗以1.0ml剂量接种疫苗的组中比在其它接种疫苗者中显著更高。对照和测试组中未反应的动物的量范围为65至81％，其是反应允许的。

表39.以0.5ml的剂量用根据实施例41和43的疫苗肌内免疫的狗中的皮肤病的临床体征的动力学(显示每组中的均值临床症状的得分；n＝10)。疫苗以7天间隔注射3次。

临床症状的得分

0＝无症状

1＝毛发生长，痂的主动排斥或过度剥落

2＝脱发，没有毛发生长，痂排斥

3＝脱屑，肿胀或肿胀伴有痂，未排斥痂

4＝脱屑或肿胀，触诊疼痛

5＝炎症应答，坏死性痂

表40.用根据实施例42制备的疫苗处理的猫中的鼻炎临床体征的动力学。通过以1-2滴剂量对鼻滴注疫苗5天，一天1-2次滴入每个鼻道来治疗动物，并且通过相同方法，但用生理氯化钠溶液(安慰剂)处理来自对照组的其他动物。检查动物，并在治疗前和第一次应用后第5、10、20和30天描述疾病的临床表现。在变应性鼻炎恶化的情况下，进行第二治疗过程达5天。图7中也显示了结果。

0＝无症状

1＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀

2＝从鼻的轻微流出

3＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的流出

4＝呼吸困难，鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的大量流出

5＝动物死亡

表41.用根据实施例43制备的疫苗处理的狗中的鼻炎临床体征的动力学。通过以1-2滴剂量对鼻滴注疫苗5天，一天1-2次滴入每个鼻道来治疗动物，并且通过相同方法，但用生理氯化钠溶液(安慰剂)处理来自对照组的其他动物。检查动物，并在治疗前和第一次应用后第5、10、20和30天描述疾病的临床表现。在变应性鼻炎恶化的情况下，进行第二治疗过程达5天。图8中也显示了结果。

症状得分：

0＝无症状

1＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀

2＝从鼻的轻微流出

3＝鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的流出

4＝呼吸困难，鼻道粘膜的充血和/或肿胀，从鼻的大量流出

5＝动物死亡

表42.用根据实施例54制备的疫苗处理的猫中的结膜炎临床体征的动力学。通过以1-2滴剂量将疫苗滴注入每只眼中达3-5天，每天2-3次来治疗10只猫。在缺乏临床体征的情况下，中断治疗。用生理氯化钠溶液(安慰剂)处理其他5只动物以及实验组的实验动物。检查动物，在治疗前和治疗期间每天描述疾病的临床表现。然后，在第10天检查动物。图9中也显示了结果。

症状得分：

0＝无症状

1＝结膜充血和/或肿胀

2＝轻微的流泪；从眼中流出

3＝结膜充血和/或肿胀，从眼的流出

4＝结膜充血和肿胀，从眼的大量流出

5＝眼球的破坏

实施例73.寻常性疣的治疗功效

病例1.通过对患有寻常性疣(Verucae vulgares和甲沟炎疣(paronychialwarts))的16岁龄女孩进行疫苗接种来证明如实施例38中所述制备的疫苗的功效。用硬膏剂和液滴在受累指甲下将疫苗以24小时的间隔局部应用5次，导致最后一次应用后疣的量的显著减少，并且在最后一次治疗后约两周疣消失。没有观察到严重的副作用。

病例2.通过对患有寻常性疣(Verucae vulgares)的12岁龄女孩接种疫苗来证明如实施例39中所述制备的疫苗的功效。用硬膏剂将疫苗以24小时的间隔局部应用7次，导致最后一次施用后疣的量显著减少，并且在最后一次治疗后约两周疣消失。没有观察到严重的副作用。

病例3.通过对患有寻常性疣(Verucae vulgares)的6岁龄男孩接种疫苗来证明如实施例40中所述制备的疫苗的功效。用硬膏剂将疫苗以24小时的间隔局部应用6次，导致最后一次施用后疣的量显著减少，并且在最后一次治疗后约两周疣消失。没有观察到严重的副作用。

实施例74.水胶体

化学名称：壳聚糖-戊酸-水胶体

小标题：聚氨基糖-戊酸-水复合物(Hydrocomplex)

