CN109576180A - 一株赤红球菌及其作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株赤红球菌及其作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用。本发明的赤红球菌也称为红色红球菌(Rhodococcus ruber)RDC‑01，保藏编号为CGMCC NO.16640，该菌具有提高调节机体免疫的功能，可非特异增强TB淋巴细胞、巨噬细胞，NK细胞的活性，诱生干扰素等多种细胞因子，将该菌灭活后作为免疫佐剂添加入油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体产生，与单独使用油乳剂灭活疫苗相比，能够产生高滴度的抗体，使用安全，无短期及长期的毒副作用，在动物用疫苗制备领域应用前景良好。

Description

一株赤红球菌及其作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用
技术领域
本发明属于微生物学与免疫学领域，具体地说，涉及一种赤红球菌及其作为免疫佐剂在制备疫苗中的应用。
背景技术
禽用各类传染病的灭活疫苗，对防控这些疫病发挥了重要作用。使用灭活疫苗希望能够达到消除性免疫，即在接受某种疫苗免疫后，完全保护机体受此类疫病的感染发病，或者在感染后不排毒，不将病毒传播给其它动物。但现有灭活疫苗免疫机体后抗体产生较慢，抗体持续期较短，抗体水平整齐度差。为了使抗体水平整齐度较好，一方面，一般需要多次免疫，维持较高的抗体水平；另一方面，禽用灭活疫苗在配制时需要进行抗原浓缩，以保证疫苗中的抗原含量和疫苗的免疫效果。这些措施都增加了疫苗的生产成本，因此，研究开发安全、高效、经济的禽用油乳剂灭活疫苗专用免疫佐剂成为研究热点。
免疫佐剂就是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型，而本身无抗原性的物质，又称免疫佐剂或抗原佐剂。常用的免疫佐剂有灭活的分岐杆菌(如卡介苗和结核杆菌等)、细胞因子、双链聚肌苷酸、铝胶佐剂及矿物油佐剂等。目前免疫佐剂普遍存在以下问题：(1)灭活的结核杆菌佐剂，由于自然的结核分岐杆菌具有高毒力，对人和动物有致病性。目前都是采用减毒的卡介苗制备佐剂，但是仍然存在后续处理要求高，容易造成灭活不彻底导致作为佐剂应用是引发高度的动物健康危险性，此外在注射部位会引起强烈的炎症和溃疡，使用受到限制。(2)细胞因子具有调整和重建免疫应答的能力，但价格较为昂贵，不适用于动物疫苗。(3)双链聚肌苷酸(聚肌胞)是一种人工合成的双链核糖核酸，是一种干扰素诱导剂，有抗病毒和免疫调节功能，但是鉴于其半衰期短，体内呈一过性反应，其作为禽用油乳剂灭活疫苗免疫佐剂的效用仍不明确。(4)铝胶佐剂是目前动物疫苗常用佐剂，其主要问题是：①主要激活Th2型免疫细胞，只诱导体液免疫应答，适用于以抗体保护为主的疾病疫苗；②铝胶佐剂在注射部位缓慢释放抗原的效应较低，对很多抗原效果不确实。
综上所述，目前常用的疫苗佐剂，由于局部刺激强烈、诱导免疫应答差等诸多缺点，限制了其应用。因此，开发新一代高效、低毒、廉价的疫苗佐剂用于改善动物免疫效果变得十分迫切，成为畜禽养殖业亟待解决的重要问题。
赤红球菌(Rhodococcus rubber)是降解苯酚的专性菌，对原油中苯酚、烃类及芳烃类化合物具有较高的降解作用，现有技术常利用赤红球菌的特性降解废水中的有机污染物，促进污染环境的改善，保护生态环境。赤红球菌在除了环境治污方面的应用有广泛的报道外，未有其他应用的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有调节机体免疫功能，高免疫刺激力的赤红球菌在作为免疫佐剂方面的用途。
为了实现本发明的目的，本发明的赤红球菌(Rhodococcus rubber)RDC-01是从广州市番禺区附近郊野红土中筛选到的。经16S rRNA基因序列分析和培养特性鉴定，该菌株为赤红球菌也称为红色红球菌。该菌株已于2018年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为赤红球菌(Rhodococcus rubber)，保藏号为CGMCCNo.16640。
本发明的赤红球菌具有以下特征：属于革兰氏阳性菌，好氧培养；菌落呈橙色、黄色、红色或桔黄色，圆形不透明；细胞形态为球状或短杆状，无鞭毛，不运动，不产芽孢；能够利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，不能利用甘露糖、蔗糖、棉子糖。细菌细胞壁肽聚糖属A1γ型，含有大量内消旋二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖。
所述的赤红球菌(Rhodococcus rubber)RDC-01优选好氧培养；氧化酶阴性；接触酶阳性；V.P.反应阳性；甲基红反应阴性；革兰氏染色为阳性；镜检细胞形态复杂，球形细胞可萌芽变成短杆状，形成丝状体或产生大量分枝菌丝，杆状细胞、丝状体和菌丝体的片段形成下一代的球形和短杆状细菌。
