ES2878071T3 - Nuevos productos inmunobiológicos - Google Patents

Abstract

Método para la preparación de un quitosano modificado, una variante del quitosano o un derivado de quitosano, en donde el método comprende la etapa de: (a) incubar quitosano en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, en donde el ácido orgánico carboxílico se selecciona del grupo que consiste en ácido valérico, ácido para- aminobenzoico, ácido glucurónico o una sal de cualquiera de dichos ácidos, en particular un cloruro del ácido valérico, en donde el quitosano presenta un grado de desacetilación de 62% a 98%.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos productos inmunobiológicos

La invención se refiere a un procedimiento que comprende la etapa de incubar quitosano en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, un quitosano modificado que puede obtenerse mediante el procedimiento de la presente invención, un hidrocoloide, un compuesto de fórmula [X]n, una composición que comprende el quitosano modificado, el hidrocoloide o compuesto de acuerdo con la presente invención, el quitosano modificado, el hidrocoloide, el compuesto o la composición de acuerdo con la presente invención para su uso en seres humanos y/o en medicina veterinaria y el quitosano modificado, el hidrocoloide, el compuesto o composición de acuerdo con la presente invención para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la mastitis, preferentemente la mastitis latente y/o la mastitis aguda, endometritis, preferentemente endometritis crónica, aguda y/o purulentacatarral, enfermedades podales y de las pezuñas, cojera, lesiones en el espacio interdigital, dermatitis digital, dermatitis interdigital, flemón interdigital, tricofitosis, microesporosis, micosis de la piel, alergias, así como enfermedades complicadas por alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis o verrugas, en particular verrugas comunes, en un sujeto, y para modular la respuesta inmunitaria en un sujeto y/o para mejorar la eficacia de la reproducción, preferentemente la eficacia de la reproducción en la cría de animales.

La mastitis del ganado se distribuye por todo el mundo y provoca un daño económico enorme en la agricultura. El daño causado por la mastitis está causado, en particular, por un rendimiento y una calidad reducida de la leche. La mastitis provoca hipogalactia y agalactia en los animales. La pérdida de partes de las células epiteliales secretoras da como resultado la regeneración de tejido conectivo y la atrofia de la parte afectada de la ubre.

La endometritis es la inflamación de una membrana mucosa del útero, que va seguida por un cambio más o menos significativo del endometrio y una actividad aumentada de las glándulas uterinas sanas o regeneradas. La uteritis va seguida frecuentemente de reproducción de una microflora polimórfica. La endometritis crónica es una enfermedad ginecológica muy extendida: se registra en un 12-40% de las vacas no fértiles.

Aproximadamente 15% a 25% de las vacas padecen mastitis clínicamente evidente y oculta, y en particular, se encuentra más expuesto a esta enfermedad el ganado con una muy alta producción de leche. La falta de leche de las vacas convalecientes llega a suponer hasta un 20% de la producción general de leche de una granja. Los procedimientos de control y tratamientos actuales de la mastitis ocasionan inevitablemente altas pérdidas de animales y leche. Las enfermedades postparto de las vacas que comprenden endometritis como enfermedad más común ocasionan enormes daños económicos. Hay varias causas para la endometriosis. El tratamiento por médicos veterinarios es costoso y laborioso.

La forma más común de la mastitis es la mastitis oculta (subclínica). La mastitis oculta de las vacas va seguida de un proceso inflamatorio de avance lento con tan solo unos pocos o ningún signo de mastitis. El tratamiento de animales con esta forma de mastitis resulta complicado. Esta forma es muy común en grandes unidades lácteas y normalmente solo se diagnostica durante los exámenes efectuados mensualmente para la forma oculta de mastitis del rebaño de ordeño. Aproximadamente un 15% de las vacas lactantes se ven afectadas por la mastitis latente durante el ordeñado mecánico. Hay múltiples motivos para el desarrollo de la mastitis oculta. La mastitis oculta aparece principalmente debido a la falta de cumplimiento de los reglamentos de salud veterinaria por parte de los operarios del ordeñado mecánico, debido a un comienzo erróneo y a la falta de cumplimiento con un ciclo de tratamiento en el animal con mastitis. Al mismo tiempo, la endometritis crónica es una enfermedad ginecológica muy común: se registra en un 12% a 40% de las vacas no fértiles.

Un indicador objetivo de una ubre sana de vaca es la cantidad de células somáticas contenidas en la leche. Las células en la leche de vaca están representadas por leucocitos y epitelio de las glándulas mamarias. Las células epiteliales son predominantes en la secreción láctea de una vaca sana. Las células epiteliales se forman en los tejidos de la ubre durante el proceso del envejecimiento natural y de regeneración de los tejidos. Durante la mastitis, la migración de leucocitos aumenta en el área de inflamación, ocasionando finalmente un aumento agudo de las células somáticas en la leche. Un solo ml de leche de vacas clínicamente sanas contiene 200.000 a 250.000 células somáticas. Durante la mastitis, su cantidad aumenta hasta 900.000 o más.

La leche de las vacas afectadas por la forma oculta de la mastitis tiene hipoacidez, ya que comprende un contenido aumentado de cloruros, albúmina y globulinas. La cantidad de elementos celulares aumenta en varias veces, especialmente la cantidad de leucocitos. Al mismo tiempo, el contenido de sólidos (caseína, lactosa, calcio y fósforo) se reduce. Al combinar leche de vacas afectadas por la forma oculta de mastitis con leche de vacas sanas, se reduce la calidad general de la leche. No puede usarse para la preparación de queso y productos de leche agria y tiene un efecto adverso muy grave en la salud humana.

En la actualidad, se usan antibióticos, preparaciones de sulfanilamida o mezclas de los mismos para tratar las diversas formas de mastitis y endometritis. También se usan extractos de plantas que comprenden aceites esenciales con efecto antimicrobiano. En los últimos años, se han usado preparaciones enzimáticas y productos inmunobiológicos que comprenden probióticos e interferón.

Existe una gran cantidad de procedimientos y agentes para tratar la mastitis con signos clínicos, pero el tratamiento de las formas ocultas de mastitis resulta complicado y la distribución de esta forma de mastitis es mucho mayor que de las otras formas. Existen procedimientos conocidos para tratar la mastitis subclínica mediante fisioterapia (aplicaciones de ozoquerita, parafina, vendas calientes, compresas, calentamiento con lámparas solux y radiación infrarroja en una ubre) y también el uso de dispositivos láser con diversas modificaciones. El ciclo de tratamiento consiste en 3 a 4 sesiones, en el que solo se efectúa una sesión al día. La eficacia de estos procedimientos es de entre 60% y 85%, aunque resultan laboriosos y costosos. También se conoce un procedimiento de administración intramuscular de antibióticos: una dosis de 8 a 10 ml de Tilozin 200 una vez al día durante tres días, una dosis de 0,5 ml/10 kg de peso corporal de Bilozin 200 dos veces al día (no puede usarse la leche con fines alimentarios durante 7 días), una dosis subcutánea de 1 ml/50 kg de peso corporal de Efikur durante 2-3 días. En el caso de que se utilicen antibióticos, se necesita comprobar previamente la sensibilidad a antibióticos de los activadores del cuarto afectado de la ubre. Además, la leche y los productos de matanza de los animales tratados no pueden usarse en varios días o una semana. También se conoce un procedimiento para la aplicación intramamaria de la preparación Mastiyet-forte en una jeringuilla de plástico que contiene oxitetraciclina, neomicina, bacitracina y prednisolona. La preparación resulta muy eficaz, aunque la leche y los productos de matanza de los animales tratados no pueden usarse en varios días. También se conoce una forma de tratamiento de la mastitis subclínica mediante el bloqueo con procaína de una ubre, según D. D. Logvinov. Se llevan a cabo inyecciones de solución de procaína al 0,5% cada 48 horas. Usando este procedimiento, la recuperación requiere 3 a 5 días. Las desventajas de este procedimiento son que resulta laborioso y que comporta el riesgo de contaminación microbiana por la inyección. También se conoce una forma de tratar las vacas enfermas usando una solución al 1% de Collargol y preparaciones que comprenden plata. Las preparaciones se inyectan en la aorta abdominal. Si resulta necesario, la inyección se repite después de 48 horas. Las preparaciones que comprenden plata tienen una alta actividad antibacteriana y pueden usarse en el tratamiento de cualquier etiología de la mastitis. Sin embargo, este procedimiento resulta laborioso. También se conoce un procedimiento para usar la introducción intramamaria de leche emparejada que contiene altas cantidades de lisozima (obtenida de vacas sanas) 1-2 veces al día durante 2-3 días. El procedimiento no resulta muy eficaz, pero la leche y los productos de matanza pueden usarse tras este tratamiento sin restricciones. También se conoce un procedimiento de tratamiento de la mastitis subclínica usando preparaciones a base de probióticos que comprenden un cultivo de Str. thermophilus y otros bifido-lactobacilos. Estos fármacos se inyectan por vía intracisternal 1-2 veces al día. La recuperación de la mastitis oculta comienza tras 1-2 inyecciones durante 2-3 días. Las desventajas de este procedimiento son la contaminación bacteriana accidental de la leche y la aparición de nuevas irritaciones del tejido parenquimatoso de la glándula lactífera y, por consiguiente, una potencial exacerbación del proceso patológico. También se conoce un procedimiento para tratar la mastitis de las vacas usando soluciones de interferón. Estas soluciones aumentan la función protectora de los leucocitos que se encuentran presentes en grandes cantidades en la leche de los animales con mastitis. Las soluciones contienen por lo menos 1.000 unidades de interferón bovino recombinante que se empaquetan en inyectores de 10 g. Las soluciones se usan por vía intracisternal dos veces al día en un intervalo de 8 a 14 horas durante 3 días o hasta la recuperación completa. El tiempo de recuperación es de 4 a 12 días. Las ventajas de este procedimiento son la ausencia de límites en cuanto al uso de la leche y la carne de los animales tratados, no ocasiona resistencia de los organismos patógenos y no tiene propiedades localmente irritantes y resortivas-tóxicas. Las desventajas de este procedimiento son la necesidad de aplicación repetida de la preparación y la presencia de componentes proteicos que pueden provocar reacciones alérgicas.

La DD, la DI y el FI, que son las enfermedades infecciosas podales y de la pezuña más comunes, están distribuidas esporádicamente por todo el mundo, aunque pueden ser endémicas, en particular, en unidades de producción intensivas de vacas lecheras o de carne. La incidencia depende, entre otras cosas, del clima, de la estación del año, de los periodos de pastoreo y del sistema de estabulación. La DD normalmente ocasiona cojera y una reducción significativa del peso corporal, pérdida de fertilidad y disminución de la producción de leche. La incidencia puede estar comprendida entre 5% y 30%. En los primeros casos epidémicos, aproximadamente 30% a 80% de los animales pueden mostrar signos clínicos de la enfermedad. Sin embargo, en promedio, el FI representa únicamente el 15%, como máximo, de las enfermedades de las pezuñas.

Resultó inesperado que muchos investigadores sugirieran que los factores etiológicos de la DD, la DI y el FI son los mismos microorganismos, tales como Dichelobacter nodosus, Fusobacterium necroforun y Fusobacterium spp, que primero destruyen la epidermis y permiten que las espiroquetas de Treponema spp, tales como T. phagedenis, T. vincentii, y T. denticola, tengan acceso a tejidos más profundos y desarrollen los signos clínicos de la DD. Otras especies bacterianas aisladas de material patológico de tejidos afectados por DD, DI y FI son Campylobacter spp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Arcanobacterium pyogenes y Prevotella spp. Además, se ha sugerido que un virus tiene una función importante en la patogénesis de las enfermedades.

La estrategia típica de tratamiento para la DD, la DI y el FI es la aplicación de antibióticos, preparaciones antibacterianas y aplicaciones tópicas de paños con antibióticos, antisépticos y soluciones astringentes. Todas las vacunas conocidas frecuentemente no son capaces de inducir una respuesta inmunitaria suficiente ni de proteger a los animales contra la dermatitis interdigital y el flemón interdigital. No existen vacunas eficaces contra la dermatitis digital.

Se conocen muchos tratamientos para las alergias y dependen del cuadro clínico de la alergia. Para el tratamiento de la dermatitis de contacto alérgica aguda, el eccema de contacto alérgico crónico y/o el eccema atópico, normalmente se usan cremas lipófilas que comprenden glucocorticoesteroides, sustancias antimicrobianas, fármacos antiinflamatorios y/o calcio. Para el tratamiento de otras dermatitis alérgicas, se han aplicado por vía local o parenteral diversos compuestos, por ejemplo, preparaciones de esteroides, salicilatos, aceites o péptidos aislados de microorganismos. Todos los procedimientos anteriores tratan únicamente los síntomas y no las causas de las alergias. También se conocen agentes para tratar las alergias que comprenden material antigénico de hongos y levaduras queratinofílicos, tal como se indica en el documento n° WO 97/07232. El material antigénico descrito en el documento n° WO 97/07232 comprende polisacáridos y/o glucopéptidos obtenidos de hongos y levaduras queratinofílicos. Las preparaciones antigénicas pueden usarse como composiciones farmacéuticas, así como en forma de vacunas para el tratamiento de animales y seres humanos, especialmente para el tratamiento de alergias y para modular la respuesta inmunitaria. Pueden tener utilidad inmunológica, así como farmacológica.

Kuen Y L et al. (Biomaterials, Elsevier Science Publishers BV., vol. 16, n° 16, 1 de enero de 1995, páginas 1211-1216) dan a conocer derivados de quitosano en los que el quitosano se ha acilado en diversos grados con reactivos acéticos, propiónicos, n-butíricos, n-valéricos y n-hexanoicos. La biocompatibilidad de dichos derivados se ha sometido a ensayo, p. ej., en combinación con enzimas. Kuen Y L et al. dan a conocer que el grado de desacetilación del quitosano debe mantenerse a menos de 50% para prevenir la gelificación.

El documento n° CN 102 727 887 A describe un adyuvante inmunitario en un modelo murino de asma alérgica, que comprende la preparación de un derivado de quitosano acetilado preparado mediante la utilización de una solución de quitosano-ácido acético neutralizada con NaOH. Se utiliza OVA como antígeno modelo.

Seferian P G et al. (Vaccine, ElsevierLtd, GB, vol. 19, n° 6, 8 de noviembre de 2000, páginas 661-668) describen una mezcla de antígeno de quitosano en la que el antígeno se ha mezclado con una solución estéril al 2% en una solución de ácido acético al 2% seguido de eutralización con NaOH, formando de esta manera un precipitado gelatinoso fino que se utiliza para la vacunación.

Huadong Wang et al. (BMC Infectious Diseases, vol. 14, n° 1, 11 de abril de 2014, página 195) da a conocer la preparación de una vacuna contra el citomegalovirus murino, que comprende la preparación de una solución de antígeno mezclada con un adyuvante de quitosano al 0,2% (p/v) diluido en una solución de acetato de sodio 25 mM (pH 5,0). El quitosano se preparó mediante la adición de 0,04 g de quitosano a 20 ml de una solución 0,1 M de ácido acético glacial [concentración: 0,2% (p/v)] y la mezcla durante aproximadamente una hora para disolverlo y el ajuste del pH con NaOH.

El documento n° WO 2013/033400 describe en detalle la preparación de una vacuna contra el citomegalovirus murino, que comprende la preparación de una solución de antígeno mezclada con un adyuvante de quitosano al 0,2% (p/v) diluido en una solución de acetato de sodio 25 mM (pH 5,0). El quitosano se preparó mediante la adición de 0,04 g de quitosano a 20 ml de una solución 0,1 M de ácido acético glacial [concentración: 0,2%(p/v)], y la mezcla durante aproximadamente una hora para disolverlo y el ajuste del pH con NaOH.

El objeto de la presente invención es proporcionar un producto/preparación inmunobiológico más eficaz. Es un objeto de la presente invención además proporcionar un nuevo agente para su uso en medicina veterinaria y/o humana. Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos agentes para tratar y/o prevenir la mastitis, preferentemente la mastitis latente y/o la mastitis aguda, endometritis, preferentemente endometritis crónica, aguda y/o purulentacatarral, enfermedades podales y de las pezuñas, cojera, lesiones en el espacio interdigital, dermatitis digital, dermatitis interdigital, flemón interdigital, tricofitosis, microesporosis, micosis de la piel, alergias, así como enfermedades complicadas por alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis o verrugas, en particular verrugas comunes, en un sujeto, y para modular la respuesta inmunitaria en un sujeto y/o para mejorar la eficacia de la reproducción, preferentemente la eficacia de la reproducción en la cría de animales.

Dichos objetos se resuelven por la materia objeto definida en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras sirven para ilustrar la invención.

La figura 1 ilustra una curva patrón para la cuantificación de 1,3-p-D-glucano. Se muestra la velocidad media del cambio de la densidad óptica representado frente a concentraciones conocidas [pg/ml] de soluciones patrón de 1,3-p-D-glucano. Para la generación de la curva patrón, se prepararon soluciones de 1,3-p-D-glucano de 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml y 6,25 pg/ml según recomendación del fabricante. La curva representada era lineal a lo largo de todo el intervalo y cumple con los criterios de aceptación de control de calidad (R2 > 0,980).

La figura 2 ilustra la dinámica de la intensidad de los síntomas clínicos de bronquitis alérgica en caballos tras la aplicación de la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 41 (grupo experimental) y sin vacunación (grupo de control). La composición se inyectó 3 veces en un intervalo de 4 días. La puntuación de los síntomas clínicos era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = sibilancia leve, sin tos; 2 = sibilancia leve, con tos; 3 = sibilancia perceptible; 4 = sibilancia perceptible con síntomas clínicos de depresión.

La figura 3 ilustra la dinámica de la intensidad de los síntomas clínicos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en caballos tras la aplicación de la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 41_(grupo experimental) y sin vacunación (grupo de control). La composición se inyectó 3 veces en un intervalo de 4 días. La puntuación de los síntomas clínicos era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = sibilancia leve, sin tos; 2 = sibilancia leve, con tos; 3 = sibilancia perceptible; 4 = sibilancia perceptible con síntomas clínicos de depresión.

La figura 4 ilustra la dinámica de los signos clínicos de enfermedades cutáneas en perros inmunizados con la composición de acuerdo con el ejemplo 42 en dosis de 0,5 ml y 1,0 ml (se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; n=10). La composición se inyectó 3 veces en un intervalo de 7 días. La puntuación de los síntomas clínicos era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = crecimiento del pelo, rechazo activo de costras o exceso de descamación; 2 = alopecia, sin crecimiento del pelo, rechazo de costras; 3 = descamación, inflamación o inflamación con costra, costra no rechazada; 4 = descamación o inflamación, dolor a la palpación; 5 = respuesta inflamatoria, costra necrótica.

La figura 5 ilustra la dinámica de los signos clínicos de enfermedades cutáneas en perros inmunizados con la composición de acuerdo con el ejemplo 50 en dosis de 0,5 ml. (Se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; en vacunados, n=15 y en el grupo de control, n=15). La composición se inyectó 3 veces en un intervalo de 3 a 4 días. La puntuación de los síntomas clínicos era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = crecimiento del pelo, rechazo activo de las costras o exceso de descamación; 2 = alopecia, sin crecimiento del pelo, rechazo de costras; 3 = descamación, inflamación o inflamación con costra, costra no rechazada; 4 = descamación o inflamación, dolor a la palpación; 5 = respuesta inflamatoria, costra necrótica.

La figura 6 ilustra la dinámica de los signos clínicos de enfermedades de la piel en perros inmunizados con la composición de acuerdo con los ejemplos 41 y 43 en una dosis de 0,5 ml. (Se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; n=10). La puntuación de los síntomas clínicos era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = crecimiento del pelo, rechazo activo de las costras o exceso de descamación; 2 = alopecia, sin crecimiento del pelo, rechazo de costras; 3 = descamación, inflamación o inflamación con costra, costra no rechazada; 4 = descamación o inflamación, dolor a la palpación; 5 = respuesta inflamatoria, costra necrótica.

La figura 7 ilustra la dinámica de los signos clínicos de rinitis en gatos tratados con la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 42. El grupo experimental de gatos se trató con la composición. Se llevaron a cabo dos ciclos de acuerdo con el protocolo del estudio cada día con 1-2 gotas en la nariz. La puntuación de los síntomas era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = hiperemia y/o inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales; 2 = rinorrea leve; 3 = hiperemia y/o inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales y rinorrea; 4 = dificultad para respirar, hiperemia e inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales, rinorrea fuerte; 5 = muerte de los animales.

La figura 8 ilustra la dinámica de los signos clínicos de rinitis en perros tratados con la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 43. El grupo experimental de perros se trató con la composición. Se llevaron a cabo dos ciclos de acuerdo con el protocolo del estudio cada día con 1-2 gotas en la nariz. La puntuación de los síntomas era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = hiperemia y/o inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales; 2 = rinorrea leve; 3 = hiperemia y/o inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales y rinorrea; 4 = dificultad para respirar, hiperemia e inflamación de las membranas mucosas de los conductos nasales, rinorrea fuerte; 5 = muerte de los animales.

La figura 9 ilustra la dinámica de los signos clínicos de conjuntivitis en gatos tratados con la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 54. El grupo experimental de gatos se trató con la composición de acuerdo con el protocolo del estudio mediante la instilación diaria de 1-2 gotas en la conjuntiva. La puntuación de los síntomas era la siguiente: 0 = sin síntomas; 1 = hiperemia y/o inflamación de la conjuntiva; 2 = lagrimeo leve; descarga de los ojos; 3 = hiperemia y/o inflamación de la conjuntiva, descarga de los ojos; 4 = hiperemia e inflamación de la conjuntiva, descarga intensa de los ojos; 5 = destrucción del globo ocular.

El uso del término “un” o “una”, utilizado junto con la expresión “que comprende” en las reivindicaciones y/o la descripción, puede significar “uno” o “una”, aunque también corresponde al significado de “uno o más”, “por lo menos uno” y “uno o más de uno”.

El término “aproximadamente” significa que se contempla el valor indicado, más o menos un 5% del valor indicado, o el error típico de las mediciones del valor dado.

La expresión “que comprende”, tal como se usa en el presente documento, no debe considerarse limitada al significado de “que consiste en” (es decir, que excluye la presencia de otra materia adicional). Por el contrario, “que comprende” implica que puede estar presente opcionalmente otra materia adicional. La expresión “que comprende” abarca como realizaciones particularmente contempladas comprendidas dentro de su alcance, “que consiste en” (es decir, que excluye la presencia de otra materia adicional) y “que comprende, aunque no consiste en” (es decir, que requiere la presencia de otra materia adicional), resultando más preferida la primera expresión.