结构式：

化学式：(C₆H₁₁NO₄)_x(C₈H₁₃NO₅)_y(C₅H₁₀O₂)_z(HCl)_z(H₂O)_m

一般特性

分子量：x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36.5)+m*(18)

外观：天然白色至浅黄色粘性液体，具有典型的气味

溶解度：溶解于：水

气味：典型，类似物戊酸

密度：1.002

pH值：5.5

贮存：保持避光；在4°-8℃的冰箱中在容器中贮存，避空气

稳定性：在上文描述的条件下36个月

化学名称：壳聚糖-4-氨基苯甲酸-水胶体

小标题：聚氨基糖-对氨基苯甲酸-水复合物

结构式：

化学式：(C₆H₁₁NO₄)_x(C₈H₁₃NO₅)_y(C₇H₇NO₂)_z(H₂O)_m

一般特性

分子量：x*(161)+y*(203)+z*(137.14)+m*(18)

外观：浅黄色至黄色粘性液体

化学名称：壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体

小标题：聚氨基糖-葡糖醛酸-水复合物

结构式：

化学式：(C₆H₁₁NO₄)_x(C₈H₁₃NO₅)_y(C₆H₁₀O₇)_z(H₂O)_m

一般特性

分子量：x*(161)+y*(203)+z*(194.14)+m*(18)

外观：浅黄色至黄色粘性液体

实施例75.壳聚糖-戊酸-水胶体的制备

纯化壳聚糖80/100和80/200，AS-No.：9012-76-4，

将氨基-N-乙酰基-D-葡糖胺在单独的容器中灭菌，并进行以获得药物质量的壳聚糖。

试剂溶液

将无菌氨基-N-乙酰基-D-葡糖胺在此无菌水中在搅拌下再悬浮15分钟。在搅拌下(24小时)将400ml乙酸加入悬浮液中直至获得清澈溶液。

纯化步骤

向该溶液中逐滴(小心地)加入4N氢氧化钠溶液以获得pH8.0至8.5。所得溶液沉淀成白色质量。将所得的悬浮液搅拌不少于30分钟。通过过滤将残余物与液相分离。

再悬浮

将沉淀物再悬浮在等量的纯化(无菌)水(注射用水(Pharm.Eur.))(40μl，初始量)中。测量80ml戊酰氯。在搅拌条件下，将戊酰氯逐滴加入悬浮液中。搅拌所得悬浮液直至溶液清澈。加入1.6g硫柳汞(40μg/mL)。清澈溶液是活性成分(水胶体)。获得的多糖胶体(CVHC)在4℃至8℃下储存。对于终产物，得到具有限定的生物活性的水溶液。

制备的反应步骤的概述

1.壳聚糖+水→悬浮液

悬浮液+HAc(24h)→壳聚糖-HAc-溶液

2.纯化步骤

2.1.壳聚糖-HAc-溶液+4N NaOH→(pH 8-8.5)壳聚糖+NaAc+H₂O

2.2.壳聚糖+NaAc+H₂O→H₂O+NaAc

→壳聚糖(固体，纯化)

3.产生

壳聚糖(固体)+H₂O+戊酰氯→

壳聚糖+戊酸+H₂O+HCl→CVHC(壳聚糖-戊酸-水胶体)

产生是基础材料壳聚糖的纯化步骤和在过程中与第二试剂戊酰氯的反应的组合。

此第一个关键步骤是壳聚糖的沉淀，以获得药物质量的纯化壳聚糖的总量。

在过程控制中：监测反应时间和pH值以获得定量沉淀。

测试壳聚糖的药物质量：

测试中间体的质量(壳聚糖药物质量)