在本发明的实施例中，用于培养赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的培养基为：蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖15g/L，NH4SO4 2g/L，pH7.0-7.5。
本发明提供了含有赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的菌剂。
本发明提供了含有赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的药物。
优选地，所述的药物为免疫佐剂、保健品或疫苗。
本发明提供的赤红球菌作为免疫佐剂具有如下优点：(1)具有高表达量的赤红球菌细胞壁肽聚糖，革兰氏染色呈现阳性；(2)自然无毒力，不会引起研究人员和生产人员发生意外感染，降低了实验室生物材料泄露造成的环境污染的可能；(3)好氧发酵，发酵条件要求低；(4)增值速度快，发酵周期短；(5)营养要求不高，发酵成本低；(6)后处理简单，活性成分损耗少。
本发明提供灭活赤红球菌作为免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将赤红球菌RDC-01活化后接种至摇瓶培养基中，30～37℃振荡培养至对数生长后期，收集摇瓶菌种；(2)将摇瓶菌种接种至种子培养基中，30～37℃培养至对数生长期，优选30℃，得种子液；(3)将所述种子液接种至发酵培养基中，30～37℃发酵完成后，优选30℃，离心收集沉淀。
种子培养基为：蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖15g/L，NH4SO4 2g/L，pH7.0-7.5，优选pH7.3；发酵培养基同种子培养基；
(4)将步骤(3)中收集的沉淀用生理盐水或注射用水清洗三遍，121℃高压灭菌15min，用无菌生理盐水制成混悬液，4℃保存备用；
进一步优选地，所述疫苗为动物用油乳剂疫苗。
更进一步，其中赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01在疫苗中的浓度为0.025-0.75mg/mL(菌体干重)。优选地，赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01在疫苗中的浓度为0.025-0.40mg/mL(菌体干重)。
本发明提供了含有赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的免疫细胞诱导刺激剂。
本发明提供了赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01在制备免疫细胞诱导刺激剂中的应用。
上述应用中，进一步地，所述免疫细胞为T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞。
本发明提供了赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01在制备干扰素诱生剂中的应用。
本发明提供了一种动物用油乳剂灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)佐剂液的制备：取所述的赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01溶于生理盐水中制备成10-100mg/mL浓度的佐剂液(菌体干重)；将佐剂液高压灭菌处理；优选地，RDC-01溶于生理盐水中制备成50mg/mL浓度的佐剂液；
(2)抗原水相的制备：取80-98体积份的灭菌抗原，无菌条件下添加1-10体积份的佐剂液，再加入2-8体积份灭菌的吐温80，至吐温80完全溶解后得到抗原水相；所述抗原水相中赤红球菌的浓度为0.1-1.0mg/mL(菌体干重)；
(3)疫苗的制备：抗原水相与灭菌油相的体积比为1:1.5-1:3混合进行乳化，制备得到油乳剂灭活疫苗。优选体积比为1：2。
上述制备方法中，所述乳化，是在抗原水相加入过程中保持4000-6000rpm/min低速搅拌，带抗原水相完全加入到灭菌油相后，调节转速为12000-20000rpm/min，进行高速剪切乳化3-8min。
本发明的实施例中，选用的油相含有6％(体积百分比)司盘80和2％(体积百分比)硬酯酸铝。
上述制备方法制得的动物用油乳剂灭活疫苗属于本发明的保护范围，所述疫苗为禽用油乳剂灭活疫苗。优选地，所述禽用油乳剂灭活疫苗为禽用禽流感灭活疫苗。
