CN105749260A - 一种盐酸溶菌酶阴道片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐酸溶菌酶阴道片及其制备方法和应用。所述的阴道片，包括活性成份和辅料，所述的活性成份是盐酸溶菌酶，其在盐酸溶菌酶阴道片中的重量百分比为25～48％。所述的辅料为制备盐酸溶菌酶阴道片所需的可接受的任何辅料，包括冻干粉骨架剂、粘合剂、填充剂、润滑剂和/或其他添加剂。所述阴道片具有较好的抑菌或杀菌效果，对属革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌的大肠埃希氏菌均具有较强的杀灭作用。

Description

一种盐酸溶菌酶阴道片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种阴道片及其制备方法，特别涉及一种盐酸溶菌酶阴道片及其制备方法和应用，属于医药技术领域。
背景技术
妇女阴道由于具有特殊的解剖生理特点，最容易受到各种病原体的感染，从而引起阴道炎症和其他阴道疾病，如果不积极治疗，可能引起其他妇科疾病和产妇围生期不良结局。在引起阴道炎的各种病原体中，排在第一位的是白色念珠菌，而且感染率很高，几乎占到了阴道炎病人的1/2，是目前妇女阴道炎的主要病原体，其他病原体，如滴虫、革兰阳性菌、革兰阴性菌等的感染率与过去相比有显著增高。另一方面，引起阴道炎的各病原体之间有合并感染现象，其原因是致病菌感染后，阴道自净作用受到破坏，pH值增大，酸性减弱，阴道黏膜受损，有利于混合感染的发生。
目前市场上妇科阴道用药剂型有：片剂、栓剂、凝胶剂、软胶囊、洗液等；而阴道片剂在市场中使用量较大，其中阴道片剂具有较多的优点：(1)使用方便、质量稳定、生产的机械化程度高；(2)与栓剂相比，克服了栓剂基质受体温作用熔融后连同药物一起流失而影响疗效、污染衣物及患者的不适感；(3)阴道泡腾片可以快速崩解，增加药物在阴道的分布面积，起效快，疗效高；(4)生物黏附性阴道片提高了制剂的抗排出能力，延长了阴道内的滞留时间，有利于提高生物利用度。
中国专利文件CN102178938A公开了一种海洋溶菌酶栓剂及其制备方法，其主要是以含有海洋溶菌酶、聚乙二醇4000、聚乙二醇1500、丙三醇、纯化无菌水经调配、成栓而得棕色或浅棕色鸭嘴形栓剂。以上专利很好的提供一种溶菌酶治疗妇科阴道炎的药物栓剂，不足之处在于(1)该专利制备方法溶菌酶在55℃条件下溶解，而海洋溶菌酶最适作用温度范围5～50℃，稳定性较好，其效价最高；(2)因盐酸溶菌酶在pH4.0～6.0之间稳定性好，该工艺未描述在制备过程中的pH。
溶菌酶广泛存在于高等动物、原生动物、昆虫以及植物和各种微生物中，是一种无毒蛋白质。近年来，随着生物技术的普及和人们环保意识的增强，尤其是生物高技术产业的发展，使得溶菌酶的作用价值得到更加广泛的关注和新的认识。溶菌酶在医学领域有很高的实用价值，可与血液中病菌或病毒结合，发挥消炎、抗病毒、抗肿瘤及止血等作用。溶菌酶为典型的低温酶，最适作用温度范围5～50℃，且广谱杀菌、低毒。本研究以阴道炎常见致病菌白色念珠菌以及生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌为受试菌，测定海洋低温溶菌酶的MIC和MBC，探讨该酶的抗菌活性，为寻找治疗阴道炎药物开辟一新的领域。
目前，盐酸溶菌酶制剂主要为口服制剂，临床用于急慢性咽喉炎、口腔粘膜溃疡及咳痰困难等。迄今为止，盐酸溶菌酶阴道片在治疗妇科阴道炎应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在不足与缺陷，提供了一种盐酸溶菌酶阴道片及其制备方法和应用。
发明概述
本发明以盐酸溶菌酶为有效成分，加以合适的辅料制成阴道片，实现治疗阴道感染等效果。可发挥以下作用：(1)与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并增强抗生素和其他药物的疗效；(2)改善组织基质的粘多糖代谢，从而有利于修复被炎症损伤的组织；(3)激活血小板，改善组织局部循环障碍，分解脓液，增强局部防卫；(4)防止阴道感染，更好的发挥抗菌、消炎、止痛等作用，阻止外界的细菌入侵，并对受损的阴道粘膜有愈合作用。
发明详述
术语说明：
盐酸溶菌酶，英文名Lysozymehydrochloride，系自新鲜鸡蛋清中提取的一种粘多糖的碱性蛋白酶，与氯离子结合成为溶菌酶氯化物，CAS登录号9066-59-5，市场可购。
本发明的技术方案如下：
一种盐酸溶菌酶阴道片，包括活性成份和辅料，所述的活性成份是盐酸溶菌酶，其在盐酸溶菌酶阴道片中的重量百分比为25～48％。
根据本发明，所述的辅料为制备盐酸溶菌酶阴道片所需的可接受的任何辅料，根据本领域所熟知的，包括冻干粉骨架剂、粘合剂、填充剂、润滑剂和/或其他添加剂。
根据本发明优选的，所述的冻干粉骨架剂为甘露醇；粘合剂、填充剂均为乳糖；润滑剂为硬脂酸镁，其他添加剂为纯化水。
本发明提供以下优选的技术方案：
一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
进一步优选的：