El término “quitosano”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un copolímero de 2-amino-2-desoxi-D-glucopiranosa y 2-acetamido-2-desoxi-D-glucopiranosa, en el que el grado de desacetilación es superior al 50%, preferentemente superior al 60%, 70%, 80% o 90%. El quitosano puede derivar químicamente de la quitina, que es una poli-1,4-p-N-acetil-D-glucosamina, más particularmente una N-acetiM,4-p-D-glucopiranosairima, por desacetilación. Las preparaciones típicas de quitosano tienen pesos moleculares variables, según el procedimiento de fabricación.

El término “mastitis”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inflamación de la mama y del tejido de la ubre. Preferentemente, comprende la mastitis latente y/o la mastitis aguda. La mastitis latente también puede denominarse mastitis oculta y/o mastitis subclínica. Preferentemente, la mastitis latente puede diagnosticarse mediante un procedimiento bien conocido de la técnica con una solución de mastidina al 2%. La mastitis aguda también puede ser mastitis fibrinosa, catarral, purulenta-catarral o hemorrágica con síntomas clínicos manifiestos de la enfermedad.

El término “endometritis”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una inflamación del endometrio. Más preferentemente, se refiere a una inflamación de la membrana mucosa del útero, que puede ir seguida por un cambio más o menos significativo del endometrio y una actividad aumentada de las glándulas uterinas sanas o regeneradas. Preferentemente, comprende endometritis crónica, endometritis subaguda, aguda y subclínica (oculta). La naturaleza de la inflamación se divide en catarral, catarral-purulenta, purulenta, fibrinosa y oculta. La endometritis también puede denominarse uteritis. La uteritis va seguida frecuentemente de reproducción de una microflora polimórfica.

El término “tricofitosis”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una enfermedad causada por una infección por hongos del género Trichophyton. El ganado se infecta normalmente por Trichophyton verrucosum, mientras que los seres humanos, perros, gatos, caballos, animales con pelaje y otros animales se infectan normalmente por T. mentagrophytes. Los seres humanos también pueden infectarse por T. rubrum. También puede denominarse enfermedad por Trichophyton.

Los términos “microesporosis” o “enfermedad por Microsporum canis", tal como se usan en el presente documento, se refieren a una enfermedad causada por una infección por el género Microsporum, más preferentemente por Microsporum canis. Normalmente, los gatos, perros, caballos y otros animales resultan afectados por esta enfermedad. Es especialmente común en cerdos, que se infectan predominantemente por Microsporum nanum.

El término “verrugas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere en general a un crecimiento pequeño y rugoso que se asemeja a una coliflor o a una ampolla sólida. Normalmente, las verrugas están causadas por una infección vírica. Preferentemente, el término “verruga” se refiere a las verrugas comunes, en particular, las verrugas vulgares y las verrugas paroniquiales.

La expresión “enfermedad podal y de las pezuñas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere, en particular, a enfermedades podales y de las pezuñas en bóvidos y/o cerdos. Dichas enfermedades se producen en particular por bacterias, hongos y/o virus. En particular, la expresión “enfermedades podales y de las pezuñas” se refiere a la dermatitis digital, la dermatitis interdigital y el flemón interdigital.

El término “bóvido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere, en particular, a mamíferos rumiantes biungulados, entre los que se incluyen el bisonte, el búfalo africano, el búfalo de agua, los antílopes, las gacelas, las ovejas, las cabras, el buey almizclero, y el ganado bovino.

El término “cojera”, tal como se usa en el presente documento, se refiere, en particular, a la cojera como resultado de una infección y daño en un tejido. En particular, el término “cojera” se refiere a la cojera debida a enfermedades podales y de las pezuñas, más particularmente debida a la dermatitis digital (DD), la dermatitis interdigital (DI) y el flemón interdigital (FI).

Ahora se ha descubierto inesperadamente, que una composición que comprende quitosano modificado con un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo estimula la respuesta inmunitaria y puede usarse en un procedimiento para tratar y/o prevenir una serie de enfermedades distintas. Además, se ha descubierto inesperadamente que, en caso de administrar en combinación agentes activos ya conocidos con un quitosano modificado de la presente invención, pueden usarse dichos agentes activos en una dosis hasta 50 veces menor.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar quitosano modificado con un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, un hidrocoloide, un compuesto y una composición, según se define en las reivindicaciones. Además, la presente invención se refiere al hidrocoloide, al compuesto o a la composición tal como se define en las reivindicaciones para su uso tal como se define en las reivindicaciones. Preferentemente, el quitosano modificado es un gel transparente sin olor o con un olor leve a ácido acético. El quitosano modificado preparado mediante el procedimiento de la presente invención preferentemente tiene un peso molecular o un peso molecular medio de aproximadamente 50 Da a aproximadamente 700 kDa, en particular, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 500 kDa, más particularmente, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 150 kDa o de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 250 kDa o de aproximadamente 300 kDa a aproximadamente 700 kDa. El contenido en masa de cenizas del quitosano modificado de acuerdo con la presente invención es preferentemente de aproximadamente 0,2% a 2%, más preferentemente, de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 1,2% y lo más preferentemente, de 0,22%. El quitosano modificado de acuerdo con la presente invención también puede denominarse derivado de quitosano o variante de quitosano.

Preferentemente, el quitosano modificado tiene grupos amino reactivos en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 por cada 100 kDa de quitosano. El quitosano modificado preparado mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención tiene un grado de desacetilación de 62% a 98%, más preferentemente, de aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, más preferentemente, de aproximadamente 89% a aproximadamente 93% o de aproximadamente 89% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 93% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 93% a 95% o de aproximadamente 95% a 98%.

El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano preparado mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención es preferentemente un compuesto de fórmula [X]n, en la que n representa un número entero entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5.000, en particular un número entero entre

en la que de 2% a 38% de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados por acetilación y en la que todos o parte de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados con un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo.

De esta manera, la presente invención se refiere además a un compuesto de fórmula [X]n, en la que n representa un número entero entre 1 y 5.000, en particular un número entero entre 300 y 4.000, y X tiene la fórmula (1) a continuación:

en la que de 2% a 38%, más preferentemente, de 5% a 20% de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados por acetilación y en la que todos o parte de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados con un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo.

La fórmula X se refiere a una unidad de 2-amino-2-desoxi-D-glucosa desacetilada y a una unidad de D-glucosamina, respectivamente, que es el monómero del quitosano 100% desacetilado. Por consiguiente, la fórmula X también puede referirse a la fórmula representada entre corchetes de la fórmula (2) a continuación, que representa la fórmula estructural de un quitosano con un grado de desacetilación del 100%:

Tal como se ha indicado anteriormente, n representa un número entero entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5.000. Dentro de estos límites, n es preferentemente por lo menos aproximadamente 10, aproximadamente 50, aproximadamente 80, aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900 o aproximadamente 1.000 y/o como máximo aproximadamente 4.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.500, aproximadamente 2.000 o aproximadamente 1.500. En realizaciones preferidas adicionales de la presente invención, n representa un número entero entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2.500, en particular, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.000 o entre aproximadamente 300 y aproximadamente 1.500, entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 2.000, entre aproximadamente 400 y aproximadamente 1.700, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 1.700 o entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 5.000.

En una realización preferida adicional de la presente invención, de aproximadamente 5% a aproximadamente 35%, más preferentemente, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, más preferentemente, de aproximadamente 7% a aproximadamente 11% o de aproximadamente 2% a aproximadamente 7%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 7% o de aproximadamente 2% a aproximadamente 5% de los restos de X que forman el compuesto tal como se ha definido anteriormente se encuentran modificados por acetilación, lo que significa que están acetilados. Una modificación por acetilación se refiere a la introducción de un grupo funcional acetilo en el resto de acuerdo con la fórmula (1) que da como resultado un resto de N-acetil-D-glucosamina.

En una realización preferida de la presente invención, el ácido carboxílico orgánico tiene un pK de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, más preferentemente de aproximadamente 2,3 a aproximadamente 4,9. Más preferentemente, el ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo se selecciona del grupo que consiste en ácido valérico, cloruro de ácido valérico, ácido para-aminobenzoico, ácido glucurónico y ácido láctico. La modificación con el ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo puede conseguirse preferentemente mediante la puesta en contacto o la reacción con dicho ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, o una solución acuosa que comprende dicho ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo. Preferentemente, la modificación se produce mediante la puesta en contacto con una solución acuosa que comprende de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 22,5 M de dicho ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, o en una solución acosa que comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM del ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, más preferentemente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM.

El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano preparado mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención es preferentemente un coloide de poliaminoazúcar, preferentemente un hidrocoloide. Preferentemente, el quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano es un hidrocoloide de quitosano-ácido glucurónico o un hidrocoloide de quitosano-acido p-aminobenzoico o un hidrocoloide de quitosano-ácido valérico. El hidrocoloide de quitosano-ácido glucurónico tiene preferentemente la fórmula química: (C⁶H¹¹O⁴ N)x(C8H13O5Ny(C6H10O7)z(H2O)m. Preferentemente, el hidrocoloide de quitosano-ácido glucurónico tiene el siguiente peso molecular: x*(161 )+y*(203)+z*(194,14)+m*(18). Alternativamente, el hidrocoloide de quitosano-ácido paminobenzoico tiene la fórmula química: (C⁶H¹¹O⁴ N)x(C8H13O5N)y(C7H7O2N)z(H2O)m. Preferentemente, el hidrocoloide de quitosano-ácido p-aminobenzoico tiene el siguiente peso molecular: x*(161)+y*(203)+z*(137,14)+m*(18). Alternativamente, el hidrocoloide de quitosano-ácido valérico tiene la fórmula química: (C⁶H¹¹O⁴ N)x(C8H13O5N)y(C5H10O2)z(HCl)z(H2O)m. Preferentemente, el hidrocoloide de quitosano-ácido valérico tiene el siguiente peso molecular: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36,5)+m*(18).

De esta manera, la presente invención se refiere además a un hidrocoloide que comprende:

(i) de 0,1% a 5% (p/v) de quitosano y de 0,001% a 5% (p/v) de ácido valérico, o una sal del mismo, preferentemente, cloruro de ácido valérico, o

(ii) de 0,1% a 5% (p/p) de quitosano y de 0,001% a 5% (p/p) de ácido glucurónico o ácido p-aminobenzoico o una sal del mismo.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a un hidrocoloide que comprende:

(i) de un 0,1% a un 3% (p/v) de quitosano y de un 0,001 a un 2% (p/v) de ácido valérico, o una sal del mismo, preferentemente, cloruro de ácido valérico o

(ii) de un 0,1% a un 3% (p/p) de quitosano y de un 0,001 a un 2% (p/p) de ácido glucurónico o ácido paminobenzoico o una sal del mismo.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un hidrocoloide que comprende:

(i) de 0,1% a 1,2% (p/v) de quitosano y de 0,001% a 1% (p/v) de ácido valérico, o una sal del mismo, preferentemente, cloruro de ácido valérico o

(ii) de 0,1% a 1,2% (p/p) de quitosano y de 0,001% a 1% (p/p) de ácido glucurónico o ácido p-aminobenzoico o una sal del mismo.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un hidrocoloide que comprende:

(i) de 0,1% a 1,2% (p/v) de quitosano y

(ii) de 0,01% a 0,44% (p/v) de ácido valérico, o una sal del mismo, preferentemente, cloruro de ácido valérico. Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un hidrocoloide que comprende:

(i) de 0,1% a 1,2% (p/p) de quitosano y

(ii) de 0,001% a 0,6% (p/p) de ácido glucurónico, o una sal del mismo.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere a un hidrocoloide que comprende:

(i) de 0,1% a 1,2% de quitosano y

(ii) de 0,006% a 1% (p/p) de ácido p-aminobenzoico, o una sal del mismo.

Preferentemente, el quitosano del hidrocoloide es un compuesto de fórmula [X]n, en la que n representa un número entero entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5.000, en particular un número entero entre aproximadamente

en la que entre aproximadamente 2% y aproximadamente 38%, más preferentemente, entre aproximadamente 5% y aproximadamente 20% de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados por acetilación y en la que todos o parte de los restos de X que constituyen dicho compuesto están modificados con un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, tal como se define posteriormente.

En una realización preferida, el porcentaje restante del hidrocoloide de acuerdo con la presente invención se proporciona mediante el medio de dispersión, preferentemente agua o agua y ácido clorhídrico (HCl).

En una realización preferida, el hidrocoloide de acuerdo con la presente invención se usa en forma de una dilución, preferentemente de una dilución de 0 a 10 veces.

El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano preparado mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención es preferentemente un líquido viscoso natural de color blanco a amarillento. Preferentemente, el quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano tiene el olor típico del ácido carboxílico, preferentemente el olor típico del ácido valérico.

El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano contiene preferentemente aproximadamente 0,2% de cloruro de pentanoílo o 0,2% de ácido glucurónico o 0,2% de ácido p-aminobenzoico. El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano contiene preferentemente 1% de residuo de quitosano procedente del secado de quitosanos.

El quitosano modificado, el derivado de quitosano o la variante de quitosano tiene preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 1.000 mOsmol, preferentemente, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 200 mOsmol, más preferentemente, aproximadamente 100 mOsmol.

El quitosano modificado preparado mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención, preferentemente se modifica adicionalmente con un ácido mineral. Dicha modificación puede ser el resultado de la puesta en contacto o de la reacción con dicho ácido mineral o una solución acuosa que comprende dicho ácido mineral. Dicho ácido mineral es preferentemente HCl o H²SO⁴. Preferentemente, la modificación se produce mediante incubación del quitosano modificado en una solución acuosa que comprende entre aproximadamente 0,05 M y aproximadamente 1 M de dicho ácido mineral, preferentemente HCl o H2SO4.

La presente invención se refiere además a una composición que comprende un quitosano modificado, un derivado de quitosano o una variante de quitosano o un hidrocoloide de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la composición que comprende dicho quitosano modificado es un gel transparente sin olor o con un olor suave a ácido acético que es soluble en agua y en una solución de ácido acético al 1%. La composición preferentemente tiene un peso molecular o un peso molecular medio de aproximadamente 50 Da a aproximadamente 700 kDa, en particular, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 500 kDa, más particularmente, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 150 kDa o de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 250 kDa o de aproximadamente 300 kDa a aproximadamente 700 kDa. El contenido en masa de cenizas de la composición de acuerdo con la presente invención es de 0,1% a 2%, preferentemente, de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 1,2%, más preferentemente, de aproximadamente 0,22%.

Preferentemente, el quitosano modificado de dicha composición tiene grupos amino reactivos en una cantidad de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 por cada 100 kDa de quitosano. El quitosano modificado de la composición de acuerdo con la presente invención tiene preferentemente un grado de desacetilación de aproximadamente 65% a aproximadamente 98%, más preferentemente, de aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, más preferentemente, de aproximadamente 89% a aproximadamente 93% o de aproximadamente 89% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 93% a aproximadamente 98%, de aproximadamente 93% a aproximadamente 95% o de aproximadamente 95% a aproximadamente 98%.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la composición comprende adicionalmente un ácido mineral. Dicho ácido mineral soporta la solubilidad del quitosano modificado y/o puede modificar adicionalmente al quitosano. Dicho ácido mineral es preferentemente HCl o H²SO⁴ . La solución acuosa comprende preferentemente de 0,05 M a aproximadamente 1 M de ácido mineral, preferentemente HCl o H²SO⁴.

La presente invención se refiere además a un procedimiento para preparar un quitosano modificado, una variante del quitosano o un derivado del quitosano que comprende la etapa de:

(a) incubar quitosano en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo tal como se define en las reivindicaciones.

En una realización preferida, el quitosano primero se disuelve bajo condiciones acuosas ácidas y posteriormente se hace precipitar mediante incremento del valor del pH hasta un valor de pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5 antes de incubarlo en la solución acuosa del ácido carboxílico orgánico o la sal del mismo, tal como se ha indicado anteriormente.

Por lo tanto, la presente exposición se refiere además a un quitosano modificado obtenible mediante un procedimiento que comprende:

(i) disolver quitosano en una solución acuosa de un ácido

(ii) aumentar el valor del pH hasta que precipite el quitosano

(iii) recuperar el quitosano precipitado y

(a) incubar el quitosano recuperado de la etapa (iii) en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, tal como se define adicionalmente después.

La presente invención se refiere además a un procedimiento que comprende las etapas de:

(i) disolver quitosano en una solución acuosa de un ácido

(ii) aumentar el valor de pH hasta que precipite el quitosano

(iii) recuperar el quitosano precipitado y

(a) incubar el quitosano recuperado de la etapa (iii) en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, tal como se define adicionalmente después.

El ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo de la etapa (a) tiene preferentemente un valor de pKs de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, más preferentemente de aproximadamente 2,3 a aproximadamente 4,9. Dicho ácido carboxílico orgánico es ácido valérico, ácido láctico, ácido para-aminobenzoico o ácido glucurónico o una sal de los mismos, en particular, cloruro de ácido valérico. Dicho ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo se usa preferentemente en una concentración de aproximadamente 0,2 M a aproximadamente 22,5 M. La incubación del quitosano y el quitosano recuperado de la etapa (iii), respectivamente, y la solución acuosa del ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo tal como se indica en la etapa (a) da como resultado la solución del quitosano, la modificación del quitosano y/o la formación de un gel. Preferentemente, el valor de pH de la solución acuosa de la etapa (a) es de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 o de aproximadamente 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. Preferentemente, la modificación del quitosano tiene lugar en una solución acuosa que comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 100 mM del ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, más preferentemente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 10 mM.

Preferentemente, la etapa (a) se lleva a cabo hasta que el quitosano se ha modificado y disuelto. Se lleva a cabo preferentemente mediante la mezcla de quitosano con una solución acuosa del ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo o mediante la suspensión de quitosano bajo condiciones acuosas y la adición del ácido carboxílico orgánico a la suspensión. Se realiza preferentemente bajo agitación durante aproximadamente 1 a aproximadamente 72 horas, más preferentemente durante aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. La etapa (a) puede comprender la adición de un ácido adicional o puede llevarse a cabo en presencia de un ácido adicional. Dicho ácido adicional es preferentemente un ácido mineral, un ácido orgánico o una sal de dicho ácido mineral o ácido orgánico. Preferentemente, el ácido mineral es HCl o H²SO⁴ y el ácido orgánico es ácido glutámico, ácido para-aminobenzoico o ácido láctico. El ácido mineral u orgánico preferentemente se añade o está presente en la cantidad necesaria para ajustar el valor de pH de la mezcla de la etapa (a) a un valor de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 o de aproximadamente 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. La adición de un ácido adicional puede ayudar a la disolución y/o modificación del quitosano, por ejemplo, mediante la reducción del tiempo que se necesita para disolver el quitosano modificado.

La concentración de quitosano en la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) para la etapa (i), es preferentemente de aproximadamente 1 g a aproximadamente 20 g de quitosano por litro, más preferentemente de aproximadamente 5 g a aproximadamente 15 g de quitosano por litro, lo más preferentemente de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 g de quitosano por litro.

El quitosano usado para la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) para la etapa (i), puede ser quitosano disponible comercialmente o quitosano aislado a partir de cualquier fuente natural que comprenda quitosano, tal como biomasa que comprende quitosano. Alternativamente, puede usarse quitina, que se desacetila para obtener quitosano antes de la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) antes de la etapa (i). Dicha quitina puede estar disponible comercialmente o puede aislarse de una fuente natural que comprenda quitina, tal como biomasa que comprende quitina. La biomasa para aislar la quitina y/o el quitosano preferentemente es biomasa de hongos, insectos y/o crustáceos.

La desacetilación de la quitina puede realizarse mediante procedimientos conocidos de la técnica, tales como, por ejemplo, el uso de hidróxido sódico (NaOH) en exceso como reactivo y agua como disolvente, o mediante procedimientos enzimáticos. El aislamiento del quitosano y/o la quitina a partir de fuentes naturales también puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos de la técnica y mediante los procedimientos descritos en los Ejemplos de la presente invención.

El quitosano usado para la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) para la etapa (i), tiene un grado de desacetilación de 62% a 95%, más preferentemente, de 80% a 94%, más preferentemente, de aproximadamente 89% a aproximadamente un 93% o de aproximadamente 93% a aproximadamente 98%, de aproximadamente un 93% a un 95%, de aproximadamente 95% a aproximadamente 98%, o de al menos 70%, 80%, 90% o 95%, o un grado de desacetilación de aproximadamente 80% a aproximadamente 95%, incluso más preferentemente, de aproximadamente 90% a aproximadamente 95%, más preferentemente de aproximadamente 77% a aproximadamente 80%.

El quitosano usado para la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) para la etapa (i), tiene preferentemente una viscosidad de aproximadamente 50 a 400 MPa, más preferentemente de aproximadamente 70 a aproximadamente 150 MPa, o de aproximadamente 151 a aproximadamente 350 MPa.

El quitosano usado para la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) para la etapa (i), preferentemente tiene un peso molecular o un peso molecular medio de aproximadamente 50 Da a aproximadamente 700 kDa, en particular, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 500 kDa, más particularmente, de aproximadamente 15 kDa a aproximadamente 150 kDa o de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 200 kDa, de aproximadamente 150 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 100 kDa a aproximadamente 250 kDa o de aproximadamente 300 kDa a aproximadamente 700 kDa.

Antes de usar el quitosano en la etapa (a), o si el procedimiento comprende una etapa (i) en la etapa (i), el quitosano puede esterilizarse mediante tratamiento en autoclave. Dicha esterilización puede resultar en que el quitosano modificado de acuerdo con la presente invención resulte menos tóxico, resulte mejor tolerado por cualquier sujeto y/o produzca menos efectos secundarios indeseados.

Preferentemente, la etapa (i) se lleva a cabo mediante el uso de una solución acuosa de un ácido débil, preferentemente un ácido orgánico o una sal del mismo, más preferentemente, ácido acético, ácido valérico, ácido láctico, ácido para-aminobenzoico o ácido glucurónico o una sal de los mismos, en particular, cloruro de ácido valérico. El ácido preferentemente se usa en una concentración de aproximadamente 0,8% a aproximadamente 2%. La etapa (i) preferentemente se lleva a cabo bajo agitación. La agitación puede llevarse a cabo durante aproximadamente 2 horas a aproximadamente 24 horas. Preferentemente, la etapa (i) se lleva a cabo hasta que se obtiene un gel o una suspensión de gel. Las partículas no disueltas pueden eliminarse, por ejemplo, mediante filtración. Por ejemplo, para dicha filtración puede usarse una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm.

