CN114574402B - 一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用，该假单胞菌是从黄鳍东方鲀(Takifugu xanthopterus)的卵巢组织中分离得到，被命名为假单胞菌HTY‑1（Pseudomonas.sp HTY‑1），于2021年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.23768。本申请还提供该假单胞菌HTY‑1在在河豚毒素制备中的应用以及该毒素的制备方法，本发明所分离的假单胞菌，经液体发酵培养后可从发酵液中大规模分离提取获得河豚毒素粗提取。

Description

一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用
技术领域
本发明涉及毒素制备技术领域，尤其涉及一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用。
背景技术
河鲀毒素（tetradotoxin，简写为TTX）是小分子量的非蛋白质神经毒素，中毒潜伏期短，死亡率高，毒素吸收后迅速作用于末梢神经和中枢神经系统，使神经传导产生障碍，首先使感觉神经麻痹，而后运动神经麻痹，严重者脑干麻痹导致呼吸循环衰竭。河鲀的表皮、内脏、血液、睾丸、卵巢、肝、脾、眼球等不同组织中含有该河鲀毒素，它是一种剧毒的非蛋白神经毒素。河鲀毒素的分子式为C11H17O8N3，分子量为319，该神经毒素经腹腔注射对小鼠的LD50为8μg/kg。TTX的化学性质稳定，一般烹调手段难以将其破坏。
而TTX作为一种重要的工具药，广泛应用于生理学和药理学研究。TTX可用来镇痛、镇静、抗心律失常、预防肾功能衰竭及降血压等，还可作为广谱抗生素的代替药物。同时，其镇痛效果是吗啡的 3000 倍, 比普鲁卡因和可卡因强 10 万倍; 作为戒毒剂, 其戒毒有效率达 98%,且不具毒副作用和成瘾性，可取代化学药物和中草药戒毒，且无副作用。河豚毒素具有极高的经济价值。
目前，河豚毒素主要是从河豚鱼内脏中提取纯化。该方法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，难以进行工业化生产；同时，因人工养殖的河豚鱼含毒极低甚至无毒，因此需消耗大量的野生河豚鱼资源，会破坏生态环境。而利用产河豚毒素的微生物进行发酵来生产TTX的方法，更适用于工业化生产，更具有发展前景，但是，目前已有发现产河豚毒素的微生物，但是种类较少，且其产量较低且不稳定，因此，需要找到能够实现持续、高效、稳定地产TTX 的微生物菌株。
因此，现有技术有待进一步改进。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一株来自黄鳍东方鲀 Takifugu xanthopterus卵巢组织的产河豚毒素的假单胞菌 Pseudomonas adaceaeHTY-1，可利用该假单胞菌HTY-1进行发酵培养，用于大批量生产河豚毒素。
为了解决上述问题，本申请提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种假单胞菌，其被命名为假单胞菌HTY-1（Pseudomonas.sp HTY-1），保藏号为CGMCC No. 23768。
该假单胞菌HTY-1是从黄鳍东方鲀( Takifugu xanthopterus) 的卵巢组织中分离得到，进行鉴定后，确定其为假单胞菌，并将其于2021年11月10日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC），保藏地址为：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该假单胞菌HTY-1的保藏号为CGMCC NO.23768。
第二方面，本发明还提供上述假单胞菌在河豚毒素制备中的应用。可通过利用假单胞菌HTY-1发酵技术，对菌液中产生的河豚毒素进行提取和纯化，从而得到河豚毒素产品。
第三方面，本发明提供一种河豚毒素的制备方法，其包括以下步骤：
将上述假单胞菌HTY-1接种到液体培养基中进行发酵培养，将得到的发酵液进行离心处理后，收集发酵上清液；浓缩发酵上清液后，进行纯化处理。
所述液体培养基可采用现有的适合假单胞菌生长的各种培养基。可选地，所述液体培养基：5g/L的胰蛋白胨，5g/L的大豆蛋白胨，10g/L的酵母抽提物，20g/L的蔗糖，10g/L的NaCl，pH为7.0-7.2。