一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
更进一步优选的：
一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
或者，
一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
或者，
一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
本发明所述的盐酸溶菌酶阴道片，所使用的原料未特别说明的均为常规市购产品。
一种盐酸溶菌酶阴道片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将乳糖进行粉碎，过80～100目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用2～10％(W/W)盐酸调pH4.0～6.0，用0.1～0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6～7h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3～4h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度20～30min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在2～6％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间10～15分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合10～15分钟；压片，即得。
根据本发明优选的，步骤(3)所述的灭菌是在环氧乙烷灭菌柜中进行。
根据本发明优选的，步骤(5)所述的冻干粉水分在2％～5％(W/W)。
根据本发明进一步优选的，一种盐酸溶菌酶阴道片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将乳糖进行粉碎，过90目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用10％(W/W)盐酸调pH4.0～5.0，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度25min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在4％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间15分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合15分钟；压片，即得。
本发明所述的室温是指实验操作所处的环境温度，控制在15～30℃范围内。
下面结合实验例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
就制备方法而言，以上是本发明的优选方法，但不限于此。以上所述盐酸溶菌酶阴道片制备方法中未特别限定的，可参照现有技术。本领域的技术人员根据其熟知的知识，可以适当加以调整。制备方法中所使用的设备均为现有技术中的常规设备。
经过实验表明，盐酸溶菌酶阴道片具有较好的抑菌或杀菌效果，对属革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌的大肠埃希氏菌均具有较强的杀灭作用。盐酸溶菌酶阴道片用于治疗大鼠细菌性阴道炎获得了显著的疗效，因此，本发明还包括所述的盐酸溶菌酶阴道片在制备治疗阴道炎的药物中的应用。
根据本发明优选的，盐酸溶菌酶阴道片在制备治疗阴道炎的药物中的应用，其中，所述阴道炎包括霉菌性、细菌性或混合性阴道炎。
根据本发明优选的，所述应用是盐酸溶菌酶阴道片单独应用或者和与其它药物配合作为药剂的联合应用。
本发明所述的制备方法中盐酸溶菌酶阴道片质量标准如下，但不限以下所述盐酸溶菌酶阴道片标准。
盐酸溶菌酶阴道片
本品每片中含盐酸溶菌酶的效价不得低于3.125万单位。
【性状】本品为白色片剂。
【鉴别】
(1)取本品1片，加入纯化水30mL溶解后，取出2mL加10％(w/w)氢氧化钠溶液5滴与10％硫酸铜溶液1滴,混匀后显紫红色；
(2)取鉴别(1)项下滤液5mL，加茚三酮试液1mL，加热，溶液应显蓝紫色；
(3)取鉴别中的溶解液10mL加醋酸-醋酸钠缓冲液制成每1mL中含盐酸溶菌酶0.4mg的溶液，照分光光度法(中国药典2010年版二部附录ⅣA)测定，在280nm的波长处有最大吸收，吸收度应为0.39～0.49；
所述的醋酸-醋酸钠缓冲液按如下方法制得：取无水醋酸钠6.7g，加水约900mL，振摇使溶解，用醋酸调节pH值至5.4，加水稀释至1000mL，摇匀即得。
(4)取盐酸溶菌酶标准品适量，用磷酸盐缓冲液制成每1mL含1mg的溶液。照有关物质项下方法试验。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的条带；