在水中的溶解度：将约250mg壳聚糖沉淀物的样品重悬于1ml纯化水中

目标：无法获得溶解度

质量：若不能检测到固体材料量的减少，则满足。

在较强酸中的溶解度：平行地，将相同量的沉淀物悬浮在1ml HCl(3N) 中

目标：总体溶解

质量：若可以检测到固体材料总量的溶液，则满足。

第二个关键步骤是对活性成分的溶解过程。视觉进行控制：应当溶解沉淀物的总量。

实施例76.使用UV/VIS光谱法检查身份

使用根据欧洲药典2.2.25的测试方法。

装置：分光光度计Jasco 7800

测量条件：带宽2nm

范围200-600nm

用溶剂的空白校正

温度：25℃

UV-Cell：12.5x 45mmsemi-micro，10mm路径长度UV级二氧化硅

溶剂：H₂O

测试溶液：将壳聚糖HCl、壳聚糖-HAc、壳聚糖、壳聚糖-戊酸-水胶体和戊酸的适当样品分别溶解在上述溶剂中。将该混合物摇动，然后在超声波浴中超声处理5分钟。

分别对壳聚糖HCl、壳聚糖-HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体和戊酸，根据光谱学的一般基本原理和具有特定发色团基团和取代基的化学结构的吸收最大值可以预期为：200nm。

无法分析壳聚糖的吸收最大值，因为壳聚糖是一种水不溶性固体，其在典型的有机溶剂中也不能溶解。

所有光谱的比较显示无显著性或结构改性如芳香键等。基于原始材料的测量的光谱和文献数据，测量的光谱对应于预期的光谱。因此，上述测量数据证实预期结构的特性。

实施例77.IR-吸收分光光度法

使用根据欧洲药典2.2.24的测试方法。

为了鉴定活性成分壳聚糖-戊酸-水胶体，将不同壳聚糖-衍生物的一系列 IR光谱与产物和戊酸的光谱进行比较。

1.方法和装置

装置红外分光光度计FT/IR 410Jasco

范围：4000cm^-1至600cm^-1

测试样品：将4.8mg壳聚糖的混合物，或4mg壳聚糖-HCl的混合物或3.8 mg乙酸壳聚糖和100mg KBr的混合物小心研磨，并且压成合适的溴化钾盘，或壳聚糖-戊酸-水胶体的膜或NaCl板(对于戊酸)

测量条件：

背景校正：实际

温度20℃

测量的光谱直接对应于来自数据库的文献光谱。

结果：上述测量数据确认测试物质的身份。

2.不同IR-谱的数据

活性成分中的戊酸的IR信号非常小至不可见。

与文献数据的比较：基于原始材料的测量光谱和文献数据，测量的CVHC 谱对应于探察的光谱。

结果：上述测量的数据确认探察结构的身份。

实施例78.¹³C-NMR-光谱学分析

使用根据欧洲药典2.2.33的测试方法。

a)壳聚糖的¹³C-NMR谱

1.方法和装置

装置Bruker AMX 500AVANCE

测量条件

扫描频率：对于以下各项为125MHz：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖-戊酸-水胶体、戊酸

温度：对于以下各项为300K：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体、戊酸；

对于以下各项为301K：葡糖胺HCl和N-乙酰葡糖胺

溶剂：对于以下各项为D₂O：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺；

对于壳聚糖-戊酸-水胶体为DMSO-D6

对于戊酸为CDCl₃

浓度：对于壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体；

对于以下各项为约15mg/0.5ml：葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺和戊酸

校正：对于壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺

对于壳聚糖-戊酸-水胶体为DMSO-D6

对于戊酸为CDCl₃

1.结果

a)壳聚糖的¹³C-NMR-光谱学分析

溶液中的测量：根据中性溶剂中缺少的溶解度，溶液中的测量是不可能的。

固态中的测量：固态中的测量是不可能的。还有，在长测量条件(时间) 后，无可接受的信号出现。

结果：壳聚糖的NMR-鉴定是不可能的。

b)壳聚糖HCl的¹³C-NMR-光谱学分析

结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。

c)壳聚糖HAc的¹³C-NMR-光谱学分析

结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。

d)葡糖胺HCl的¹³C-NMR-光谱学分析

与文献数据的比较：测量的光谱直接对应于来自数据的文献光谱。

结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。

e)N-乙酰葡糖胺的¹³C-NMR-光谱学分析

结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。

f)壳聚糖-戊酸-水胶体的¹³C-NMR-光谱学分析

结果：上述测量的数据确认提出结构的身份。

g)戊酸的¹³C-NMR-光谱学分析

结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。

实施例79。用于分析新产物壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHC)中壳聚糖和杂质的 TLC方法

