CN103505476A - 多种免疫增强剂的无细胞制剂、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及假单胞菌制剂的无细胞制剂、卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、A群链球菌制剂的无细胞制剂、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、布氏菌制剂的无细胞制剂，所述无细胞制剂的粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。革兰氏阳性菌的热原均小于320EU/ml，优选小于120EU/ml。无细胞制剂的制备方法为：将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；无菌试验合格的菌液经洗涤后，在无菌条件下用破碎装置破碎菌体；菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；将悬液分装后加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂。本发明还涉及上述无细胞制剂的应用。
Description
技术领域
本发明涉及多种免疫增强剂，具体讲，涉及多种免疫增强剂的无细胞制剂、其制备方法及用途。
背景技术
免疫增强剂(immunopotentiator)是通过不同方式，达到增强机体免疫力的一类免疫治疗药物。临床上常用于治疗与免疫功能低下有关的疾病及免疫缺陷病。目前针对免疫增强剂的研究很多。
现代药理学研究表明，药物加工到纳米水平之后，可显著提高吸收度、扩散度，有利于降低药物的某些副作用，提高药效。通常微生物细胞的破碎技术为机械法、非机械法两种。机械法包括：高压匀浆器、高速珠磨机、超声波震荡器，非机械法包括化学法、酶解法、渗透压冲击法、冻融法和干燥法。虽然细胞破碎的方法很多，但都难以将细胞破碎到粒度均一的纳米水平。将药物加工到其粒度绝大部分都小于100nm从技术角度讲难于实现的，并且研究表明，纳米级药物尚存在着用目前的技术难以准确评估的安全性患。
为了进一步的扩大免疫增强剂的应用范围，提高其吸收度，本发明提出了免疫增强剂的无细胞制剂。
发明内容
本发明的首要发明目的在提供一种假单胞菌制剂的无细胞制剂；
本发明的第二发明目的在提供一种卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂；
本发明的第三发明目的在提供一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂；
本发明的第四发明目的在提供一种A群链球菌制剂的无细胞制剂；
本发明的第五发明目的在提供一种绿脓杆菌制剂的无细胞制剂；
本发明的第六发明目的在提供一种布氏菌制剂的无细胞制剂；
本发明的第七发明目的在于提供一种治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂；
本发明的第八发明目的在于提供一种耻垢分支杆菌的无细胞制剂；
本发明的第九发明目的在提供上述无细胞制剂的制备方法；
本发明的第十发明目的在提供上述无细胞制剂的应用。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
一种假单胞菌制剂的无细胞制剂，所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂是由假单胞菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂，所述的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂是由卡介菌多糖、核酸制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂，所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂是由红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种A群链球菌制剂的无细胞制剂，所述的A群链球菌制剂的无细胞制剂是由A群链球菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种绿脓杆菌制剂的无细胞制剂，所述的绿脓杆菌制剂的无细胞制剂是由绿脓杆菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种布氏菌制剂的无细胞制剂；所述的布氏菌制剂的无细胞制剂是由布氏菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种治疗用母牛分枝杆菌制剂的无细胞制剂，所述的治疗用母牛分枝杆菌制剂的无细胞制剂是由治疗用母牛分枝杆菌的菌体经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
一种耻垢分支杆菌制剂的无细胞制剂，所述的耻垢分支杆菌制剂的无细胞制剂是由耻垢分支杆菌的菌体经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
本发明的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、A群链球菌制剂的无细胞制剂、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、布氏菌制剂的无细胞制剂、治疗用母牛分枝杆菌制剂的无细胞制剂、耻垢分支杆菌制剂的无细胞制剂，革兰氏阳性菌的热原均小于320EU/ml，优选热原小于120EU/ml。
本发明还涉及上述无细胞制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经洗涤后，在无菌条件下用破碎装置破碎菌体；
(3)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；
(4)将悬液分装后加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂。
本发明制备方法的第一优选技术方案为：在步骤(2)中，超高压射流对撞机，其压力为500～2000kgf/cm2，破碎至少1次，将菌体破碎到粒度小于1000nm、优选粒度10～500nm。