本发明的有益效果在于，本发明发现了赤红球菌的新用途，本发明分离得到的赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01(1)具有高免疫刺激活性，可非特异增强T、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞的活性，诱生干扰素等多种细胞因子，其添加到禽用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生。(2)本发明的赤红球菌扩大培养工艺中，具有发酵工艺简单、生产周期短、产量高、成本较低等特点，适合商业化生产，具有良好的应用前景。(3)本发明提供的赤红球菌制备的禽用油乳剂灭活疫苗用于免疫动物后，诱导的抗体水平显著高于无佐剂添加的对照组疫苗，使用安全，无短期及长期的毒副作用，在动物用疫苗制备领域应用前景良好。
附图说明
图1为赤红球菌RDC-01接种至pH值7.0的LB培养基中，分别在25℃、28℃、30℃、35℃、37℃下培养的菌液OD值。
图2为赤红球菌RDC-01接种至pH值7.0的LB培养基中，分别在25℃、28℃、30℃、35℃、37℃下培养的菌干重。
图3为将同浓度同体积的赤红球菌接种至pH值分别为6.0、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5和8.0的LB培养基中30℃培养的菌液OD值。
图4为将同浓度同体积的赤红球菌接种至pH值分别为6.0、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5和8.0的LB培养基中30℃培养的菌干重。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的(CGMCC NO.16640)分离和鉴定
(1)供试土壤：土壤样品取自广州市郊红土，采样时去掉土壤表层枯枝落叶层和根，以避免植物对土壤样品的影响。采样深度为5-10cm。采样时间为2017年1月下旬，过10目筛，4℃保存。
(2)菌种筛选：取新鲜土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡制成菌悬液，在试管中梯度稀释。选取三个稀释度(10-3—10-5)的菌悬液涂布于LB培养基，37℃恒温培养，计数观察菌落的形态特征，统计不同土壤中自生菌的种类。选取长势良好的菌株6株，用牙签分别挑取不同种类的单菌落各5个，接种到新鲜的LB培养基上，37℃培养后，革兰氏染色，观察其菌体形态特征。选取革兰氏染色呈现阳性菌落，连续划线纯化多次。连续传代培养后，初步剔除生长缓慢的株菌，选取1株长势较好的优势菌命名为RDC-01。RDC-01菌株菌落形态呈小圆形、橙色。
(3)菌种鉴定：对分离的菌株RDC-01进一步用分子生物学方法鉴定，扩增获得的16S rDNA序列。测序结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性检索，结果表明菌株RDC-01为Rhodococcus ruber(赤红球菌也称为红色红球菌)。该菌株已于2018年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为赤红球菌(Rhodococcusruber)，保藏号为CGMCC No.16640。
(4)分离菌的微生物学特性为：属于革兰氏阳性菌，好氧培养；菌落呈橙色、黄色、红色或桔黄色，圆形不透明；细胞形态为球状或短杆状，无鞭毛，不运动，不产芽孢；能够利用葡萄糖、果糖、柠檬酸盐，不能利用甘露糖、蔗糖、棉子糖。细菌细胞壁肽聚糖属A1γ型，含有大量内消旋二氨基庚二酸、阿拉伯糖和半乳糖。RDC-01理化测试结果来自北京麦克罗科技有限公司为该菌做出的鉴定分析报告。
表1菌株RDC-01理化试验结果
实施例2中性红法检测赤红球菌对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
巨噬细胞(缩写为)属免疫细胞，能激活调节淋巴细胞或其他免疫细胞，令其对病原体作出反应，也能通过其分泌淋巴因子、TNF、干扰素等杀伤靶细胞。中性红法是检测吞噬功能常用的检测方法之一。巨噬细胞吞噬中性红的量能够反映其吞噬功能，结果以A值表示。
(1)实验动物：BALB/C小鼠40只，体重为18-22g，均为雄性。
培养基：蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖15g/L，NH4SO4 2g/L，pH7.3。
0.09％中性红：称90mg中性红生物染色素，溶于100mL生理盐水中，121℃高压灭菌。
细胞裂解液：0.1mol/L乙酸：乙醇＝1：1(V/V)
(2)赤红球菌RDC-01摇瓶30℃培养36h，收集菌体，用注射用水清洗三遍，121℃高压灭菌15min，用无菌生理盐水制成菌体干重浓度分别为50mg/mL、100mg/mL和200mg/mL的混悬液。
(3)巨噬细胞功能影响试验：试验组小鼠30只，采用灌胃剂量分别为1.25g/kg、2.5g/kg、5.0g/kg(g/kg指每公斤体重小鼠灌胃的赤红球菌RDC-01混悬液中赤红球菌的干重质量)，每日灌胃0.5mL，每组均连续给药20日，对照组10只，采取等量生理盐水代替。停药次日将小鼠颈椎脱臼致死，以无菌操作方式提取腹腔液，离心洗涤后镜检计数，并以5％苔酚蓝观察活性在95％以上，调节溶液的浓度为2×106/mL，加入96孔板中，每孔100μL，37℃、5％CO2培养4h，弃上清，洗涤后加入一定量的0.075％中性红溶液，37℃、5％CO2培养1h，弃上清，洗涤后加入细胞裂解液150μL.静置过夜，酶标仪570nm测定吸光值OD570。