使用根据欧洲药典2.2.27的测试方法。

本部分呈现了用于鉴定CVHC的薄层层析的程序和数据以及使用的溶剂混合物中的Rf值和在UV光(365nm和254nm)，可见光下和用典型的显现试剂检测时的点颜色。

任何种类的葡糖胺的原始基础原始材料是来自昆虫或螃蟹的天然材料几丁质。这些生物聚合物的单体结构是N-乙酰基-葡糖胺。

对于药物和其他用途，在大多数情况下，脱乙酰几丁质是典型的。此种所得到的生物聚合物是所谓的壳聚糖，其可以被改性为水溶性离子化合物。此壳聚糖的单体结构理论上应当是葡糖胺。

因为脱乙酰化步骤不完全进行，所以壳聚糖具有N-乙酰葡糖胺(乙酰化) 和葡糖胺(脱乙酰化)单元的混合结构。壳聚糖-戊酸-水胶体是一种新的聚氨基糖-戊酸水复合物。因此，没有N-乙酰基-葡糖胺和葡糖胺的阳性分析测试结果应当是可能的。若将单体片段作为残留杂质包埋，则应当可以以其水溶性离子化合物壳聚糖HCl和壳聚糖HAc的形式鉴定壳聚糖。

1方法

装置	Camag层析罐系统
		TLC板	Merck Si60F 254预包被的板
条件	避光和室饱和
		温度	20-25℃
显色：	垂直显色

层析条件

样品溶液	参见单一分析物
		应用	30μl
干燥	气流中最小2分钟
		运动范围	80mm

流动相

溶剂	丙酮	水	25％氨水	-
					混合物	20	10	5	-

2.分析和结果

a)壳聚糖

样品制备

样品：水中悬浮的壳聚糖

1)装置：回流冷凝器

条件：在回流中(145℃)加热约30分钟

2)装置：超声浴

条件：于45℃超声处理约30分钟

3)装置：回流冷凝器

条件：在回流中(145℃)加热约30分钟

4)过滤：0.45μm滤器

使用清澈的滤液进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

备选：有机溶剂中的溶解由于壳聚糖的缺少的溶解度而显示相等的结果。

结果：水性或有机溶剂，如甲醇等中的壳聚糖的可接受的溶解是不可能的。壳聚糖的合适的溶解仅在壳聚糖HCl或壳聚糖HAc产生下在较强的酸，如HCl或HAc中是可能的。

b)壳聚糖HCl

使用5mg壳聚糖HCl/ml H₂O进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

c)壳聚糖HAc

使用5mg壳聚糖HAc/ml H₂O进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

d)葡糖胺HCl

使用5mg葡糖胺HCl/ml H₂O进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

e)N-乙酰葡糖胺

使用5mg N-乙酰葡糖胺/ml H₂O进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

f)壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHC)

CVHC是高粘性的水性凝胶。使用两滴CVHC进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

g)戊酸

使用1μl戊酸(纯)进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

结果：化合物纯度：一个主要点。

3.TLC分析结果的比较

来自TLC的上述结果显示了没有可以用上文测试的特定衍生化试剂检测的单体或二聚体结构的证据。检测和Rf值“0”显示壳聚糖-戊酸-水胶体与相关化合物壳聚糖HCl和壳聚糖HAc的相似性。未能用此TLC系统特异性鉴定戊酸。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。

实施例80.用于分析性检测壳聚糖-戊酸-水胶体中的戊酸的TLC方法

1.方法和参数

建立新的TLC系统以进行成分戊酸的鉴定和纯度测试。

层析条件

干燥	气流中最小2分钟
		运动范围	80mm

流动相

溶剂	乙酸乙酯	-	-	-
					混合物	100	-	-	-

2.结果

a)戊酸(纯)

使用2μl戊酸(纯)进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg

b)壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHV)

使用45μl壳聚糖-戊酸-水胶体，纯(与先前的测试相比，这是高约850被的戊酸量)进行分析。

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg

可以用此TLC-系统鉴定纯戊酸。不能在纯化合物壳聚糖-戊酸-水胶体中检测胶体整合戊酸。检测和Rf值“0”显示壳聚糖-戊酸-水胶体与其它相关壳聚糖化合物的相似性。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。上述结果确认提出的结构的身份。

实施例81.用高真空和较高的温度从壳聚糖-戊酸-水胶体消除戊酸

方法：对干燥评估损失(特殊方法)