优选地，假单胞菌HTY-1的培养条件为：28℃下，150转/分钟，培养48h，得到发酵液。
优选地，上述河豚毒素的制备方法包括以下步骤：
S1、将前述的假单胞菌进行发酵培养后，离心分离分离发酵上清液；
S2、通过减压旋蒸浓缩上一步的发酵上清液；
S3、使用C18固相萃取柱纯化发酵浓缩液毒素；
S4、将得到洗脱液进行过滤，再将过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌水中。
优选地，S4步骤后还设置以下步骤：
S5、利用系统来分析河豚毒素；对河豚毒素质谱分析。
优选地，所述制备方法中，采用减压旋蒸的方式浓缩发酵上清液，其条件为：水浴温度40-60℃，压力为0.01Mpa，浓缩比例为1：（50-200）。
优选地，所述制备方法中，纯化方法为：将C18柱进行活化；加入发酵浓缩液，控制流速为1滴/min，使用1倍柱体积的0.3%甲酸水冲洗，用2倍柱体积0.3%甲酸水洗脱。本发明的方法不限于上述具体的纯化条件。
优选地，发酵采用的液体发酵培养基包括以下成分：5g/L的胰蛋白胨，5g/L的大豆蛋白胨，10g/L的酵母抽提物，20g/L的蔗糖，10g/L的NaCl，pH为7.0-7.2。
第四方面，本发明还提供另一种河豚毒素的制备方法，其包括如下步骤：
S1、将前述的假单胞菌HTY-1进行发酵培养后，进行离心处理，并收集菌体细胞；
S2、向菌体细胞中加入体积浓度为1%的乙酸甲醇提取液，吹吸上一步得到的菌体细胞；
S3、进行超声破碎细胞并提取毒素；
S4、离心去除细胞沉淀后，将得到的液体进行0.22uM有机滤膜的过滤。
优选地，所述制备方法中，所述超声波破碎的条件为：功率90-120w，频率30-50hz，超声20-40min。优选条件为：功率100w，频率40hz，超声30min；离心条件为：4℃，3000-5000rpm条件下，离心10-30min。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供一株高效且稳定的产出河豚毒素的假单胞菌HTY-1，可通过液体发酵培养该菌株从而实现河豚毒素的大规模生产，不仅降低河豚毒素的产量，并且不会破坏生态环境，具有更好的发展前景。
2、本申请提供了两种不同的河豚毒素的制备方法，都是通过对假单胞菌HTY-1的发酵液进行不同的处理，从而分离和纯化得到河豚毒素产物。这两种方法操作简单，周期短。
附图说明
图1为采用的野生黄鳍东方鲀；
图2为假单胞菌HTY-1的菌落形态；
图3为TTX的标准曲线；
图4为TTX标准品的检测图谱；
图5为方法一得到的TTX提取物的色图谱；
图6为方法二得到的TTX提取物的色图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1假单胞菌HTY-1的分离纯化
(1)取一条具有河鲀毒素(TTX)的黄鳍东方鲀（ Takifugu xanthopterus），并分离出体内的卵巢组织；
(2)对卵巢组织进行手动匀浆处理，并以质量分数为0.75%的NACl溶液梯度稀释，取0.2ml的稀释梯度为10-2，10-3的稀释液涂布于改良2216E固体培养基上；
(3)28℃培养48h，挑取平板上的特征菌落，并将其划线于另一改良的2216E固体培养基上；
(4)28℃培养24h，再将分离到的单菌落再次划线分离培养；
(5)重复划线分离培养，直到分离到单菌落。
其中，所述的改良2216E固体培养基的组成为：蛋白胨 6g，酵母膏 10g，NaCl 10g，蔗糖 20g，KH2PO4 2.5g，琼脂20g，超纯水 1L，加入1 moL/L NAOH溶液调节pH为7.0-7.2。
如图2所示，最后分离得到黄色的单菌落。
实施例2 假单胞菌HTY-1的生物学鉴定
1、形态学鉴定
假单胞菌HTY-1在改良2216E培养基上菌落呈黄色，圆形，表面湿润粘稠，半透膜，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，运动。2、生理生化鉴定
经生理生化测定，本发明的假单胞菌HTY-1的脲酶测试阴性，氧化酶、接触酶试验为阳性；能水解明胶、吐温80，对淀粉不具水解性；能利用柠檬酸盐；硝酸还原测定为阳性，苯丙氨酸测定为阴性。生长温度范围7~45℃以及生长pH值范围为5.5~9.5,。
3、分子生物学鉴定
提取分离的菌株的基因组DNA，将分离提取的基因组DNA送至北京擎科生物科技有限公司公司进行扩增和测序，得到该菌株的16S rDNA片段，长度为1469bp，序列为：SEQ IDNO:1。