La etapa (ii) preferentemente se lleva a cabo mediante el incremento del valor del pH del gel o de la suspensión de gel obtenida en la etapa (i) hasta que se forma un precipitado. Se lleva a cabo preferentemente bajo agitación. Se lleva a cabo preferentemente mediante tratamiento del quitosano bajo condiciones acuosas alcalinas, más preferentemente bajo condiciones acuosas alcalinas que comprenden aproximadamente 0,1% a aproximadamente 25,0% de álcali. en una realización preferida, el álcali es NaOH. Preferentemente, dicha etapa se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 55°C. Preferentemente, el tratamiento se lleva a cabo durante aproximadamente 20 min a aproximadamente 2 horas, más preferentemente, durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 70 min, aunque también puede requerir hasta aproximadamente 24 h. Preferentemente, el valor del pH se incrementa mediante la adición del álcali al gel o a la suspensión de gel de la etapa (i). Preferentemente, el valor de pH se incrementa hasta obtener un pH de aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,5. La etapa (ii) puede ocasionar una desacetilación adicional del quitosano. También puede resultar en que el quitosano modificado de acuerdo con la presente invención resulte menos tóxico, resulte mejor tolerado por cualquier sujeto y/o produzca menos efectos secundarios indeseados.

La etapa (iii) preferentemente se lleva a cabo mediante centrifugación de la mezcla o suspensión obtenida en la etapa (ii) . La centrifugación preferentemente se lleva a cabo a aproximadamente 4.000 a aproximadamente 6.000 revoluciones/min, más preferentemente a aproximadamente 5.000 revoluciones/min. La centrifugación se lleva a cabo preferentemente durante un periodo de hasta 60 minutos.

Los procedimientos mediante los que se puede obtener el quitosano de la presente invención y los procedimientos de la presente invención pueden comprender etapas adicionales. Por ejemplo, el producto obtenido en la etapa (ii), puede homogeneizarse. Preferentemente, la etapa de homogeneización se lleva a cabo en un homogeneizador estéril cerrado.

Alternativamente o adicionalmente, el producto obtenido en la etapa (a) puede dializarse. La diálisis preferentemente se lleva a cabo en un sistema cerrado a fin de eliminar iones libres de sales y compuestos de bajo peso molecular. Preferentemente, la diálisis se lleva a cabo mediante filtración cruzada durante aproximadamente 1 a aproximadamente 6 horas o mediante filtración de membrana frente a agua destilada durante aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas.

Alternativamente o adicionalmente, los procedimientos mediante los que se puede obtener el quitosano de la presente invención y los procedimientos de la presente invención pueden comprender una etapa adicional de preparación del producto final. La preparación del producto final puede comprender la dilución del producto obtenido. Preferentemente, el producto se diluye mediante la adición de agua, más preferentemente, de agua estéril para inyección. Sin embargo, el producto también puede diluirse en cualquier otra solución acuosa adecuada. Alternativamente o adicionalmente, la preparación del producto final puede comprender la adición de uno o más compuestos adicionales, tales como diluyentes, conservantes, antibióticos, sustancias activas adicionales y/o material antigénico del microorganismo y/o enzimas. Son conservantes adecuados, por ejemplo, clorocresol, tiomersal y formol. Son antibióticos adecuados, por ejemplo, neomicina, penicilina, gentamicina, cloxacilina, cefapirina y cefalosporina. Finalmente, el producto final puede esterilizarse. Preferentemente, la esterilización se lleva a cabo mediante calentamiento, preferentemente durante aproximadamente 40 a 50 minutos a una temperatura de aproximadamente 65°C a aproximadamente 80°C. Preferentemente, dicha esterilización se repite una, dos, tres, cuatro o cinco veces.

Preferentemente, el producto final tiene una concentración de aproximadamente 0,02 g a aproximadamente 2 g de quitosano modificado por litro, más preferentemente, de aproximadamente 0,04 a aproximadamente 1 g de quitosano modificado por litro.

En una realización preferida, los procedimientos de la presente invención comprenden las etapas descritas en las reivindicaciones. Por ejemplo, los procedimientos pueden comprenden las siguientes etapas:

- opcionalmente esterilizar el quitosano, por ejemplo, mediante tratamiento en autoclave,

(i) disolver el quitosano en una solución acuosa de un ácido, en particular en presencia de ácido acético, - opcionalmente eliminar las partículas no disueltas, por ejemplo, mediante filtración,

(ii) incrementar el valor de pH hasta que precipite el quitosano,

(iii) recuperar el quitosano precipitado,

- opcionalmente homogeneizar el quitosano recuperado bajo condiciones acuosas,

(a) incubar el quitosano recuperado de la etapa (iii) o el quitosano recuperado homogeneizado en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo tal como se define en las reivindicaciones, opcionalmente en presencia de un ácido mineral u orgánico adicional,

- opcionalmente dializar el producto obtenido en la etapa (a),

- opcionalmente añadir compuestos adicionales, tales como diluyentes, conservantes, antibióticos, compuestos activos adicionales, tales como preparaciones quimioterapéuticas y/o material antigénico de microorganismos y/o enzimas, y

- opcionalmente esterilizar el producto final, por ejemplo, mediante calentamiento.

Preferentemente, el orden de las etapas indicadas anteriormente corresponde al orden indicado anteriormente. Sin embargo, tal como es conocido por el experto en la materia, puede variarse el orden de etapas individuales con la condición de que se obtengan los mismos efectos. Por ejemplo, pueden añadirse diluyentes, tales como agua, en diversas etapas del procedimiento, tal como se ha indicado anteriormente.

En el caso de que no se proporcionen intervalos de temperatura específicos para las etapas del procedimiento descritas anteriormente, las etapas preferentemente se llevan a cabo a temperatura ambiente y/o en un intervalo de aproximadamente 10°C a aproximadamente 40°C, más preferentemente, en un intervalo de aproximadamente 20°C a aproximadamente 30°C.

En una realización preferida adicional, la presente invención se refiere a una composición que comprende un quitosano modificado, un derivado de quitosano o una variante de quitosano o un hidrocoloide de acuerdo con la presente invención.

Además, la composición de la presente invención puede comprender sustancias activas adicionales. Preferentemente, la composición de la presente invención puede comprender adicionalmente una preparación quimioterapéutica, en particular, si se usa para el tratamiento de la mastitis.

En una realización preferida adicional de la presente invención, la composición de la presente invención puede comprender adicionalmente material antigénico del microorganismo y/o enzimas, en particular material antigénico de hongos queratinofílicos y/o hongos de tipo levadura y/o levaduras queratinofílicas.

El material antigénico de levaduras u hongos queratinofílicos puede obtenerse a partir de cualquier parte de la levadura u hongo queratinofílico que comprenda antígenos, tal como del micelio, artrosporas, microconidios de dermatofitos, blastosporas de levadura u otros. Los antígenos son preferentemente polisacáridos y/o glucopéptidos. Preferentemente, el material antigénico de levaduras u hongos queratinofílicos se selecciona del grupo que consiste en: microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados, blastosporas de levadura homogeneizadas e inactivadas, material antigénico de blastosporas de levadura y material antigénico de microconidios de dermatofitos. Por lo tanto, la composición de la presente invención puede comprender además microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados y/o blastosporas de levadura homogeneizadas e inactivadas y/o material antigénico de blastosporas de levadura y/o microconidios de dermatofitos.

El material antigénico de levaduras queratinofílicas, en particular las blastosporas de levadura, pertenecen preferentemente al género Candida y más preferentemente, a la especie Candida albicans. El material antigénico de dermatofitos queratinofílicos, en particular, los microconidios de dermatofitos, pertenecen preferentemente a los géneros Trichophyton, Microsporum y/o Chrisporium. Más preferentemente, los microconidios de dermatofitos pertenecen a la especie Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum y/o Chrisporium tropicum. En particular, las especies de Microsporum canis pueden ser Microsporum canis var. obesum y/o Microsporum canis var. distortum.

En una realización preferida de la presente invención, las blastosporas de levadura y los microconidios de dermatofitos se obtienen de cepas de las especies mencionadas anteriormente que se han obtenido por selección dirigida basada en la producción de esporas y/o atenuación. Resulta altamente preferente usar una cepa que crezca más rápido en medio nutriente, produzca más microconidios y blastosporas, respectivamente, presente menor virulencia y/o no produzca reacciones adversas después de su aplicación intramuscular en comparación con cualquier cepa epizoótica a partir de la que se ha obtenido. Son ejemplos de estas cepas, las cepas Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, Trichophyton verrucosum DSM - 28406, Trichophyton rubrum Ds M - 9469, Trichophyton rubrum DSM - 9470, Trichophyton rubrum DSM - 9471, Trichophyton rubrum DSM - 9472, Candida albicans DSM - 9456, Candida albicans DSM - 9457, Candida albicans DSM - 9458 y Candida albicans DSM - 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405 y Microsporum canis BINO 483. Por lo tanto, en realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, las blastosporas de levadura y los microconidios de dermatofitos se obtienen de cepas de Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, Trichophyton verrucosum DSM - 28406, Trichophyton rubrum DSM - 9469, Trichophyton rubrum DsM - 9470, Trichophyton rubrum DSM - 9471, Trichophyton rubrum DSM - 9472, Candida albicans DSM - 9456, Candida albicans DSM - 9457, Candida albicans DSM - 9458, Candida albicans DSM - 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405 y Microsporum canis BINO 483.

Las cepas Trichophyton rubrum DSM - 9469, Trichophyton rubrum DSM - 9470, Trichophyton rubrum DSM - 9471, Trichophyton rubrum DSM - 9472, Candida albicans DSM - 9456, Candida albicans DSM - 9457, Candida albicans DSM - 9458 y Candida albicans DSM - 9459 se han depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen” (DSM), Mascheroder Weg 1B, W-38124 Brunswick, Alemania (cuyo nombre y dirección actual es “Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DmSz ), InhoffenstralJe 7B, 38124 Brunswick, ALEMANIA) el 5 de octubre de 1994 por Basotherm GmbH, Eichendorffweg 5, 88396 Biberach an der Riss. Los depositantes actuales de dichas cepas son los solicitantes, es decir, el Dr. Igor Polyakov y la Dra.sc.Dr. Liudmila Ivanova, Eberhardtstr. 40, 89073 Ulm.

TRICHOPHYTON RUBRUM, DSM N.° 9469

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9469. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 533, que fue identificada en piel humana en 1985. La cepa se identificó usando la clave de “Rebell-Taplin” (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3rd Print, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, Estados Unidos, 1978). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla A. La cepa n.° DSM-9469 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, una enorme producción de microconidios y una menor virulencia.

TABLA A

TRICHOPHYTON RUBRUM, DSM n.° 9470

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9470. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 535, que fue identificada en piel humana en 1990. La cepa se identificó usando la clave de “Rebell-Taplin” (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3rd Print, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, Estados Unidos, 1978). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla B. La cepa n.° DSM-9470 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, una enorme producción de microconidios y una menor virulencia.

TABLA B

TRICHOPHYTON RUBRUM, DSM n.° 9471

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9471. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 620, que se identificó en uña humana en 1989. La cepa se identificó usando la clave de “Rebell-Taplin” (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 3rd Print, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, Estados Unidos, 1978). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla C. La cepa n.° DSM-9471 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, una enorme producción de microconidios y una menor virulencia.

TABLA C

TRICHOPHYTON RUBRUM, DSM N.° 9472

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9472. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 754, identificada en uña humana en 1990. La cepa se identificó usando la clave de “Rebell-Taplin” (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3rd Print, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, Estados Unidos, 1978). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla D. La cepa n.° DSM-9472 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, una enorme producción de microconidios y una menor virulencia.

TABLA D

CANDIDA ALBICANS, DSM n.° 9456

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9456. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la estabilización de características de cultivo-morfológicas y atenuación de la cepa epidémica n.° 008-L, que se identificó en ser humano en 1990. La cepa se identificó usando la clave de Lodder (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Ámsterdam - Londres (1970). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla E. La cepa n.° DSM-9456 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, propiedades biológicas estables, una enorme producción de biomasa y una menor virulencia.

TABLA E

TABLA E (continuación)

CANDIDA ALBICANS, DSM n.° 9457

La cepa ha sido depositada en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9457. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la estabilización de características de cultivo-morfológicas y atenuación de la cepa epidémica n.° 012, identificada en ser humano en 1992. La cepa se identificó usando la clave de Lodder (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Ámsterdam - Londres (1970). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla F. La cepa n.° DSM-9457 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, propiedades biológicas estables, una enorme producción de biomasa y menor virulencia.

TABLA F

CANDIDA ALBICANS, DSM n.° 9458

La cepa se ha depositado en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9458. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la estabilización de características de cultivo-morfológicas y atenuación de la cepa epidémica n.° 047, identificada en ser humano en 1989. La cepa se identificó usando la clave de Lodder (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Ámsterdam - Londres (1970). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla G. La cepa n.° DSM-9458 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, propiedades biológicas estables, una enorme producción de biomasa y una menor virulencia.

TABLA G

CANDIDA ALBICANS, DSM N.° 9459

La cepa se ha depositado en la DSM con fecha 5/10/1994 con el n.° de serie DSM-9459. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la estabilización de características de cultivo-morfológicas y atenuación de la cepa epidémica n.° 158, identificada en el ser humano en 1990. La cepa se identificó usando la clave de Lodder (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Ámsterdam - Londres (1970). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla H. La cepa n.° DSM-9459 difiere de la cepa epidémica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, propiedades biológicas estables, una enorme producción de biomasa y una menor virulencia.

TABLAH

Tabla I

Propiedades y características de la cepa Cepa n.° VKPGF-930/1032 Cepa epizoótica n.° 1032______ Descripción del cultivo Colonia madura de 10 a 15 días Colonia madura de 25 - 30 días en agar/mosto; crema, en agar/mosto; blanca, plana, aterciopelada/pulverulenta, plana margen de crecimiento estrecho, con una ligera elevación plana superficie inferior de color en el centro, margen de marrón rojizo, diámetro de crecimiento estrecho, con flecos, colonia: 15 a 20 mm superficie inferior de color

marrón claro, diámetro de

colonia: 25 a 30 mm

Características morfológicas Hifas de ramificación septadas Hifas septadas, rectas con de 1 a 3 pm de anchura, ramificaciones y espirales de 1 a numerosos microconidios ovales 3 pm de anchura, microconidios piriformes que miden de 1 a 3 x 2 piriformes aplanados, redondos, a 6 pm, sin macroconidios que miden de 1 a 3 x 2 a 6 pm, pocos macroconidios alargados-, ovales con 2 a 5 septos, que miden de 2 a 6 x 15 a 25 pm Características patogénicas Costras necróticas Costras densas, parecidas al De 9 a 10 días después de la aplicación amianto

de una dosis de 500-600 miles de células

de materia fúngica por cm2 en piel

escarificada de un conejo

Recuperación espontánea después de 22 a 25 días 30 a 35 días

Respuesta de reacción Sin cambios observados en el Inflamación en el punto de Resultados de la inyección subcutánea e estado clínico inyección, edema intramuscular de antígenos corpusculares

inactivados de cultivos

(continuación)

Propiedades y características de la cepa Cepa n.° VKPGF-930/1032 Cepa epizoótica n.° 1032 Respuesta de antígenos

20 a 25 días después de la inyección de

antígenos corpusculares en conejos, títulos

de anticuerpos observados en suero

sanguíneo

Mediante PHR 1:320 a 1:640 1:320 a 1:640

Mediante ELISA 1:400 a 1:1.600 1:400 a 1:1.600

Respuesta inmunogénica Establece inmunidad Establece inmunidad Respuesta inmunogénica

Inmunización de un grupo de conejos con

antígenos inactivados de cultivos (repetido

al menos 5 veces)

Trichophyton mentagrophytes n.° VKPGF-930/1032, N.° DSM-7279

La cepa Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 ha sido depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest en la “Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen” (DSM), Mascheroder Weg 1B, W-38124 Brunswick, Alemania (cuyo nombre y dirección actual es “Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (Dm Sz ), InhoffenstralJe 7B, 38124 Brunswick, ALEMANIA) el 1 de octubre de 1992 por Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, 6507 Ingelheim am Rhein (cuya dirección actual es Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, 55216 Ingelheim am Rhein). Los depositantes actuales de dicha cepa son los solicitantes, particularmente el Dr. Igor Polyakov y la Dra.sc.Dr. Liudmila Ivanova, Eberhardtstr. 40, 89073 Ulm.

Trichophyton verrucosum, DSM n.° 28406

La cepa Trichophyton verrucosum BINO 348 ha sido depositada por Binomed GmbH (EinsteinstralJe 59, 89077 Ulm) de acuerdo con el Tratado de Budapest en el - Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstralJe 7B, 38124 Brunswick, Alemania, con el n.° de serie DSM-28406 el 12 de febrero de 2014. El depositante ha autorizado a los solicitantes a hacer referencia al material biológico depositado en la solicitud y han dado su consentimiento incondicional e irrevocable a que el material depositado esté disponible para el público de acuerdo con la Norma 31 EPC. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 348, que fue aislada a partir de vacas en 1997. La cepa se identificó usando la clave de Rebell-Taplin (Rebell, G,Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 1978) y de acuerdo con Kashkin, P.N. et al. (onpedenumenb ^amo^eHHbx, moKcu êHHbx epedHbx dnn nenoeeKa ^pu6oe, opredelítel patoguénnij, toksiguénnij vrédnij dlia cheloveka gribov, 1979). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla J. La cepa BINO 348-DSM 28406 difiere de la cepa epizoótica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, la enorme producción de microconidios, menor virulencia y la ausencia de cualquier reacción adversa después de la aplicación intramuscular de antígenos.

Tabla J

(continuación)

Chrisporium tropicum, n.° DSM-28405

La cepa Chrisporium tropicum BINO 122 ha sido depositada por Binomed GmbH (Einsteinstraie 59, 89077 Ulm) de acuerdo con el Tratado de Budapest en el - Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraie 7B, 38124 Brunswick, Alemania, con el n.° de serie DSM-28405 el 12 de febrero de 2014. El depositante ha autorizado a los solicitantes a hacer referencia al material biológico depositado en la solicitud y ha dado su consentimiento incondicional e irrevocable a que el material depositado esté disponible para el público de acuerdo con la Norma 31 EPC. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas de la cepa de campo n.° 122, aislada a partir del suelo en 1993. La cepa se identificó usando la clave de Rebell-Taplin (Rebell, G. Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 1978) y de acuerdo con Carmichael, J.N. Chrysosporium and some other aleuriosporic hyphomycetes. - Can.J.Bot., 1962, 40, 1137-1173. Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla K. La cepa BINO 122-DSM 28405 difiere de la cepa de campo en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, la enorme producción de conidios, la débil virulencia y la producción de enzimas.

Tabla K

(continuación)

Microsporum canis BINO 483

La cepa Microsporum canis BINO 483 ha sido depositada por Binomed GmbH (Einsteinstraíe 59, 89077 Ulm) de acuerdo con el Tratado de Budapest en el - Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstralíe 7B, 38124 Brunswick, Alemania, con el n.° de serie DSM-32271 el 25 de febrero de 2016. El depositante ha autorizado a los solicitantes a mencionar el material biológico depositado en la solicitud y ha dado su consentimiento incondicional e irrevocable para que el material depositado esté disponible para el público de acuerdo con la Norma 31 EPC. La cepa se obtuvo por selección directa basada en la producción de esporas y atenuación de la cepa epizoótica n.° 483, aislada a partir de gatos en 1990. La cepa se identificó usando la clave de Rebell-Taplin (Rebell, G,Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 1978) y de acuerdo con Kashkin, P.N. et al. (onpedenumenb ^amo^eHHbx, moKcu êHHbx epedHbtx dnn nenoeeKa ^pu6oe, opredelitel patoguénnij, toksiguénnij vrédnij dlia cheloveka gribov, 1979). Las propiedades biológicas de la cepa se describen en la Tabla L. La cepa de vacuna n° 483 difiere de la cepa epizoótica en su mayor velocidad de crecimiento en medio nutriente, la enorme producción de microconidios, una menor virulencia y la ausencia de cualquier reacción adversa después de la aplicación intramuscular de antígenos.

Tabla L

(continuación)

En una realización preferida, la composición de la presente invención comprende microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados de un microconidio o de una mezcla de microconidios de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de las cepas indicadas anteriormente de dermatofitos. En una realización preferida adicional, la composición comprende una mezcla de dermatofitos homogeneizados e inactivados de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de los dermatofitos indicados anteriormente y blastosporas de levadura homogeneizadas e inactivadas de una, dos, tres o cuatro de las levaduras indicadas anteriormente. En una realización preferida adicional, la composición comprende microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados de una o una mezcla de dos, tres o cuatro de las levaduras indicadas anteriormente. Las composiciones pueden comprender además material antigénico de microconidios de dermatofitos y/o material antigénico de blastosporas de levadura.

En una realización preferida adicional, la composición comprende material antigénico de un microconidio de dermatofitos o una mezcla de material antigénico de microconidios de dermatofitos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de las cepas de dermatofitos indicadas anteriormente. En una realización preferida adicional, la composición comprende una mezcla de material antigénico de microconidios de dermatofitos de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de los dermatofitos indicados anteriormente y material antigénico de blastosporas de levadura de una, dos, tres o cuatro de las levaduras indicadas anteriormente. En una realización preferida adicional, la composición comprende material antigénico de blastosporas de levadura de una o una mezcla de dos, tres o cuatro de las levaduras indicadas anteriormente. Las composiciones pueden comprender además microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de los dermatofitos indicados anteriormente y/o blastosporas de levadura homogeneizadas e inactivadas de una, dos, tres o cuatro de las levaduras indicadas anteriormente.

En una realización preferida, la composición para el uso de la presente invención comprende una mezcla de microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var. obesum, Microsporum canis var. distortum y Microsporum gypseum. Por ejemplo, la vacuna Polivac-TM (fabricante: “Vetbiochim” LLC, Moscú; Distribuidor: “Prostore” LLC, Moscú) es conforme a esta realización y puede estar comprendida en una composición de la presente invención. Polivac-TM es una vacuna diseñada para animales tales como gatos, perros, caballos y otros.

En una realización preferida adicional, la composición de la presente invención comprende una mezcla de microconidios de dermatofitos homogeneizados e inactivados de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum y Trichophyton sarkisovii. Por ejemplo, la vacuna Polivac-T (fabricante: “Vetbiochim” LLC, Moscú; Distribuidor: “Prostore” LLC, Moscú) es conforme a la presente realización y puede estar comprendida en la composición de la presente invención. Polivac-T es una vacuna diseñada específicamente para vacas.