所述的磷酸盐缓冲液按如下方法制得：取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g及乙二胺四乙酸二钠0.37g，加水溶解使成1000mL，调节pH值至6.0即得。
【检查】酸碱性取本品3片，加水30mL，溶解后，滤过，取滤液，依法测定，PH值应为4.0～6.0。
有关物质取本品照效价测定项下供试品溶液制备方法用磷酸盐缓冲液(pH6.2)制成每1mL中含溶菌酶1mg的溶液，作为供试品溶液。取盐酸溶菌酶标准品适量，用磷酸盐缓冲液(pH6.2)制成每1mL含2mg的溶液，作为标准品溶液。分别精密吸取各溶液10μL照电泳法(《中国药典》2010年版二部附录ⅤF)测定，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色。供试品溶液如显杂质斑点，与标准品溶液杂质斑点比较，不得更深。
融变时限取25mL量筒6只，分别加水3mL，置37℃恒温水浴中，待恒温后，分别投入1片，药片均应在5min内崩解完成。
其他应符合中国药典片剂项下有关的各项规定。
【效价测定】取本品2片，加入适量的纯化水，并时时振摇，所得液体过滤，取液体10mL，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，移入200mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置100mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
标准品溶液制备精密称取盐酸溶菌酶标准品25毫克，置100mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液溶解，定容至刻度。分别精密移取1mL、2mL溶液置50mL容量瓶中，加PH6.2磷酸盐缓冲溶液至刻度，做为标准溶液(1)及标准溶液(2)。样品溶液，标准溶液(1)标准溶液(2)置冰浴中保存；
底物悬浮液的制备称取盐酸溶酶小球菌15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.0)0.5～1mL，在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.0)适量，使总体积约为50mL，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.70±0.05(临用前配制)。
测定法精密量取盐酸溶菌酶底物试液4mL，在35℃水浴中加热5分钟，精密移取在水浴提前加热3分钟的样品溶液100μl，加入底物试液中，并在35℃水浴中加热10分钟后，再精密量取1mol/L的盐酸溶液0.5mL加入底其中，摇匀。以水做为空白，在波长640nm处，紫外可见分光光度法测量样品溶液的吸收值Ast。标准溶液(1)、标准溶液(2)按以上方法测定吸光度As1、As2。
Ws：溶菌酶标准品称取量；
Wt：样品称取量×规格；
As1：标准溶液(1)吸收度；
As2：标准溶液(2)吸收度。
下面结合实验例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实验例1、乳糖以及硬脂酸镁灭菌实验
不同的环氧乙烷灭菌压力和时间对乳糖以及硬脂酸镁灭菌效果的比较，见表1。
表1乳糖以及硬脂酸镁灭菌效果比较
由表1中可分析出：
1、环氧乙烷灭菌压力10～20Kpa，时间在3～6h条件下，乳糖以及硬脂酸镁无菌检查，不符合规定。
2、环氧乙烷灭菌压力20～30Kpa，时间在3～4h条件下，乳糖以及硬脂酸镁无菌检查，不符合规定。
3、环氧乙烷灭菌压力20～30Kpa，时间在6h条件下，乳糖无菌检查，符合规定。而硬脂酸镁无菌检查，不符合规定。
4、环氧乙烷灭菌压力35～50Kpa，时间在3～4h条件下，硬脂酸镁无菌检查，符合规定。
试验结果：乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3～4h。
实验例2、甘露醇灭菌实验
不同的高温灭菌温度和时间对甘露醇高温灭菌效果的比较，见表2：
表2甘露醇高温灭菌效果比较
由表2中可分析得出：
1、高温灭菌温度在121～126℃，时间在15～30min条件下，无菌检查，不符合规定；
2、高温灭菌温度在131℃、时间在15min、无菌检查，不符合规定；
3、高温灭菌温度在131～136℃、时间在20～30min、无菌检查，符合规定；
试验结果：甘露醇高温灭菌控制温度在131～136℃、时间在20～30min。
实验例3、盐酸溶菌酶冻干粉粒径和粒径分布的测定实验
盐酸溶菌酶阴道片剂外观、脆碎度、硬度、重量差异、融变时限、效价等质量，主要是片剂的中间体质量所控制，也是决定片剂的主要质量因素，首先研究盐酸溶菌酶冻干粉的质量；
1、仪器及材料仪器Winner99图象仪；超微振动粉碎机。
2、实验方法
样品1制备：盐酸溶菌酶冻干粉按照实施例1步骤(5)方法制备；
样品2制备：将盐酸溶菌酶进行粉碎，过80～100目筛；
2.1粒径检测
