CN102329849A - 微生物共栖培养发酵生产河豚毒素的方法 - Google Patents

Abstract

一种微生物共栖培养发酵生产河豚毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将从野生河豚各含毒组织中分离的微生物菌株用无菌蒸馏水制备成菌悬液，混合各菌悬液接种到同一液体培养基中进行种子液培养1-3天；将种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养，2-7天；其中所述的液体培养基按质量百分比的组成为：酵母膏0.1-0.5%，牛肉膏0.1-0.5%，蛋白胨0.1-0.5%，葡萄糖0.5-2%，蔗糖0-1%，余量为海水，pH6.5-7.2；其中所述的种子液及发酵培养条件为：24-30℃，150-200rpm。本发明可以更好的模拟河豚体内产毒微生物所处的微生态环境，有利与产毒微生物在体外培养的适应性，最终有利于产毒微生物的生长和产毒，解决了当前微生物发酵产河豚毒素产量普遍较低的瓶颈。

Description

微生物共栖培养发酵生产河豚毒素的方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种从野生河豚的多种含毒组织中分离其共生微生物和发酵培养方法。

技术背景

河豚毒素(tetrodotoxin，TIX)是一种毒性较强的小分子非蛋白类神经毒素，由于其可与神经细胞膜的钠离子通道受体高度特异性的结合，阻断钠离子通道，从而抑制神经冲动的传导。TTX具有出色的神经止痛作用，其麻醉作用比一般麻醉药强1000倍以上，而且具有不成瘾的优点，可取代化学药物和中草药用于戒毒。同时，它还具有来镇静、抗心律失常、预防肾功，能衰竭及降血压等作用。因而其具有很大的药用开发价值。由于河豚毒素具有极强的医疗效果，而提取工艺复杂﹑不易提取，且产量非常低，目前国际上只有日本﹑中国﹑韩国﹑加拿大等少数几个国家有研究和生产的报道，因此国际市场上高纯度的河豚毒素每克价格高达18-20万美金。

目前河豚毒素的生产方法主要有化学合成法、生物组织提取法、微生物发酵法。其中化学合成法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，而组织提取法需消耗大量的河豚鱼资源，破坏生态系统。近年来，很多学者报道了从河豚内脏中分离产毒菌及其发酵产河豚毒素的方法，据报道产TTX 的微生物类群包括细菌和放线菌。细菌有弧菌属的溶藻弧菌和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、希瓦氏菌属的腐败希瓦菌(Shewanella putrefaciens)和海藻希瓦氏菌，还有假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、发光菌属(Photobacterium sp.)、气单胞菌属(Aeromonassp.)、邻单胞菌属(Plesionsnanas sp.)、交替单胞菌属(Alteromonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)等。放线菌则主要是链霉菌属(Streptomyces sp.)。2003年清华大学曾提出了有关利用微生物生产河豚毒素申请（公开号CN1460721A），其利用的是单菌纯培养方式。尽管微生物发酵产河豚毒素取得了一定的进展，但由于单菌株纯培养发酵存在产毒菌株遗传特性不稳定，产量低等缺陷，至今微生物法产河豚毒素的产量仅为0.11-0.73MU/mL，使其难于实行大规模工业生产。因此，有必要对传统的微生物发酵产河豚毒素的发酵模式和工艺进行创新和改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从野生河豚组织分离微生物及发酵共培养产河豚毒素的方法。利用从野生含毒河豚鱼中各个含毒部位（卵巢、肝脏、脾脏、腮等）分离出能和这些河豚鱼含毒器官共生的微生物群落。通过模拟这些微生物群落的生长环境，对微生物群落进行共栖发酵培养。在此共栖培养发酵过程中，具有产河豚毒素能力的微生物菌株，能在相应的微生物群落体系中很好的生长并保持较高的产生河豚毒素能力。经过适当的发酵工艺优化，得到的发酵液将含有较高浓度及高纯度的河豚毒素。