En caso de que la composición de la presente invención comprenda microconidios de dermatofitos de solo una cepa o blastosporas de levadura de solo una cepa, dichos microconidios de dermatofitos o blastosporas de levadura pueden prepararse como se indica a continuación:

(i) se cultiva un dermatofito y una levadura, respectivamente, en un medio sólido adecuado, se recoge y se homogeneiza el dermatofito y

(ii) se inactiva el homogeneizado obtenido en la etapa (i)

En caso de que la composición de la presente invención comprenda una mezcla de microconidios de dermatofitos y/o blastosporas de levadura, dicha mezcla puede prepararse tal como se indica a continuación:

(i) se cultiva una cepa de dermatofito y dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez cepas distintas de dermatofitos, respectivamente, por separado en un medio sólido adecuado, se recoge cada cultivo y se homogeneiza cada cultivo por separado, y

(ii) opcionalmente, se cultiva una cepa de levadura y dos, tres o cuatro cepas distintas de levadura, respectivamente, por separado en un medio sólido adecuado, se recoge cada cultivo y se homogeneiza cada cultivo por separado, y

(iii) se combinan y se inactivan los homogeneizados obtenidos en la etapa (i) y, opcionalmente, obtenidos en la etapa (ii).

El crecimiento de los dermatofitos de los procedimientos de preparación indicados anteriormente se realiza preferentemente en agar y mosto en matraces de cultivo. Preferentemente, el cultivo se realiza durante aproximadamente 15 a aproximadamente 30 días. Preferentemente, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 26°C y aproximadamente 28°C. El crecimiento de las levaduras de los procedimientos de preparación indicados anteriormente se realiza preferentemente en agar extracto de malta o agar Sabouraud en matraces de cultivo. Preferentemente, el cultivo se lleva a cabo durante aproximadamente 4 a aproximadamente 7 días. Preferentemente, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 28°C y aproximadamente 37°C.

Tras el cultivo, los dermatofitos y las levaduras, respectivamente, se homogeneizan para obtener una suspensión fina. Preferentemente la homogeneización se lleva a cabo en agua desionizada, en una solución acuosa que comprende entre aproximadamente 0,1% y 0,3% de proteína muscular hidrolizada y fermentada o entre aproximadamente 0,1% y 1% de peptona de soja o de cerdo en combinación con aproximadamente 5% a 6% de glucosa y entre aproximadamente 0,1% y 1% de extracto de levadura, o en una solución acuosa que comprende un 0,1% a 0,9% (p/v) de quitosano modificado de acuerdo con la presente invención.

Son volúmenes adecuados para la homogeneización, aproximadamente 100 a 500 ml. Preferentemente, la concentración de microconidios y blastosporas, respectivamente, se ajusta a una cantidad de aproximadamente 30 a aproximadamente 90 millones de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml o aproximadamente 250 a aproximadamente 500 miles, más preferentemente aproximadamente 250 a aproximadamente 400 miles de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml. A continuación, la suspensión puede ajustarse opcionalmente de forma adicional a aproximadamente 40, 50 o 60 millones de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml o aproximadamente 250 a aproximadamente 500 miles, más preferentemente, aproximadamente 250 a aproximadamente 400 miles de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml, con agua destilada, solución fisiológica salina, tal como, por ejemplo, cloruro sódico, u otra solución adecuada. En el caso de la preparación de una mezcla, las suspensiones individuales preferentemente se ajustan a la misma cantidad de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml, y en un solo recipiente se mezclan volúmenes iguales de cada cultivo en suspensión.

La inactivación preferentemente se realiza usando tiomersal, formaldehído y/o 2-propiolactona. Los agentes para la inactivación pueden añadirse directamente a la suspensión celular. Se prefiere una inactivación mediante la adición de tiomersal en una relación de aproximadamente 1:11.000 a aproximadamente 1:2.500 (p/v). También se prefiere una inactivación mediante la adición de formaldehído para alcanzar una concentración final de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 0,4% (v/v). Posteriormente, la mezcla preferentemente se incuba. La incubación puede llevarse a cabo durante aproximadamente 1 a 30 días a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 37°C. Resulta preferente la incubación durante aproximadamente 1 a 3 días a temperatura ambiente, durante aproximadamente 5 a 7 días a 37°C, durante aproximadamente 30 días a temperatura ambiente o durante aproximadamente 30 días a una temperatura de aproximadamente 26°C a 28°C.

En una realización preferida, los microconidios de las composiciones de la presente invención están en un estado hinchado y/o tienen tubos germinales. Más preferentemente, por lo menos 50% de las blastosporas y/o microconidios están en un estado hinchado y/o tienen tubos germinales. El estado hinchado y/o los tubos germinales de los dermatofitos pueden obtenerse, por ejemplo, mediante una segunda etapa de incubación. Dicha segunda etapa de incubación se realiza preferentemente después de la homogeneización y antes de la inactivación, tal como se ha indicado anteriormente. Para realizar la segunda etapa de cultivo, la suspensión de microconidios se introduce en un recipiente separado que contiene el mismo medio de la primera etapa de incubación. La segunda etapa de cultivo preferentemente se lleva a cabo durante aproximadamente 10 a aproximadamente 48 horas. La segunda etapa de cultivo preferentemente se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 28°C. Preferentemente, la segunda etapa de cultivo se continúa hasta que al menos 50% de los microconidios presentan un estado hinchado o de germinación y no más de aproximadamente 7% a 10% de las células presentan una segunda ramificación miceliar. El diámetro de los microconidios hinchados y germinados aumenta aproximadamente en un factor de 1,2 o más en comparación con los microconidios regulares.

El material antigénico de blastosporas de levadura y/o microconidios de dermatofitos comprende preferentemente polisacáridos y/o glucopéptidos aislados de levaduras u hongos queratinofílicos. Preferentemente, dicho material antigénico puede ser material antigénico insoluble (MIAP), material antigénico soluble (MSAP) o material antigénico exógeno (MEAP). Los hongos queratinofílicos preferentemente son especies de Trichophyton o Microsporum, más preferentemente Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Microsporum canis y Chrisporium tropicum, y las levaduras queratinofílicas son preferentemente de especies de Candida, más preferentemente Candida albicans. Se prefiere especialmente el material antigénico derivado de Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, Trichophyton verrucosum DSM - 28406, Trichophyton rubrum DSM - 9469, Trichophyton rubrum DSM - 9470, Trichophyton rubrum DSM - 9471, Trichophyton rubrum DSM - 9472, Chrisporium tropicum DSM-28405, Candida albicans Ds M - 9456, Candida albicans Ds M - 9457, Candida albicans DSM - 9458 y Candida albicans DSM - 9459. El material antigénico, por ejemplo, se puede obtener por el procedimiento dado a conocer en el documento n° WO 97/07232.

En general, para obtener MIAP, las células fúngicas pertenecientes al grupo de levaduras u hongos queratinofílicos se tratan bajo condiciones acuosas alcalinas, se separan las fases sólida y líquida de la preparación y, después de la separación, la fase sólida se trata con ácido mineral u orgánico. El tratamiento bajo condiciones acuosas alcalinas se lleva a cabo preferentemente con aproximadamente 0,1% a 5% (p/v) de KOH o NaOH a una temperatura de entre aproximadamente 20°C y 150°C durante hasta 30 h. La fase sólida preferentemente se trata con ácido orgánico 0,2 a 1,5 M o con ácido mineral 0,05 a 1 M y se lava con una solución acuosa. De manera más específica, las levaduras u hongos queratinofílicos preferentemente se cultivan en placas de agar. Un medio preferido es, por ejemplo, agar extracto de malta de Oxoid. También puede usarse otro medio que asegure el crecimiento de levaduras u hongos queratinofílicos. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con la solución acuosa de álcali. Posteriormente, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o sedimentación. Preferentemente, la separación se realizó mediante centrifugación, por ejemplo, a 3500 g, lo que permite una buena separación de los residuos de células fúngicas. Tanto el tratamiento bajo condiciones acuosas alcalinas como la etapa de separación pueden repetirse varias veces. Después del tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, puede usarse HCl o ácido acético. El tratamiento con ácido preferentemente se realizó durante aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 horas. La temperatura preferentemente se encuentra comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 100°C. La solución acuosa para lavado preferentemente era agua destilada. Ventajosamente, el lavado se repitió aproximadamente cinco veces. Finalmente, se levantó la fase sólida y se homogeneizó en agua para inyección o en una solución acuosa al 0,1-0,9% del quitosano modificado, de la variante de quitosano o del derivado de quitosano de acuerdo con la presente invención. La homogeneización se realizó preferentemente en un volumen de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 ml. La concentración de partículas después se ajustó preferentemente a aproximadamente 30 a 90 millones de partículas por ml. Finalmente, la preparación que comprendía el material antigénico podía liofilizarse y almacenarse en condiciones secas.

El MSAP generalmente puede obtenerse como se indica a continuación: se tratan células fúngicas de levaduras u hongos queratinofílicos bajo condiciones acuosas alcalinas, se separan las fases sólida y líquida de la preparación, después de la separación el sobrenadante se trata con ácido mineral u orgánico y, después de la separación, el MSAP se precipita respecto del sobrenadante. Más particularmente, las levaduras u hongos queratinofílicos se cultivan en placas de agar, por ejemplo, tal como se indica en el documento n° EP 0564620. Un medio preferido es, por ejemplo, agar extracto de malta de Oxoid. También puede usarse otro medio que asegure el crecimiento de levaduras u hongos queratinofílicos. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de álcali. Son soluciones acuosas alcalinas preferidas, NaOH o KOH a concentraciones preferidas de 0,1-5% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo preferentemente a aproximadamente 20-150°C durante hasta 30 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o sedimentación. Preferentemente, la separación se realiza mediante centrifugación, lo que asegura una buena separación de los residuos de células fúngicas, por ejemplo, con fuerzas de aproximadamente 3500 g. El tratamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, así como la etapa de separación, puede repetirse varias veces. Después del tratamiento alcalino y la separación, el sobrenadante resultante se trata bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido orgánico 0,2-1,5 M o ácido mineral 0,05-1 M. Por ejemplo, puede usarse HCl o ácido acético, preferentemente a valores de pH de aproximadamente pH 2,5 a pH 4,5. Preferentemente, el tratamiento bajo condiciones ácidas acuosas se lleva a cabo durante aproximadamente 2 a 4 horas a temperaturas de aproximadamente 4 a 8°C, produciéndose seguidamente la separación de las capas sólida y líquida. El tratamiento bajo condiciones acuosas ácidas, así como la etapa de separación, pueden repetirse varias veces, preferentemente bajo las condiciones indicadas anteriormente. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. Preferentemente, la precipitación se llevó a cabo mediante la adición de un disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, un alcohol, tal como un alcanol inferior, por ejemplo, metanol o etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 2 a 5 volúmenes de alcohol producirá una buena precipitación del material antigénico. También pueden usarse otros procedimientos de precipitación no alcohólica conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, sulfato amónico u otra precipitación con sal. La fase sólida después se somete a una etapa de separación adicional, preferentemente bajo las condiciones indicadas anteriormente. La fase sólida resultante se recupera y, si se desea, se disuelve en una solución acuosa, preferentemente en agua destilada, típicamente en un volumen de aproximadamente 25 a 100 ml. Finalmente, la preparación de MSAP puede liofilizarse y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados bajo condiciones de sequedad.

El MEAP generalmente puede obtenerse tal como se indica a continuación: se cultivaron células fúngicas de hongos o levaduras queratinofílicas en medio líquido, se separaron la fase sólida y las fases líquidas de la preparación y, después de la separación, se precipitó el MEAP respecto del sobrenadante. Más particularmente, pueden incubarse hongos o levaduras queratinofílicas en solución acuosa o cultivarse en medio líquido. Asimismo, el hongo queratinofílico puede incubarse en solución acuosa con queratina. El cultivo puede realizarse durante un periodo de hasta aproximadamente 240 a 250 horas. El volumen de la solución o cultivo se define en el presente documento como el volumen primario (VP). Puede usarse agua destilada, así como el medio indicado en el documento n° EP 0564620. Después de la incubación o el cultivo, las células fúngicas se separaron, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración o sedimentación, preferentemente mediante centrifugación, bajo las condiciones indicadas anteriormente. Opcionalmente, el sobrenadante resultante se liofiliza a continuación y posteriormente se disuelve en solución acuosa, preferentemente en agua. Preferentemente, el volumen de agua es aproximadamente 0,1 a 0,2 volúmenes del volumen primario (VP). La solución resultante o el sobrenadante resultante obtenido después de la separación, posteriormente se somete a una etapa de precipitación. Preferentemente, la precipitación se llevó a cabo mediante adición de un disolvente orgánico adecuado, por ejemplo, un alcohol, tal como un alcanol inferior, por ejemplo, metanol o etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada aproximadamente 1 a 5 volúmenes de alcohol producirá una buena precipitación del material antigénico. También pueden usarse otros procedimientos de precipitación no alcohólica conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, sulfato amónico u otra precipitación con sal. El precipitado resultante se recupera y, si se desea, se disuelve en un disolvente acuoso, preferentemente en agua destilada. Preferentemente, se disuelven aproximadamente 0,5 a 50 mg del precipitado en 1 ml de disolvente acuoso. Finalmente, la solución de MEAP puede liofilizarse y almacenarse durante periodos de tiempo prolongados en condiciones de sequedad, preferentemente a una temperatura de entre aproximadamente 2°C y 10°C.

En una realización particularmente preferida, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, microconidios de dermatofitos inactivados de Trichophyton mentagrophytes, en particular, de Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, microconidios de dermatofitos inactivados de Trichophyton verrucosum, en particular, de Trichophyton verrucosum DSM - 28406.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, blastosporas de levadura inactivadas de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, MIAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, una mezcla de microconidios de dermatofitos inactivados homogeneizados de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var. obesum, Microsporum canis var. distortum y Microsporum gypseum y opcionalmente, MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456. Más preferentemente, la composición de la presente invención comprende la vacuna Polivac-TM y opcionalmente, MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456.

En una realización particularmente preferida adicional, la composición de la presente invención comprende, además del quitosano modificado o el hidrocoloide de la presente invención, MEAP de Chrisporium tropicum, en particular, de Chrisporium tropicum DSM - 28405 o de Microsporum canis BINO 483.

La concentración de microconidios de dermatofitos inactivados y/o de blastosporas de levadura en la composición de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 90, más preferentemente, de aproximadamente 45 a aproximadamente 80 millones de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml o de aproximadamente 250 a aproximadamente 500 miles, más preferentemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 miles de microconidios y blastosporas, respectivamente, por ml. La concentración de MSAP en la composición de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 pg/ml, más preferentemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 400 pg/ml. La concentración de MIAP en la composición de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 30 a aproximadamente 90, más preferentemente, de aproximadamente 40 a aproximadamente 80 millones por ml. La concentración de Polivac-TM en la composición de la presente invención es preferentemente de aproximadamente 40 millones por ml a aproximadamente 50 millones por ml, más preferentemente, de aproximadamente 40 millones por ml a aproximadamente 45 millones por ml. La concentración de MEAP en la composición de la presente invención es preferentemente de 0,5 a aproximadamente 2 U/ml, más preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,2 U/ml.

La composición de la presente invención es preferentemente una composición farmacéutica que comprende un diluyente, excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un quitosano modificado o el hidrocoloide de acuerdo con la presente invención y un diluyente, excipiente y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La concentración del quitosano modificado o el hidrocoloide en las composiciones o las composiciones farmacéuticas de la presente invención es preferentemente de aproximadamente un 0,1% aproximadamente un 2,0% (p/v), más preferentemente, de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1,4% (p/v), más preferentemente, de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1% (p/v), más preferentemente, de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 0,5% (p/v), más preferentemente, de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 0,3% (p/v).

Otro aspecto de la presente invención es el compuesto, el quitosano modificado, el hidrocoloide y/o la composición de la presente invención para su uso en medicina humana y/o veterinaria. Preferentemente, el compuesto, el quitosano modificado, el hidrocoloide o la composición de la presente invención es para su uso como vacuna en medicina humana y/o veterinaria.

La presente invención se refiere además al compuesto, el quitosano modificado, el hidrocoloide y/o la composición de la presente invención para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la mastitis, preferentemente la mastitis latente y/o la mastitis aguda, endometritis, preferentemente endometritis crónica, aguda y/o purulenta-catarral, enfermedades podales y de las pezuñas, cojera, lesiones en el espacio interdigital, dermatitis digital, dermatitis interdigital, flemón interdigital, tricofitosis, microesporosis, micosis de la piel, alergias, así como enfermedades complicadas por alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis o verrugas, en particular verrugas comunes, en un sujeto.

La presente invención se refiere además al compuesto, el quitosano modificado, el hidrocoloide y/o la composición de la presente invención para su uso en un procedimiento para modular la respuesta inmunitaria en un sujeto y/o para mejorar la eficacia de la reproducción, preferentemente la eficacia de la reproducción en la cría de animales.

El sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano o un animal, en particular un mamífero, más preferentemente bóvidos y/o cerdos, más preferentemente vacas, aunque también perros, gatos y otros animales de granja o domésticos.

En una realización particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado, el hidrocoloide o compuesto de acuerdo con la presente invención y microconidios de dermatofitos inactivados de Trichophyton mentagrophytes, en particular, de Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la dermatitis interdigital, la dermatitis digital y/o el flemón interdigital en animales, en particular en bóvidos y/o cerdos, más preferentemente en vacas.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y microconidios de dermatofitos inactivados de Trichophyton verrucosum, en particular, de Trichophyton verrucosum DSM - 28406, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la dermatitis interdigital, dermatitis digital, el flemón interdigital y/o la tricofitosis en animales, en particular en bóvidos y/o cerdos, más preferentemente en vacas.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y blastosporas de levadura inactivadas de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la dermatitis interdigital, la dermatitis digital y/o el flemón interdigital, en particular en bóvidos y/o cerdos, más preferentemente en vacas.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis o verrugas, en particular verrugas comunes, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis o conjuntivitis en seres humanos y/o animales, en particular, en mamíferos, más preferentemente en animales de compañía, lo más preferentemente, perros, gatos y/o caballos, aunque también vacas, cerdos u otros animales de granja o domésticos.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y MlAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la dermatitis interdigital, la dermatitis digital y/o el flemón interdigital en animales, en particular en bóvidos y/o cerdos, más preferentemente en vacas.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y una mezcla de microconidios de dermatofitos inactivados homogeneizados de Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var. obesum, Microsporum canis var. distortum y Microsporum gypseum y opcionalmente, MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456. Más preferentemente, la composición de la presente invención comprende además del quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de la presente invención, la vacuna Polivac-TM y opcionalmente, MSAP de Candida albicans, en particular, de Candida albicans DSM - 9456, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir la tricofitosis o la dermatofitosis en animales, en particular en bóvidos y/o cerdos, más preferentemente en vacas.

En una realización adicional particularmente preferida, la invención se refiere a una composición que comprende el quitosano modificado o el hidrocoloide o el compuesto de acuerdo con la presente invención y MEAP de Chrisporium tropicum, en particular, de Chrisporium tropicum DSM - 28405 o de Microsporum canis BINO 483, para su uso en un procedimiento para tratar y/o prevenir alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis, micosis de la piel o verrugas, en particular verrugas comunes, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis o conjuntivitis en seres humanos y/o animales, en particular, en mamíferos, más preferentemente bóvidos y/o cerdos, más preferentemente vacas o caballos, pero también perros, gatos y otros animales de granja o domésticos.

El quitosano modificado, el hidrocoloide, el compuesto y las composiciones de la presente invención pueden modular el sistema inmunitario, es decir, tienen propiedades inmunoestimuladoras. Pueden usarse como vacuna para prevenir en el sujeto las enfermedades indicadas en el presente documento. Alternativa o adicionalmente, pueden usarse para tratar y curar en el sujeto las enfermedades indicadas en el presente documento. El quitosano modificado, el hidrocoloide y las composiciones pueden administrarse por vías de administración conocidas, tales como, por ejemplo, vía oral, parenteral, mediante inyección intramuscular, mediante inyección intracutánea, mediante inyección percutánea, mediante instilación, intracisternal, intrauterina, rectal, subcutánea y/o por vía tópica, preferentemente por vía cutánea, más preferentemente, inyección intramuscular y/o inyección intracutánea y/o por vía tópica sobre la piel y/o por vía tópica sobre la membrana mucosa. Pueden administrarse en ausencia o en presencia de una o más sustancias inmunoestimuladoras adicionales. En una realización, dichas sustancia o sustancias inmunoestimuladoras adicionales se administran por separado respecto al quitosano modificado, al compuesto o a las composiciones de la presente invención. En otra realización, dicha sustancia o sustancias inmunoestimuladoras adicionales están comprendidas o se añaden a las composiciones de la presente invención.

Dichas sustancia o sustancias inmunoestimuladoras son preferentemente un adyuvante, seleccionado preferentemente del grupo que consiste en acetato de vitamina E, emulsión de aceite/agua, fosfato de aluminio, óxido de aluminio, gel de hidróxido de aluminio/metilcelulosa, una emulsión de aceite, dipéptidos de muramilo, adyuvantes de Freund y saponinas y/o al menos una citoquina, seleccionada preferentemente entre el grupo que consiste en IL 2, IL 12 e INF-gamma.

En una realización preferida, las composiciones de la presente invención son una vacuna y/o se usan a modo de vacuna.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un quitosano modificado, un hidrocoloide o un compuesto o una composición de la presente invención para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo animal y/o humano mediante terapia. Dicho procedimiento comprende normalmente la administración en un sujeto de una cantidad eficaz del quitosano modificado, una composición, preferentemente una composición farmacéutica, o el hidrocoloide de la presente invención. El sujeto puede ser, por ejemplo, un ser humano o un animal, en particular un mamífero, más preferentemente bóvidos y/o cerdos, más preferentemente vacas, aunque también perros, gatos y otros animales de granja o domésticos. En particular, el quitosano modificado, el hidrocoloide o las composiciones, en particular, composiciones farmacéuticas, de la presente invención pueden usarse en procedimientos para el tratamiento o la prevención de las enfermedades indicadas anteriormente. El procedimiento de tratamiento puede comprender el tratamiento y/o la prevención de infecciones bacterianas, micóticas y/o víricas de la piel, el oído, el pulmón, la nariz, la pata, el pie, las pezuñas, la parte posterior del pie y/o el espacio interdigital. Dichas infecciones pueden estar causadas por Dichelobacter nodosus, Fusobacterium necroforun, Fusobacterium spp, Treponema spp tales como T. phagedenis, T. vincentii, y T. denticola, Campylobacter spp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Arcanobacterium pyogenes, Prevotella spp., Trichophyton spp., tal como T. verrucosum, T. mentagrophytes, T. sarkisovii, T. equinum, T. schonleinii, T. rubrum, T. tonsurans, T. interdigitale, y/o Microsporum spp., tal como M. canis, M. canis var. distortum, M. canis var. obesum, M. gypseum, y/o Malassezia spp., tal como M. pachydermatitis, M. furfur, M. dermatitis y/o VPH, papilomavirus humano, del género Papillomavirus familia Papovaviridae, tal como HPV-2, VPH-3, VPH-4, VPH-6, VPH-11.

