CN109735474A - 一株具有促生作用的氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株氢氧化细菌假单胞菌Pseudomonas zw‑26，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018639。本发明还公开了从不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出该氢氧化细菌的方法，首先是利用持续通H₂的培养装置和矿质盐培养基实现对氢细菌的富集、分离和培养，并通过气相色谱法筛选具有较强氧化H₂的菌株。分析比较其生长指标，最终筛选出一株能够在重金属胁迫下保护白菜幼苗生长的氢氧化细菌，为氢氧化细菌对植物的促生和保护提供理论依据。

Description

一株具有促生作用的氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用

技术领域

本发明涉及一株氢氧化细菌zw-26及其分离方法和应用，具体涉及一种不含吸氢酶的豆科植物根际土壤中分离培养出的氢氧化细菌假单胞菌（Pseudomonas）zw-26，该氢氧化细菌zw-26菌株于2018年9月19日在武汉大学中国典型培养物中心保藏，其保藏编号为CCTCC M 2018639。

背景技术

由于人为的活动，例如自然资源的开采、产品加工制造业、现代农业活动和能源制造，导致释放的重金属对自然环境产生不利的影响。常见的污染物有Cd，Pb，Zn，Cr，Cu等。重金属不像有机物，不能被降解为无害的产物，因此一直存留在环境中，对植物生长和人类的健康构成威胁，急需找到一种高效、绿色环保的方法。

通过接种植物促生菌(PGPR)、菌根辅助细菌(MHB)、固氮根际细菌、丛枝菌根真菌(AMF)作为定植者和生物肥料来保护植物免受重金属的毒害已经被报道。这些根际微生物与植物相辅相成，不仅在保护植物免受毒害方面有着重要的角色之外，而且还对植物抵抗重金属的毒害表现出实质性的防御，因而提高植物共生关系及植物的产值。

植物与共生根瘤菌的营养物质交换对豆科植物的生长有着重要的作用，豆科植物的轮作效益主要归功于植物的固氮作用，但研究表明只有25%的效益是因为固氮作用。豆科植物在固氮过程中，根瘤周围会产生大量的H₂，一些具有吸氢酶的共生根瘤菌（HUP⁺）能够使氢气被细菌氧化，减少周围土壤中能量的流失，然而许多共生根瘤菌缺失这种酶（HUP^-），从而使大量的氢气释放到土壤中，被周围的氢氧化细菌摄取。已有研究表明H₂处理过的土壤能够促进植物的生长，植物促生剂是自然环境中的细菌。

氢氧化细菌属于植物促生菌，对植物的生长发育有着不可估量的作用，所以其促生机制的探索已成为当前国内外关注的热点，其中氢氧化细菌对重金属的耐受及其对植物的促生少有研究。通过本实验筛选出既能够保护植物免受毒害又能促进植物生长的菌株，以便于研制成为生物肥料菌剂用于农业生产。

发明内容

本发明的目的是提供一株氢氧化细菌zw-26及其分离培养方法。

本发明的另一目的是提供上述氢氧化细菌在Cr胁迫下对白菜幼苗的促生作用。

本发明实现过程如下：

一种氢氧化细菌zw-26，其分类命名为假单胞菌属zw-26（Pseudomonas sp. zw-26），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018639。

本发明氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤如下：

(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

(2)土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H₂的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；

(3)菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；

(4)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。

本发明的氢氧化细菌zw-26为在28℃的MSA培养基中培养的革兰式阴性杆状细菌。

其鉴定特征如下：

1、生理生化特征

zw-26的生理生化特征显示在表1

所述菌株zw-26呈球状，革兰氏染色阴性。在MSA半固体培养基上28℃培养可形成菌落，呈圆形、乳白色。

2、序列分析

挑取适量单菌落划线至6m1 LB培养基中28 C , 180rpm培养24h，取菌体悬浮液1mL,12000转每分钟离心2min，收集菌体，剩余步骤根据TIANamp Bacteria DNA Kit说明书依次规范操作，最终获得高纯度的DNA。将部分氢氧化细菌的DNA送上海生工完成16S rDNA扩增及序列测定。提交该细菌的16S rDNA序列到NCBI网站，Blast后获取相似度较高的序列。利用ClustalXl .81将序列进行比对，选择MEGA5.05分子进化遗传分析软件NJ法构建系统发育树。结果显示菌株zw-26与Pseudomonas菌株的序列相似程度达99%，据此可以确定菌株zw-26在分子系统发育分类学上属于Pseudomonas。