实现本发明的技术方案如下：

1、从野生河豚各含毒组织中分离微生物菌群的方法，包括如下步骤。

1）选取新鲜﹑健康的野生河豚鱼。

2）鱼体先用纯水洗净，在无菌环境下解剖鱼体，分别取出各新鲜的内脏组织，分别加入少量的已灭菌海水研磨匀浆，得到新鲜的河豚内脏匀浆液。

3）将各新鲜的匀浆液以已灭菌海水按比例制成系列稀释液，分别取稀释液涂布于固体培养基上。

4）24-35℃培养，观察并挑取平板上各个时期形成的不同特征的单菌落，划线于新的固体培养基上进行分离纯化，直至原代平板上不再长出新菌落为止。

5）将分离到的各菌株进行菌种鉴定，产毒性能测试，并按照组织来源分类保藏。

其中所述的野生河豚为正值产卵期的野生河豚鱼，其毒性最强；海水为天然海水或用海水精配成的3%的人工海水。

其中分离培养基按质量百分比的组成为：酵母膏0.1-0.5%，牛肉膏0.1-0.5%，蛋白胨0.1-0.5%，葡萄糖0.5-2%，蔗糖0-2%，河豚组织提取液1mL，余量为海水，琼脂2-3%，pH6.5-7.2。

2、河豚组织微生物的共培养方法，其特征在于，包括如下步骤。

1）将上述得到的各菌株用无菌蒸馏水制备成菌悬液，混合各菌悬液接种到同一液体培养基中进行种子液培养1-3天。

2）将种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养，2-7天。

其中所述的液体培养基按质量百分比的组成为：酵母膏0.1-0.5%，牛肉膏0.1-0.5%，蛋白胨0.1-0.5%，葡萄糖0.5-2%，蔗糖0-1%，余量为海水，pH6.5-7.2。

其中所述的种子液及发酵培养条件为：24-30℃，150-200rpm。

3、河豚组织微生物共培养产河豚毒素的分离纯化及检测方法，包括如下步骤。

1）分离：发酵结束后，发酵液4000-10000rpm离心10-30min，收集上清液。冰乙酸调pH至4-6，沸水浴加热10-20分钟，冷却后4000-10000rpm离心10-20分钟，除去沉淀收集上清液。上清液经微孔滤膜抽滤后，40-60℃旋转蒸发浓缩，得到毒素粗提液。

2）纯化：毒素粗提液经大孔吸附树脂处理，上样后，用0.1-2%乙酸洗脱，分步收集洗脱液，小鼠腹腔注射法检测洗脱液毒性，收集含毒部分，浓缩后冷冻保藏。经大孔树脂处理后的样液上离子交换树脂，乙酸梯度洗脱，分步收集酸性洗脱液，小鼠腹腔注射法检测洗脱液毒性，合并有毒部分，浓缩后，再经HPLC纯化精制。

 本发明首次提出采用河豚微生物群落的共栖培养发酵技术来生产河豚毒素。本发明的优势在于采取微生物群落共培养而不是培养一种菌来产河豚毒素，可以更好的模拟河豚体内产毒微生物所处的微生态环境，有利与产毒微生物在体外培养的适应性，最终有利于产毒微生物的生长和产毒。采用本发明的方法生产河豚毒素的一个显著优势就是其产量比任何一种产毒菌单一培养所得的产量都高，有利的解决了当前微生物发酵产河豚毒素产量普遍较低的瓶颈。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例作进一步说明。

实施例1：河豚卵巢微生物群落的分离及共栖发酵培养产河豚毒素。

步骤一、从河豚卵巢中分离出微生物群落中的单个有效菌株，具体操作如下。

1）春季河豚产卵期，从长江流域附近选取正值产卵期的新鲜野生河豚鱼。

2）新鲜的野生河豚鱼用纯水擦洗干净后，再用95%的酒精擦洗消毒，在无菌条件下，放于解剖盘内用镊子及解剖刀解剖鱼体，取出卵巢置于无菌海水中，称去1g卵巢加入少量无菌海水研磨，得到卵巢匀浆液。

3）卵巢匀浆液以无菌海水1-10倍梯度稀释后，吸取1mL系列稀释液涂布于固体平板上，26℃培养，每隔8小时观察平板菌落变化，挑出特征菌落进行纯化，纯化后的单菌落斜面低温保藏。分离培养基的组成：酵母膏0.3%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.3%，葡萄糖1%，蔗糖1%，1mL组织提取液，余量为人工海水，琼脂3%，pH 7。人工海水：3%海水精配制。