(4)结果见表2：
表2不同灌胃剂量的RDC-01对机体巨噬细胞吞噬功能的影响
注：与对照组相比较*：P＜0.05；**：P＜0.001
与对照组比较，赤红球菌三组不同剂量试验组均具有明显提高小鼠吞噬中性红的作用(P＜0.05)，说明其具有显著的激活小鼠吞噬功能和提高机体应激反应的能力，其中5.0g/kg剂量组非常显著的提高小鼠吞噬中性红的作用。试验结果表明本发明的赤红球菌RDC-01能显著提高的吞噬功能，低剂量组(1.25g/kg灌胃剂量)已显示显著的激活效果，其作用强度随剂量的加大而增强。
实施例3 H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的制备
(1)佐剂样本处理及定量
取无菌生理盐水制成的赤红球菌RDC-01混悬液，摇匀后准确量取10mL至玻璃培养皿中，于80℃鼓风干燥箱中持续烘干24h后每隔1h称重1次，直至前后两次称量重量一致为止，计算混悬液中菌体干重，以无菌生理盐水将混悬液配制成100mg/mL(菌体干重)的佐剂液，4℃保存备用。
取上述赤红球菌RDC-01佐剂液10mL，溶于10mL生理盐水后制备成50mg/mL浓度的佐剂液，4℃保存备用。
(2)抗原(水相)的制备：
①无佐剂对照组抗原(水相)：取92mL灭活的H5亚型禽流感抗原(H5亚型禽流感抗原为鸡胚制备)，无菌条件下添加1mL生理盐水，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(总量为100mL)。
②佐剂组抗原(水相，佐剂终浓度为50mg/mL)：取92mL灭活的H5亚型禽流感抗原(H5亚型禽流感抗原为鸡胚制备)，无菌条件下添加1mL步骤(1)制得的佐剂液，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(水相，总量为100mL)。
(3)疫苗制备：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
(4)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫60日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫8只，每日观察鸡的健康状态，连续观察28天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(5)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫60日龄SPF鸡，其中空白组1组8只，不进行任何免疫；对照组以0.5mL/只剂量免疫1组8只，试验组以0.5mL/只剂量免疫3组，每组8只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后2周起，每周采血分离血清进行H5亚型禽流感的HI检测，连续检测3周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。结果如表3所示。表3中，①②③代表免疫14d、21d、28d；试验组为平行三组，每组8只实验对象。
表3.免疫后HI效价检测结果
结论：H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗实验中，免疫后14天，佐剂组疫苗比无佐剂对照组疫苗表现出更高抗体水平的趋势，至免疫后28天，佐剂组比对照组具有更高抗体水平并且二者间抗体水平差异增大。本实验可以看出，赤红球菌RDC-01作为佐剂能显著增强H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗抗体水平。
实施例4 H5亚型禽流感(D7株)油乳剂灭活疫苗的制备(1)佐剂样本处理及定量
取无菌生理盐水制成的赤红球菌RDC-01混悬液，摇匀后准确量取10mL至玻璃培养皿中，于80℃鼓风干燥箱中持续烘干24h后每隔1h称重1次，直至前后两次称量重量一致为止，计算混悬液中菌体干重，以无菌生理盐水将混悬液配制成100mg/mL(菌体干重)的佐剂液，4℃保存备用。
取上述赤红球菌RDC-01佐剂液10mL，溶于10mL生理盐水后制备成50mg/mL浓度佐剂液，4℃保存备用。
(2)抗原(水相)的制备：
①无佐剂对照组抗原(水相)：取92mL灭活的H5亚型禽流感(D7株)抗原，无菌条件下添加1mL生理盐水，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(水相，总量为100mL)。