2.1.1称取样品1适量，加入20倍量(质量比W/W)正辛醇，装片，采集图像(见图1)并检测粒径；
2.1.2称取样品2适量，照上述方法装片，采集图像(见图2)并检测粒径；
2.1.3样品1与样品2的粒径检测结果，见表3：
表3样品1与样品2的粒径检测结果
显微学研究表明两种粉体的显微特征有很大的区别：图1可见有含针状体的大形晶体，平均直径35.3～56.4μm；图2可见有钟乳体大形晶体，平均直径61.8～89.6μm；从其可见具有很大的区别。
实验例4、处方筛选实验
本片剂所拟用的辅料均为药用辅料级，针对本制剂特点，设计初步筛选的处方。分别对性状、脆碎度、融变时限、效价进行考察，并注意观察制备过程现象。见表4。
表4盐酸溶菌酶阴道片处方筛选1(单位：g)
取原辅料盐酸溶菌酶、甘露醇，按照实施例1方法制备冻干粉；加入乳糖混合，然后加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀制成颗粒；用橄榄型冲模压片。对各处方进行检验，结果见下表5：
表5处方筛选试验1检验结果
结果分析：处方1、2并融变时间较长，弃用。处方3制备过程较顺利，片剂融变时间较好，故根据处方3调整辅料用量，试验3批，继续验证处方。见表6。
表6处方筛选2(单位：W/W)
取原辅料盐酸溶菌酶、甘露醇，按照实施例1方法制备冻干粉；加入乳糖混合，然后加入润滑剂硬脂酸镁混合均匀制成颗粒；用橄榄型冲模压片。对各处方进行检验，结果见下表7：
表7处方筛选试验2检验结果
结论：处方4、5、6处方所得片剂各项均良好。所以确定处方4、5、6为本制剂的最优处方。
实验例5、盐酸溶菌酶阴道片体外抑菌实验
引起阴道炎的病原体主要有白色念珠菌、阴道毛滴虫、淋球菌、沙眼衣原体、阴道加德纳菌、革兰阳性菌、革兰阴性菌等。溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种广泛存在于生物组织中的无毒蛋白质，能选择性地分解微生物的细胞壁形成溶菌现象，同时不破坏其他组织。为进一步探讨溶菌酶对阴道炎常见致病菌的抗菌活性，我们测定了该酶对白色念珠菌、生孢梭菌以及金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，为溶菌酶治疗阴道炎奠定实验和理论基础。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1盐酸溶菌酶阴道片按照实施例1方法制备，粉碎细粉过80目筛；
1.1.2菌株：白色念珠菌和生孢梭菌各40株，由中国药品生物制品检定所提供；金黄色葡萄球菌45株、大肠埃希菌45株，均为临床分离菌株。选用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和绿脓杆菌作为质控菌。
1.1.3培养基：MH肉汤培养基、厌氧培养基和真菌培养基；MH琼脂培养基、营养肉汤和小牛血清由中国药品生物制品检定所购进。
1.2方法
1.2.1MIC测定：采用平皿二倍稀释法和Denlay多点接种器进行药敏试验，试验菌用营养肉汤及脑心浸液增菌；盐酸溶菌酶用MH肉汤二倍稀释成各种所需浓度，分别加适量至平皿中，MH琼脂培养基熔化后定量注入含药液平皿内混匀，使菌液最终浓度为108cfu/L，需氧菌37℃培养18h，真菌27℃培养24h，厌氧菌置厌氧孵箱37℃孵育48h后观察结果，无菌生长的平皿中所含药物最小的浓度即为MIC。
1.2.2MBC测定：采用试管二倍稀释法，先测出试验菌的MIC，再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取0.1mL，转移到不含药液的琼脂平皿中，培养条件同MIC测定，观察测定结果，平皿上菌落数＜5个的最小药物浓度即为MBC。
2、结果
盐酸溶菌酶对白色念珠菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌有较好的抗菌活性，其MIC分别为390.06、9.74、10.93、10.93μmol/L，MBC分别为39.06、19.56、10.93、21.87μmol/L。盐酸溶菌酶对白色念珠菌和金黄色葡萄球菌的MBC为MIC的1倍，对生孢梭菌和大肠埃希菌的MBC为MIC的2倍。进一步证明了盐酸溶菌酶对阴道炎常见致病菌有较强的抗菌活性，可以进一步开发为治疗阴道炎药物而服务于临床。
实验例6、原辅料相容性实验
本发明盐酸溶菌酶阴道片研究过程中选用的盐酸溶菌酶，尤其是辅料在处方中的应用，需进行原辅料的相容性试验，原辅料相容性试验如下；
将原料与所选辅料按一定比例物理混合，按照中国药典2010版二部(附录ⅪXC)原料药与药物制剂稳定性试验指导原则中影响因素的实验方法，分别在高温50℃±2℃、湿度90％±5％、强光4500±500lx的条件下放置10天，检查放置前后变化。试验结果如下：
1、高温条件原辅料相容性试验
将原辅料按照一定比例混合，暴露置高温50℃±2℃条件下10天取样，检验结果见表8：
表8原辅料相容性试验(50℃±2℃)10天
经高温60℃±2℃条件下10天相容性试验，结果显示与各辅料性状、含量均无变化。水分检查结果显示随时间延长而有所降低。