装置：速度循环真空浓缩器

条件：5mbar

温度：60℃

时间：1周

端点：恒定质量

外观：玻璃状质量

结果气味：无典型的来自戊酸的气味

样品制备

用水部分再溶解

外观：高粘性凝胶

TLC-分析

装置：Camag层析罐系统

TLC-板：Merck Si 60F 254预包被板

条件：避光和室饱和

温度：20-25℃

显色：垂直显色

层析条件

样品溶液，参见上文

应用：5μl

干燥：气流中最小2分钟

运动范围：80mm

流动相

溶剂	乙酸乙酯	-	-	-
					混合物	100	-	-	-

用UV-荧光和VIS测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

Rf值

点

0

TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg

结果：凭借高真空和较高的温度，发生壳聚糖-戊酸-水胶体的不成比例(disproportion)。可以通过绝对无来自戊酸的典型气味显示戊酸的消除。可以通过TLC分析显示戊酸的消除：无在Rf值0.56处游离戊酸的典型点。可以在 Rf值0处鉴定壳聚糖或壳聚糖化合物。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。

实施例82.在溶剂的情况下壳聚糖-戊酸-水胶体的不成比例

在乙酸乙酯中将壳聚糖-戊酸-水胶体的结构分解成戊酸和壳聚糖化合为。

样品制备

装置：分离漏斗，蒸发器

液体-液体分布：20ml壳聚糖-戊酸-水胶体和10ml乙酸乙酯

条件：摇动约5分钟并且等待相分离

相分离：收集乙酸乙酯相

浓缩步骤：用蒸发器将约10ml浓缩成液体残留物(含水)

再溶解：在1ml甲醇中

均质化：离心步骤约5min 12.000rpm

相分离：上部相：清澈的甲醇溶液

下部相：高粘性凝胶

上部和下部相的TLC分析(参见上文)

a)上部相(清澈的甲醇溶液)的分析

TLC分析

装置：Camag层析罐系统

TLC板：Merck Si 60F 254预包被板

条件：避光和室饱和

温度：20-25℃

显色：垂直显色

层析条件

样品溶液：清澈甲醇溶液

应用：5μl

干燥：气流中最小2分钟

运动范围：80mm

流动相

溶剂	乙酸乙酯	-	-	-
					混合物	100	-	-	-

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

用显现试剂的检测限：0.03μg

结果：上部相是清澈的甲醇溶液。可以用TLC在此溶液中分解水胶体后鉴定戊酸。用TLC不能检出壳聚糖或壳聚糖化合物。

b)分析下部相(高粘性凝胶)

TLC-分析

装置：Camag层析罐系统

TLC板：Merck Si 60F 254预包被板

条件：避光和具有室

温度：20-25℃

显色：垂直显色

层析条件

样品溶液：高粘性凝胶，完全再溶于水中

应用：30μl

干燥：气流中最小2分钟

运动范围：80mm

流动相

溶剂	乙酸乙酯	-	-	-
					混合物	100	-	-	-

用UV-荧光和VIS检测

荧光波长	254nm	365nm	VIS
				化合物信号	无	无	无
杂质	无	无	无

用显现试剂检测

用显现试剂的检测限：0.03μg

结果：下部相是高粘性凝胶，溶于水中。通过TLC在此相中不能检出戊酸。可以通过TLC在下部相(凝胶)中鉴定壳聚糖或壳聚糖化合物。

结果的汇总

结果：壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或聚糖衍生物的溶液。上述结果确认提出的结构的身份。

实施例83.相对密度的评估

由于壳聚糖-戊酸-水胶体的高粘性，根据欧洲药典2.2.5的测试方法，用密度瓶/比重瓶评估密度是不可能的。

1.通过称重的测试方法

装置：250ml容量瓶

天平：Sartorius MC 1LC 2200S

温度计：具有刻度(min 0.5℃)和不超过60℃的范围的温度计

结果1.001[d₂₀ ²⁰]

活性成分是水凝胶，因此理论密度应当高于1.0。测量的数据确认提出的物质的身份。

2.用液体密度计的测试方法

使用根据欧洲药典2.2.5的测试方法。

装置：250ml容量瓶

液体密度计：Widder 1573°，20℃-M100-DIN 12791Klasse H

温度计：具有刻度(min 0.5℃)和不超过60℃的范围的温度计

测量条件：温度20+/-0.5℃，用电子恒温箱

结果1.002[d₂₀ ²⁰]