氢氧化细菌最优菌株的筛选具体包括以下步骤：

(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤

(2)土壤富集与分离纯化：采集的根际土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养。待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化，将菌株转接斜面培养基，放入密闭干燥器中，按上述通H₂的量培养，备用；

(3)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。按照:氧化H₂值(mol/L)=密闭试管中初始H₂浓度(mol/L)－培养3d后密闭试管中剩余H₂浓度(mol/L)，检测菌株是否具有氧化H₂能力以及氧化H₂能力的大小，筛选出具有较强氧化能力H₂的氢氧化细菌一假单胞菌(Pseudomonas)zw-26。

上述步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5mm以内。

上述步骤(2)所述采集的根际土壤加入无菌水置于锥形瓶中，稀释至10^-11，涂布于矿质盐培养基上，倒置在改良的气体培养体系中，氢气含量为1.4 mmol，常温下富集培养土壤中的氢氧化细菌。所述的矿质盐培养基：NaNO₃ 2.0g，KH₂PO₄ 0.14g，K₂HPO₄ 1.2g，酵母膏0.02g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，Fe(SO₄)·3H₂O 0.0lg，KCl 0.5g，琼脂16g，蒸馏水1L，pH7.2。

上述步骤(3)所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N₂，流速20mL·min^-1，进样口温度：150℃，检测器温度：160℃，检测温度：40℃，分析时间3min。

氢氧化细菌制剂的制备

(1)菌株：上述分离纯化出的较强氧化能力H₂的氢氧化细菌假单胞菌(Pseudomonas)zw-26；

(2)发酵培养：接种新鲜的氢氧化细菌到三角瓶，放入摇床，转速180r/min,280C摇瓶培养36h；

(3)菌剂制备：以草炭、泥炭土、米糠、菜园土、锯木屑、蒙脱土等为吸附剂制成固体菌剂；

(4)田间试验：在西北大学试验田进行。设zw-26、营养液、空白对照3个处理，每个处理用土埂隔开。每隔5天调查促生效果。

本发明还提供了含有氢氧化细菌zw-26或其产生的次级代谢产物的微生物制剂。

可以使用本领域熟知的方法将本发明的氢氧化细菌制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但本发明并不局限于此。为替代化肥，本发明的氢氧化细菌制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。

附图说明

图1 α一酮丁酸的标准曲线；

图2 牛血清白蛋白标准曲线。

具体实施事例

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1土壤微生物zw-26的分离培养

1、样品采集：在甘肃省靖远县郊区(36.36N，104.42W)蚕豆植株的田地内，挑选生长旺盛、有大量结瘤的蚕豆植株，根据Riley和Barber的方法采集根瘤周围4mm以内的蚕豆根际土壤。

2、土壤氢细菌的富集、分离：准确称量l0g蚕豆根际4mm内周围土壤，加入装有90mL无菌水(含有25-35个玻璃珠)的锥形瓶中，置振荡器上震荡15分钟，得到初始浓度为10^-1的稀释液，连续稀释至10^-11，将10^-1到10^-11梯度的稀释液均匀的涂布于矿质盐培养基上，倒置于改良的气体循环培养体系里面,氢气含量为1.4mmol·L^-1，常温下培养数周，直至培养皿内长出肉眼可见的菌落。挑取形态特征不同的菌落划线至矿质盐培养基继续培养，每菌株连续纯化三代以上，最终使培养皿内的菌落大小、颜色及形状和显微镜观察的菌体结果一致，将纯化的细菌划线至营养肉汤琼脂斜面，4℃保藏，以备后续研究。

3、菌株筛选：将待测菌株的单菌落接种至矿质盐琼脂培养基中，待有肉眼可见的菌落时用灭菌的橡皮塞封闭，将未接菌的矿质盐培养基作为对照组，将100µL纯氢气加入到上述试管，使混合气体的H₂浓度大约在1.4mmol·L^-1，充分混合后用气相色谱检测密闭试管中的H₂初始浓度，将密闭试管放置于旋转摇床上28℃，180rpm培养3d，抽取试管中的气体100µL，气相色谱确定氢气末浓度，计算细菌的氧化氢气值(氢气末浓度－氢气初始浓度)，根据氧化氢气值的大小判断细菌消耗H₂值的大小。检测条件(lm×2mm)的色谱柱内装5A分子筛，以高纯N₂作载气，流速20mL·min^-1)，进样口温度150℃；检测器温度160℃；检测温度40℃；分析时间为3min。

按上述实施方法共分离筛选出11株氢氧化细菌，表2是11株氢氧化细菌的氧化H₂能力测定结果，都有较强的氧化氢能力。

注: 平均值+S.D. 取自三次重复，**表示与对照具有显著差异 (p<0.01). 对照菌株: Staphylococcus aureus.