将该16SrDNA基因序列提交NCBI进行在线比对，发现：该基因序列与ATCC菌株（ PseudomonasotitidisBAA-1130）亲缘关系最近，结合菌株的形态学特征、生理生化鉴定，确定菌株该分离的菌株为假单胞菌 Pseudomonas otitidis，将其命名为HTY-1。
实施例3 假单胞菌HTY-1的发酵培养及河豚毒素的提取
1、假单胞菌HTY-1的发酵：
将假单胞菌HTY-1接种在液体发酵培养基中，在28℃下，150转/分钟，培养48h，得到发酵液。
其中，所述液体发酵培养基的配置方法为：分别称取5g胰蛋白胨，5g大豆蛋白胨，10g酵母抽提物，20g蔗糖，10g NaCl，加入到1L的超纯水中，再加入1 moL/L NAOH溶液，将培养基的pH调节至7.0-7.2即可。
2、河豚毒素的粗提
2.1方法一：
(1) 假单胞菌Pseudomonas adaceae细菌发酵培养后，4℃下4000rpm离心20min分离发酵上清液与菌体细胞；
(2)减压旋蒸浓缩发酵上清液，设置水浴温度50℃，压力为0.01Mpa，浓缩比例为1：100；
(3)使用C18固相萃取柱纯化发酵浓缩液毒素，C18柱使用1倍柱体积甲醇，1倍柱体积水活化；加入发酵浓缩液，控制流速1滴/min；1倍柱体积0.3%甲酸水冲洗；2倍柱体积0.3%甲酸水洗脱；
(4)将洗脱液过滤；
(5)过滤液冷冻干燥后，溶解在1ml无菌去离子水中；
(6)加入1%乙酸甲醇提取液，吹吸汇总收集菌体细胞；
(7)超声破碎细胞并提取毒素；
(8)4000rpm离心20min去除细胞沉淀；
(9)过0.22uM有机滤膜；
2.2方法二：
(1)假单胞菌Pseudomonas adaceae细菌发酵培养后，4℃下4000rpm离心20min分离发酵上清液与菌体细胞；
(2)加入1%乙酸甲醇提取液，吹吸汇总收集菌体细胞；
(3)超声破碎细胞并提取毒素；
(4)4000rpm离心20min去除细胞沉淀；
(5)过0.22uM有机滤膜。
3、毒素的鉴定
检测采用液相质谱联用仪
液相色谱条件如下：
1.色谱柱：HILIC柱（100*3mm，3um）
2.流动相
3.流速：0.3mL/min
4.柱温：40℃
5.进样量：10uL
质谱条件如下：
1.质谱：thermofisher TSQ QUANTIS。
2.离子源：ESI离子源；
3.气流量：反吹气2（Arb）鞘气35（Arb）辅助气10（Arb）；
4.扫描模式：正离子；
5.喷雾电压： 3500V；
6.离子参数：见下表：
2、检测结果及分析
（1）方法一的毒素的检测
样品检测图谱的图5对比TTX标准品检测图谱的图4，可见在出峰时间6.47位置附近出现一个特征峰，根据峰面积计算得到TTX浓度为14.287ppb。
（2）方法二的毒素检测（参照（1））
样品检测图谱图6对比TTX标准品检测图谱图4，可见在出峰时间6.47位置附近出现一个特征峰，根据峰面积计算得到TTX浓度为11.83ppb。
（3）毒素的产量或纯度
方法一得到的河豚毒素的产量为14.287ug/L，方法二得到的河豚毒素的产量为11.83ug/L，这不仅说明本申请提供的假单胞菌HTY-1是产河豚毒素的，并且通过本发明提供的前述方法一或方法二可对该假单胞菌HTY-1的发酵液进行河豚毒素的高效提取，该方法可用于河豚毒素的制备。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 青岛普瑞邦生物工程有限公司
<120> 一种假单胞菌及其在河豚毒素制备中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1469
<212> DNA
<213> 假单胞菌HTY-1的16S rDNA(16S rDNA of Pseudomonas otitidis HTY-1)
<400> 1
tggcggaggg ctaccatgca agtcgagcgg atgagtggag cttgctccat gattcagcgg 60
cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctggtagtgg gggataacgt ttcgaaagga 120
acgctaatac cgcatacgtc ctacgggaga aagtggggga tcttcggacc tcacgctatc 180
agatgagcct aggtcggatt agctagttgg tggggtaatg gcccaccaag gcgacgatcc 240