以上结果表明盐酸溶菌酶在高温50℃±2℃条件下与辅料相容性良好。
2、光照条件原辅料相容性试验
将原辅料按照一定比例混合，暴露置光照(4500±500lx)条件下10天取样，测定各项指标，结果见表9。
表9原辅料相容性试验光照(4500±500lx)10天
以上结果表明盐酸溶菌酶在光照(4500±500lx)条件下与辅料相容性良好；经光照(4500±500lx)条件下10天相容性试验，结果显示各辅料性状、含量均无变化。
3、高湿条件原辅料相容性试验
将原辅料按照一定比例混合，暴露置高湿(90％±5％)条件下10天取样，测定各项指标，结果见表10。
表10原辅料相容性试验高湿(90％±5％)10天
经高湿90％±5％条件下10天相容性试验，结果显示各辅料性状、含量均无变化。因本法为物料暴露于高湿条件下，故水分有所增加。
以上结果表明盐酸溶菌酶在高湿90％±5％条件下与辅料相容性良好。综合试验结果表明制剂应密封保存。
实验例7、盐酸溶菌酶阴道片的长期稳定性实验
将实施例1制备的盐酸溶菌酶阴道片在上市规定的贮存条件下进行长期稳定性试验，考察盐酸溶菌酶阴道片在运输、保存、使用过程中的稳定性特征，从而作为确定有效期和贮存条件的依据。将采用PVC/铝箔包装的盐酸溶菌酶阴道片样品，放置于25℃±2℃、RH60％±10％的恒温、恒湿箱中放置24个月，分别于0、3、6、9、12、18、24个月取样，检测各项质量指标。结果见表11。
表11盐酸溶菌酶阴道片长期稳定性试验
结果：经长期稳定性24个月的考察，结果显示与0月比较各项指标无明显变化，表明盐酸溶菌酶阴道片在25℃±2℃、RH60％±10％条件下稳定性良好，在规定的各项条件下生产、包装、贮存、运输均不会对本品的质量产生不利影响，可保障临床用药安全有效。
实验例8、盐酸溶菌酶阴道片主动皮肤过敏性及阴道刺激性的实验研究
盐酸溶菌酶阴道片经阴道给药后毒副反应低，本试验观察了盐酸溶菌酶阴道片多次给予家兔阴道后所产生的刺激反应情况，以期将此开发为治疗细菌性阴道炎的新药。
1、试验材料
1.1动物健康雌性大鼠，体重200～250g；健康性成熟大耳白家兔，雌性，体重(2.75±0.25)kg由由山东大学实验动物中心提供；
1.2试验药物，盐酸溶菌酶阴道片，实施例1制备；将盐酸溶菌酶阴道片粉碎成粉末过80目筛；
赋形剂空白对照，是不加盐酸溶菌酶，由甘露醇、乳糖、硬脂酸镁、纯化水制备方法按实施例1制备片剂；并粉碎成粉末过80目筛；
阳性对照组(市售甲硝唑阴道泡腾片)，将甲硝唑阴道泡腾片粉碎成粉末过80目筛；
2、试验方法
大鼠阴道急性毒性试验：取大鼠9只，均分为3组，以相当于预计临床用量的50、10、3倍(5.0、1.0、0.3mg/kg)分别给予盐酸溶菌酶阴道片粉末，观察7～14d，均未出现中毒及死亡情况，故急性毒性试验只设一个高剂量组。取大鼠30只，体重230～250g，随机均分为3组，将动物仰卧固定，禁食、禁水8h并导尽膀胱中尿液，小心注入高剂量盐酸溶菌酶1.25g(即盐酸溶菌酶37.5mg/kg，相当于预计临床用量的50倍)和赋形剂粉末于阴道，使其与阴道黏膜接触6h；另外l0只为空白对照组(不作任何处理)。观察10d，记录动物的全身状况、体重、呼吸、四肢活动等变化及有无死亡。给药10d后将动物处死，进行局部解剖观察。
2.1阴道刺激性实验：取家兔l6只，雌性，随机均分为机械刺激组、空白赋形剂组、阳性对照组(市售甲硝唑阴道泡腾片粉末)、试验组(盐酸溶菌酶阴道片粉末)。每天定时用特制的消毒玻璃套管将粉末缓缓推人阴道深处(机械刺激组只使用玻璃套管不加药物)。根据动物给药剂量不得低于人体治疗剂量的5～15倍(人体重按50kg计算，动物体重按3.0kg计)进行取量，阳性对照组和试验组给药剂量为粉末0.1g。给药前用消毒玻璃套管刺激使其排尿，给药后使家兔在特制铁丝笼内呈仰卧位10min后放回，连续给药7d。每天观察阴道口症状(如充血、水肿及分泌物等)，在末次给药后24h内将动物处死，解剖，肉眼观察并记录阴道充血和炎症情况。取出阴道组织，在磷酸缓冲溶液(PBS溶液)中以10％甲醛溶液固定24h后，将阴道壁分上、中、下三部分取材，经石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，透射电镜下观察。按Eckstein刺激性评价标准，以充血、水肿、炎性细胞浸润及上皮细胞坏死等4项指标评分，每项刺激程度按轻重分别判定为0～4分，0分为无刺激反应，4分为严重损伤。平均分值小于4分表示刺激非常小，5～8分表示轻度刺激，9～12分表示中度刺激，l3～l6分表示刺激性严重。总分在0～8分为可接受，9～10分为边缘值，等于和大于11分为不可接受。
3、结果
3.1局部急性毒性试验：在观察期内，盐酸溶菌酶阴道片与赋形剂组、空白对照组比较，各组动物一般情况良好，摄食情况未见明显变化和异常反应，生殖道未见异常分泌物。大鼠体重、呼吸、四肢活动均无明显差异，且无大鼠死亡。对动物进行解剖观察，阴道黏膜完整，表面较为光洁，黏膜无明显充血，无红肿、溃烂现象。局部急性毒性试验表明，盐酸溶菌酶阴道片经阴道用药无毒性。