4）按以上操作从卵巢中共分离到17株菌，经连续传代3代后9株菌性状稳定，经生理生化和分子生物学鉴定分别为：1株沙雷氏菌，2株芽孢杆菌，2株希瓦氏菌，2株放线菌，1株酵母菌，1株假单胞菌。

步骤二、单个微生物的纯种单独发酵及产毒能力测试。

1）将从卵巢分离到的9株菌分别接种于液体培养基中进行种子液培养，26℃培养1天后，取5mL种子液接种于100mL液体发酵培养基中，进行单菌纯培养，26℃，150rpm振荡培养4天。

2）发酵结束后，发酵液8000rpm离心20分钟，除去菌体收集上清液。冰乙酸调pH至5，沸水浴加热10分钟，再8000rpm离心20分钟，除去沉淀物收集上清液。上清液经孔径为0.45的微孔滤膜抽滤，滤液浓缩后得到粗提液。

 3）小鼠腹腔注射检测粗提液的毒性。选取体重均为20-22g的健康昆明小鼠，小鼠分9组进行腹腔注射。吸取0.5mL粗提液注射小鼠，同时记录各组试验小鼠的死亡时间。试验小鼠注射后有3组（1株沙雷氏菌，2株希瓦氏菌）表现出明显的河豚毒素中毒症状，初期兴奋，随后后肢麻痹、抽搐、继而呼吸衰竭而死，与标准品注射出现的症状相似，其余6组未表现出明显的中毒症状。可初步判断3株菌为疑似河豚毒素产生菌，另外6株为共生菌。

4）对三株疑似产毒菌的发酵液粗提物进行柱层析纯化。D101大孔吸附树脂前处理：先水洗2-3次，再用95%的乙醇浸泡24小时，装柱后以95%乙醇冲洗至流出液澄清，再水洗至无乙醇味。上样：缓慢将毒素粗提液滴入柱中，以5-6滴/分钟流经柱子。洗脱：先以2倍柱床体积纯水洗脱，再以0.1%乙酸洗脱，收集洗脱液，定量浓缩后小鼠腹腔注射检测毒性，同时记录各组试验小鼠的死亡时间。结果三组小鼠均出现典型河豚中毒症状并死亡。

5）将上述经柱层析纯化后得到的样品，进行薄层层析，并和购得的河豚毒素标准品在同一条件下进行展开，结果显示两者比移值相同，可以定性为分离纯化所得即为河豚毒素。薄层条件如下：（1）薄层硅胶层析板， 110℃活化1h；（2）展开剂，吡啶/乙酸乙酯/冰醋酸/水( 10 /5 /2 /3，v /v)；（3）点样，以河豚毒素标准品作阳性对照， 粗毒素与标准品都用0.1% 醋酸溶液溶解，每个样品点样5μl。同时以空白培养基点样， 作阴性对照。（4）样品展开后用10% KOH 溶液均匀喷到薄层板上，吹风机吹干，在110-130℃ 烘箱加热10min，取出冷却（5）于365 nm下观察荧光斑点，通过比移值来定性。

步骤三、卵巢微生物菌群的共栖培养发酵及产毒能力测试。

将9株菌共同接种于同一液体培养基中进行共栖发酵培养，培养基及培养条件同上所述，得到河豚毒素卵巢微生物菌群共栖培养的发酵液。发酵液处理方法如步骤二所述。将纯化后得到的样品进行小鼠生物检测和薄层层析，从小鼠生物法检测发酵液毒性试验的结果显示，与各产毒菌单独培养相比，共栖培养的发酵液进行小鼠腹腔注射后小鼠死亡时间缩短，中毒症状更加明显，根据河豚毒素标准品制备的毒素含量与小鼠死亡时间的标准曲线可计算出样品中河豚毒素的浓度（表1）；从薄层层析板上的样品荧光斑点亮度可以看出，在同一点样体积下，共栖培养得到的样品，与三组产毒菌单独培养制备得到的样品相比，荧光亮度更强。可证实微生物共栖发酵培养能更好的模拟河豚体内的微环境，有利于产毒菌生长及后期毒素的合成，从而提高微生物发酵培养生产河豚毒素的产量。