gtaactggtc tgagaggatg atcagtcaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300
gggaggcagc agtggggaat attggacaat gggcgaaagc ctgatccagc catgccgcgt 360
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cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgtaacga gcgcaaccct tgtccttagt 1080
taccagcacc tcgggtgggc actctaagga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140
ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg gccagggcta cacacgtgct acaatggtcg 1200
gtacaaaggg ttgccaagcc gcgaggtgga gctaatccca taaaaccgat cgtagtccgg 1260
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tcacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1380
gctccagaag tagctagtct aaccgcaagg aggacggtta ccacggagtg attcatgact 1440
ggggtgaagt cgtaacaaga gccattccc 1469

Claims (9)

1.一种假单胞菌，被命名为假单胞菌HTY-1(Pseudomonas.sp HTY-1)，其特征在于，保藏号为CGMCC No.23768。
2.如权利要求1所述的假单胞菌在河豚毒素制备中的应用。
3.一种河豚毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如权利要求1所述的假单胞菌HTY-1接种到液体培养基中进行发酵培养，将得到的发酵液进行离心处理后，收集发酵上清液；浓缩发酵上清液后，进行纯化处理。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将权利要求1所述的假单胞菌进行发酵培养后，离心分离分离发酵上清液；
S2、通过减压旋蒸浓缩上一步的发酵上清液；
S3、使用C18固相萃取柱纯化发酵浓缩液毒素；
S4、将得到洗脱液进行过滤，再将过滤液冷冻干燥后，溶解在无菌水中。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S1步骤中发酵培养采用的发酵培养基包括以下成分：5g/L的胰蛋白胨，5g/L的大豆蛋白胨，10g/L的酵母抽提物，20g/L的蔗糖，10g/L的NaCl，pH为7.0-7.2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，采用减压旋蒸的方式浓缩发酵上清液，条件为：水浴温度40-60℃，压力为0.01Mpa，浓缩比例为1：(50-200)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，纯化方法为：将C18柱进行活化；加入发酵浓缩液，控制流速为1滴/min，使用1倍柱体积的0.3％甲酸水冲洗，用2倍柱体积0.3％甲酸水洗脱。
8.一种河豚毒素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将权利要求1所述的假单胞菌进行发酵培养后，进行离心处理，并收集菌体细胞；
S2、向菌体细胞中加入乙酸甲醇提取液，吹吸上一步得到的菌体细胞；
S3、进行超声破碎细胞并提取毒素；
S4、离心去除细胞沉淀后，将得到的液体进行0.22uM有机滤膜的过滤。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述超声波破碎的条件为：功率90-120w，频率30-50hz，超声20-40min；离心条件为：3000-5000rpm条件下，离心10-30min。
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