CN1294151C - 一种海洋真菌多糖及其提取方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从白枝海绵Leucosolenia sp.细胞中内生真菌leptosphaeria sp.菌体中提取的一种多糖及其提取方法，以及该真菌多糖在抗肿瘤药物中的应用。其制备方法如下：步骤一、以leptosphaeria sp.真菌为原料，先用弱极性溶剂脱脂，再用去离子水提取，离心去沉淀；步骤二、加入硫酸铵，搅拌后静置沉淀蛋白质；步骤三、离心除去沉淀，将上清液兑水透析除去小分子物质；步骤四、透析液浓缩，加入乙醇，静置、离心、沉淀；步骤五、依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥后得到海洋真菌多糖。海洋真菌多糖固态呈浅黄色，糖溶液的PH＜7。本发明的海洋真菌多糖有明显抑制肿瘤的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种从海绵细胞中内生真菌(leptosphaeria sp.)菌体中提取的一种多糖及其提取方法，以及该真菌多糖在抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
近年来海洋药物的研究已成为一个热点。海洋生物由于其独特的生存环境(如高压、高渗、高温、低温等复杂多变的生态环境)，使之形成了特殊的身体结构和奇妙的生理功能，其代谢产物有别于陆地生物，为人类提供了许多具有新颖的化学结构和独特的生理功能的活性物质，包括萜类、甾醇类、生物碱、甙类、多糖、肽类、核酸、蛋白质、酶等，有的可以直接作为药物，有的可作为新药化学修饰和半合成的先导化合物或分子设计的模型，有的可从中发掘新的功能基因用于疾病治疗——这无疑为人类的食品、医药和工业用品提供了一个巨大的宝库。
海绵是最原始、最低等的多细胞动物，无组织无器官分化，是海洋中的无脊椎动物。海绵中活性物质的研究，受到世界各国科学家的重视。海绵是地球上最原始的多细胞生物，分布自潮汐地带到水深上千米的世界各大海域中。从已公布的近千种海绵的化学成分来看，海绵生物活性化合物可分为萜类、甾醇、大环内酯、生物碱、肽类、高级脂肪醇及含硫、含卤素化合物等。这些化合物大多具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降血压等生理活性。
近年来，海洋真菌中的有效活性物质的研究愈来愈引起国内外学者的关注。一方面由于近年证实多数海洋高等动植物中的活性成分来源于海洋微生物(真菌、细菌)，另一方面由于很多海洋先导化合物含量低微，难以进一步开展药效及临床研究。而微生物则具有易于进行实验室及工业化规模培养，并可通过改变培养基定向富集有效成分等优势，可直接产业化，易见经济效益。海洋动植物体内含有多种以共生或互生方式生活的微生物。海绵细胞中的共生微生物约占海绵体积的40％，从中可获取多种生物活性物质。美国马里兰大学发现：海绵中存在复杂的微生物类群，海绵中的抗癌活性物质是由与其共生存的微生物所产生，并从海绵中分离得到一株亮桔色微球菌可以发酵产生与海绵中一样的活性物质。另外，中国科学院沈阳应用生态研究所已从渤海膜海绵细胞中获得多株产家用抗菌素及抗肿瘤先导化合物等活性物质的微生物菌株。目前，如何从海绵细胞中分离纯化得到其共生的、能产生活性物质的海绵微生物，并利用这些宝贵的资源，研究海洋新药，已成为国内外关注的焦点。
多糖在抗肿瘤方面的优势也引起广泛关注。研究表明：许多多糖，尤其是真菌多糖(如香菇多糖、猪苓多糖、云芝多糖等)具有抗肿瘤作用。海洋生物来源的多糖，尤其是海洋微生物多糖的抗肿瘤作用研究不多。日本学者Umezawa等报道了从海洋微生物湿润黄杆菌(Flavobacterium uliginosum)的发酵产物中获得一种称为“marinactan”的杂多糖，该多糖不仅具有很强的抗肿瘤和提高人体免疫功能的作用，而且与化疗药物在抗肿瘤方面有协同作用，毒副作用极小。我国南京大学谭仁祥等从海洋真菌炭团菌(HypoxylonSP.)发酵物中提取出一种多糖，该多糖有抑制小鼠移植Heps实体瘤和促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。
然而，到目前为止，尚未见有关抗肿瘤海洋真菌(leptosphaeria sp.，小球腔菌，属子囊菌亚门真菌，leptosphaeria sp在多种地方存在)多糖提取和应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从白枝海绵(Leucosolenia sp.)细胞中内生真菌(leptosphaeria sp.)菌体中提取的一种多糖及其提取方法和用途。
本发明所用的海绵采集自深圳大亚湾深海海域，经鉴定为白枝海绵(Leucosolenia sp.)。
本发明的海洋真菌多糖，是从白枝海绵(Leucosolenia sp.)中分离的内生真菌(leptosphaeria sp.)菌体中提取分离而得。多糖的总糖含量为925.0μg/mg-982.3μg/mg。其具体的制备方法包括如下步骤：
菌种分离与培养：
(1)从海洋中选取健康的、活的海绵有机体，在无菌条件下采用无菌生理盐水清洗外表，并用75％酒精进行表面消毒；然后取海绵内部细胞切成小块，研磨，获得新鲜海绵细胞提取液。
(2)对新鲜海绵细胞提取液，采用平板稀释法，分别以10-2--10-3浓度无菌生理盐水稀释液，在分离海洋真菌培养基的平皿上，涂刮平板，然后放入到25-30℃保温箱中培养。