实施例2 ACC脱氨酶的测定

ACC脱氨酶水解ACC产生的α-酮丁酸用来测定ACC脱氨酶的活性。挑取适量待测菌株接种至营养肉汤培养基上活化24 h，接种活化的氢氧化细菌菌株至7.5 ml LB培养液28℃180rpm培养24 h，室温5000 g离心20 min收集菌体，5 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5)缓冲溶液洗涤菌体2次，将收集的菌体重新分散于7.5 ml DF液体培养基，每个样品中加入45 µL0.5M ACC溶液，菌体28℃ 180rpm摇床培养24h，按上面的方法收集和清洗菌体，用600 µL0.1 M Tris-HCl (pH 8.5)缓冲溶液重新悬浮菌体，加入30µL甲苯震荡30s，取100 µL甲苯化溶液于1.5 ml离心管4℃保存稍后测定蛋白含量。取上述甲苯化溶液200 µL于1.5 ml离心管中加入15 µL 0.5M ACC溶液混匀，另取200µL甲苯化溶液不加ACC作为阴性对照组，30℃反应15分钟，所有样本加入1 ml 0.56mo1·L^-1 HCl混匀，12000 r离心10min移除细胞残体，取上清液lml至5ml 比色管中，加入800 µL 0.56M HCl混匀，加入300 µL DNF ( 2,4二硝基苯肼)溶液30℃水浴30 min，样品中加入2m1 2 M NaOH混匀，540nm检测吸光值。空白组为200 µL 0.1 M Tris- HCl (pH 8.5)缓冲溶液，每个菌株三次重复。根据Bradford方法测定菌体蛋白含量。根据α-KB和蛋白质的标准曲线确定1-氨基环丙烷-1-氨基狡酸脱氨酶的活性。

α-酮丁酸标准曲线的制作：用0.1 mol L^-1(pH 8.5)的Tris-HCl配制0.1 mol/L的α-酮丁酸母液，用Tris-HCl对母液梯度稀释至浓度为0.1 mmol~1.0 mmol的标准液，每梯度取1 mL α-酮丁酸母液，加800 µL 0.56 mol L^-1的HCl和300 µL 2, 4一二硝基苯肼(0.2 g的2,4一二硝基苯肼溶于100 mL 2M HCl)，漩涡震荡混匀，30℃水浴30 min，加入2 mL浓度2mol L^-1，的NaOH显色，空白组为200 µL 0.1 M Tris- HCl (pH 8.5)缓冲溶液用来调零，540nm测其吸光值。

根据测定所得的吸光值换算出α-KB的浓度，为了比较各株氢氧化细菌的ACC脱氨酶活性大小，还需测定相应菌体的蛋白含量。每毫克菌体蛋白每小时产生的α-KB含量定义为ACC脱氨酶的活力。参照Bradford蛋白质含量测定方法建立牛血清蛋白标准曲线(图2)。根据α-酮丁酸标准曲线（图1）和牛血清蛋白标准曲线确定ACC脱氨酶活力，菌株zw-26的ACC脱氨酶活性为9.460.27 µMol·mg^-1·h^-1。

实施例3 氢氧化细菌zw-26对Hoagland半固体培养基中白菜幼苗的影响

采用修改的Belimov方法确定根际细菌的植物促生根长活性。接种待测株菌体至6mLLB液体培养基中180rmp，28℃培养24h，用无菌生理盐水悬浮菌体数为5×10⁷CFUmL^-1，1mL细菌悬浮液加入到含有40mL Hoagland半固体培养基培养皿中，半固体培养基中加入Cr⁶⁺的终浓度为10µM，1mL的生理盐水作为对照组。用3%的H₂O₂和95%的乙醇(1:1)对白菜种子表面灭菌20min，无菌水冲洗数次至种子表面无气泡产生，挑选20个生长一致的发芽白菜种子到Hoagland半固体培养基，所有的实验处理组做三次重复。在光照培养箱中28℃黑暗培养7天，从半固体培养基中缓慢拔出白菜幼苗。用蒸馏水冲净白菜幼苗表面多余的培养基，待滤纸吸干其表面的水分，测量统计根长、茎长、鲜重和干重的数据。所统计的数据做Fisher'sDuncan^a多重比较，白菜幼苗的根长、茎长、鲜重、干重数据见表3。

注:3次重复的平均值t标准偏差，小写字母表示试验之间的显著性(p<0.01)