 表1 河豚卵巢微生物共栖培养与产毒菌单独培养产毒对比表

菌  种  名  称	来 源	发酵液中毒素的含量	定量检测方法
				沙雷氏菌（Serratiasp.）	卵巢	0.416 μg/ml	小鼠生物检测法
希瓦氏菌 (Shsewnaelalasp.1)	卵巢	0.443 μg/ml	小鼠生物检测法
				希瓦氏菌 (Shsewnaelalasp.2)	卵巢	0.548 μg/ml	小鼠生物检测法
混合菌（1株沙雷氏菌，2株芽孢杆菌，2株希瓦氏菌，2株放线菌，1株酵母菌，1株假单胞菌）	卵巢	1.178 μg/ml	小鼠生物检测法

实施例2：河豚卵巢和肝脏微生物群落的共栖发酵培养产河豚毒素。

将从河豚卵巢和肝脏中分离得到并经过菌种鉴定的各有效微生物菌株的保藏斜面进行活化，这些菌株分别是。

1 河豚卵巢微生物群落：其中产毒菌有沙雷氏菌（Serratia sp.）1株和希瓦氏菌（Shewanella sp.）2株；其中不产毒的共生菌有酵母菌(Saccharomyces sp.) 1株、放线菌（Actinomyces sp.）2株、芽孢杆菌（ Bacillus sp.）2株、假单胞菌（Pseudomonas sp.）1株。

2 河豚肝脏微生物群落：其中产毒菌有梭形芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）1株、气单胞菌（Aeromonas sp.）1株、微杆菌（Microbacterium sp.）2株；其中不产毒的共生菌有芽孢杆菌（Bacillus sp.）2株，气单胞菌（Aeromonas sp.）1株和酵母菌(Saccharomyces sp.) 2株。

将上述各斜面保藏的菌株用无菌蒸馏水制备成菌悬液，按等体积比例混合各菌悬液制备成河豚卵巢和肝脏混合微生物菌群，将这一混合液接种到同一液体培养基中进行种子液培养1天；将种子液以10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养4天，其中所述的液体培养基的组成为：酵母膏0.5%，牛肉膏0.5%，蛋白胨0.5%，葡萄糖2%，蔗糖1%，余量为海水，pH7.2。其中所述的发酵培养条件为：28℃、180rpm培养。

同时将上述产毒菌株按同样条件分别进行单独纯种发酵培养，收集发酵液。

各种培养方法得到的发酵液处理方法如实施例1中的步骤二所述。将纯化后得到的样品用商品化的河豚毒素酶联免疫（ELISA）试剂盒进行定量测定，结果显示微生物共栖发酵培养所得发酵液中河豚毒素的含量显著高于任何一株产毒菌单独发酵时所产的河豚毒素量（表2）。

表2 河豚卵巢/肝脏微生物共栖培养与产毒菌单独培养产毒对比表

菌  种  名  称	来 源	发酵液中毒素含量	定量检测方法
				沙雷氏菌（Serratiasp.）	卵巢	3.64 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
希瓦氏菌 (Shsewnaelalasp.1)	卵巢	4.72 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
				希瓦氏菌 (Shsewnaelala sp.2 )	卵巢	8.94 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
梭形芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）	肝脏	13.16 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
				气单胞菌（Aeromonas sp.）	肝脏	12.02 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
微杆菌（Microbacteriumsp.1）	肝脏	7.22 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
				微杆菌（Microbacteriumsp.2）	肝脏	11.16 μg/ml	酶联免疫试剂盒法
混合菌共栖培养（卵巢微生物和肝脏微生物）	卵巢/肝脏	23.40 μg/ml	酶联免疫试剂盒法

Claims (1)

1.一种微生物共栖培养发酵生产河豚毒素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）将从野生河豚各含毒组织中分离的微生物菌株用无菌蒸馏水制备成菌悬液，混合各菌悬液接种到同一液体培养基中进行种子液培养1-3天；

2）将种子液以5-10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养，2-7天；

所述的液体培养基按质量百分比的组成为：酵母膏0.1-0.5%，牛肉膏0.1-0.5%，蛋白胨0.1-0.5%，葡萄糖0.5-2%，蔗糖0-1%，余量为海水，pH6.5-7.2；

所述的种子液及发酵培养条件为：24-30℃，150-200rpm；

3）分离纯化。