本发明制备方法的第二优选技术方案为：在步骤(2)中，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次。
本发明制备方法的第三优选技术方案为：在步骤(3)中，菌体破碎后悬液的离心条件是在4℃～室温下，6000～20000rpm离心10～150分钟；所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1～5次。
本发明制备方法的第四优选技术方案为：在步骤(4)中，所述的加热为在60～65℃加热0.5～2小时。
本发明制备方法的第五优选技术方案为：进一步包括将步骤(5)得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
本发明还涉及所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、A群链球菌制剂的无细胞制剂、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、布氏菌制剂的无细胞制剂、治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂、耻垢分支杆菌的无细胞制剂在制备增强免疫剂药物方面的应用。
下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明：
1.治疗用布氏菌制剂系用弱毒牛型布氏菌经加热杀菌制成，专供治疗亚急性、慢性布氏菌病使用。
2.卡介菌多糖、核酸制剂系用卡介菌经热酚法提取多糖、核酸，配以灭菌生理氯化钠溶液制成，用于预防和治疗慢性支气管炎、感冒、哮喘等疾病。
3.A群链球菌制剂系用A群链球菌的弱毒菌株经培养、增效及青霉素处理后制成的冻干品，用于癌性胸水及恶性肿瘤的免疫治疗。A群链球菌制剂制品为抗肿瘤生物反应调节剂，可激活宿主细胞免疫功能，配合手术、放疗或化疗，用于恶性肿瘤的辅助治疗。经试验证明具有直接杀伤肿瘤细胞，激活宿主细胞免疫功能；临床试验证明腔内治疗恶性胸腔积液疗效明显，瘤内及全身用药对实体瘤有一定疗效，并可提高T细胞和NK细胞活性，无器官毒性，但可有注射局部红肿及发热反应。与化疗合用可提高疗效并可能有减轻化疗药对骨髓抑制的作用，可调节T细胞亚群使T3、T4及T4/T8比值全面上升。
4.红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂：红色诺卡氏菌细胞壁骨架(N-CWS)系红色诺卡氏菌经发酵、破碎、提取获得细胞壁骨架，加入适量乳化剂后冻干制成，主要含该菌细胞壁的组份霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等，用于恶性胸腹水和癌症患者的免疫治疗。
5.绿脓杆菌菌液制剂是由绿脓杆菌MSHA菌毛株培养后，取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以PBS稀释成每1ml含菌1.8×109制成，用于恶性肿瘤的辅助治疗。
6.假单胞菌液制剂采用假单胞菌济南株经培养后，收集菌体，制成菌悬液，加热灭活，用生理氯化钠溶液稀释制成，每1ml含假单胞菌6.0×109，主要用于胸腔积液的治疗。
7.母牛分支杆菌制剂是由母牛分枝杆菌种接种于罗氏培养基培养，收集菌体，离心制备而成，可用于治疗结核病、哮喘、肿瘤、流感、皮肤病、乙肝等。
8.耻垢分枝杆菌制剂是由耻垢分枝杆菌菌种，接种于罗氏培养基培养，收集菌体，离心制备而成，可用作为免疫调节剂使用。
上述的八种免疫增强剂均为由全菌体灭活或者弱毒苗制备而成，全菌体，体积大，不易进入毛细血管，使其难以发挥全身作用，主要用于局部治疗；而其无细胞制剂由于破碎了细胞，提取了有效组分，极容易进入毛细血管，故可以迅速产生全身作用，更好地发挥免疫治疗作用，使得其治疗效果增强；并且与全菌体制剂相比，可以有很多新的适应症。
从全身反应来看，全菌体中由于异种蛋白等热源含量高，致使产品在使用过程中发热、寒战等全身反应多见，部分患者可出现较重的肝肾毒性，如肝细胞坏死或肾脏免疫复合物沉积。而无细胞制剂经过纳米技术处理提取后，几乎无热源，发热和肝肾毒性等副作用大大减轻；从局部反应来看，由于全菌体不易进入毛细血管，易形成局部疼痛，肿胀，部分患者出现硬结、红斑，病人接受程度差，大大限制了其在临床的广泛应用。而无细胞制剂经过纳米技术处理提取后，可迅速进入毛细血管，大为减轻或消除局部疼痛、肿胀、硬结和红斑等副作用。通过动物的急性毒性实验证实，本发明的无细胞制剂在使用剂量400倍以上时，实验动物均未出现不良反应。
本发明还涉及所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、A群链球菌制剂的无细胞制剂、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、布氏菌制剂的无细胞制剂、治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂、耻垢分支杆菌的无细胞制剂在制备增强免疫剂药物方面的应用。
本发明还涉及所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、A群链球菌制剂的无细胞制剂、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、布氏菌制剂的无细胞制剂、治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂、耻垢分支杆菌的无细胞制剂与其他药物或药用辅料组成的药物组合物。
本发明的免疫增强剂的无细胞制剂，根据需要，可制成无菌生理盐水的悬浮制剂，固体含量为1.0mg/ml或2.0mg/ml，也可以制成冻干粉针或适合药用的其他剂型。
本发明的免疫增强剂的无细胞制剂或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
本发明的免疫增强剂的无细胞制剂可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