实施例4氢氧化细菌zw-26和不同浓度Cr⁶⁺对土壤中白菜幼苗生长的影响

试验所用的土壤取自西北大学果园，经过直径为2mm的筛子筛选土壤，将所得的土壤分装200g到15个250mL烧杯中，分为5份，每份土壤中加入Cr⁶⁺ (KCr₂O₄)的终浓度为50µM，100µM，150µM三个梯度，121℃灭菌20min。选取促生能力显著的菌株，接种待测株菌体至6mL LB液体培养基中，28℃培养24h，用无菌生理盐水悬浮菌体数为5×10⁷CFUmL^-1。用3%的H₂O₂和95%的乙醇(1:1)对白菜种子表面灭菌20min，无菌水冲洗数次至种子表面无气泡产生，灭菌的种子置于无菌的培养皿中，28℃黑暗中发芽2d，挑选6个生长一致的发芽种子到处理过的土壤中，加入5mL对应的菌液，对照组加入5mL 0.98%的NaCI。所有的试验处理组做三个平行。隔三天用无菌Hoagland营养液浇灌一次，在光照培养箱中28℃，光照时间12:12h无菌培养30天，30后测量白菜幼苗的根长、芽长、鲜重、干重。

注:3次重复的平均值标准偏差，小写字母表示试验之间的显著性((p < 0.01)。

如表4所示，在50µM处理的土壤中，该氢氧化细菌对白菜幼苗茎长的生长、干重、鲜重的增加没有显著的差别。在100µM处理的土壤中，zw-26对白菜幼苗茎的生长有促进作用，但促生作用不太明显，与对照组相比分别增加了13.1%。在100µM处理的土壤中，zw-26对白菜幼苗鲜重的增加有促进作用，与对照组相比增加了45.1%；在150µM处理的土壤中，zw-26对白菜幼苗鲜重的增加有促进作用，与对照组相比分别增加了16.3%。白菜根对Cr6+的响应表明白菜幼苗根的生长容易受这种金属的影响，这种响应随着金属浓度的增加会更明显。处于不同浓度Cr，接种氢氧化细菌的白菜幼苗的根长结果表明:接种氢氧化细菌有利于植物根的生长，相对于未接种氢氧化细菌的对照组的根长。在高浓度150 µM的Cr存在时，接种了zw-26的白菜幼苗根长与对照组相比增加了76.1%。

Claims (9)

1.一种氢氧化细菌zw-26，其分类命名为假单胞菌属zw-26（Pseudomonas sp. zw-26），已于2018年9月19日由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2018639。

2.根据权利要求1所述的氢氧化细菌zw-26，其生态特征为：在矿质盐培养基上可形成菌落，呈乳白色，圆形小菌落；个体形态是球状，革兰氏染色阴性。

3.权利要求1所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤如下：

(1)样品采集：按常规方法采集生长旺盛且不含吸氢酶的结瘤豆科植物根际土壤；

(2)土壤富集：将采集的土壤样品置于持续通H₂的培养装置，富集土壤中的氢氧化细菌；

(3)菌种分离与纯化：土壤稀释涂布于矿质盐培养基平板，置入密闭容器，室温倒置培养，待平板长出明显菌落，挑取单菌落用稀释涂布法进一步纯化；

(4)菌种筛选：气相色谱仪进行检测并筛选氢氧化细菌。

4.根据权利要求3所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤，其特征在于：其中步骤(1)所述的不含吸氢酶的豆科植物包括紫花苜蓿、大豆、紫云英和三叶草，根际土壤范围为距离根瘤5mm以内。

5.根据权利要求3所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤，其特征在于：其中步骤(2)所述采集的根际土壤加入无菌水置于锥形瓶中，稀释至10^-11，涂布于矿质盐培养基上，倒置在改良的气体培养体系中，氢气含量为1.4 mmol，常温下富集培养土壤中的氢氧化细菌。

6.根据权利要求3所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤，其特征在于：其中步骤(3)所述的矿质盐培养基：NaNO₃ 2.0g，KH₂PO₄ 0.14g，K₂HPO₄ 1.2g，酵母膏0.02g，MgSO₄·7H₂O0.5g，Fe(SO₄)·3H₂O 0.0lg，KCl 0.5g，琼脂16g，蒸馏水1L，pH7.2。

7.根据权利要求3所述的氢氧化细菌zw-26的分离纯化步骤，其特征在于：其中步骤(4)所述的气相色谱条件为：内装5A分子筛的1m×2mm的色谱柱，载气为高纯度N₂，流速20mL·min^-1，进样口温度：150℃，检测器温度：160℃，检测温度：40℃，分析时间3min。

8.含有权利要求1所述氢氧化细菌zw-26的固体菌剂。

9.权利要求1所述的氢氧化细菌zw-26在促进植物生长中应用。