El programa de dosis y la vía de administración usadas en un procedimiento de tratamiento y/o profilaxis de acuerdo con la presente invención dependen de la enfermedad/sitio de infección específicos que deben tratarse. La vía de administración puede ser, por ejemplo, la vía oral, parenteral, mediante inyección intramuscular, mediante inyección intracutánea, mediante inyección percutánea, mediante instilación, intracisternal, intrauterina, rectal, subcutánea y/o por vía tópica, preferentemente por vía cutánea, más preferentemente, inyección intramuscular y/o inyección intracutánea y/o por vía tópica sobre la piel y/o por vía tópica sobre la membrana mucosa o cualquier otra vía de administración.

Las dosis preferidas para la composición de la presente invención son de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,5 ml/kg con una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml y/o de aproximadamente 30x106 a aproximadamente 80x106 microconidios y/o blastosporas y/o partículas de MIAP. Preferentemente, la composición de la presente invención se administra aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces. El intervalo entre administraciones es preferentemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 21 días. Los siguientes ejemplos explican la presente invención, aunque no deben considerarse limitativos.

Ejemplo 1

La primera etapa.

Dilución (disolución) de quitosano

Se esterilizaron mediante autoclavado 40 g del polisacárido, quitosano y se añadieron bajo agitación a 8 litros de agua estéril para inyección acidificada con 40 ml de ácido acético al 100%, obteniendo una suspensión. La suspensión se mezcló en un recipiente estéril durante 24 horas para obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N al gel hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante del precipitado contenía en su estructura quitosano diacetilado. El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 50 minutos a 4500 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprende quitosano diacetilado

El material suspendido obtenido se homogeneizó en un homogeneizador cerrado estéril en 7 litros de agua estéril para inyección. Se añadieron gota a gota 8 ml de ácido valeriánico al 98% (cloruro de valerilo, cloruro de pentanoílo) a la suspensión bajo agitación constante. Posteriormente, la suspensión se sometió a agitación durante 24 horas. Para permitir la disolución de los copos y las partículas no disueltas, se añadió una solución de ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta que la suspensión presentaba un pH de 5,8. Se añadió agua estéril para inyección hasta obtener un volumen final de 8 litros. Después, se usó el polisacárido modificado para preparar el producto final.

Características del material biológico obtenido que comprende quitosano modificado:

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 2 litros del material biológico que comprendía quitosano modificado a un volumen de 15 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos de clorocresol. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. La suspensión resultante se esterilizó mediante calentamiento durante 40 minutos a 70°C tres veces a intervalos de 24 horas. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 2

Dilución (disolución) de quitosano

Se añadieron 4 g del polisacárido, quitosano bajon agitación a 0,8 litros de agua estéril para inyección a fin de obtener una suspensión. Se añadieron 4 ml de ácido acético al 100% y la suspensión se mezcló en un recipiente estéril durante 24 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron por filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N al gel hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 40 minutos. El material biológico resultante del precipitado contenía en su estructura, quitosano diacetilado. El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 45 minutos a 4500 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprende quitosano diacetilado

El material suspendido obtenido se homogeneizó en un homogeneizador cerrado estéril en 4 litros de agua estéril para inyección. Se añadieron gota a gota 0,8 ml de ácido valeriánico al 98% (cloruro de valerilo, cloruro de pentanoílo) a la suspensión bajo agitación constante. Posteriormente, la suspensión se sometió a agitación durante 24 horas. Para permitir la disolución de los copos y las partículas no disueltas, se añadió una solución de ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta que la suspensión presentaba un pH de 5,5. Después, se usó el polisacárido modificado para preparar el producto final.

Características del material biológico obtenido que comprendía quitosano modificado:

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se resuspendieron 200 ml del quitosano modificado en 1,5 litros de agua estéril para inyección y se añadieron 50 ml de solución de clorocresol que contenía 2 g de la sustancia activa bajo agitación. La suspensión obtenida se ajustó a un volumen de 2 litros. La suspensión obtenida se esterilizó por calentamiento durante 40 minutos a 70°C tres veces a intervalos de 24 horas. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 3

Dilución (disolución) de quitosano

Se esterilizaron mediante autoclavado 80 g del polisacárido, quitosano y se añadieron bajo agitación a 16 litros de agua estéril para inyección acidificada con 80 ml de ácido acético al 100% para obtener una suspensión. La suspensión se mezcló en un recipiente estéril durante 24 horas para obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N al gel hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 50 minutos. El material biológico resultante del precipitado contenía en su estructura, quitosano diacetilado. El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 60 minutos a 5.000 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprendía quitosano diacetilado

El material suspendido obtenido se homogeneizó en un homogeneizador cerrado estéril en 4 litros de agua estéril para inyección. Se añadieron gota a gota 16 ml de ácido valeriánico al 98% (cloruro de valerilo, cloruro de pentanoílo) a la suspensión bajo agitación constante. Además, se añadieron 4 litros de agua estéril para inyección y se añadió una solución estéril al 3% de ácido glutámico bajo agitación hasta que la suspensión presentaba un pH de 5,0. Se añadió agua estéril para inyección hasta obtener un volumen final de 8 litros. Después, la suspensión se sometió a agitación durante 24 horas. Seguidamente, se usó el polisacárido modificado para preparar el producto final.

Características del material biológico obtenido que comprendía quitosano modificado

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se resuspendieron 4.000 ml del quitosano modificado en 30 litros de agua estéril para inyección y se añadieron 50 ml de solución de clorocresol que contenía 40 g de la sustancia activa bajo agitación. La suspensión obtenida se ajustó a un volumen de 40 litros. La suspensión obtenida se esterilizó por calentamiento durante 45 minutos a 72°C tres veces a intervalos de 24 horas. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

E je m p lo 4

Dilución (disolución) de quitosano

Se esterilizaron mediante autoclavado 16 g del polisacárido, quitosano (desacetilación del 65%-72%, viscosidad de 151 a 350 mPas, 80-200 kDa) y se añadieron bajo agitación a 3 litros de agua estéril para inyección acidificada con 164 ml de ácido acético al 100% para obtener una suspensión. La suspensión se mezcló en un recipiente estéril durante 24 horas a fin de obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N al gel hasta obtener un pH final de 8,5. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante del precipitado contenía en su estructura, quitosano diacetilado. El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 50 minutos a 5.000 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprendía quitosano diacetilado

El material suspendido obtenido se homogeneizó en un homogeneizador cerrado estéril en 1 litro de agua estéril para inyección. Se añadieron gota a gota 0,6 ml de ácido valeriánico al 98% (cloruro de valerilo, cloruro de pentanoílo) a la suspensión bajo agitación constante. Además, se añadió una solución de ácido paraaminobenzoico al 0,5% bajo agitación hasta que la suspensión alcanzó un pH de 5,4. Se añadió agua estéril para inyección hasta obtener un volumen final de 1,6 litros. Después, la suspensión se sometió a agitación durante 24 horas. A continuación, se usó el polisacárido modificado para preparar el producto final.

Características del material biológico obtenido que comprendía quitosano modificado

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se resuspendieron 1.000 ml de la fracción modificada en 8 litros de agua estéril para inyección y se añadieron 200 ml de solución de clorocresol que contenía 10 g de la sustancia activa bajo agitación. La suspensión obtenida se ajustó a un volumen de 10 litros. La suspensión obtenida se esterilizó mediante calentamiento durante 45 minutos a 65°C tres veces a intervalos de 24 horas. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 5

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa.

Se esterilizaron mediante autoclavado 40 g de quitosano (desacetilación del 82%-87%, viscosidad de 151 a 350 mPas, peso molecular: 150 a 300 kDa) y se añadieron bajo agitación a 3,5 litros de agua estéril para inyección. Se añadieron 40 ml de ácido acético al 100% a la suspensión obtenida y se ajustó el volumen hasta un volumen final de 4 litros con agua para inyección. La suspensión se sometió a agitación en un recipiente estéril durante 24 horas hasta obtener una suspensión en gel. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N a la suspensión obtenida hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante del precipitado contenía en su estructura un polisacárido lineal diacetilado de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina (quitosano). El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 55 minutos a 4.500 revoluciones por minuto.

Modificación del quitosano

El precipitado se suspendió en 4 litros de agua estéril para inyección y se añadió ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,4. La suspensión se sometió a agitación durante 24 horas hasta disolver todos los copos y se obtuvo una suspensión en gel. La suspensión en gel se usó para preparar el producto final.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante la adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo bajo agitación. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 6

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano modificado; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 62% a 67%, una viscosidad de 70 a 200 mPa y un peso molecular de 100 a 250 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida, se le añadieron 40 ml de ácido acético al 100%. El volumen final se ajustó con agua para inyección hasta 4 litros. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 24 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con un tamaño de celda de 200 pm a 300 pm.

Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N a la suspensión preparada hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico recibido contenía en su estructura un polisacárido lineal diacetilado de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina (quitosano). El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 60 minutos a 4.500 revoluciones por minuto.

Modificación del quitosano

Se añadieron gota a gota 4 ml de cloruro del ácido valeriánico al 98% a la suspensión bajo agitación constante. El material suspendido obtenido se sometió a agitación durante una hora. Los copos y las partículas no disueltas se suspendieron en 4 litros de agua estéril para inyección y se añadió ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,0. La suspensión se sometió a agitación durante 28 horas hasta disolver todos los copos y se obtuvo una suspensión en gel.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales en condiciones estériles.

Ejemplo 7

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano modificado; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación del 77% a 82%, una viscosidad de 2.700 a 3.300 mPa y un peso molecular de 300 a 700 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida, se le añadieron 40 ml de ácido acético al 100%. El volumen final se ajustó a 4 litros con agua para inyección. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 30 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N a la suspensión obtenida hasta obtener un pH final de 8,0. Después, se precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante contenía en su estructura un polisacárido lineal diacetilado de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina (quitosano). El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 45 minutos a 5.000 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprendía quitosano

Se añadieron gota a gota 8 ml de ácido láctico al 90% a la suspensión bajo agitación constante. El material suspendido obtenido se sometió a agitación durante una hora. Los copos y las partículas no disueltas se suspendieron en 4 litros de agua estéril para inyección y se añadió ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,6. La suspensión se sometió a agitación durante 48 horas hasta disolver todos los copos y se obtuvo una suspensión en gel.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 8

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano modificado; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación del 82% a 87%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida, se le añadieron 40 ml de ácido acético al 100%. El volumen final se ajustó a 4 litros con agua para inyección. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 36 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm - 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N a la suspensión obtenida hasta obtener un pH final de 8,0. Después, precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante contenía en su estructura un polisacárido lineal diacetilado de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina (quitosano). El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 50 minutos a 4.500 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprendía quitosano

Se añadió una solución al 0,2% de ácido paraaminobenzoico al precipitado bajo agitación constante hasta obtener 4 litros. El material suspendido obtenido se sometió a agitación durante una hora. Los copos y las partículas no disueltas se suspendieron en solución de ácido paraaminobenzoico y ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,6. La suspensión se sometió a agitación durante 70 horas hasta disolver todos los copos y se obtuvo una suspensión en gel.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 9

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano modificado; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida, se le añadieron 40 ml de ácido acético al 100%. El volumen final se ajustó con agua para inyección hasta 4 litros. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 24 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se añadió gota a gota hidróxido de sodio (NaOH) 4 N a la suspensión obtenida hasta obtener un pH final de 8,0. Después, precipitaron copos. La suspensión se sometió a agitación durante 30 minutos. El material biológico resultante contenía en su estructura un polisacárido lineal diacetilado de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina (quitosano). El precipitado se recogió mediante centrifugación durante 60 minutos a 4.500 revoluciones por minuto.

Modificación del material biológico que comprendía quitosano

Se añadió una solución al 0,1% de sal sódica de ácido glucurónico al precipitado bajo agitación constante hasta obtener 4 litros. El material suspendido obtenido se sometió a agitación durante una hora. Los copos y las partículas no disueltas se resuspendieron en solución de ácido glucurónico y ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,6. La suspensión se sometió a agitación durante 72 horas hasta disolver todos los copos y se obtuvo una suspensión en gel.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 10

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida se le añadieron 8 ml de sal sódica del ácido valeriánico al 98%. El volumen final se ajustó a 4 litros con agua para inyección. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 48 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 11

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos de polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,9 litros de ácido paraaminobenzoico al 0,2% en agua para inyección bajo agitación. Se añadió solución de ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,6 y a fin de obtener una suspensión en gel. El volumen final se ajustó a 4 litros con agua para inyección. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 72 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 12

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de una solución al 0,1% de sal sódica del ácido glucurónico bajo agitación. Para obtener una solución en gel, se añadió solución de ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,0. El volumen final se ajustó con agua para inyección hasta 4 litros. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 78 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm - 300 pm.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 13

El producto se preparó a partir de quitosano. El producto se preparó en dos etapas. La primera etapa estaba destinada a la obtención de una solución de quitosano; la segunda etapa estaba destinada a la obtención del producto final.

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos del polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,5 litros de agua para inyección bajo agitación. A la suspensión obtenida, se le añadieron 8 ml de ácido láctico al 90%. Para disolver los copos y las partículas, se añadió solución de ácido clorhídrico 4 N hasta obtener un pH de 5,7. El volumen final se ajustó con agua para inyección hasta obtener 4 litros. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 36 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 14

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 1 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 5.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,6 gramos de principio activo. La suspensión resultante se ajustó al volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 15

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 5 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 6.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 2 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 16

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 5 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 7.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,8 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 17

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 5 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 8.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,8 gramos de principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 18

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 5 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 9.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

E je m p lo 19

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 6 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 9.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 20

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 6 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 8.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 21

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 6 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 8.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de formol que contenían 80 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 22

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 6 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 9.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 35 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 85 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 40 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 23

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 5, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 15 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 24

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 6, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 15 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 25

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 7, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 1,6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

E je m p lo 26

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 8, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 30 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 27

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 9, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 0,6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 28

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 6, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 5 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 6 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 6 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 29

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 7, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 5 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de timerosal que contenían 0,24 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 6 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 30

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 8, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 5 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 12 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 6 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 31

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 9, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 5 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de metiolato que contenía 0,24 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 6 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 32

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 8, con la diferencia de que en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de neomicina que contenían 150 g del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 33

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 8, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de sales de sodio y potasio de penicilina que contenían 300 g (300.000.000 UE) del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 34

El producto se preparó de acuerdo con el ejemplo 8, con la diferencia de que, en la segunda etapa de preparación para obtener el producto resultante, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado hasta un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de sales de sodio y potasio de penicilina que contenían 300 g (300.000.000 UE) del principio activo y 500 ml de solución de neomicina que contenían 150 g del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 35

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 7 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 8.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 15 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 30 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 20 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 36

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 7 en un volumen de 2 litros y mediante la mezcla del mismo con 2 litros del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 6.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 15 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 30 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 20 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 37

El producto se preparó llevando a cabo la 1a etapa del ejemplo 7 en un volumen de 5 litros.

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 4 litros del polisacárido modificado a un volumen de 15 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de formol que contenían 30 ml del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 20 litros. El producto estéril resultante se dispensó en viales bajo condiciones asépticas.

Ejemplo 38

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se llevó a cabo durante 15 a 30 días a una temperatura de 26°C a 28 °C. Las masas fúngicas del dermatofito se levantaron y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, de 100 a 500 ml) del producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 6, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa. La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla, 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se añadió a la suspensión fúngica para obtener una concentración de 45 a 80 millones de microconidios por ml de cada homogeneizado. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular, de tal forma que la suspensión celular contenía finalmente 0,2% (v/v) de formaldehído. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con el presente método puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

Ejemplo 39

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton verrucosum DSM - 28406, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se llevó a cabo durante 15 a 30 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Las masas fúngicas del dermatofito se levantaron y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, de 100 a 500 ml) del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 8, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa. La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla, 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se añadió a la suspensión para obtener una concentración de 45 a 80 millones por ml de homogeneizado. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular, de tal forma que la suspensión celular contenía al final 0,4% (v/v) de formaldehído. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con el presente método puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital y/o la tricofitosis en animales.

Ejemplo 40

Se cultivó la especie Candida albicans DSM - 9456 en agar extracto de malta o agar Sabouraud, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 4 a 7 días a una temperatura de entre 28°C y 37°C. Las blastosporas se lavaron con una solución fisiológica de cloruro de sodio u otra solución adecuada. Las masas fúngicas del dermatofito se levantaron y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, de 100 a 500 ml) del producto preparado de acuerdo con el ejemplo 9, pero con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustan 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. El producto estéril resultante se añadió a la suspensión para obtener una concentración de 40 a 90 millones de microconidios por ml del homogeneizado. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular, de tal forma que la suspensión celular contenía finalmente 0,3% (v/v) de formaldehído. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

Ejemplo 41

Primera etapa: se cultivó la especie Candida albicans DSM - 9456 en agar extracto de malta de Oxoid en 40 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 4 a 7 días a una temperatura de entre 28°C y 37°C, tal como se indica en el documento n° EP 0564620. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 3% (p/v). Dicho tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80 °C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3.500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a un pH de 4,0 durante 2 horas a temperaturas de 4°C a 8°C, tras de lo cual, se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. La precipitación se llevó a cabo mediante adición de etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP. Finalmente, se levantó la fase sólida y se homogeneizó en el producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 6, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa:

La segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. La concentración de MSAP se ajustó a 400 pg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de alergias.

Ejemplo 42

Primera etapa: se cultivó la especie Candida albicans DSM - 9456 en agar extracto de malta de Oxoid en 50 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 4 a 7 días a una temperatura de entre 28°C y 37°C, tal como se indica en el documento n° EP 0564620. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 3% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80°C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a un pH de 4,0 durante 2 horas a temperaturas de 4°C a 8°C. Después de lo anterior, se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. La precipitación se llevó a cabo mediante la adición de etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP.

Finalmente, se levantó la fase sólida y se homogeneizó en el producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 8, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. La concentración de MSAP se ajustó a 200 pg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de alergias.

Ejemplo 43

Primera etapa: se cultivó la especie Candida albicans DSM - 9456 en agar extracto de malta de Oxoid en 50 matraces tipo Roux. El cultivo se llevó a cabo durante 4 a 7 días a una temperatura de entre 28°C y 37°C, tal como se indica en el documento n° EP 0564620. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 3% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80°C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3.500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a pH 4,0 durante 2 horas a temperaturas de entre 4°C y 8°C. Seguidamente, se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. La precipitación se llevó a cabo mediante adición de etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP.

Finalmente, se levantó la fase sólida y se homogeneizó en el producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 9, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para la inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. La concentración de MSAP se ajustó a 100 pg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de alergias.

Ejemplo 44

La fracción que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento consiste en material insoluble antigénico que comprende polisacárido y/o glucopéptidos (MIAP) de acuerdo con el documento n° PCT/EP96/03535. Se cultivó la especie Candida albicans DSM - 9456 en agar extracto de malta de Oxoid en 50 matraces tipo Roux. El cultivo se llevó a cabo durante 4 a 7 días a una temperatura de entre 28°C y 37°C, tal como se indica en el documento n° EP 0564620. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de álcali a una concentración de 4% (p/v) de NaOH. El tratamiento se llevó a cabo a 80°C durante hasta 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación con fuerzas de aproximadamente 3.500 g. Tras el tratamiento alcalino, se trató la fase sólida con una solución al 50% de ácido acético. Después del tratamiento ácido, se lavó la fase sólida con agua destilada cinco veces. Finalmente, se levantó la fase sólida y se homogeneizó en el producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 6, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 25 litros mediante adición de agua estéril para la inyección bajo agitación. A continuación, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 30 litros. Se ajustó la concentración de partículas a 30 a 90 millones por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

Ejemplo 45

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton verrucosum DSM - 28406, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 15 a 30 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Las masas fúngicas del dermatofito se levantaron y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, de 100 a 500 ml) del producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 6, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 10 litros mediante adición de agua estéril para la inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de una solución de clorocresol que contenía 30 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 15 litros. El producto estéril resultante se añadió a la suspensión fúngica, obteniendo una concentración de 45 a 60 millones de microconidios por ml de cada homogeneizado. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular, de tal forma que la suspensión celular contenía finalmente 0,2% (v/v) de formaldehído. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la tricofitosis en vacas.

Ejemplo 46

Se añadió una solución de material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificada con ácido paraaminobenzoico al 0,2% a la vacuna Polivac-TM contra la dermatofitosis en animales (fabricante: “Vetbiochim” LLC, Moscú; Distribuidor: “Prostore” LLC, Moscú) hasta alcanzar una concentración final de 0,3% (p/v). El pH de la solución era de aproximadamente 5,6. La concentración de microconidios se ajustó a 40 millones por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse para la profilaxis y el tratamiento de la dermatofitosis en animales.

Ejemplo 47

Se cultivó Candida albicans DSM - 9456 en placas de agar tal como se describe en el documento n° EP 0564620. Un medio preferido es, por ejemplo, agar extracto de malta de Oxoid. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 3% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80°C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3.500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a pH 4,0 durante 2 horas a una temperatura de entre 4°C y 8°C. Seguidamente, se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP.

Se añadió una solución de material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificada con ácido paraaminobenzoico al 0,5% a la vacuna Polivac-TM contra la dermatofitosis en animales (fabricante: “Vetbiochim” LLC, Moscú; Distribuidor: “Prostore” LLC, Moscú) hasta alcanzar una concentración final de 0,3% (p/v). El pH de la solución era de aproximadamente 5,8. La concentración de microconidios se ajustó a 40 millones por ml. Finalmente, se mezcló la fase sólida de MSAP con la vacuna Polivac-TM modificada. La concentración de MSAP se ajustó a 400 pg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatofitosis en animales.

Ejemplo 48

Se usó Keratinase Pure 70 producida por PROTEOS Biotech, calle Almansa 14, 02006 Albacete, España, para preparar una solución que contenía 2 U/ml. Se cultivó Candida albicans DSM - 9456 en placas de agar tal como se describe en el documento n° EP 0564620. Un medio preferido fue, por ejemplo, agar extracto de malta de Oxoid. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH a una concentración de 3% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80°C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a pH 4,0 durante 2 horas a temperaturas de entre 4°C y 8°C. Seguidamente, se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP.