这些制剂是按照本领域的技术人员所熟知的方法制备的。为制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的助剂，例如淀粉，明胶，阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂例如有水，乙醇，丙二醇，植物油类如玉米油，花生油，橄榄油等。含有本发明化合物的制剂中还可有其他助剂，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂，色素等。
为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001～150mg/Kg体重，优选为0.01～100mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
本发明的有益效果为：
1.本发明的八种免疫增强剂的无细胞制剂具有低热原、无杂菌污染、无甲醛残留，颗粒具有纳米水平，粒度均一，吸收度和扩散度提高，有利于人体吸收并提高药效；同时可减少发烧、胸痛，注射局部红肿、硬结，肝肾毒性等副作用。
2.本发明的制备工艺简单，可作成口服液、注射液、片剂等剂型，使用方便。
3.经药效研究表明，本发明的免疫增强剂的无细胞制剂克服了化学药物治疗时产生耐药性的缺点。
本发明的具体实施方式进限于进一步解释和说明本发明的内容，并不对本发明的内容构成限制。本发明所用试剂均为市售试剂。
具体实施方式
实施例1治疗用布氏菌制剂无细胞制剂的制备
一、治疗用布氏菌制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
1.生产用种子：将工作种子批菌种启开后，接种于肝浸液琼脂斜面或其他适宜培养基上，37℃培养44～48小时为第1代菌种。第1代菌种在2～8℃可以保存15日；将第1代菌种移种肝琼脂或其他适宜培养基上，放37℃培养44～48小时，为第2代菌种，经肉眼纯菌检查合格后，用灭菌生理氯化钠溶液洗下菌苔制成悬液。以此作为生产用种子，用于生产。
2.生产用培养基：用肝浸液琼脂培养基。
3.菌种接种和培养：于培养基中接种生产用种子后，放37℃培养44～48小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌者废弃。
二、治疗用布氏菌制剂无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在1000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经10000rpm离心0.5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤5次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例2卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂的制备
卡介菌多糖、核酸制剂系用卡介菌经热酚法提取多糖、核酸，配以灭菌生理氯化钠溶液制成，用于预防和治疗慢性支气管炎、感冒、哮喘等疾病。
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
一、卡介菌多糖、核酸制剂的制备
来源：采用国家药品管理批准的菌种进行生产，严禁使用通过动物的菌种用于生产。
冻干菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上每传一次为一代。在马铃薯培养基上培养的菌种放冰箱保存不超过2个月。用于生产的培养物的总代数不超过12代。
菌体收集：培养物应逐瓶检查，若有污染、混浊等情况应废弃。收集马铃薯培养基内培养物或液体苏通表面培养物，压干，加入适量蒸馏水，以高速粉碎机破碎菌体后备用。
提取：取破碎菌悬液与等量热酚混匀，以静置法或离心沉淀菌体，吸取上清，以透析法除酚，加入适量乙醇沉淀多糖、核酸，收集沉淀物。分别以乙醇、乙醚混匀洗涤，离心后干燥即得精制多糖、核酸。
二、治疗用卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在2000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经8000rpm离心1小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤5次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例3：A群链球菌制剂的无细胞制剂的制备
A群链球菌制剂是由A群链球菌的弱毒菌株经培养、增效及青霉素处理后制成的冻干品，用于癌性胸水及恶性肿瘤的免疫治疗。
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
一、A群链球菌制剂的制备
菌种为CMCC32235株或SIPI722株，接种在Todd-Hewitt肉汤或酵母浸膏或其他适宜的固体或液体培养基。
将工作种子批菌种启开后，接种在适宜的固体或液体培养基上，36±1℃培养，2～4代扩增，由此制备适宜的工作种子液。
菌种接种及培养：采用大瓶或大罐液体培养。于培养基中接种生产用工作种子液后，在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌应废弃。
采集及处理：正常培养物离心或薄膜过滤，菌体用适量生理氯化钠溶液洗两次，根据菌体湿重，加入适量的青霉素G，在660nm处测定A值，计算含量或将菌体悬浮于适量的BBM溶液中，在660nm处测定A值来计算含量后加入适量青霉素G。经多步处理后的菌液为待稀释原液。
二、A群链球菌制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在500kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经20000rpm离心10分钟后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤4次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例4：红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂的制备
红色诺卡氏菌细胞壁骨架(N-CWS)系红色诺卡氏菌经发酵、破碎、提取获得细胞壁骨架，加入适量乳化剂后冻干制成，主要含该菌细胞壁的组份霉菌酸、阿拉伯半乳聚糖和粘肽等，用于恶性胸腹水和癌症患者的免疫治疗。