培养基(按重量比)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉2.0、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.1、蛋白胨0.5、琼脂2、氯化钠3，水100。
每1000ml此培养基中，灭菌消毒前加入1％Rose bengal水溶液3ml；把融化培养基倒在平板上，临用时每100ml培养基中加入1％链霉素溶液0.5ml，及环丙沙星300μl。
(3)培养1-15天后，对平皿长出单菌落纯的真菌进行鉴定，菌即为从海绵中分离的内生真菌中提取分离而得，移至斜面保藏。
真菌的发酵培养：
将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，在28℃下摇瓶培养72小时，然后过滤，获得菌体。
发酵培养基(按重量比)：葡萄糖1.0、可溶性淀粉2.0、KH2PO40.1、MgSO4·7H2O0.1、蛋白胨0.5、氯化钠3，水100。
真菌多糖的提取分离：
将上述培养好的发酵液过滤，即得真菌菌体。
制备海洋真菌多糖分为以下步骤：步骤一、以leptosphaeria sp.真菌为原料，先用弱极性溶剂脱脂，再用真菌重量10-20倍的去离子水，在温度70-80℃提取6-10小时，离心去沉淀；步骤二、加入提取水重量60-85％的硫酸铵，搅拌后静置1小时以上沉淀蛋白质，离心除去沉淀，得到上清液；步骤三、将上清液兑水透析72小时除去小分子物质，得到透析液；步骤四、将透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置5小时，离心，沉淀；步骤五、依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥后得到本发明的海洋真菌多糖。本发明的海洋真菌多糖固态呈浅黄色，糖溶液的PH＜7。
真菌多糖的含量的测定：
精确配置100μg/mg标准葡萄糖液，分别吸取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml标准溶液置带塞试管中，补足蒸馏水水到1ml，加入2mg/ml蒽酮试剂4ml，混匀，沸水浴煮10min。冷却后测定波长为620nm处的吸光度。以“0”管作空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度制作标准曲线，取粗品多糖配成1mg/ml的溶液，吸取0.1ml，补足蒸馏水1ml，其余操作同标准曲线的制备，再由回归方程算出相应浓度。
由试验可得总糖含量为942.5μg/mg。
药理试验表明，本发明的海洋真菌多糖有明显抑制肿瘤的作用，能明显抑制小鼠肉瘤S180的生长，延长H22腹水小鼠的生存时间。
本发明的特色在于，在我们的实验条件下，其作用强度明显优于香菇多糖。因此，菌多糖系极具前途的抗肿瘤药。与其他海洋生物相比，海洋真菌可以发酵生产，故来源有保证。总之，本发明提供了一种来源独特、易于工业化生产、抗肿瘤作用优于香菇多糖的海洋真菌多糖。
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体实施方式
实施例1：真菌多糖的提取分离
称取菌丝体50g，分别用乙酸乙酯和甲醇脱脂，加入去离子水500ml，在温度70℃提取8小时，离心去沉淀；加入提取水重量70％的硫酸铵，搅拌后静置1小时以上沉淀蛋白质，离心除去沉淀；将上清液兑水透析72小时除去小分子物质；透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置5小时，离心，沉淀；依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥后得到本发明的海洋真菌多糖。真菌多糖的含量的测定为925.0μg/mg。
实施例2：真菌多糖的提取分离
称取菌丝体50g，分别用乙酸乙酯和甲醇脱脂，加入去离子水1000ml，在温度80℃提取10小时，离心去沉淀；加入提取水重量85％的硫酸铵，搅拌后静置1小时以上沉淀蛋白质，离心除去沉淀；将上清液兑水透析72小时除去小分子物质；透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置5小时，离心，沉淀；依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥后得到本发明的海洋真菌多糖。真菌多糖的含量的测定为982.3μg/mg。
药理试验：菌多糖对小鼠移植性肿瘤的抑制作用
1、对小鼠肉瘤S180的作用
于小鼠右腋皮下接种商购的肉瘤S180细胞悬液(1.0×1010·L-1)0.20ml，接种次日随机分组，分为空白对照组，香菇多糖组，leptosphaeria sp.菌多糖40、80、160mg·kg-1三个剂量组。于接种次日开始口服灌胃给予以实施例1制得的受试样品。每天一次，连续给药十天。停药次日处死动物，按下式计算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。
结果表明，leptosphaeria sp.菌多糖40、80、160mg·kg-1对S180肉瘤的瘤重抑制率分别为12.93％、31.87％、38.68％，其中80和160mg·kg-1剂量组有明显的抗肿瘤作用(P＜0.01)。
对小鼠肉瘤S180的抑制作用(
x±s，n＝10)
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 体重变化/g | 平均瘤重/g | 抑瘤率/％ |