La solución de Keratinase Pure 70 se mezcló en una solución acuosa (por ejemplo 100 a 500 ml) de solución al 0,3% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificado con ácido paraaminobenzoico preparado de acuerdo con el ejemplo 8 (primera etapa). Se ajustó la concentración de Keratinase Pure 70 a 1-1,2 U por ml. Se añadió formol hasta alcanzar 0,2% (v/v) en la suspensión final. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C. Finalmente, se levantó la fase sólida de MSAP y se homogeneizó en una suspensión acuosa de polisacárido lineal modificado de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina. La concentración de MSAP se ajustó a 200 |jg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatofitosis en animales.

Ejemplo 49

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Microsporum canis BINO 483, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux durante 21 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. La suspensión de los microconidios se cultivó en medio con queratina y se obtuvieron exoantígenos de dermatofitos de acuerdo con la patente RF n.° 2219945, tal como se indica a continuación. Se cultivó la suspensión obtenida con una concentración de microconidios de 40x106 a 50x106 durante 7 días bajo agitación a una temperatura de 29°C. Después, se añadió formol hasta obtener una concentración final de 0,4%. Se separó la fase líquida mediante tres etapas de filtración - a través de una rejilla metálica con una celda de 200 jm a 300 jm , después a través de papel de filtro Whatman del n.° 4 (poro: 20 jm a 25 jm ) y al final, a través de un filtro de nilón para esterilización con un poro de 0,22 jm , pero en el procedimiento de conservación con formol, se observó una actividad antigénica aumentada de las fracciones obtenidas (MEAP). Se levantaron los MEAP de exoantígenos de dermatofitos y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, 100 a 500 ml) de solución al 0,2% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina modificado con ácido paraaminobenzoico de acuerdo con el ejemplo 8. Se ajustó la concentración de MEAP a 1-1,2 U por ml. Se añadió formol hasta alcanzar un 0,2% (v/v) en la suspensión final. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatofitosis en animales.

Ejemplo 50

Se cultivó en agar/mosto un cultivo fúngico de la especie Chrisporium tropicum DSM-28405, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux durante 21 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Posteriormente, se cultivó la suspensión obtenida de microconidios en medio con queratina y exoantígenos preparados de acuerdo con la patente RF n.° 2219945, tal como se indica continuación: Se cultivó la suspensión obtenida con una concentración de microconidios de 50x106 a 60x106 durante 7 días bajo agitación a una temperatura de 30°C. Después, se añadió formol a una concentración final del 0,4%. Se separó la fase líquida mediante tres etapas de filtración - a través de una rejilla metálica con una celda de 200 jm a 300 jm , después a través de papel de filtro Whatman del n.° 4 (poro: 20 jm a 25 jm ) y al final, a través de un filtro de nilón para esterilización con un poro de 0,22 jm , pero en el procedimiento de conservación con formol, se observó una actividad antigénica aumentada de las fracciones de exoantígenos (MEAP). Se levantaron los exoantígenos solubles de MEAP de hongos y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, 100 a 500 ml) de solución al 0,2% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificado con ácido paraaminobenzoico de acuerdo con el ejemplo 8. Se ajustó la concentración de MEAP a 1-1,2 U por ml. Se añadió formol hasta alcanzar un 0,2% (v/v) en la suspensión final. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para el tratamiento de la dermatofitosis y enfermedades alérgicas en animales.

Ejemplo 51

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton verrucosum DSM - 28406, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 15 a 30 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Se levantaron las masas fúngicas de los dermatofitos y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, 100 a 500 ml) de solución al 0,2% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificado con cloruro de ácido valérico de acuerdo con el ejemplo 6. Se ajustó la concentración de microconidios a 250-300 miles por ml. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular hasta alcanzar finalmente 0,2% (v/v). La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

E je m p lo 52

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton mentagrophytes DSM -7279, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 15 a 30 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Se levantaron las masas fúngicas de los dermatofitos y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, 100 a 500 ml) de solución al 0,2% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetiM,4-p-D-glucopiranosamina modificado con ácido paraaminobenzoico de acuerdo con el ejemplo 8. Se ajustó la concentración de microconidios a 250-300 miles por ml. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído hasta alcanzar una concentración final de 0,2% (v/v) directamente a la suspensión celular. La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C. La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

Ejemplo 53

Se cultivó en agar/mosto un cultivo de dermatofitos de la especie Trichophyton verrucosum DSM - 28406, por ejemplo, en 3 a 10 matraces tipo Roux. El cultivo se cultivó durante 15 a 30 días a una temperatura de entre 26°C y 28°C. Se levantaron las masas fúngicas de los dermatofitos y se homogeneizaron en una solución acuosa (por ejemplo, 100 a 500 ml) de solución al 0,2% del material biológico que contenía en su estructura un polisacárido lineal de N-acetil-1,4-p-D-glucopiranosamina modificado con ácido glucurónico de acuerdo con el ejemplo 9. Se ajustó la concentración de microconidios a 250-300 miles por ml. Los homogeneizados se inactivaron mediante adición de formaldehído directamente a la suspensión celular hasta alcanzar al final0,1% (v/v). La mezcla se incubó durante 5 a 7 días a 37°C.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de la dermatitis interdigital y/o digital y/o el flemón interdigital en animales.

Ejemplo 54

La primera etapa. Como materia prima, se usó quitosano con una desacetilación de 67% a 72%, una viscosidad de 151 a 350 mPa y un peso molecular de 150 a 300 kDa. Se esterilizaron 40 gramos de polisacárido mediante autoclavado y se añadieron a 3,9 litros de ácido paraaminobenzoico al 0,2% en agua para inyección bajo agitación. Para obtener la solución en gel, se añadió solución de ácido clorhídrico 4 N bajo agitación hasta obtener un pH de 5,6. El volumen final se ajustó con agua para inyección hasta 4 litros. Se sometió a agitación el polisacárido suspendido en un recipiente estéril durante 72 horas hasta obtener una suspensión en gel. Las partículas no disueltas se eliminaron mediante filtración a través de una rejilla metálica con una celda de 200 pm a 300 pm. Se cultivó Candida albicans DSM - 9456 en placas de agar tal como se describe en el documento n° EP 0564620. Un medio preferido fue, por ejemplo, agar extracto de malta de Oxoid. La biomasa fúngica resultante se levantó y se trató con una solución acuosa de NaOH con una concentración de 3% (p/v). El tratamiento alcalino se llevó a cabo a 80°C durante 6 h. Después del procesamiento bajo condiciones acuosas alcalinas, se separaron las fases sólida y líquida de la preparación mediante centrifugación a 3.500 g. Tras el tratamiento alcalino, el sobrenadante resultante se trató bajo condiciones ácidas acuosas, por ejemplo, ácido acético al 50% a pH 4,0 durante 2 horas a una temperatura de 4°C a 8°C; seguidamente se produjo la separación de las capas sólida y líquida. A continuación, el sobrenadante de la etapa de separación se sometió a una etapa de precipitación. La precipitación se llevó a cabo mediante adición de etanol. Una relación de un volumen de sobrenadante por cada 3 volúmenes de alcohol produjo una buena precipitación del material antigénico. Finalmente, se liofilizó la preparación de MSAP. Se levantó la fase sólida y se homogeneizó en el producto obtenido de acuerdo con el ejemplo 6, aunque con la siguiente diferencia en la segunda etapa: la segunda etapa. Para obtener el producto final, se ajustaron 0,3 litros del polisacárido modificado a un volumen de 2,5 litros mediante adición de agua estéril para inyección bajo agitación. Después, se añadieron a la mezcla 500 ml de solución de timerosal que contenía 0,24 gramos del principio activo. La suspensión resultante se ajustó a un volumen de 6 litros. La concentración de MSAP se ajustó a 100 pg por ml.

La vacuna que puede prepararse de acuerdo con este procedimiento puede usarse, por ejemplo, para la profilaxis y el tratamiento de alergias.

Ejemplo 55

Se llevó a cabo un análisis para la presencia de glucanos.

Descripción de la prueba

Los análisis de 1,3-p-D (Cape Cod, EE. UU.). La prueba se llevó a cabo tal como se indica en las instrucciones del fabricante. Se determinó el contenido de glucano en las muestras de antígeno mediante la utilización del ensayo comercializado bajo la marca CE Fungitell® para suero. En resumen, la prueba es un ensayo colorimétrico a base de cimógeno de proteasa y hace uso de una modificación de la vía del lisado de amebocitos de Limulus (LAL). El reactivo Fungitell se modifica para eliminar el factor C y, por lo tanto, para que reaccione únicamente con 1,3-p-D-glucano. Las muestras desconocidas se mezclaron con el reactivo de ensayo y se calculó la velocidad media de cambio de la densidad óptica para todos los puntos de datos a lo largo de un intervalo de 40 min. Mediante comparación con una curva patrón generada en paralelo, puede calcularse la cantidad de 1,3-p-D-glucano en las muestras.

Se prepararon soluciones de ensayo de los antígenos n.° 1-13 en ddhhO estéril y, posteriormente, se prepararon diluciones adicionales en agua despirogenada de grado de reactivo de LAL. Basándose en los resultados de las pruebas de endotoxinas, se midió la máxima dilución con coagulación detectable del gel y una dilución superior y una inferior en el ensayo Fungitell. Cada muestra se midió por duplicado en un intervalo de 20 s durante un total de 40 min. Resultados del ensayo

Para la generación de la curva patrón, se prepararon soluciones de 1,3-p-D-glucano de 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml y 6,25 pg/ml según las recomendaciones del fabricante (Fig. 1). La curva representada era lineal a lo largo de todo el intervalo y cumplía con los criterios de aceptación de control de calidad (R2 > 0,980). La curva patrón se muestra en la figura 1.

Tabla 1. Basándose en la curva mostrada anteriormente, se detectaron los siguientes contenidos de 1,3-p-D-glucano en las soluciones de las muestras analizadas:

mg > pg > ng > pg

Ejemplo 56

Se llevó a cabo un análisis para la presencia de endotoxinas.

Se determinó el contenido de endotoxinas en las muestras de antígeno mediante la utilización del procedimiento de coagulación de gel, según el documento EP 2.6.14.

Se prepararon soluciones de ensayo de los antígenos n.° 1-7 en H²O estéril y, posteriormente, se prepararon diluciones de 1:10 a 1:10.000.000 en agua despirogenada de grado de reactivo de LAL. Las diluciones se midieron por duplicado y se calculó la concentración de endotoxina usando la fórmula a continuación:

Concentración de endotoxina = 0,06 Ul/ml x factor de dilución con por lo menos una formación de coágulo de gel. El ensayo semicuantitativo tiene una sensibilidad de LAL de 0,06 Ul/ml. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Resultados del ensayo

Tabla 2

Tabla 2 (continuación)

Ejemplo 57

Se llevó a cabo un análisis de la actividad antimicrobiana.

Descripción de la prueba

Se analizó la actividad antimicrobiana de los compuestos mediante la “prueba de eficacia de conservación antimicrobiana” de acuerdo con el siguiente procedimiento. Para el recuento de los microorganismos viables en los productos inoculados, se usó el medio de agar usado para el cultivo inicial de los microorganismos respectivos. Se inoculó una serie de recipientes del producto que se iba a examinar, cada uno con una suspensión de los organismos de ensayo para proporcionar un inóculo de 105 a 106 microorganismos por mililitro o por gramo de la preparación. El volumen de la suspensión de inóculo no superó el 1 por ciento del volumen del producto. Para asegurar una distribución homogénea, se mezcló exhaustivamente. El producto inoculado se mantuvo a una temperatura de entre 20°C y 25°C, protegido de la luz. Se extrajo de cada recipiente una muestra adecuada, normalmente de 1 ml o 1 g a las cero horas y a intervalos adecuados según el tipo de producto y se determinó el número de microorganismos viables mediante recuento de la placa o filtración con membrana (2.6.12). Se aseguró la eliminación de cualquier actividad antimicrobiana residual del producto mediante dilución, filtración o mediante el uso de un inactivador específico. En el caso de que se utilizasen procedimientos de dilución, se tuvo en cuenta la sensibilidad reducida que se da en la recuperación de números bajos de microorganismos viables. En el caso de que se utilizase un inactivador específico, se confirmó la capacidad del sistema para soportar el crecimiento de los organismos de ensayo mediante el uso de controles adecuados. El procedimiento se validó para verificar su capacidad para demostrar la reducción necesaria en el recuento de microorganismos viables.

En resumen, se inocularon 4 x 10 ml de solución de ensayo (preparada con ddhhO) cada uno con 0,1 ml (al 1% v/v) de los microorganismos de ensayo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans y Aspergillus brasiliensis. Se recogieron muestras a las 6 hdi (horas después de la inoculación), 24 hdi, a los 7 ddi (días después de la inoculación) y 14 ddi y se determinaron los números de microorganismos viables mediante la siembra de una dilución en serie en placas de agar. Se comprobó la eliminación de la supuesta actividad antimicrobiana residual de los compuestos de ensayo mediante dilución antes de llevar a cabo el ensayo.

Tabla 3

Tabla 3 (continuación)

P. a., Pseudomonas aeruginosa; S. a., Staphylococcus aureus; C. a., Candida albicans; A. b., Aspergillus brasiliensis; los factores de reducción con relación a 0 hdi se indican entre paréntesis.

Ejemplo 58

Se trataron vacas con mastitis latente (subclínica). El diagnóstico se llevó a cabo mediante un procedimiento convencional con solución de mastidina al 2%. Se dividió a los animales en 13 grupos con 6 animales en cada grupo. Se trató a todos los grupos de vacas con 10 ml de la preparación por vía intracisternal dos veces en un intervalo de 24 horas. Se volvió a evaluar a todos los animales con una solución al 2% de mastidina mediante el procedimiento convencional el día 7 y el día 14.

Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Ejemplo 59

Se trataron vacas con mastitis latente (subclínica). El diagnóstico se llevó a cabo mediante un procedimiento convencional con solución de mastidina al 2%. Se dividió a los animales en 14 grupos con 10 animales en cada grupo. Se trató a todos los grupos de vacas con 10 ml de la preparación por vía intracisternal tres veces en un intervalo de 24 horas. Se evaluó nuevamente a todos los animales con una solución al 2% de mastidina mediante el procedimiento convencional en el día 5.

Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Ejemplo 60

Se trató a vacas con mastitis latente (subclínica) y clínica y con endometritis purulenta-catarral. El diagnóstico se efectuó mediante un procedimiento habitual con solución al 5% de dimastina para la mastitis y por síntomas clínicos para la endometritis. Se administró a todas las vacas 10 ml de la preparación fabricada de acuerdo con el ejemplo 13 por vía intracisternal o intrauterina dos veces o tres veces con un intervalo de 24 horas. Se volvió a evaluar a todos los animales con una solución al 5% de dimastina mediante el procedimiento convencional y observación clínica en el día 7.

Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Ejemplo 61

Se trató a vacas con mastitis latente (subclínica). El diagnóstico se efectuó mediante un procedimiento habitual con solución al 5% de dimastina para la mastitis y por síntomas clínicos para la endometritis. Se administró a todas las vacas 10 ml de la preparación fabricada de acuerdo con el ejemplo 26 por vía intracisternal o intrauterina dos veces o tres veces con un intervalo de 24 horas. Se volvió a evaluar a todos los animales con una solución al 5% de dimastina mediante el procedimiento convencional y observación clínica el día 7.

Los resultados se muestran en la Tabla 7.

Por lo tanto, la preparación inmunobiológica obtenida posibilita el tratamiento de la mastitis de las vacas, que puede usarse ampliamente para controlar esta enfermedad tan extendida.

Ejemplo 62

Se trató a vacas con mastitis latente (subclínica). El diagnóstico se efectuó mediante un procedimiento habitual con solución al 5% de dimastina para la mastitis y por síntomas clínicos para la endometritis. Se administró a todas las vacas 10 ml de la preparación fabricada de acuerdo con el ejemplo 26 por vía intracisternal o intrauterina dos veces o tres veces con un intervalo de 24 horas. Se volvió a evaluar a todos los animales con una solución al 5% de dimastina mediante el procedimiento convencional y observación clínica en el día 7. Se recuperó un 59% de los animales tras el tratamiento.

Los resultados se muestran en la Tabla 8.

Ejemplo 63

Se trataron vacas con evidencia clínica de cojera y lesiones del espacio interdigital, que son típicas de DD, DI y FI, con diversos fármacos. Aplicación terapéutica de la vacuna: 3 veces en un intervalo de 7 días con una dosis de 5 ml. La vacuna se preparó de acuerdo con los ejemplos 45, 40 y 6.

Manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 9.

(continuación)

No se observaron reacciones comunes y locales tras la aplicación. La eficacia de la vacunación fue de aproximadamente el 100%.

Ejemplo 64

Se trataron vacas con evidencia clínica de cojera y lesiones del espacio interdigital, que son típicas de DD, DI y FI, con diversos fármacos. Aplicación terapéutica de la vacuna: 3 veces con un intervalo de 10 días de vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 45.

Manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++ lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 10.

No se observaron reacciones comunes y locales tras la aplicación. La eficacia de la vacunación fue de aproximadamente el 80% a 100% tras la aplicación de la vacuna a una dosis de 5 ml.

Ejemplo 65

Se trataron vacas con evidencia clínica de cojera y lesiones del espacio interdigital, que son típicas de DD, DI y FI, con diversos fármacos. Aplicación terapéutica de la vacuna: 3 veces con un intervalo de 10 días de vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 45.

Manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++ lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 11.

No se observaron reacciones comunes y locales tras la aplicación. La eficacia de la vacunación fue de aproximadamente el 60% a 63% tras la aplicación de la vacuna a una dosis de 5 ml.

Ejemplo 66

Se trataron vacas con evidencia clínica de cojera y lesiones del espacio interdigital, que son típicas de DD, DI y FI, con diversos fármacos. Aplicación terapéutica de la vacuna: 3 veces en un intervalo de 7 días a una dosis de 5 ml. La vacuna se preparó de acuerdo con los ejemplos 38, 39, 40 y 44.

Manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 12.

No se observaron reacciones comunes y locales tras la aplicación. La eficacia de la vacunación fue de aproximadamente el 60% al 70% en todos los grupos vacunados.

Ejemplo 67

Se trataron vacas con evidencia clínica de cojera y lesiones del espacio interdigital, que son típicas de DD, DI y FI, con diversos fármacos. Aplicación terapéutica de la vacuna: 3 veces, 0,4 ml intracutánea en un intervalo de 7 días. La vacuna se preparó de acuerdo con los ejemplos 51 y 52.

Manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 13.

No se observaron reacciones comunes y locales tras la aplicación. La eficacia de la vacunación fue de aproximadamente el 60% al 70% en todos los grupos vacunados.

Ejemplo 68

Estudio de ajuste de la dosis. Se llevó a cabo la vacunación de vacas contra DD, DI y FI. Aplicación profiláctica de la vacuna: 2 veces en un intervalo de 10 días de vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 6.

Se investigó la manifestación clínica de la enfermedad:

Recuperación, o gris, sin dolor

+ en curación, <2 cm, amarillo, ligero dolor

++ lesiones > 2 cm, amarillo, dolor moderado

+++ enfermedad aguda > 2 cm, rojo, dolor significativo

Los resultados se muestran en la Tabla 14.

No se observaron reacciones comunes ni locales después de la aplicación de la vacuna. La eficacia de la vacunación a dosis de 1 ml y 2,5 ml en este tiempo fue de aproximadamente 93%. 45 animales (aproximadamente un 21%) del grupo de control tuvieron síntomas clínicos de DD, DI y FI.

Los resultados se muestran en la Tabla 15.

La eficacia de la vacunación con dosis de 1 ml y 2,5 ml en este tiempo fue de aproximadamente el 87%-89%. 59 animales (aproximadamente un 27%) del grupo de control tuvieron síntomas clínicos de DD, DI y FI.

Los resultados se muestran en la Tabla 16.

La eficacia de la vacunación a dosis de 1 ml fue de aproximadamente 70% y a 2,5 ml fue de aproximadamente 53%.

154 animales (aproximadamente un 72%) del grupo de control presentaron síntomas clínicos de DD, DI y FI.

Esta investigación demuestra la vacunación profiláctica de animales a una dosis de 1,0 ml. La duración de la inmunidad fue de aproximadamente 5,5 meses.

Ejemplo 69

Se llevó a cabo la vacunación de vacas contra DD, DI y FI. Aplicación profiláctica de la vacuna: 3 veces intracutánea con una dosis de 0,4 ml con un intervalo de 10 días de vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 51.

Sumario de la investigación:

Se vacunó a los animales del grupo 1

Observación antes de la vacunación

Número de animales/manifestaciones clínicas de DD, DI y FI 200/100

160 a 175 días después de la última vacunación

Número de animales/cantidad de extremidades con cojera 200/20 Número de animales sanos 180 Eficacia de la vacunación 90%

No se vacunó a los animales en el grupo 2 (control)

Observación antes de la vacunación

Número de animales/manifestaciones clínicas de DD, DI y FI 200/100

160 a 175 días después de la última aplicación de placebo

Número de animales/Número de animales con manifestaciones de

Síntomas clínicos de DD, DI y FI 200/132 Número de animales sanos 68 Número de animales enfermos durante el periodo de observación 66% Todos los animales con síntomas clínicos de enfermedades se trataron mediante aplicación local de medicinas asépticas o antibióticos. En caso de FI, se usó la inyección intramuscular de antibióticos.

Ejemplo 70

Se llevó a cabo la vacunación de vacas contra DD, DI y FI. Aplicación profiláctica de la vacuna: 3 veces intracutánea con una dosis de 0,4 ml con un intervalo de 10 días de vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 52.

Sumario de la investigación:

Se vacunó a los animales del grupo 1

Observación antes de la vacunación

Número de animales/manifestaciones clínicas de DD, DI y FI 150/80

160 a 190 días después de la última vacunación

Número de animales/cantidad de extremidades con cojera 150/15 Número de animales sanos 135 Eficacia de la vacunación 90%

No se vacunó a los animales en el grupo 2 (control)

Observación antes de la vacunación

Número de animales/manifestaciones clínicas de DD, DI y FI 150/70

160 a 175 días después de la última aplicación de placebo

Número de animales/Número de animales con manifestaciones de

Síntomas clínicos de DD, DI y FI 150/118 Número de animales sanos 32 Número de animales enfermos durante el periodo de observación 78,7% Todos los animales con síntomas clínicos de enfermedades se trataron con la aplicación local de medicinas asépticas o antibióticos. En caso de FI, se usó la inyección intramuscular de antibióticos.