一、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
制造用菌种用红色诺卡氏菌P0-8株；
生产用培养基：使用葡萄糖-酵母膏培养基。
生产用种子：将工作种子批菌种启开后接种在营养琼脂斜面上，28℃培养。2～3代采用葡萄糖-酵母膏液体振荡培养36小时。纯菌试验无污染杂菌者方可供作种子。
接种及培养：在葡萄糖-酵母膏培养液中接种种子液，振荡通气培养5天，在培养过程中及杀菌前取样涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
菌体收集：收集培养液，离心收获湿菌体。
破壁：湿菌体加蒸馏水，以超声波破碎菌体。分别加胰蛋白酶、糜蛋白酶和链蛋白酶水解16～24小时，离心，获细胞壁粗提物。
提取：分别以乙醚-乙醇、氯仿和氯仿-甲醇提取16小时。
干燥：溶媒提取后的细胞壁骨架于60℃减压干燥至无溶媒味为止。获得的细胞壁骨架于玛瑙研钵中研细，得N-CWS原粉。置-20℃干燥保存，有效期为2年。
二、红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在1500kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经15000rpm离心45分钟后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤3次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例5 绿脓杆菌制剂的无细胞制剂
本品系绿脓杆菌MSHA菌毛株培养后，取菌苔制成悬液，加甲醛杀菌，以PBS稀释成每1ml含菌1.8×109制成，用于恶性肿瘤的辅助治疗。
一、绿脓杆菌制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。将工作种子批菌种启开后，接种在营养琼脂或其他适宜培养基，放35～37℃培养，一般不超过18小时，传代不得超过5代，由此制备适宜数量的生产用工作种子，用于生产。
生产用培养基：用pH7.2～7.4的营养琼脂或国家药品管理当局批准的其他培养基。培养基中不应含有对人体有害或其他过敏源物质。
菌种接种和培养：采用克氏瓶涂种法，置37℃培养18～20小时。在培养过程中及杀菌前取样进行纯菌试验，涂片做革兰氏染色镜检，发现污染杂菌应废弃。
收获和杀菌：培养结束后于采集的培养物中加入不超过1％甲醛的PBS，加杀菌剂后的原液放置室温(20～26℃)，维持时间14～16天，离心洗涤后保存于2～8℃。
二、绿脓杆菌制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸45分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在2000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经6000rpm离心1.5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤3次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例6：假单胞菌制剂的无细胞制剂的制备
一、假单胞菌制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
将工作种子批菌种开启后，接种于肉浸液基础培养基，放30℃培养48小时，传代不得超过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
培养基：肉浸液基础培养基。
菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30℃培养72小时。在培养过程和杀菌前取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
采集和杀菌：培养结束后，刮取菌苔混悬于生理氯化钠溶液的瓶中。将收获的菌悬液置70℃水浴间歇灭菌2次，每次2小时，然后于3500r/min离心30分钟，并弃上清液，加生理氯化钠溶液混悬，菌悬液放2～8℃保存。
二、假单胞菌制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在2000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经8000rpm离心1小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1～5次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例7：母牛分支杆菌制剂的无细胞制剂的制备
一、母牛分支杆菌制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
将工作种子批菌种开启后，接种于罗氏培养基，放30℃培养48小时，传代不得超过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
培养基：罗氏培养基。
菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30℃培养72小时。在培养过程和杀菌前取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
二、母牛分支杆菌制剂的无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在1000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经8000rpm离心1小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1～5次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实施例8：耻垢分支杆菌制剂的无细胞制剂的制备
一、耻垢分支杆菌制剂的制备
参照2000版《中国生物制品规程》中描述的方法进行细菌种子批的建立、检定以及其它检定。
将工作种子批菌种开启后，接种于罗氏培养基，放30℃培养48小时，传代不得超过5代。由此制备适宜数量的生产用工作种子。