实施例84.硫酸灰分

使用根据欧洲药典2.4.14的测试方法。

测试

实施例85.干燥后的损失

基于此

建立测定干燥后损失的合适的方法。

1.用于测试壳聚糖HCl、壳聚糖和壳聚糖HAc的方法和参数

样品制备

容器的预处理：在合适的称重瓶中放置物质，所述称重瓶先前在以下使用的条件下干燥。

填充：物质填充不高于5毫升

转运：用合适的盖密封称重瓶

PC法：“较高的真空下”

修改的药典方法2.2.32(EP)“在干燥器中的真空”

装置：干燥器

干燥时间：至恒定的重量

干燥温度：25℃±2℃

真空：用特定的泵得到的持久的4-8mbar

干燥试剂：五氧化二磷(Diphosporuspentoxide)(新鲜)

2.壳聚糖-戊酸-水胶体中壳聚糖干燥后损失的评估(特殊方法)

用比重测定测量评估壳聚糖-戊酸-水胶体中的壳聚糖含量。

装置：速度循环真空浓缩器

方法：评估干燥后的损失(特殊方法)

测量条件

压力：5mbar

温度：60℃

时间：1周

端点：恒定质量

外观：玻璃状质量

测量：测试溶液4ml壳聚糖-戊酸-水胶体

重复：10次

结果气味：无典型的来自戊酸的气味

称重

平均值40,04mg

标准偏差0,236643191

相对标准偏差0,591016961

方差0,056

结果：干燥物质的称重显示良好的相似性。基于此测量，壳聚糖-戊酸- 水胶体中的壳聚糖含量是1％。

结果的比较

主要成分应当是水胶体凝胶。测量的数据确认化合物的结构。

实施例86.渗量的评估

可以完成渗量的评估，其是溶液的熔解点的降低的间接测量。

装置：Halbmicro Osmometer Knauer

测量条件：外部冷却系统

范围：0-1600mOsmol

方法：冷冻

测试程序

在11Wasser中于20℃用标准溶液400mOsmol/Kg：12,687g NaCl校正

重复：2次

容器：特定的玻璃小瓶

样品：壳聚糖-戊酸-水胶体

测试溶液：1，无稀释

2，1∶5稀释

量：各150μl

校正

测量

结果：壳聚糖-戊酸-水胶体渗量的测量显示相对较低的含量。若没有壳聚糖和戊酸的溶液或悬浮液，则渗透反应性组分的测量含量可以仅如此之低。高粘性胶凝化合物可以仅是水胶体。

结果：上述的测量数据确认提出物质的身份。

Claims

1.方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将壳聚糖溶解在酸的水溶液中，其中所述壳聚糖具有62％至98％脱乙酰化度和80kDa至700kDa的分子量或平均分子量，

(ii)增加步骤(i)中获得的溶液的pH值，直至将壳聚糖沉淀，并且

(iii)回收沉淀的壳聚糖；并且

(iv)将步骤(iii)中获得的沉淀的壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育，其中所述有机羧酸选自下组：戊酸、对氨基苯甲酸、葡糖醛酸或任何所述酸的盐。

2.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的酸是乙酸的水溶液和/或步骤(ii)中的pH值增加到8.0至8.5的pH值和/或步骤(iii)中的戊酸的盐是戊酸氯化物。

3.权利要求1或2的方法，其中用于步骤(i)的所述壳聚糖具有80％至95％的脱乙酰化度。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(a)另外包括添加或存在无机酸或有机酸。

5.权利要求4的方法，其中所述无机酸是HCl或H₂SO₄，并且所述有机酸是乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸。

6.可通过权利要求1至5中任一项的方法获得的改性壳聚糖、壳聚糖变体或壳聚糖衍生物。

7.水胶体，所述水胶体包含：

(i)0.1％至5％(w/v)壳聚糖和0.001至5％(w/v)戊酸或其盐，或

8.式[X]n的化合物，其中n表示1至5000的整数，并且X具有下式(1)：

其中构成所述化合物的X残基的2％至38％通过乙酰化改性，并且其中构成所述化合物的全部或部分X残基由选自下组的有机羧酸改性：戊酸、对氨基苯甲酸、葡糖醛酸或任何所述酸的盐。