Ejemplo 71

Eficacia de la vacunación tras la exposición a Trichophyton y Microsporum en cobayas (este procedimiento se describió en el documento WO 98/15284).

La exposición a microconidios de Trichophyton mentagrophytes y Microsporum canis consistió en 100-200 miles de microconidios por cm2 (300-600 miles de microconidios) aplicados por vía tópica en cada animal. La exposición a microconidios de Trichophyton verrucosum consistió en 500 miles de microconidios por cm2 (1,5 millones de microconidios) aplicados por vía tópica en cada animal. Se aplicó una sola dosis de 1,0 ml de la vacuna mediante inyección intramuscular el mismo día de la exposición y una segunda dosis después de 7 días. Se continuó con la observación durante 4 semanas tras la inyección inicial de la vacuna. Se sometieron a ensayo vacunas preparadas de acuerdo con los ejemplos 38, 39, 46, 47, 48, 49, 50 (véanse las Tablas 17 a 30).

Se aplicó una sola dosis de 1,0 ml de la vacuna mediante inyección intramuscular el mismo día de la exposición y una segunda dosis después de 7 días. Se continuó con la observación durante 4 semanas tras la inyección inicial de la vacuna.

Suspensión de células de la cepa de exposición

Para la infección de los animales, se usaron como patógenos fúngicos Trichophyton verrucosum (Tv) Trichophyton mentagrophytes (Tm), y Microsporum canis (Mc). A continuación, se muestran datos acerca de estas cepas:

1. Especie: Trichophyton verrucosum

Número de cepa: 1220

Volumen: 0,5 ml

Dosis infecciosa (1.000 células): 500-600/cm2

Superficie de la piel para infección: 2-4 cm

2. Especie: Trichophyton mentagrophytes

Número de cepa: 1440

Volumen: 0,5 ml

Dosis infecciosa (1.000 células): 100-200/cm2

Superficie de la piel para infección: 2-4 cm2

3. Especie: Microsporum canis

Número de cepa: 724

Volumen: 0,5 ml

Dosis infecciosa (1.000 células): 100-200/cm2

Superficie de la piel para infección: 2-4 cm2

Evaluación de la infección fúngica

En el 7o, 15o, 22o, 29o y 36o día del estudio, se observó a los animales y se evaluó cualquier síntoma clínico basándose en el siguiente sistema de puntuación:

0 = sin síntomas

1 = hiperemia de la piel en el área de infección fúngica

2 = puntos de descamación individuales

3 = descamación de la piel en el área de infección fúngica

4 = costras pequeñas y finas en el área de infección fúngica

5 = costras en el área de infección fúngica

ESQUEMA DE TRATAMIENTO 1

ESQUEMA DE TRATAMIENTO 2

ESQUEMA DE TRATAMIENTO 3

Tabla 17. Síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton verrucosum en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Trichophyton verrucosum en cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves los días 29 y 36.

Tabla 18. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton verrucosum

(Nota: número de animales con síntomas clínicos/número de expuestos)

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos en los días 29 y 36.

Tabla 19. Síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton mentagrophytes en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Trichophyton mentagrophytes en las cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves los días 29 y 36.

Tabla 20. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton mentagrophytes

(Nota: número de animales con síntomas clínicos/número de expuestos)

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos los días 29 y 36.

Tabla 21. Síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Microsporum canis en las cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves el día 36.

Tabla 22. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos el día 36.

Tabla 23. Síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Microsporum canis en cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves los días 29 y 36.

Tabla 24. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos en los días 29 y 36.

Tabla 25. Síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton verrucosum en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Trichophyton verrucosum en cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves en el día 29 y 36.

Tabla 26. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton verrucosum

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos los días 29 y 36.

Tabla 27. Síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton mentagrophytes en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Trichophyton mentagrophytes en cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves los días 29 y 36.

Tabla 28. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Trichophyton mentagrophytes

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos los días 29 y 36.

Tabla 29. Síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis en cobayas

Se muestra la gravedad de los síntomas clínicos de infección por Microsporum canis en cobayas expuestas tras diferentes periodos de observación. En comparación con los animales vacunados, los controles no vacunados presentaban síntomas clínicos más graves los días 29 y 36.

Tabla 30. Número de cobayas con síntomas clínicos de enfermedad por Microsporum canis

En comparación con el grupo de control, los animales menos vacunados presentaban síntomas clínicos los días 29 y 36.

Ejemplo 72

Eficacia del tratamiento de enfermedades alérgicas

Tabla 31. La dinámica de la intensidad de los síntomas clínicos de bronquitis alérgica en caballos tras la aplicación de la vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 41 (grupo experimental) y sin vacunación (grupo de control). La vacuna se inyectó por vía intramuscular 3 veces en un intervalo de 4 días a una dosis de 1,0 ml.

Tabla 31 (continuación)

En la figura 2 se muestra la dinámica de la intensidad de los síntomas clínicos de bronquitis alérgica en caballos. Tabla 32. La dinámica de la intensidad de los síntomas clínicos de enfermedad pulmonar obstructiva crónica en caballos tras la aplicación de la vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 41_(grupo experimental) y sin vacunación (grupo de control). La vacuna se inyectó por vía intramuscular 3 veces en un intervalo de 4 días a una dosis de 1,0 ml. Los resultados también se muestran en la figura 3.

Tabla 33. Dinámica de los signos clínicos de enfermedades cutáneas en perros inmunizados con la vacuna de acuerdo con el ejemplo 42 a dosis de 0,5 ml y 1,0 ml (se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; n=10). La vacuna se inyectó por vía intramuscular 3 veces en un intervalo de 7 días a una dosis de 1,0 ml. Las dinámicas también se muestran en la figura 4.

Tabla 33 (continuación)

Tabla 34. Dinámica de los signos clínicos de enfermedades cutáneas en perros inmunizados con la vacuna de acuerdo con el ejemplo 50 intramuscular a una dosis de 0,5 ml (se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; en vacunados n=15 y en el grupo de control n=15). La vacuna se inyectó 3 veces en un intervalo de 3 a 4 días. Los resultados también se muestran en la figura 5.

Tabla 35. Prueba de inflamación en oreja de ratón.

Tabla 36. Actividad antialérgica de la vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 41.

El eritema en la oreja se determinó mediante inspección visual y detección de la presencia (+) o ausencia (-) de signos.

Con un micrómetro, se midió el grosor de la oreja de control y oreja experimental en todos los animales. Se sumaron ( !) las mediciones realizadas por separado de las orejas derecha e izquierda en grupos. Se calculó el porcentaje de inflamación de oreja y las series de actividad mediante la utilización de las fórmulas siguientes:

1. % de inflamación 7 Grosor de la oreja tras la exposición a alérgeno_____

de la oreja = ⁷ Grosor de la oreja tras la exposición a solvente x 100

(grupo de control)

2. % de inflamación 7 Grosor de la oreja tras la exposición a alérgeno_____

de la oreja = ⁷ Grosor de la oreja tras la exposición a solvente x 100 (vacunados)

3. % de actividad de la = % de inflamación de la oreja en el grupo de control -% de vacuna inflamación de la oreja en los vacunados

En todas las etapas del experimento, se observó la dinámica positiva de reducción de la respuesta inflamatoria tras la vacunación y el uso de prednisolona-21-acetilo en los ratones expuestos. La mayor expresión de inhibición de la reacción inflamatoria fue 24 horas después de la provocación. Cabe destacar que se produjo una reacción de eritema tras la inyección en los vasos de la oreja derecha (sitio de provocación con alérgeno) en todos los animales de control. En los animales vacunados, no se expresó una reacción alérgica de tipo inmediato. No se observó un eritema intenso de la oreja tras la aplicación del alérgeno. La intensidad del edema auricular fue significativamente mayor en los animales de control que en los ratones vacunados y superior al umbral del 10%. Además, cabe destacar que se produjo una mayor inhibición de la provocación en los animales vacunados que en los tratados con prednisolona-21-acetato. El número de animales sin reacción en los grupos de control y de ensayo osciló entre 56% y 80%, lo que está permitido por el método.

Tabla 37. Prueba de inflamación en oreja de ratón.

Tabla 38. Actividad antialérgica de la vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 41.

Cabe destacar que a pesar de la pequeña diferencia en el grosor de la oreja de los ratones de control y vacunados a una dosis de 0,1 ml y 0,5 ml 2 horas después de la exposición, todos los animales de control mostraron eritema en los vasos de inyección en la oreja derecha (sitio de provocación con alérgeno). En los animales vacunados, no se expresó una reacción alérgica de tipo inmediato.

Se observó reacción alérgica a las 24 y 48 horas a consecuencia de la provocación en los de control y vacunados con una dosis de 0,1 ml de vacuna diluida y vacuna no diluida con una dosis de 1,0 ml. La reacción tras la provocación de la reacción alérgica en ratones vacunados con una dosis de 0,1 ml y 0,5 ml estaba ausente o se expresaba débilmente. La intensidad del edema auricular fue significativamente mayor en los animales de control y en los grupos vacunados con vacuna diluida y vacuna en una dosis de 1,0 ml que en otros vacunados. El número de animales sin reacción en los grupos de control y de ensayo osciló entre 65% y 81%, lo que está permitido por el procedimiento.

Tabla 39. Dinámica de los signos clínicos en perros inmunizados por vía intramuscular con vacuna de acuerdo con los ejemplos 41 y 43 en una dosis de 0,5 ml (se muestra la puntuación media de los síntomas clínicos en cada grupo; n=10). La vacuna se inyectó 3 veces en un intervalo de 7 días.

Tabla 40. Dinámica de los signos clínicos de rinitis en gatos tratados con la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 42. Se trató a los animales por instilación de la vacuna en la nariz durante cinco días a una dosis de 1 a 2 gotas en cada conducto nasal 1 a 2 veces al día; los demás animales del grupo de control se trataron del mismo modo, aunque con solución fisiológica de cloruro de sodio (placebo). Se examinó a los animales con una descripción de las manifestaciones clínicas de la enfermedad antes del tratamiento los días 5, 10, 20 y 30 después de la primera aplicación. En caso de agravamiento de la rinitis alérgica, se llevó a cabo el segundo ciclo de tratamiento durante cinco días. Los resultados también se muestran en la figura 7.

Tabla 41. Dinámica de los signos clínicos de rinitis en perros tratados con la composición preparada de acuerdo con el ejemplo 43. Se trató a los animales por instilación de la vacuna en la nariz durante cinco días a una dosis de 1 a 2 gotas en cada conducto nasal 1 a 2 veces al día, los otros animales del grupo de control se trataron del mismo modo, aunque con solución fisiológica de cloruro de sodio (placebo). Se examinó a los animales con una descripción de las manifestaciones clínicas de la enfermedad antes del tratamiento los días 5, 10, 20 y 30 después de la primera aplicación. En caso de agravamiento de la rinitis alérgica, se llevó a cabo el segundo ciclo de tratamiento durante cinco días. Los resultados también se muestran en la figura 8.

Tabla 42. Dinámica de los signos clínicos de conjuntivitis en gatos tratados con vacuna preparada de acuerdo con el ejemplo 54. Se trató a diez gatos mediante instilación de la vacuna durante de tres a cinco días a una dosis de 1 a 2 gotas en cada ojo 2 a 3 veces al día. En ausencia de signos clínicos, se interrumpió el tratamiento. Los 5 animales restantes fueron tratados con una solución fisiológica de cloruro de sodio (placebo), así como los animales experimentales del grupo experimental. Se examinó a los animales con una descripción de las manifestaciones clínicas de la enfermedad antes del tratamiento y cada día durante el tratamiento. Después, se examinó a los animales el día 10. Los resultados también se muestran en la figura 9.

Tabla 42 (continuación)

Ejemplo 73. Eficacia del tratamiento de las verrugas comunes

Caso 1. Se demostró la eficacia de la vacuna preparada tal como se indica en el ejemplo 38 mediante la vacunación de una joven de 16 años con verrugas comunes (verrugas vulgares y verrugas paroniquiales). La vacuna se aplicó 5 veces en un intervalo de 24 horas por vía tópica con un emplasto y gotas bajo la uña afectada, dando como resultado una reducción significativa de la cantidad de verrugas tras la última aplicación y las verrugas desaparecieron aproximadamente dos semanas después del último tratamiento. No se observaron efectos secundarios graves.

Caso 2. Se demostró la eficacia de la vacuna preparada tal como se indica en el ejemplo 39 mediante la vacunación de una joven de 12 años con verrugas comunes (verrugas vulgares). La vacuna se aplicó 7 veces en un intervalo de 24 horas por vía tópica con un emplasto, dando como resultado una reducción significativa de la cantidad de verrugas tras la última aplicación y las verrugas desaparecieron aproximadamente dos semanas después del último tratamiento. No se observaron efectos secundarios graves.

Caso 3. Se demostró la eficacia de la vacuna preparada tal como se indica en el ejemplo 40 mediante la vacunación de un niño de 6 años con verrugas comunes (verrugas vulgares). La vacuna se aplicó 6 veces en un intervalo de 24 horas por vía tópica con un emplasto, dando como resultado una reducción significativa de la cantidad de verrugas tras la última aplicación y las verrugas desaparecieron aproximadamente dos semanas después del último tratamiento. No se observaron efectos secundarios graves.

Ejemplo 74. Hidrocoloides

Nomenclatura química: Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

Subtítulo: hidrocomplejo de poliaminoazúcar-ácido valérico

Fórmula estructural:

Propiedades generales

Peso molecular: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36,5)+m*(18)

Apariencia: líquido viscoso natural de color blanco a amarillento de olor típico

Solubilidad: soluble en: agua

Olor: típico, similar a ácido valérico

Densidad: 1,002

Valor de pH: 5,5

Almacenamiento: mantener protegido de la luz; conservar en un recipiente protegido del aire en un frigorífico a 4°C-8°C

Estabilidad: 36 meses en las condiciones descritas anteriormente

Nomenclatura química: hidrocoloide de quitosano-ácido 4-aminobenzoico

Subtítulo: hidrocomplejo de poliaminoazúcar-ácido p-aminobenzoico

Fórmula estructural:

Propiedades generales

Peso molecular: x*(161)+y*(203)+z*(137,14)+m*(18)

Apariencia: líquido viscoso de color amarillento a amarillo

Nomenclatura química: hidrocoloide de quitosano-ácido glucurónico

Subtítulo: hidrocomplejo de poliaminoazúcar-ácido glucurónico

Fórmula estructural:

Propiedades generales

Peso molecular: x*(161)+y*(203)+z*(194,14)+m*(18)

Apariencia: líquido viscoso de color amarillento a amarillo

Ejemplo 75. Fabricación de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

Purificación de quitosano 80/100 y 80/200, AS-n.°: 9012-76-4,

se esterilizó la amino-N-acetil-D-glucosamina en un recipiente separado y se procesó para obtener quitosano de calidad farmacéutica.

Solución de reactivo

Se resuspendió amino-N-acetil-D-glucosamina estéril bajo agitación durante 15 minutos en dicha agua estéril. Se añadieron 400 ml de ácido acético a la suspensión bajo agitación (24 h) hasta obtener una solución transparente. Etapa de purificación

A esta solución, se le añadió hidróxido sódico 4 N gota a gota (cuidadosamente) hasta obtener un pH de 8,0 a 8,5. La solución resultante precipitó hasta obtener una masa blanca. La suspensión obtenida se sometió a agitación durante no menos de 30 minutos. El resto se separó de la fase líquida mediante filtración.

Resuspensión

El precipitado se resuspendió en una cantidad igual de agua purificada (estéril) (agua para inyección [Pharm. Eur.]) (40 l, cantidad inicial). Se midieron 80 ml de cloruro de pentanoílo. Bajo condiciones de agitación, se añadió cloruro de pentanoílo gota a gota a la suspensión. La suspensión obtenida se sometió a agitación hasta clarificar la solución. Se añadieron 1,6 g de tiomersal (40 pg/ml). La solución transparente era el principio activo (hidrocoloide). El coloide de polisacárido obtenido (HCQV) se conservó a una temperatura de entre 4°C y 8°C. Para el producto final, se preparó una solución acuosa con actividad biológica definida.

Visión general de las etapas de reacción de la fabricación

1. Quitosano agua ^ Suspensión

suspensión HAc (24 h) ^ Solución de quitosano-HAc

2. Etapa de purificación

2.1. Solución de quitosano-HAc NaOH 4 N ^Quitosano (pH 8-8,5) NaAc H²O

2.2. Quitosano NaAc+ H²O ^ H ²O NaAc

^Quitosano (sólido, purificado)

3. Producción

Quitosano (sólido) H²O cloruro de pentanoílo^

Quitosano ácido valérico H²O HCl ^H CQ V (hidrocoloide de quitosano-ácido valérico)

La producción era una combinación de una etapa de purificación del material básico quitosano y una reacción en proceso con el segundo reactivo cloruro de pentanoílo.

Esta primera etapa crítica es la precipitación de quitosano para obtener la cantidad total del quitosano purificado de calidad farmacéutica.

Control durante el procedimiento: se supervisan el tiempo de reacción y el valor de pH para conseguir una precipitación cuantitativa.

Ensayo de la calidad farmacéutica del quitosano:

Ensayo de la calidad del intermediario (calidad farmacéutica del quitosano)

Solubilidad en agua: una muestra de aproximadamente 250 mg del precipitado de quitosano se resuspendió en 1 ml de agua purificada

Objetivo: no puede obtenerse solubilidad

Calidad: se cumple si no puede detectarse reducción de la cantidad de material sólido.

Solubilidad en ácidos más fuertes: en paralelo, se suspendió la misma cantidad de precipitado en 1 ml de HCl (3 N) Objetivo: disolución total

Calidad: se cumple si puede detectarse una solución de la cantidad total del material sólido.

La segunda etapa crítica es el procedimiento de disolución para el principio activo. El control se realizó visualmente: debe solubilizarse la cantidad total del precipitado.

Ejemplo 76. Examen de identidad usando espectroscopía UV/VIS

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.25.

Aparato: Espectrofotómetro Jasco 7800

Condiciones de medición:

Ancho de banda de 2 nm

Intervalo 200 a 600 nm

Corrección de blanco con disolvente

Temperatura: 25°C

Celda UV: sílice de calidad UV, 12,5 x 45 mm semi-micro, longitud del camino: 10 mm

Disolvente: H²O

Solución de ensayo: una muestra adecuada de quitosano HCl, quitosano-HAc, quitosano, hidrocoloide de quitosanoácido valérico y ácido valérico, se disolvió respectivamente en el disolvente anterior. Esta mezcla se sometió a agitación y posteriormente se sometió a sonicación en un baño ultrasónico durante 5 minutos.

Puede esperarse el máximo de absorción de acuerdo con los fundamentos de espectroscopía generales y la estructura química con grupos cromóforos y sustituyentes específicos a 200 nm para quitosano HCl, quitosano-HAc, hidrocoloide de quitosano-ácido valérico y ácido valérico, respectivamente

El máximo de absorción del quitosano no pudo analizarse, ya que el quitosano es un sólido insoluble en agua, que tampoco puede solubilizarse en disolventes orgánicos típicos.

La comparación de todos los espectros no mostró una modificación significativa o estructural, tal como enlaces aromáticos, etc. Basándose en los espectros medidos y los datos bibliográficos de los materiales de partida, el espectro medido correspondía a los espectros previstos. De esta manera, los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la estructura prevista.

Ejemplo 77. Espectrofotometría de absorción IR

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.24.

Para la identificación del principio activo hidrocoloide de quitosano-ácido valérico, se compara una serie de espectros de IR de diferentes derivados de quitosano con el espectro del producto y de ácido valérico.

1. Procedimiento y Parámetros

Aparato: espectrómetro de infrarrojos FT/IR 410 Jasco

Intervalo: de 4.000 cirr1 a 600 cirr1

Muestra de ensayo: una mezcla de 4,8 mg de quitosano, o una mezcla de 4 mg de quitosano-HCl o una mezcla de 3,8 mg de acetato de quitosano y 100 mg de KBr se trituró cuidadosamente y se prensó en un disco de bromuro de potasio adecuado, o una película de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico o placa de NaCl para ácido valérico Condiciones de medición:

Corrección de fondo: real

Temperatura: 20°C

El espectro medido corresponde directamente a los espectros de la bibliografía procedente de la base de datos. Resultado: los datos medidos anteriormente confirman la identidad de las sustancias sometidas a ensayo.

2. Datos de los diferentes espectros IR

Las señales IR del ácido valérico en el principio activo son muy pequeñas o no visibles.

Comparación con los datos bibliográficos: Basándose en los espectros medidos y los datos bibliográficos de los materiales de partida, el espectro medido de HCQV corresponde al espectro previsto.

Resultado: Los datos medidos anteriormente confirman la identidad de la estructura propuesta.

Ejemplo 78. Análisis de espectroscopía de RMN de 13C

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.33.

a) Espectro de RMN de 13C de quitosano

1. Procedimiento y Parámetros

Aparato Bruker AMX 500 AVANCE

Condiciones de medición

Frecuencia de exploración: 125 MHz para quitosano, quitosano HCl, quitosano HAc,

glucosamina HCl, N-acetilglucosamina, hidrocoloide de

quitosano-ácido valérico, ácido valérico

Temperatura: 300°K para qquitosano, quitosano HCl, quitosano HAc,

hidrocoloide de quitosano-ácido valérico, ácido valérico;

301°K para glucosamina HCl y N-acetilglucosamina

Disolvente: D²O para quitosano, quitosano HCl, quitosano HAc,

glucosamina HCl,

N-acetilglucosamina;

DMSO-D6 para hidrocoloide de quitosano-Ácido valérico

CDCl3 para ácido valérico

Concentración: - para quitosano, quitosano HCl, quitosano HAc,

hidrocoloide de quitosano-ácido valérico;

aprox. 15 mg/0,5 ml para glucosamina HCl, N-acetilglucosamina y ácido valérico

Calibración: - para quitosano, quitosano HCl, quitosano HAc,

glucosamina HCl,

N-acetilglucosamina

DMSO-D6 para hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

CDCl3 para ácido valérico

1. Resultados

a) Análisis de espectroscopía de RMN de 13C de quitosano

Medición en solución: debido a la falta de solubilidad en disolventes neutros, no resultó posible la medición en solución. Medición en estado sólido: no resultó posible la medición en estado sólido. Tampoco aparecieron señales aceptables después de condiciones de medición prolongadas (tiempo).