| 空白对照香菇多糖leptosphaeria sp.菌多糖 | -804080160 | +2.8+2.0+2.2+1.9+2.3 | 1.942±0.5821.420±0.502*1.767±0.3881.257±0.407**1.100±0.350** | 26.808.7635.2743.36 |
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
2对肝癌H22腹水小鼠生存期的影响
于小鼠腹腔内接种商购的H22细胞悬液(1.0×1010·L-1)0.20ml，接种次日随机分为5组。空白对照组，香菇多糖组，leptosphaeria sp.菌多糖40、80、160mg·kg-1三个剂量组。于接种次日开始口服灌胃给予以实施例1制得的受试样品。每天一次，连续给药十天。记录其自然死亡时间的天数。按下式计算生命延长率：生命延长率(％)＝(给药组平均生存天数/对照组平均生存天数-1)×100％
结果表明，与荷瘤对照组比较，leptosphaeria sp.菌多糖40、80、160mg·kg-1 H22腹水小鼠的生存时间分别延长了13.99％、23.07％(P＜0.05)、44.76％(P＜0.01)。结果表明，菌多糖能明显延长H22腹水小鼠的生存时间。
对H22腹水小鼠生存期的影响(
x±s，n＝10)
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 生存天数/天 | 生命延长率/％ |
| 空白对照香菇多糖leptosphaeria sp.菌多糖 | -804080160 | 14.3±3.117.2±3.716.3±4.018.4±3.9*20.7±5.1** | -20.2813.9923.0744.76 |
与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
Claims (10)
1、一种海洋真菌多糖，其特征在于：为从海绵内生真菌leptosphaeria sp.中分离提取的多糖，固态呈浅黄色，糖溶液的PH＜7。
2、根据权利要求1所述的海洋真菌多糖，其特征在于：多糖的总糖含量为925.0μg/mg-982.3μg/mg。
3、根据权利要求1或2所述的海洋真菌多糖，其特征在于通过下述方法制备得到：
步骤一、以leptosphaeria sp.真菌为原料，先用弱极性溶剂脱脂，再用去离子水提取，离心去沉淀；
步骤二、加入硫酸铵，搅拌后静置沉淀蛋白质，离心除去沉淀，得到上清液；
步骤三、将上清液兑水透析除去小分子物质，得到透析液；
步骤四、将透析液浓缩，加入乙醇，静置、离心、沉淀；
步骤五、依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥。
4、根据权利要求3所述的海洋真菌多糖，其特征在于：
(1)、步骤一中所述的弱极性溶剂分别为乙酸乙酯和甲醇，去离子水的量为真菌重量10-20倍，在温度70-80℃进行提取，离心去沉淀；
(2)、步骤二中所述加入硫酸铵的量为提取水重量60-85％，搅拌后静置沉淀蛋白质；
(3)、步骤三中所述兑水透析的时间为72小时；
(4)、步骤四中透析液浓缩，逐步加入95％乙醇，4℃静置5小时，离心，沉淀。
5、根据权利要求3所述的海洋真菌多糖，其特征在于：
(1)、步骤一中所述的提取为6-10小时；
(2)、步骤二中所述的搅拌后静置为1小时以上；
(3)、步骤四中所述的透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入的95％乙醇的体积为透析液的3倍。
6、权利要求1中所述的海洋真菌多糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、以leptosphaeria sp.真菌为原料，先用弱极性溶剂脱脂，再用去离子水提取，离心去沉淀；
步骤二、加入硫酸铵，搅拌后静置沉淀蛋白质，离心除去沉淀，得到上清液；
步骤三、将上清液兑水透析除去小分子物质，得到透析液；
步骤四、将透析液浓缩，加入乙醇，静置、离心、沉淀；
步骤五、依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥。
7、根据权利要求6所述的海洋真菌多糖的制备方法，其特征在于：
(1)、步骤一中所述的弱极性溶剂分别为乙酸乙酯和甲醇，去离子水的量为真菌重量10-20倍，在温度70-80℃进行提取，离心去沉淀；
(2)、步骤二中所述加入硫酸铵的量为提取水重量60-85％，搅拌后静置1小时以上沉淀蛋白质；
(3)、步骤三中所述兑水透析的时间为72小时；
(4)、步骤四中透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入透析液的3倍体积的95％乙醇，4℃静置5小时，离心，沉淀。
8、根据权利要求7所述的海洋真菌多糖的制备方法，其特征在于：
(1)、步骤一中所述的提取为6-10小时；
(2)、步骤二中所述的搅拌后静置为1小时以上；
(3)、步骤四中所述的透析液浓缩至浓缩液体积的1/2，逐步加入的95％乙醇的体积为3倍。
9、一种权利要求1或2所述的海洋真菌多糖的用途，其特征是用于制备抗肿瘤药物。
10、一种权利要求4所述的海洋真菌多糖的用途，其特征是用于制备抗肿瘤药物。
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| CN 200510032971 CN1294151C (zh) | 2005-01-21 | 2005-01-21 | 一种海洋真菌多糖及其提取方法和用途 |
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