9.根据权利要求8的化合物，其中n表示300至4000的整数，和/或构成所述化合物的X残基的5％至20％通过乙酰化改性。

10.根据权利要求7的水胶体或根据权利要求8或9的化合物，其中所述戊酸的盐是戊酸氯化物。

11.包含根据权利要求6的改性壳聚糖、壳聚糖变体、壳聚糖衍生物或根据权利要求7的水胶体或权利要求8或9的化合物的组合物。

12.根据权利要求11的组合物，其中所述组合物是药物组合物并且包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂和/或载体。

13.根据权利要求11的组合物，其中所述组合物另外包含来自微生物的抗原性物质和/或酶，或防腐剂和/或抗生素。

14.根据权利要求13的组合物，其中所述微生物是喜角质性真菌和/或喜角质性酵母。

15.权利要求13或14的组合物，其中所述抗原性物质源自以下一种或多种：念珠菌属(Candida)，毛癣菌属(Trichophyton)，小孢子菌属(Microsporum)，和/或Chrisporium。

16.根据权利要求15的组合物，其中所述抗原性物质源自以下一种或多种：白色念珠菌(Candida albicans)，疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)，须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)，马毛癣菌(Trichophyton equinum)，Trichophyton sarkisovii，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，须毛癣菌，犬小孢子菌(Microsporum canis)，石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)，或Chrisporium tropicum。

17.根据权利要求16的组合物，其中所述犬小孢子菌是犬小孢子菌obesum变种(Microsporum canis var.obesum)和/或犬小孢子菌歪斜变种(Microsporum canisvar.distortum)。

18.根据权利要求15的组合物，其中所述抗原性物质源自以下一种或多种菌株：须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458、白色念珠菌DSM-9459、Chrisporium tropicum DSM-28405和犬小孢子菌DSM-32271。

19.根据权利要求11-18中任一项的组合物，其中所述改性壳聚糖、壳聚糖变体、壳聚糖衍生物或化合物以0.1至2.0％(w/v)的浓度存在。

20.根据权利要求19的组合物，其中所述浓度是0.1至1.4％(w/v)。

21.根据权利要求20的组合物，其中所述浓度是0.1％至0.3％(w/v)。

22.根据权利要求6的改性壳聚糖、壳聚糖变体或壳聚糖衍生物，根据权利要求7的水胶体，根据权利要求8或9的化合物，或根据权利要求11-21中任一项的组合物在制备用于人和/或兽医药物的药物中的应用。

23.权利要求22的用途，其中所述人和/或兽医药物是疫苗。

24.根据权利要求6的改性壳聚糖、壳聚糖变体或壳聚糖衍生物，根据权利要求8或9的化合物，根据权利要求7的水胶体，或根据权利要求11-21中任一项的组合物在制备用于在受试者中治疗和/或预防以下疾病的药物中的应用，其中所述疾病选自：乳腺炎，子宫内膜炎，蹄和爪病、跛、指间隙病变、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝组织炎、毛癣菌病、小孢子菌病、皮肤真菌病(mycosis of skin)、变态反应、以及并发变态反应的疾病，阻塞性肺疾病，皮肤病，鼻炎、结膜炎、皮真菌病(dermatophytosis)或疣。

25.根据权利要求24的用途，其中乳腺炎是潜伏性乳腺炎和/或急性乳腺炎，所述子宫内膜炎是慢性、急性和/或化脓性卡他性子宫内膜炎，所述并发变态反应的疾病是变应性阻塞性肺疾病、变应性皮肤病、变应性耳红斑、变应性鼻炎、变应性结膜炎、急性变应性接触性皮炎、慢性变应性接触性湿疹或特应性湿疹，所述阻塞性肺疾病是慢性阻塞性肺疾病，和/或所述皮肤病是皮炎或耳红斑；和所述疣是寻常性疣。

26.根据权利要求6的改性壳聚糖、壳聚糖变体或壳聚糖衍生物，根据权利要求8或9的化合物，根据权利要求7的水胶体，或根据权利要求11-21中任一项的组合物在制备用于调节受试者的免疫应答和/或用于增强生殖效率，或用于增强动物育种中的繁殖效率的药物中的应用。