②佐剂组抗原(水相，佐剂终浓度为50mg/mL)：取92mL灭活的H5亚型禽流感(D7株)抗原，无菌条件下添加1mL佐剂液，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(水相，总量为100mL)。
(3)疫苗制备：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
(4)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫10日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫8只，每日观察鸡的健康状态，连续观察28天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(5)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫10日龄SPF鸡，0.5mL/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行H5亚型禽流感(D7株)的HI检测，连续检测4周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。检测结果如表4所示。
表4免疫后HI效价检测结果
结论：H5亚型禽流感(D7株)油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后7天，佐剂组疫苗比对照组疫苗表现出更高抗体水平的趋势，至免疫后28天，佐剂组比对照组抗体水平差距加大，即佐剂组比对照组抗体高。本实验可以看出，赤红球菌RDC-01作为佐剂能够显著增强机体免疫力。
实施例5 H5亚型禽流感(rD8株)油乳剂灭活疫苗的制备
(1)佐剂样本处理及定量
取无菌生理盐水制成的赤红球菌RDC-01混悬液，摇匀后准确量取10mL至玻璃培养皿中，于80℃鼓风干燥箱中持续烘干24h后每隔1h称重1次，直至前后两次称量重量一致为止，计算混悬液中菌体干重，以无菌生理盐水将混悬液配制成100mg/mL(菌体干重)的佐剂液，4℃保存备用。
取上述赤红球菌RDC-01佐剂液10mL，溶于10mL生理盐水后制备成50mg/mL浓度佐剂液，4℃保存备用。
(2)抗原(水相)的制备：
①无佐剂对照组抗原(水相)：取92mL灭活的H5亚型禽流感(rD8株)抗原，无菌条件下添加1mL生理盐水，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(水相，总量为100mL)。
②佐剂组抗原(水相，佐剂终浓度为50mg/mL)：取92mL灭活的H5亚型禽流感(rD8)抗原，无菌条件下添加1mL佐剂液，再加入7mL吐温80，震荡或搅拌至吐温80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原(水相，总量为100mL)。
(3)疫苗制备：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原(水相)100mL，缓慢加入200mL油相(6％司盘80和2％硬酯酸铝)，使用乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化5min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃备用。
(4)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫10日龄SPF鸡，1mL/只，每组疫苗免疫8只，每日观察鸡的健康状态，连续观察14天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(5)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫10日龄SPF鸡，0.5mL/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行H5亚型禽流感(rD8株)的HI检测，连续检测4周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。检测结果如表5所示。
表5免疫后HI效价检测结果
结论：H5亚型禽流感(rD8株)油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后7天，佐剂组疫苗比对照组疫苗表现出更高抗体水平的趋势，至免疫后28天，佐剂组比对照组抗体水平差距加大，即佐剂组比对照组抗体高。本实验可以看出，佐剂免疫增强显著。
实施例6赤红球菌的毒性试验
(1)实验动物：BALB/C小鼠30只，体重为18-22g，均为雄性。
培养基：蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖15g/L，NH4SO4 2g/L，pH7.3。
(2)赤红球菌混悬液的制备：赤红球菌RDC-01摇瓶30℃培养36h，收集菌体，用注射用水清洗三遍后，121℃高压灭菌15min，用无菌生理盐水制成200mg/mL和400mg/mL(菌体干重)混悬液。
(3)实验方法：将小鼠分为3组，每组各10只。对照组10只，以无菌生理盐水0.5mL/天灌胃；试验组分2组，各10只，0.5mL/天灌胃，第1组赤红球菌样品浓度200mg/mL，第2组赤红球菌样品浓度400mg/mL，连续观察20日。
(4)结果：灌胃后试验组小鼠与对照组相比，未见行为异常，未见任何毒性反应。
实施例7赤红球菌RDC-01培养条件的优化
(1)培养温度和时间的考察
将同浓度同体积赤红球菌RDC-01接种至pH值7.0的LB培养基中，分别在25℃、28℃、30℃、35℃、37℃下培养。
图1、图2可以得出，当温度为30℃是红球菌的生长较快。可以看到当培养时间超过36h后，OD值在增加，但是菌液中的菌干重均开始降低。综上所述，选取的最优培养温度为30℃，培养时间为36h。
(2)pH值的考察
将同浓度同体积的赤红球菌接种至pH值分别为6.0、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5和8.0的LB培养基中30℃培养。结果：图3分析可见，pH值为7.0、7.3、7.5和8.0的培养基中菌体OD值生长较快，培养36h OD值都趋于平缓，结合菌液中的菌干重图(图4)分析，最终选定最优培养pH值为7.3。
(3)培养基成分优化实验：设计四因素三水平正交实验考察影响因素和水平。将同浓度同体积的赤红球菌接种至pH 7.3的不同培养基中30℃培养。
表6培养基各组分L9(34)正交实验结果
根据正交实验结果选取酵母粉10g和15g水平，蛋白胨选取10g和15g水平，葡萄糖选取5g和15g水平，硫酸铵选取2g和6g水平，设计四因素二水平正交实验进一步验证影响因素和水平。
表7培养基各组分L8(24)正交实验结果
结果：根据上述结果确定最优培养基成分为：酵母粉15g/L，蛋白胨15g/L，葡萄糖15g/L，硫酸铵选取2g/L。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一株赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01，其保藏编号为CGMCC NO.16640。
2.含有权利要求1所述的赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的菌剂。
3.含有权利要求1所述的赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01的药物。
4.如权利要求3所述的药物，其特征在于，其为免疫佐剂、保健品或疫苗。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，所述疫苗为动物用油乳剂疫苗。
6.如权利要求3-5任一所述的药物，其特征在于，赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01在疫苗中的浓度为0.025-0.75mg/mL。
7.权利要求1所述的赤红球菌在制备免疫细胞诱导刺激剂或在制备干扰素诱生剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞。
9.一种将赤红球菌制作为免疫佐剂的方法，包括以下步骤：
(1)将赤红球菌RDC-01活化后接种至摇瓶培养基中，30～37℃振荡培养至对数生长后期，收集摇瓶菌种；
(2)将摇瓶菌种接种至种子培养基中，30～37℃培养至对数生长期，优选30℃，得种子液；所述种子培养基为：蛋白胨15g/L，酵母粉15g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖15g/L，NH4SO4 2g/L，pH7.0-7.5，优选pH7.3；
(3)将所述种子液接种至发酵培养基中，30～37℃发酵完成后，优选30℃，离心收集沉淀，用生理盐水或注射用水冲洗沉淀三次后，离心收集沉淀；发酵培养基同种子培养基；
(4)将步骤(3)中收集的沉淀高压灭菌，即得。
10.一种动物用油乳剂灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)佐剂液的制备：取权利要求1所述的赤红球菌(Rhodococcus ruber)RDC-01高压灭菌处理后，溶于无菌生理盐水中制备成10-100mg/mL浓度的佐剂液；
(2)抗原水相的制备：取80-98体积份的灭菌抗原，无菌条件下添加1-10体积份的佐剂液，再加入2-8体积份灭菌的吐温80，至吐温80完全溶解后得到抗原水相；所述抗原水相中赤红球菌的浓度为0.1-1.0mg/mL；
(3)疫苗的制备：抗原水相与灭菌油相的体积比为1:1.5-1:3混合进行乳化，制备得到油乳剂灭活疫苗。
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