3.2阴道刺激性试验：肉眼观察，4组家免的阴道壁组织均未见明显异常。在透射电镜下观察，4组家兔的阴道均未见异常改变，细胞间存在桥粒、连接紧密、中间连接结构等正常(见图3、4、5、6)。各组家兔阴道刺激性评分见表12。可见，4组总的刺激性评分值接近，无显著差异(P＞0.05)，且均在可接受范围内，说明盐酸溶菌酶阴道片对阴道的刺激性符合规定。
表12阴道刺激性试验评分结果(n＝4)
注：与试验组比较。＊P＞0.05；
3、讨论
家兔阴道黏膜上皮由单层柱状细胞覆盖构成，人类阴道黏膜上皮则由复层扁平细胞构成，前者对外界黏膜刺激物具有高度敏感性。因此采用家兔模型研究多次给药盐酸溶菌酶阴道片及市售甲硝唑阴道泡腾片的刺激性相比，结果表明急性毒性及阴道刺激性均无明显变化，说明盐酸溶菌酶阴道片的安全性及阴道适用性较好，值得进一步研发。
实验例9、盐酸溶菌酶阴道片对大鼠细菌性阴道炎作用的实验
盐酸溶菌酶阴道片具有较好的抑菌或杀菌效果，对属革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌的大肠埃希氏菌均具有较强的杀灭作用。盐酸溶菌酶阴道片用于治疗大鼠细菌性阴道炎获得了满意的疗效，加之该制剂为纯天然的提取物且无毒副作用，资源丰富，临床应用前景广阔。研究盐酸溶菌酶阴道片治疗方案的临床疗效作一前瞻性的研究，旨在进一步客观评价这一新疗法的价值。
1、试验材料盐酸溶菌酶阴道片：由实施例1制备，粉碎过80目筛。洗必泰(阳性对照)，市购。细菌：本实验选用阴道感染常见菌2种。即金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌，均为山东省人民医院近期收集的临床分离菌株。动物Wistar大鼠，雌性，体重：200～250g，由山东大学动物中心提供；
2、试验方法
2.1大鼠阴道金葡菌、大肠埃希氏菌混合感染模型的建立首先用无菌较硬棉拭子反复涂擦大鼠阴道内壁15次。使阴道粘膜机械性损伤，致使棉拭子粘有少许血性粘液为度。然后向大鼠阴道注入金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的混合菌液。两菌活菌计数分别为4X103CFU/mL和1X104CFU/mL，注射菌液量为0.2mL/200g，注入部位距阴道口5mm。每日接种一次，共接种3次，每日观察大鼠阴道粘膜。并分别在接种首日后的第5天和第7天取阴道分泌物进行镜检和细菌培养，并作菌株鉴定。镜检和菌株鉴定均为阳性者为建立成功的细菌性阴道炎大鼠模型。
2.2菌株鉴定标准
2.2.1金黄色葡菌球菌的鉴定：(1)镜检为革兰氏阳性球菌，无芽孢。无荚膜，排列不规则，堆积似葡萄状；(2)血液琼脂平板培养24～48h，在菌落周围产生溶血环；(3)血浆凝固酶试验呈阳性。
2.2.2大肠埃希氏菌的鉴定：(1)镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌；(2)能发酵乳糖并产酸产气，靛基质、甲基红、Vp、柠檬酸盐试验反应为++--(典型大肠埃希氏菌)或----(非典型大肠埃希氏菌)。
2.3动物的分组与治疗将造模成功的大鼠50只，分别随机分为5组。即大剂量组、中剂量组、小剂量组、洗必泰(阳性对照)组、模型组。另取10只正常大鼠为空白(正常)对照组。溶菌酶3个剂量组分别给予溶菌酶l0mg/kg、5mg/kg、2.5mg/kg，洗必泰组给予洗必泰5mg/kg，模型组和空白对照组给生理盐水冲洗，连续7d。
3、观察指标
3.1细菌转阴率停药后第1、2、5d取大鼠阴道分泌物进行鉴定，3次细菌鉴定均为阴性定为转阴。
3.2阴道病变治愈程度于停药第6天处死大鼠解剖，取阴道进行肉眼观察，并按表13进行评分。以模型组的分值为炎症程度100％，给药组与模型组比较，可得出给药组的炎症程度。空白组与给药组炎症程度的差值即为给药组治愈程度。
表13大鼠阴道粘膜炎性刺激评分标准
4、结果
4.1盐酸溶菌酶膜对大鼠阴道细菌感染的转阴率(见表14)。
表14盐酸溶菌酶膜对大鼠阴道细菌感染的转阴率，n＝10
盐酸溶菌酶阴道片对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的转阴率分别为：大剂量组为80％和90％，中剂量组为50％和60％，小剂量组为30％，与阳性组比较，随剂量的增加而对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的抑菌率也增高，与模型组比较也有可比性。
4.2盐酸溶菌酶阴道片对大鼠阴道混合细菌感染阴道炎标本的炎症分值和炎症程度(见表15)。
表15盐酸溶菌酶阴道片对大鼠阴道混合细菌感染阴道炎标本的炎症分值和炎症程度(n＝10)
注：以模型对照组炎症程度为100％。
盐酸溶菌酶阴道片大剂量组、中剂量组、小剂量组和阳性对照组对大鼠阴道混合细菌感染的阴道炎标本的转阴率分别为7.1％、17.9％、35.7％和17.9％。
4.3盐酸溶菌酶阴道片对细菌混合感染大鼠阴道炎的疗效(见表16)。
表16盐酸溶菌酶阴道片对细菌混合感染大鼠阴道炎的疗效
盐酸溶菌酶阴道片大剂量组、中剂量组、小剂量组和阳性对照组对大鼠细菌混合感染阴道炎的疗效分别为92.9％、82.1％、64.3％和82.1％。
5、讨论