培养基：罗氏培养基。
菌种接种和培养：采用涂种法，按种后置30℃培养72小时。在培养过程和杀菌前取样进行纯菌试验，涂片镜检，如发现污染杂菌，应废弃。
二、耻垢分支杆菌制剂无细胞制剂的制备
(1)将所述制剂加热煮沸15分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经生理盐水洗涤3次后，在无菌条件下用超高压射流对撞机在1000kgf/cm2压力下破碎菌体2次；
(3)菌体破碎后的悬液经10000rpm离心0.5小时后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤5次；
(4)无菌检验(2000版《中国生物制品规程》)及热原检测(2000版《中国人民共和国药典》)合格后将悬液分装，在60～65℃加热0.5～2小时加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂；
(5)将得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
实验例1 治疗用布氏菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：治疗用布氏菌制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为布氏菌制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例1制备的布氏菌制剂组0.2ml/只(6×108/ml，)，无细胞制剂组0.2ml/只(6×108/ml)，观察并测试注射局部，结果见表1。
表1
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例2 卡介菌多糖、核酸制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：卡介菌多糖、核酸制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为卡介菌多糖、核酸制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例2制备的卡介菌多糖、核酸制剂0.2ml，无细胞制剂0.2ml，观察并测试注射局部，结果见表2。
表2
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例3 A群链球菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：A群链球菌制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为A群链球菌制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例3制备的A群链球菌制剂0.1mg，无细胞制剂组0.1mg，观察并测试注射局部，结果见表3。
表3
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例4 红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例4制备的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂0.05mg，无细胞制剂组0.05mg，观察并测试注射局部，结果见表4。
表4
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例5 绿脓杆菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：绿脓杆菌制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为绿脓杆菌制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例5制备的绿脓杆菌制剂0.25ml(含菌0.4×109～0.5×109)，无细胞制剂组0.25ml，观察并测试注射局部，结果见表5。
表5
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例6 假单胞菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：假单胞菌制剂以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为假单胞菌制剂组及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例6制备的假单胞菌制剂0.5ml(含菌0.3×1010)，无细胞制剂组0.5ml，观察并测试注射局部，结果见表6。
表6
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例7 母牛分支杆菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：母牛分支杆菌以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为母牛分支杆菌及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例7制备的母牛分支杆菌制剂组0.2ml/只，无细胞制剂组0.2ml/只，观察并测试注射局部，结果见表7。
表7
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
实验例8 耻垢分支杆菌制剂以及该制剂的无细胞制剂吸收性能比较试验
内容：耻垢分支杆菌以及该制剂的无细胞制剂的皮内吸收实验。
家兔：1500～2000克，雌雄各半。
分组：分为耻垢分支杆菌及无细胞制剂组，每组各4只。
给药：每只兔背部皮内注射，采用实施例8制备的耻垢分支杆菌制剂组0.2ml/只，无细胞制剂组0.2ml/只，观察并测试注射局部，结果见表8。
表8
结论：观察72小时，无细胞制剂易于被吸收，未产生明显红肿、硬结，未经无细胞作用的制剂不易被吸收，产生了明显的红肿、硬结反应。此结果说明将细胞破碎制备的无细胞制剂更有利于机体的吸收，并能减少副作用。