Resultado: no resultó posible la identificación de quitosano por RMN.

b) Análisis de espectroscopia de RMN de 13C de quitosano HCl

Resultado: los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la sustancia sometida a ensayo. c) Análisis de espectroscopía de RMN de 13C de quitosano HAc

Resultado: los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la sustancia sometida a ensayo. d) Análisis de espectroscopía de RMN de 13C de glucosamina HCl

Comparación con los datos bibliográficos: el espectro medido correspondía directamente a los espectros de la bibliografía procedente de la base de datos.

Resultado: los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la sustancia ensayada.

e) Análisis de espectroscopía de RMN de 13C de N-acetilglucosamina

Resultado: los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la sustancia sometida a ensayo.

f) Análisis de espectroscopía de RMN de 13C de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

Resultado: los datos medidos anteriormente confirmaron la identidad de la estructura propuesta.

g) Análisis de espectroscopia de RMN de 13C de ácido valérico

Comparación con los datos bibliográficos: El espectro medido corresponde directamente a los espectros de la bibliografia procedente de la base de datos.

Resultado: los datos medidos anteriormente confirman la identidad de la sustancia ensayada.

3. Comparación de los espectros de RMN

Comparación con los datos bibliográficos: no disponible o basado en los espectros medidos y los datos bibliográficos de los materiales de partida, el espectro medido corresponde directamente a los espectros propuestos.

Resultado: los datos medidos anteriormente confirman la identidad de la estructura propuesta.

Ejemplo 79. Procedimiento de CCF para el análisis de quitosano e impurezas en el nuevo producto hidrocoloide de quitosano-ácido valérico (HCQV)

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.27.

Esta parte representa los procedimientos y los datos de cromatografia en capa fina para la identificación de HCQV junto con los valores de Rf en las mezclas de disolvente usadas y las manchas de color detectadas con luz UV (365 nm y 254 nm), luz visible y con reactivos de visualización típicos.

El material de partida de base original para cualquier tipo de glucosamina es el material natural de quitina procedente de insectos o cangrejos. La estructura monomérica de estos biopolímeros es N-acetil-glucosamina.

Para uso farmacéutico y otros usos, en la mayoría de los casos es típica la quitina desacetilada. Este biopolímero resultante es el denominado quitosano, que puede modificarse para formar compuestos iónicos solubles en agua. La estructura monomérica de este quitosano debería ser, teóricamente, glucosamina.

Debido a que la etapa de desacetilación no se completa, el quitosano presenta una estructura mixta de unidades de N-acetilglucosamina (acetilada) y glucosamina (desacetilada). El hidrocoloide de quitosano-ácido valérico es un nuevo hidrocomplejo de poliaminoazúcar-ácido valérico. Por lo tanto, no deberían resultar posibles resultados positivos del ensayo analítico para la N-acetil-glucosamina y la glucosamina. En el caso de que se incluyan fragmentos monoméricos como impurezas residuales, sería posible identificar el quitosano en forma de sus compuestos iónicos solubles en agua quitosano HCl y quitosano HAc.

1. Procedimiento

Condiciones cromato ráficas

Fase móvil

2. Análisis y Resultados

a) Quitosano

Preparación de muestra

Muestra: Quitosano suspendido en agua

1) Aparato: condensador de reflujo

Condiciones: calentamiento durante aproximadamente 30 minutos a reflujo (145 °C)

2) Aparato: Baño ultrasónico

Condiciones: Sometido a sonicación durante aproximadamente 30 minutos a 45 °C

3) Aparato: condensador de reflujo

Condiciones: calentamiento durante aproximadamente 30 minutos a reflujo (145 °C)

4) Filtración: filtro de 0,45 pm

El filtrado transparente se usó para el análisis.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Alternativa: La solubilización en disolventes orgánicos muestra resultados iguales debido a la falta de solubilidad del quitosano.

Resultado: No es posible una solución aceptable de quitosano en disolventes acuosos u orgánicos tales como metanol etc. Únicamente es posible una solubilización adecuada de quitosano en ácidos más fuertes tales como HCl o HAc en la producción de quitosano HCl o quitosano HAc.

b) Quitosano HCl

Para el análisis se usaron 5 mg de quitosano HCl/ml de H²O.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Resultado: Pureza del compuesto; Una mancha principal.

c) Quitosano HAc

Para el análisis se usaron 5 mg de quitosano HAc/ml de H²O.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Valor de la bibliografía |_________ No disponible__________| datos procedentes de

Resultado: Pureza del compuesto; Una mancha principal.

d) Glucosamina HCl

Para el análisis se usaron 5 mg de Glucosamina HCl/ml de H²O.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

No disponible

Datos procedentes de

Resultado: Pureza del compuesto; Una mancha principal.

e) N-acetilglucosamina

Para el análisis se usaron 5 mg de N-acetilglucosamina/ml de H²O.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

f) Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico (HCQV)

HCQV es un gel acuoso de alta viscosidad. Para el análisis se usaron dos gotas de HCQV.

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

__________________________________________________________________

\~ Valor de la bibliografía | No disponible | datos procedentes de

Resultado: pureza del compuesto; Una mancha principal.

g) Ácido valérico

Para el análisis se usó 1 pl de ácido valérico (puro).

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Resultado: Pureza del compuesto; Una mancha principal.

3. Comparación de los resultados del análisis de CCF

Los datos anteriores de la CCF muestran que no hay indicios de estructuras monoméricas o diméricas que puedan detectarse con los reactivos de derivación específicos sometidos a ensayo anteriormente. La detección y el valor de Rf de “0” muestran la similitud entre el hidrocoloide de quitosano-ácido valérico y los compuestos relacionados quitosano HCl y quitosano HAc. No se consiguió una identificación específica de ácido valérico con este sistema de CCF. El hidrocoloide de quitosano-ácido valérico solo puede ser un coloide de poliaminoazúcar, pero no una solución de quitosano o un derivado de quitosano con ácido valérico en agua.

Ejemplo 80. Procedimiento de CCF para la detección analítica de ácido valérico en hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

1. Procedimiento y Parámetros

Se estableció un nuevo sistema de CCF para un ensayo de identificación y pureza del constituyente ácido valérico.

Condiciones cromato ráficas

Fase móvil

2. Resultados

a) Ácido valérico (puro)

Para el análisis se usaron 2 pl de ácido valérico (puro).

Detección con fluorescencia-UV y VIS

| Valor de la bibliografía________| No disponible | Datos procedentes de | - |

Límite de detección: del ácido valérico con este reactivo de visualización después de la cromatografía CCF: 0,03 |jg b) Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico (HCQV)

Para el análisis se usaron 45 j l de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico, puro (esta es una cantidad de ácido valérico aproximadamente 850 veces mayor, en comparación con las pruebas anteriores).

Detección con fluorescencia-UV y VIS

Detección con reactivos de visualización

| Valor de la Bibliografía_________ | No disponible | datos procedentes de | -

|

Límite de detección del ácido valérico con este reactivo de visualización después de la cromatografía CCF: 0,03 jg .

Con este sistema de CCF puede identificarse ácido valérico puro. En el compuesto puro hidrocoloide de quitosanoácido valérico no puede detectarse ácido valérico integrado coloidal. La detección y el valor de Rf de “0” muestran la similitud entre el hidrocoloide de quitosano-ácido valérico y otros compuestos de quitosano relacionados. El hidrocoloide de quitosano-ácido valérico solamente puede ser un coloide de poliaminoazúcar, pero no una solución de quitosano o un derivado de quitosano con ácido valérico en agua. Los resultados anteriores confirman la identidad de la estructura propuesta.

Ejemplo 81. Eliminación de ácido valérico de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico con alto vacío y temperatura más elevada

Procedimiento: estimación de la pérdida por desecación (procedimiento especial)

Aparato: concentrador de vacío de velocidad circulante

Condiciones: 5 mbar

Temperatura: 60°C

Tiempo: 1 semana

Punto final: masa constante

Aspecto: masa vítrea

Olor de resultado: sin olor típico de ácido valérico

Preparación de la muestra

Redisolución parcial con agua

Apariencia: gel de alta viscosidad

Análisis de CCF

Aparato: sistema cromatográfico de tanque Camag

Placa de CCF: placas prerrecubiertas de Si 60 F 254 de Merck

Condiciones: protegido de la luz solar y con cámara de saturación

Temperatura: 20°C a 25°C

Desarrollo: desarrollo vertical

Condiciones cromatográficas

Solución de muestra: véase anteriormente

Aplicación: 5 pl

Secado: mínimo 2 minutos en una corriente de aire

Intervalo de movimiento: 80 mm

Fase móvil

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Valor de Rf

mancha

0 Límite de detección: del ácido valérico con este reactivo de visualización después de la cromatografía CCF: 0,03 pg Resultado: con alto vacío y a una temperatura más elevada, tiene lugar una desproporción de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico. La eliminación del ácido valérico puede demostrarse a partir de la ausencia absoluta del olor típico del ácido valérico. La eliminación del ácido valérico puede demostrarse por análisis CCF: sin mancha típica de ácido valérico libre a un valor de Rf de 0,56. Pueden identificarse quitosano o compuestos de quitosano a un valor de Rf de 0. El hidrocoloide de quitosano-ácido valérico solamente puede ser un coloide de poliaminoazúcar, pero no una solución de quitosano o un derivado de quitosano con ácido valérico en agua.

Ejemplo 82. Desproporción de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico con disolventes

La estructura de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico se descompone en acetato de etilo respecto del ácido valérico y un compuesto de quitosano.

Preparación de muestra

Aparato: embudo de separación, evaporador

Distribución líquido-líquido: 20 ml de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico y 10 ml de acetato de etilo

Condiciones: agitar durante aproximadamente 5 minutos y esperar la separación de fases

Separación de fases: Se recogió la fase de acetato de etilo

Etapa de concentración: se concentraron aproximadamente 10 ml hasta obtener un residuo líquido (acuoso) mediante la utilización de un evaporador

Resolubilización: en 1 ml de metanol

Homogeneización: etapa de centrifugación de aproximadamente 5 min a 12.000 rpm

Separación de fases: fase superior: solución metanólica transparente

fase inferior: gel de alta viscosidad

Análisis de CCF de la fase superior e inferior (véase anteriormente)

a) Análisis de la fase superior (solución metanólica transparente)

Análisis de CCF

Aparato: sistema cromatográfico de tanque Camag

Placa de CCF: placas prerrecubiertas de Si 60 F 254 de Merck

Condiciones: protegido de la luz solar y con cámara de saturación

Temperatura: 20°C a 25°C

Desarrollo: desarrollo vertical

Condiciones cromatográficas

Solución de muestra: solución metanólica transparente

Aplicación: 5 pl

Secado: mínimo de 2 minutos en una corriente de aire

Intervalo de movimiento: 80 mm

Fase móvil

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Límite de detección con reactivo de visualización: 0,03 pg

Resultado: la fase superior es solución metanólica transparente. Pudo identificarse ácido valérico después de la descomposición del hidrocoloide en esta solución mediante CCF. No pudo detectarse quitosano o compuesto de quitosano con CCF.

b) Análisis de la fase inferior (gel de alta viscosidad)

Análisis de CCF

Aparato: sistema cromatográfico de tanque Camag

Placa de CCF: placas prerrecubiertas de Si 60 F 254 de Merck

Condiciones: protegido de la luz solar y con cámara

Temperatura: 20°C a 25°C

Desarrollo: desarrollo vertical

Condiciones cromatográficas

Solución de muestra: gel de alta viscosidad, totalmente redisuelto en agua

Aplicación: 30 pl

Secado: Mínimo 2 minutos en una corriente de aire

Intervalo de movimiento: 80 mm

Fase móvil

Detección con fluorescencia-UV VIS

Detección con reactivos de visualización

Límite de detección con reactivo de visualización: 0,03 pg

Resultados: la fase inferior es un gel de alta viscosidad, soluble en agua. No pudo detectarse ácido valérico en esta fase mediante CCF. Pudo identificarse quitosano o un compuesto de quitosano en la fase inferior (gel) mediante CCF.

Sumario de los resultados

Resultado: El hidrocoloide de quitosano-ácido valérico solamente puede ser un coloide de poliaminoazúcar, aunque no una solución de quitosano o un derivado de quitosano con ácido valérico en agua. Los resultados anteriores confirman la identidad de la estructura propuesta.

Ejemplo 83. Estimación de la densidad relativa

Debido a la alta viscosidad del hidrocoloide de quitosano-ácido valérico, la estimación de la densidad no es posible con un frasco de densidad/picnómetro de acuerdo con el procedimiento de ensayo según la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.5.

1. Procedimiento de ensayo mediante pesada

Aparato: matraz aforado de 250 ml

Balanza: Sartorius MC 1 LC 2200S

Termómetro: termómetro con graduación (mínimo 0,5°C) y un intervalo no superior a 60°C

Resultados 1,001 [d²⁰20]

El principio activo es un hidrogel, por lo que la densidad teórica debe ser superior a 1,0. Los datos medidos confirman la identidad de la sustancia propuesta.

2. Procedimiento de ensayo con hidrómetro

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.2.5.

Aparato: matraz aforado de 250 ml

Hidrómetro: Widder 1573°, 20 °C-M100-DIN 12791 Klasse H

Termómetro: termómetro graduado (mínimo 0,5°C) y un intervalo no superior a 60°C

Condiciones de medición: temperatura 20°C /- 0,5°C con termostato electrónico

Resultados 1,002 [d²⁰20]

El principio activo era un hidrogel, por lo que la densidad teórica debía ser superior a 1,0. Los datos medidos confirmaron la identidad de la sustancia propuesta.

Ejemplo 84. Cenizas sulfatadas

Se usó el procedimiento de ensayo de acuerdo con la FARMACOPEA EUROPEA 2.4.14.

Ensa os

Ejemplo 85. Pérdida por desecación

Basada en procedimientos apropiados establecidos por Phytochem® para la determinación de la pérdida por desecación.

1. Procedimiento y parámetro para el ensayo de quitosano HCl, quitosano y quitosano HAc

Preparación de muestra

Pretratamiento del recipiente: la sustancia se introdujo en un frasco de pesada adecuado, secado previamente bajo las condiciones usadas posteriormente

Carga: el material se introdujo no más de 5 milímetros

Transporte: el frasco de pesada se cerró con una cubierta adecuada

Procedimiento PC: un procedimiento de la Farmacopea 2.2.32 (EP) modificado “de alto vacío”, “al vacío, en un desecador”

Aparato: desecador

Tiempo de secado: hasta peso constante

Temperatura de secado: 25°C ± 2°C

Vacío: permanente de 4 a 8 mbar con bombas específicas

Reactivo de secado: pentaóxido de difósforo (reciente)

2. Estimación de la pérdida por desecación del quitosano en hidrocoloide de quitosano-ácido valérico (procedimiento especial)

El contenido de quitosano en hidrocoloide de quitosano-ácido valérico se estima con una medición gravimétrica. Aparato: concentrador de vacío de velocidad circulante

Procedimiento: estimación de la pérdida por desecación (procedimiento especial)

Condiciones de medición

Presión: 5 mbar

Temperatura: 60°C

Tiempo: 1 semana

Punto final: masa constante

Aspecto: masa vítrea

Medición: solución de ensayo 4 ml de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

Repetición: 10 veces

Olor del resultado: sin olor típico de ácido valérico

Pesada

1 40,20 mg 6 40,10 mg

2 39,80 mg 7 39,90 mg

3 40,20 mg 8 39,60 mg

4 39,90 mg 9 40,20 mg

5 40,10 mg 10 40,40 mg

Promedio: 40,04 mg

Desviación típica: 0,236643191

Desviación típica relativa: 0,591016961

Varianza: 0,056

Resultados: la pesada de la sustancia seca mostraba una buena similitud. Basándose en estas mediciones, el contenido de quitosano en el hidrocoloide de quitosano-ácido valérico era de 1%.

Com aración de los resultados

El principio activo debe ser un gel de hidrocoloide. Los datos medidos confirmaron la estructura del compuesto.

Ejemplo 86. Estimación de la osmolaridad

La estimación de la osmolaridad puede realizarse como medición indirecta de la reducción del punto de fusión de una solución.

Aparato: osmómetro Halbmicro Knauer

Condiciones de medición: sistema de refrigeración externa

Intervalo: 0-1600 mOsmol

Procedimiento: congelación

Procedimiento de ensayo

Calibración con solución patrón de 400 mOsmol/Kg: 12,687 g de NaCl en 1 litro de agua a 20°C

Repetición: 2 veces

Recipiente: vial de vidrio específico

Muestra: hidrocoloide de quitosano-ácido valérico

Solución de ensayo:

1 sin dilución

2 dilución 1:5

Cantidad: 150 pl de cada uno

Calibración

Muestra Especificación Punto de referencia Valor medido

Calibración 1 Agua bidest. 0 mOsmol 0 mOsmol

Calibración 2 400 mOsmol/kg 400 mOsmol 400 mOsmol

Medición

Número Muestra Valor medido

1a Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico 100 mOsmol

1b Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico 110 mOsmol

2a Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico 1:5 20 mOsmol

2b Hidrocoloide de quitosano-ácido valérico 1:5 20 mOsmol

Resultados: la medición de la osmolaridad de hidrocoloide de quitosano-ácido valérico mostró un contenido relativamente bajo. El contenido medido de los componentes de reacción osmolares solo puede ser tan bajo en el caso de que no haya disolución o suspensión de quitosanos y ácido valérico. El compuesto de gelificación de alta viscosidad solamente puede ser un hidrocoloide.

Resultado: los datos medidos anteriores confirmaron la identidad de la sustancia propuesta.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   i . Método para la preparación de un quitosano modificado, una variante del quitosano o un derivado de quitosano, en donde el método comprende la etapa de:

   (a) incubar quitosano en una solución acuosa de un ácido carboxílico orgánico o una sal del mismo, en donde el ácido orgánico carboxílico se selecciona del grupo que consiste en ácido valérico, ácido para-aminobenzoico, ácido glucurónico o una sal de cualquiera de dichos ácidos, en particular un cloruro del ácido valérico,

   en donde el quitosano presenta un grado de desacetilación de 62% a 98%.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el quitosano presenta un grado de desacetilación de 80% a 95% y/o en donde el quitosano presenta un peso molecular promedio de 80 kDa a 700 kDa.
3. 3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende las siguientes etapas antes de la etapa (a):

   (i) disolver quitosano en una solución acuosa de un ácido, en particular, en una solución acuosa de ácido acético,

   (ii) incrementar el valor de pH, en particular hasta un valor de pH de 8,0 a 8,5, hasta precipitar el quitosano, y

   (iii) recuperar el quitosano precipitado,

   en donde el quitosano recuperado de la etapa (iii) se usa en la etapa (a).
4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la etapa (a) comprende adicionalmente la adición o la presencia de un ácido mineral, en particular HCl o H²SO⁴, o un ácido orgánico, en particular ácido láctico, ácido para-aminobenzoico o ácido glucurónico.
5. 5. Hidrocoloide, que comprende:

   (i) 0,1% a 5% (p/v) de quitosano y 0,001% a 5% (p/v) de ácido valérico, o una sal del mismo, preferentemente cloruro de ácido valérico, o

   (ii) 0,1% a 5% (p/p) de quitosano y 0,001% a 5% (p/p) de ácido glucurónico o ácido p-aminobenzoico o una sal del mismo.
6. 6. Compuesto de fórmula [X]n, en la que n representa un número entero entre 1 y 5.000, en particular un número

   

   en donde 2% a 38%, más preferentemente 5% a 20% de los restos X que constituyen dicho compuesto están modificados por acetilación y en donde todos o parte de los restos X que constituyen dicho compuesto están modificados por un ácido carboxílico seleccionado del grupo que consiste en ácido valérico, ácido para-aminobenzoico, ácido glucurónico o una sal de cualquiera de dichos ácidos, en particular un cloruro del ácido valérico.
7. 7. Composición que comprende el hidrocoloide según la reivindicación 5 o el compuesto según la reivindicación 6, en particular en donde la composición es una composición farmacéutica y comprende un diluyente, excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. 8. Composición según la reivindicación 7, en donde la composición comprende adicionalmente material antigénico de microorganismos y/o enzimas, en particular material antigénico de hongos queratinofílicos y/o levaduras queratinofílicas, conservantes y/o antibióticos.
9. 9. Composición según la reivindicación 8, en donde el material antigénico se obtiene a partir de uno o más de Candida, en particular Candida albicans, Trichophyton, en particular Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum y/o Trichophyton mentagrophytes, Microsporum, en particular Microsporum canis, tal como Microsporum canis var. obesum y/o Microsporum canis var. distortum y/o Microsporum gypseum y/o Chrisporium, en particular Chrisporium tropicum.

   Composición según la reivindicación 9, en la que el material antigénico se obtiene a partir de uno o más de las siguientes cepas: Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279, Trichophyton verrucosum DSM - 28406, Trichophyton rubrum DSM - 9469, Trichophyton rubrum DSM - 9470, Trichophyton rubrum DSM - 9471, Trichophyton rubrum DSM - 9472, Candida albicans DSM - 9456, Candida albicans DSM - 9457, Candida albicans DSM - 9458, Candida albicans DSM - 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405 y Microsporum canis DSM-32271.

   Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el quitosano modificado, la variante de quitosano, el derivado de quitosano o el compuesto están presentes a una concentración de 0,1% a 2,0% (p/v), en particular de 0,1% a 1,4% (p/v), más particularmente, de 0,1% a 0,3% (p/v).

   Hidrocoloide según la reivindicación 5, el compuesto según la reivindicación 6 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, para la utilización en medicina humana y/o veterinaria, en particular a modo de vacuna.

   Compuesto según la reivindicación 6 o 12, el hidrocoloide según la reivindicación 5 o 12 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, para la utilización en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de mastitis, preferentemente mastitis latente y/o mastitis aguda, endometritis, preferentemente endometritis crónica, aguda y/o purulenta-catarral, enfermedades podales y de las pezuñas, cojera, lesiones en el espacio interdigital, dermatitis digital, dermatitis interdigital, flemón interdigital, tricofitosis, microesporosis, micosis de la piel, alergias, así como enfermedades complicadas por alergias, en particular, enfermedad pulmonar obstructiva alérgica, enfermedades alérgicas de la piel, eritema alérgico del oído, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis de contacto alérgica aguda, eccema de contacto alérgico crónico o eccema atópico, enfermedad pulmonar obstructiva, en particular enfermedad pulmonar obstructiva crónica, dermopatías, en particular, dermatitis, eritema del oído, rinitis, conjuntivitis, dermatofitosis o verrugas, en particular verrugas comunes, en un sujeto y para la modulación de la respuesta inmunitaria en un sujeto y/o para la mejora de la eficacia de la reproducción, preferentemente la eficacia de la reproducción en la cría de animales.