阴道炎是妇科常见病和多发病，给广大妇女带来身心的痛苦。而引起阴道炎的致病菌有多种。本发明实验研究可知：盐酸溶菌酶阴道片具有较好的抑菌或杀菌效果，对属革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性菌的大肠埃希氏菌均具有较强的杀灭作用。盐酸溶菌酶阴道片用于治疗大鼠细菌性阴道炎获得了满意的疗效，加之该制剂为纯天然的提取物且无毒副作用，资源丰富，临床应用前景广阔。
使用盐酸溶菌酶阴道片，融变时间迅速，增加了局部用药浓度，能较快发挥效果，提高了临床疗效，并减少了全身性副作用。本研究表明盐酸溶菌酶阴道片为安全有效、简单方便的局部治疗药物，可作为治疗阴道感染的药物。
本发明的有益效果如下：
1.盐酸溶菌酶阴道片中的盐酸溶菌酶具有促进纤维芽细胞的增殖作用、促进试验性创伤愈合作用、促进结缔组织纤维形成作用等药理作用。溶菌酶阴道片中的活性成分盐酸溶菌酶为一种粘多糖溶解酶，其通过水解破坏组成细菌细胞壁的肽糖分子的由N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖氨之间的β-(1，4)糖苷键，使细胞因渗透压不平衡引起破裂，从而导致菌体细胞壁溶解而杀死细菌。
2.本发明的盐酸溶菌酶阴道片采用冻干法进行制粒，使得盐酸溶菌酶阴道片中大幅度的减少辅料的种类和使用量，融变时限显著提高，并且盐酸溶菌酶阴道片稳定性好，工艺简便。
3.本发明中加入填充剂乳糖，其中乳糖在盐酸溶菌酶阴道片中即起到填充剂作用，又起到粘合剂作用，使得冻干粉直接压片。
4.盐酸溶菌酶阴道片的作用特点为局部使用，所使用的原辅材料无毒，对阴道刺激小，无副作用，使用更安全。
综上所述，本发明提供了一种能够迅速融变的盐酸溶菌酶阴道片药物，极大地提高了融变速度；在确保盐酸溶菌酶阴道片药物符合质量标准的前提下同时使得其治疗功效不受影响，具有重大的创新突破，市场前景良好。
附图说明
图1是实验例3盐酸溶菌酶冻干粉粒径和粒径分布Winner99图；
图2是实验例3盐酸溶菌酶过80～100目筛粉粒径和粒径分布Winner99图；
图3是实验例8机械刺激组家免的阴道壁组织透射电镜图；
图4是实验例8空白赋形剂组家免的阴道壁组织透射电镜图；
图5是实验例8阳性对照组家免的阴道壁组织透射电镜图；
图6是实验例8试验组家免的阴道壁组织透射电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。
实施例中原辅料说明：
实施例中所涉及的装置和设备均为固体制剂生产通用设备，市场可购，说明如下:
万能高效粉碎机(型号30B)、方形振荡筛(型号FS-0.5M2-X)、高速混合机(型号GHL200)、三维运动混合机(型号SYH-800)以上设备：常州市腾龙药化设备有限公司有售。冻干机(型号LGJ-200F)北京松源华兴科技发展有限公司有售。全自动双进料高速压片机(型号GZPS-49)：北京翰林航宇科技发展股份公司有售。
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
实施例1、一种盐酸溶菌酶阴道片的制备方法
1、一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
2、制备方法如下：
(1)将乳糖进行粉碎，过90目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用10％(W/W)盐酸调pH4.0～5.0，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度25min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在4％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间15分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合15分钟；压片，即得。
实施例2、一种盐酸溶菌酶阴道片的制备方法
1、一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
2、制备方法如下：
(1)将乳糖进行粉碎，过80～100目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用6％(W/W)盐酸调pH5.0～6.0，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3～4h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度20～30min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在2～6％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间13分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合13分钟；压片，即得。
实施例3、一种盐酸溶菌酶阴道片的制备方法