Claims (16)
1.一种假单胞菌制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂是由假单胞菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
2.一种卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂是由卡介菌多糖、核酸制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
3.一种红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的无细胞制剂是由红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
4.一种A群链球菌制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的A群链球菌制剂的无细胞制剂是由A群链球菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
5.一种绿脓杆菌制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的绿脓杆菌制剂的无细胞制剂是由绿脓杆菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
6.一种布氏菌制剂的无细胞制剂，其特征在于，所述的布氏菌制剂的无细胞制剂是由布氏菌制剂经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
7.一种治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂，其特征在于，所述的治疗用母牛分枝杆菌的无细胞制剂是由治疗用母牛分枝杆菌的菌体经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
8.一种耻垢分支杆菌的无细胞制剂，其特征在于，所述的耻垢分支杆菌的无细胞制剂是由治疗用耻垢分支杆菌的菌体经灭活破碎后提取有效组份制备的无细胞制剂，粒度为10～1000nm，优选10～800nm，更优选10～500nm。
9.根据权利要求1所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、权利要求2所述的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、权利要求3所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、权利要求4所述的A群链球菌制剂的无细胞制剂、权利要求5所述的绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、权利要求6所述的布氏菌制剂的无细胞制剂、权利要求7所述的母牛分枝杆菌的无细胞制剂、权利要求8所述的耻垢分支杆菌的无细胞制剂，所述无细胞制剂为革兰氏阳性菌的热原均小于320EU/ml，优选小于120EU/ml。
10.权利要求1所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、权利要求2所述的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、权利要求3所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、权利要求4所述的A群链球菌制剂的无细胞制剂、权利要求5所述的绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、权利要求6所述的布氏菌制剂的无细胞制剂、权利要求7所述的母牛分枝杆菌的无细胞制剂、权利要求8所述的耻垢分支杆菌的无细胞制剂，所述无细胞制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将所述制剂加热煮沸15～60分钟得到灭活菌液；
(2)无菌试验合格的菌液经洗涤后，在无菌条件下用破碎装置破碎菌体；
(3)菌体破碎后的悬液经离心后收集沉淀，洗涤沉淀制成悬液；
(4)将悬液分装后加热灭菌，得到所述制剂的无细胞制剂。
11.根据权利要求10所述的无细胞制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的破碎装置为超高压射流对撞机，其压力为500～2000kgf/cm2，破碎至少1次，将菌体破碎到粒度小于1000nm、优选粒度10～500nm。
12.根据权利要求10所述的无细胞制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤至少2次。
13.根据权利要求10所述的无细胞制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，菌体破碎后悬液的离心条件是在4℃～室温下，6000～20000rpm离心10～150分钟；所述的洗涤是将沉淀物用无菌生理盐水离心洗涤1～5次。
14.根据权利要求10所述的无细胞制剂的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的加热为在60～65℃加热0.5～2小时。
15.根据权利要求10所述的无细胞制剂的制备方法，其特征在于，进一步包括将步骤(5)得到的无细胞制剂分装后，西林瓶在60±2℃加热30分钟或121℃加热15～30分钟。
16.权利要求1所述的假单胞菌制剂的无细胞制剂、权利要求2所述的卡介菌多糖、核酸制剂的无细胞制剂、权利要求3所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂、权利要求4所述的A群链球菌制剂的无细胞制剂、权利要求5所述的绿脓杆菌制剂的无细胞制剂、权利要求6所述的布氏菌制剂的无细胞制剂、权利要求7所述的母牛分枝杆菌的无细胞制剂、权利要求8所述的耻垢分支杆菌的无细胞制剂在制备增强免疫剂药物方面的应用。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140115 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |