CN110184215A - 一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用 - Google Patents

一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用，所述菌株为赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM‑12，于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17525；其可用于微生物发酵制备赤红球菌细胞及其提取物：赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM‑12经发酵培养后收集菌体细胞，以纯化水洗涤得湿细胞；湿细胞反复冻融结合超声波破壁，再以无水乙醇提取即得赤红球菌提取物。本发明赤红球菌菌株能够应用于工业化发酵生产，制备赤红球菌菌体细胞及赤红球菌提取物，制备的产物具有提高免疫活性及抑瘤作用的功能，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

Description

一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用
【技术领域】
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用。
【背景技术】
免疫功能是指机体在淋巴细胞、单核细胞和其他有关细胞及其产物的相互作用下完成对疾病的抵御作用。免疫是维护机体生理稳定和平衡的一种功能，是人类在长期的进化衍变过程中产生的。随着环境的污染、运动的减少、生活节奏的加快及生活习惯的改变，人类的免疫功能也在下降。一些老年性疾病年轻化，如糖尿病、病毒性疾病等都与体内调节机能的紊乱或损伤、免疫功能的下降有密切关系。近年来，免疫功能低下受到国内外医学家们的广泛关注，因为当人体免疫功能低下时，就容易招致细菌、病毒、真菌等感染，从而引起人体出现一系列疾病。
生物反应调节剂系能调节增强或恢复机体免疫功能，可增强T细胞、巨噬细胞、NK细胞活性，具有致有丝分裂原活性，并可诱导机体产生干扰素、NO等作用，增强及调节免疫功能的药物。其对治疗免疫功能低下、某些继发性免疫缺陷病及恶性肿瘤均有一定疗效。大多是生物制品如卡介苗(BCG)、胞必佳(N-CWS)等，少数是一些人工合成的化学药物如左旋咪唑(levamisloe)和梯洛龙(tilorone)等，它们有的可以激活补体，有的可以促进巨噬细胞的活性，有的可以非特异性地增强T、B淋巴细胞反应，有的可诱导干扰素产生。
红球菌属广泛分布于土壤、岩石、地下水、海底沉积物及动物体内。赤红球菌作为红球菌中的一员，对有机溶剂的降解效果显著，在石油污染的生物修复，污水处理、有机染料及农药降解等方面应用广泛，且可用于产红色素，有巨大的发展潜力。赤红球菌生长快、易培养，可简单大规模工业生产。但目前仍未有赤红球菌在免疫功能调节领域中应用的报道。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种赤红球菌菌株，其具有提高机体免疫功能以及抗肿瘤功能。
本发明是这样实现的：
一种赤红球菌菌株，所述菌株为赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17525。
本发明提供一种赤红球菌菌制剂，所述菌制剂中含有保藏编号为CGMCC No.17525的赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，所述菌制剂为固态或液态菌制剂。
本发明提供一种赤红球菌菌株的菌体细胞及其提取物的应用之一，所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在提高免疫功能药物中的应用。
本发明提供一种赤红球菌菌株的菌体细胞及其提取物的应用之二，所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在抗肿瘤药物中的应用。
本发明具有如下优点：
提供一种赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，其可制备具有免疫活性功能的赤红球菌菌体细胞及其提取物，并可应用于提高机体免疫功能、抗肿瘤等领域；且该菌株FIM-12能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1是本发明中菌株FIM-12系统发育学地位图。
【具体实施方式】
参阅图1，本发明涉及一种赤红球菌菌株，所述菌株为赤红球菌(Rhodococcusruber)FIM-12，于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17525。本发明所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12是从红树林表层底泥分离筛选得到。
本发明还涉及一种赤红球菌菌制剂，所述菌制剂中含有保藏编号为CGMCCNo.17525的赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，所述菌制剂为固态或液态菌制剂。
本发明又涉及上述一种赤红球菌菌株的菌体细胞及其提取物的应用，所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在提高免疫功能药物中的应用；以及所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在抗肿瘤药物中的应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1、菌株FIM-12的分离
(1)于海南文昌八门湾红树林，采集红树林表层底泥，具体地，用取样铲采集约10cm左右土壤，放入无菌塑料封口袋中，低温保存；称取5g土样并加入50mL无菌50％陈海水的三角瓶中，振荡后静置30min，取上清液即原液进行梯度稀释，选用稀释度为10-2、10-3、10-4和10-5的悬浮液；
(2)分别取原液及选用的悬浮液0.1mL涂布于添加50mg/L重铬酸钾的水配制的ISP4培养基平板上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于32℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征；
(3)无菌操作条件下，培养7d后挑出红色且色素不分泌到培养基、表面扁平粗糙等具有代表性的单菌落，并划线接种于营养琼脂培养基斜面，置于32℃条件下培养，分离纯化得到菌株，并将得到的菌株命名为菌株FIM-12，然后于-80℃条件下将分离获得的菌株FIM-12以20％甘油保存。
实施例2、菌株FIM-12的鉴定
(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株FIM-12在营养琼脂培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片,32℃培养7d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株FIM-12的主要形态及生理生化特性如下：
革兰氏阳性菌，不抗酸，不形成气生菌丝，不产芽孢，菌落圆形不透明，表面皱褶粗糙干燥，橙或燕红色，色素不分泌到培养基，菌丝最初丝状，后产生横膈膜进而断裂成杆状或球状；可利用蔗糖、甘油、岩藻糖、棉子糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、糊精、葡萄糖，不利用乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨糖、棉籽糖；牛奶凝固或胨化，明胶液化阴性；不利用纤维素；硝酸盐还原阴性；此菌株最适生长温度为26～37℃，最适生长pH为6.5～8.5；在摇床转速为200～250r/min，培养3～5d，菌体细胞量最高。
(2)分子生物学鉴定：对菌株FIM-12的16SrDNA序列进行测序，测得的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示；将所测的菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在LPSN(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16S rRNA基因序列，系统进化分析用CLUSTAL-X软件进行比对，生成的比对文件用TREECON软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16SrDNA序列分析表明，菌株FIM-12与赤红球菌(Rhodococcus ruber)的序列同源性为100％。
结合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株FIM-12属于赤红球菌(Rhodococcus ruber)，命名为赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12。
且菌株赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，于2019年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17525。
实施例3、赤红球菌菌体细胞的发酵
菌株活化：将采用甘油保存的菌株FIM-12转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养7d，且培养温度为32℃；
种子制备：将菌株FIM-12活化所得的斜面菌苔接种于种子培养基(500mL三角瓶内装100mL种子培养基)中，于28℃、230r/min条件下培养42h，得种子液；
发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(5000mL三角瓶内装1000mL发酵培养基)中，于32℃、230r/min条件下发酵培养120h，发酵液3000r/min离心30min，将所收集的菌体纯化水洗离心，每1000mL发酵液收获赤红球菌菌体湿细胞35.2g，菌株FIM-12湿菌体细胞产量达3.5％。
实施例4、赤红球菌提取物的提取
从发酵液中收集菌体，以纯化水洗涤得赤红球菌湿细胞，将菌体湿细胞置于-20℃低温36h，反复3次；按以1：4比例将纯化水加入湿细胞中，在冰水浴条件下超声波破碎处理，超声功率750w，超声时间5min，间隔时间2min，总时间30min；以无水乙醇提取3次，离心即得赤红球菌提取物，其产率为3.1g赤红球菌提取物粉末/100g湿细胞。
实施例5、赤红球菌细胞对免疫器官影响
不同剂量的赤红球菌细胞试验组通过灌胃小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5mL，连续15d，对照组以等量的生理氯化钠溶液代替，停药次日眼眶静脉穿刺采血，行外周白细胞计数，处死小白鼠，分别取出胸腺、脾脏并称重。各实验结果如下表1所示，与对照组比较，结果表明赤红球菌细胞明显增加胸腺脾脏重量及提升白细胞数量，提示在适当剂量下赤红球菌具有刺激T细胞和B细胞的作用。
表1赤红球菌细胞对小鼠免疫器官的影响
*：P<0.05
实施例6、赤红球菌提取物对免疫器官影响
不同剂量的赤红球菌提取物试验组通过灌胃小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5mL，连续15d，对照组以等量的生理氯化钠溶液代替，停药次日眼眶静脉穿刺采血，行外周白细胞计数，处死小白鼠，分别取出胸腺、脾脏并称重。各实验结果如下表2所示，与对照组比较，结果表明赤红球菌提取物明显增加胸腺脾脏重量及提升白细胞数量，提示在适当剂量下赤红球菌提取物具有刺激T细胞和B细胞的作用。
表2赤红球菌提取物对小鼠免疫器官的影响
*：P<0.05
实施例7、赤红球菌细胞对巨噬细胞功能影响
不同剂量的赤红球菌细胞试验组通过灌胃免疫小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5mL，连续灌胃15d，对照组以等量生理盐水灌胃。停止灌胃次日无菌采取小鼠腹腔渗出细胞液，离心洗涤获富含MΦ的小鼠腹腔细胞，调节悬液的MΦ浓度为2×106/mL，于96孔培养板中每孔加100μL，置37℃，5％CO2培养箱培养4h，弃上清，洗涤，加入一定量的0.075％中性红溶液，37℃、5％CO2培养箱培养1h。取出培养板，清洗，加入细胞裂解液(0.1M乙酸：乙醇＝1：1，V/V)150μL。静置过夜，于酶联免疫仪上测570nm的吸光值OD570。各实验结果如下表3所示，结果表明三个不同剂量组的赤红球菌均较对照组明显提高小鼠MΦ的吞噬活性，赤红球菌细胞对小鼠腹腔MΦ具有明显的激活作用，激活了的MΦ具有增强吞噬异物作用。
表3赤红球菌细胞对小鼠巨噬细胞吞噬中性红的影响
注*：P<0.05
实施例8、赤红球菌提取物对巨噬细胞功能影响
不同剂量的赤红球菌提取物试验组通过灌胃免疫小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5mL，连续灌胃15d，对照组以等量生理盐水灌胃。停止灌胃次日无菌采取小鼠腹腔渗出细胞液，离心洗涤获富含MΦ的小鼠腹腔细胞，调节悬液的MΦ浓度为2×106/mL，于96孔培养板中每孔加100μL，置37℃，5％CO2培养箱培养4h，弃上清，洗涤，加入一定量的0.075％中性红溶液，37℃、5％CO2培养箱培养1h。取出培养板，清洗，加入细胞裂解液(0.1M乙酸：乙醇＝1：1，V/V)150μL。静置过夜，于酶联免疫仪上测570nm的吸光值OD570。各实验结果如下表4所示，结果表明三个不同剂量组的赤红球菌提取物均较对照组明显提高小鼠MΦ的吞噬活性，赤红球菌提取物对小鼠腹腔MΦ具有明显的激活作用，激活了的MΦ具有增强吞噬异物作用。
表4赤红球菌提取物对小鼠巨噬细胞吞噬中性红的影响
*：P<0.05**：P<0.001
实施例9、赤红球菌细胞对小鼠移植性肿瘤的抑瘤作用
抽取生长7d的S180小鼠腹水调整成细胞5×106/mL的悬液，小鼠右腋皮下接种0.2mL/只，接种次日开始按不同剂量试验组灌胃赤红球菌细胞，每日定时0.5mL/只，连续15d，对照组灌胃等量生理盐水。停止灌胃次日解剖，取瘤称重，计算肿瘤生长抑制率。各实验结果如下表5所示，结果表明灌胃赤红球菌对S180腹水型转实体瘤具有显著的抑瘤作用。
表5赤红球菌细胞对小鼠S180的抑瘤作用
*：P<0.05
实施例10、赤红球菌提取物对小鼠移植性肿瘤的抑瘤作用
抽取生长7d的S180小鼠腹水调整成细胞5×106/mL的悬液，小鼠右腋皮下接种0.2mL/只，接种次日开始按不同剂量试验组灌胃赤红球菌提取物，每日定时0.5mL/只，连续15d，对照组灌胃等量生理盐水。停止灌胃次日解剖，取瘤称重，计算肿瘤生长抑制率。各实验结果如下表6所示，结果表明灌胃赤红球菌提取物对S180腹水型转实体瘤具有显著的抑瘤作用。
表6赤红球菌提取物对小鼠S180的抑瘤作用
*：P<0.05
另外，需要说明的是，在发明所涉及的各培养基的组分如下：营养琼脂培养基的组分为：蛋白胨1.0％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，余量为蒸馏水，pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖1.0％、酵母提取物1.0％、余量为蒸馏水，pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；且在无特殊说明的情形下，本发明中的百分数均为质量百分数。
综上可知，本发明赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物具有提高免疫活性及抑瘤作用的功能，可作为提高免疫功能的药物以及抗肿瘤药物，且可作为进一步研究和开发的生产菌株。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 福建省微生物研究所
<120> 一种赤红球菌菌株、菌制剂及其菌体细胞与提取物的应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> （Rhodococcus ruber）
<400> 1
catgcaagtc gaacgatgaa gcccagcttg ctgggtggat tagtggcgaa cgggtgagta 60
acacgtgggt gatctgccct gcacttcggg ataagcctgg gaaactgggt ctaataccgg 120
ataggacctc gggatgcatg ttccggggtg gaaaggtttt ccggtgcagg atgggcccgc 180
ggcctatcag cttgttggtg gggtaacggc ccaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 240
agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 360
ccttcgggtt gtaaacctct ttcagtaccg acgaagcgca agtgacggta ggtacagaag 420
aagcaccggc caactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggtgcga gcgttgtccg 480
gaattactgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg tcgtctgtga aaacccgcag 540
ctcaactgcg ggcttgcagg cgatacgggc agacttgagt actgcagggg agactggaat 600
tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcgggtc 660
tctgggcagt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggta gcgaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggcgct aggtgtgggt ttccttccac gggatccgtg 780
ccgtagctaa cgcattaagc gccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 840
ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa 900
gaaccttacc tgggtttgac atacaccgga ccgccccaga gatggggttt cccttgtggt 960
cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1020
cgcaacgagc gcaacccttg tcctgtgttg ccagcacgta atggtgggga ctcgcaggag 1080
actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg ccccttatgt 1140
ccagggcttc acacatgcta caatggccgg tacagagggc tgcgataccg cgaggtggag 1200
cgaatccctt aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc 1260
ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320
acaccgcccg tcacgtcatg aaagtcggta acacccgaag ccggtggcct aacccctcgt 1380
gggagggagc cgtc 1394

Claims (4)

1.一种赤红球菌菌株，其特征在于：所述菌株为赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17525。
2.一种赤红球菌菌制剂，其特征在于：所述菌制剂中含有权利要求1所述的保藏编号为CGMCC No.17525的赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12，所述菌制剂为固态或液态菌制剂。
3.根据权利要求1所述的一种赤红球菌菌株的应用，其特征在于：所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在提高免疫功能药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种赤红球菌菌株的应用，其特征在于：所述赤红球菌(Rhodococcus ruber)FIM-12的菌体细胞及其提取物在抗肿瘤药物中的应用。
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