1、一种盐酸溶菌酶阴道片，由以下原料按质量份制成：
2、制备方法如下：
(1)将乳糖进行粉碎，过80～100目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用2％(W/W)盐酸调pH4.5～5.0，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3～4h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度20～30min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在2～6％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间10分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合10分钟；压片，即得。

Claims (10)

1.一种盐酸溶菌酶阴道片，包括活性成份和辅料，其特征在于，所述的活性成份是盐酸溶菌酶，其在盐酸溶菌酶阴道片中的重量百分比为25～48％。
2.如权利要求1所述的盐酸溶菌酶阴道片，其特征在于，所述的辅料为制备盐酸溶菌酶阴道片所需的可接受的任何辅料，根据本领域所熟知的，包括冻干粉骨架剂、粘合剂、填充剂、润滑剂和/或其他添加剂。
3.如权利要求2所述的盐酸溶菌酶阴道片，其特征在于，所述的冻干粉骨架剂为甘露醇；粘合剂、填充剂、润滑剂均为乳糖；润滑剂为硬脂酸镁，其他添加剂为纯化水。
4.如权利要求1～3任一所述的盐酸溶菌酶阴道片，其特征在于，由以下原料按质量份制成：
5.如权利要求4所述的盐酸溶菌酶阴道片，其特征在于，由以下原料按质量份制成：
6.如权利要求5所述的盐酸溶菌酶阴道片，其特征在于，由以下原料按质量份制成：
或者，
或者，
7.如权利要求4～6任一所述的盐酸溶菌酶阴道片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将乳糖进行粉碎，过80～100目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用2～10％(W/W)盐酸调pH4.0～6.0，用0.1～0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得盐酸溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6～7h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3～4h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度20～30min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在2～6％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间10～15分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合10～15分钟；压片，即得。
8.如权利要求7所述的盐酸溶菌酶阴道片的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的灭菌是在环氧乙烷灭菌柜中进行；步骤(5)所述的冻干粉水分控制在2％～5％(W/W)。
9.如权利要求7所述的盐酸溶菌酶阴道片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将乳糖进行粉碎，过90目筛；
(2)按配比称取盐酸溶菌酶，加纯化水溶解，用10％(W/W)盐酸调pH4.0～5.0，用0.22μm滤膜过滤除菌后，将所得溶菌酶料液输送至已灭菌的罐内，常温备用；
(3)将乳糖和硬脂酸镁分别进行灭菌,温度为40～60℃，乳糖控制灭菌压力在20～30Kpa，时间在6h；硬脂酸镁控制灭菌压力在35～50Kpa，时间在3h，备用；
(4)按配比称取甘露醇，升温至温度至131～136℃，并保持温度25min进行灭菌；输送至已灭菌的罐内存放，降至室温备用；
(5)将步骤(2)和步骤(4)混合后，进行搅拌；配制成混合溶液，然后放入冻干箱中；开启冻干机，将冻干搁板降至-40℃～-50℃，待混合溶液温度降至-30℃～-40℃，预冻保温2～3小时；开始抽真空，然后逐步提高温度至-10℃～-15℃，真空干燥15～20小时；再次提高搁板温度至30℃～40℃，保持1～2小时，真空度维持在0～10Pa，直至制品水分在4％(W/W)冻干结束得冻干粉，出箱即得；
(6)将步骤(3)灭菌的乳糖与步骤(5)制得的冻干粉置入混合机中；进行充分的混合，时间15分钟；再将步骤(3)硬脂酸镁加入，继续混合15分钟；压片，即得。
10.如权利要求1～6任一所述的盐酸溶菌酶阴道片在制备治疗阴道炎的药物中的应用，其中，所述阴道炎包括霉菌性、细菌性或混合性阴道炎。
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