CN109414486B - 用于治疗和预防蹄和爪病的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病的方法的包含喜角质性真菌和/或喜角质性酵母的抗原性物质的组合物和新的疣状毛癣菌菌株，其可以例如用于此类治疗和/或预防方法。
Description
本发明涉及用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病的方法的包含喜角质性真菌和/或喜角质性酵母的抗原性物质的组合物和新的疣状毛癣菌菌株，其可以例如用于此类治疗和/或预防方法。
趾皮炎(简称DD，也称为Mortellaro病或意大利脚腐病(Italian foot rot))于1974年由Cheli和Mortellaro首次描述，是母牛和肉牛的一大问题，并存在于许多奶牛场。DD非常具有传染性，并且难以治疗和预防。还有，难以控制从兽群的消除。此疾病在全世界造成重大经济损失。不同种类的细菌造成趾间间隙中的皮肤损伤，其特征为红色或“草莓样”、无毛和疼痛性溃疡伴受累部位处的上皮增生和肿胀。它们通常位于足的后部，在趾间间隙中。无活动或经治疗的损伤可能很难与其他疣状趾损伤区分。DD应当与趾间皮炎(ID)区别，所述趾间皮炎导致远端趾间皮肤出现坏死或坏死细菌病。研究鉴定DD组织切片中的细菌螺旋菌(spirochetes)。在进一步分析中，在DD损伤中鉴定出许多类型的细菌。特别地，密螺旋体属物种(Treponema spp)如蚀疮溃疡密螺旋体(T.phagedenis)、文氏密螺旋体(T.vincentii)和齿垢密螺旋体(T.denticola)可以形成DD的临床表现。发现了不同病因因素的一种非常强烈的复合体。
趾间皮炎(ID)通常发生在母牛中，并且是跛的主要感染原因之一。渗出性皮炎、潮湿和臭味糜烂伴有痂皮(crust)或结痂(scab)和单一溃疡表征踵区和趾间间隙中皮肤损伤的临床表现。还可以观察到趾背表面上的临床症状。踵是疼痛的。之后，经常观察到增生(鸡眼，纤维瘤)伴有趾间间隙的慢性刺激，从而导致跛。不同细菌的混合物导致ID。结节双螯菌(Dichelobacter nodosus)在临床症状的表现中起着重要作用。此微生物是具有强光解特性的厌氧菌。通常，感染是由来自受感染的母牛的细菌引起的，其中结节双螯菌从受感染的动物传播到未感染的动物。虽然细菌不能在地上长时间存活，但它们可以在爪中长期存在。细菌破坏表皮，但不穿透真皮层。皮肤和软踵角之间的边界的崩解产生破裂和溃疡。损伤引起不适。
趾间蜂窝织炎(简称IP，也称为指头脓炎(panaritium)或腐蹄病(foot rot))是趾间间隙中皮肤的坏死性炎症。疾病的表现通常为急性或亚急性形式。趾间皮肤中的损害、糜烂和损伤充当感染入口。此外，细菌微生物区系可以进入并感染皮下组织。受感染的动物变得跛足、蜂窝织炎和肿胀。IP的临床症状伴随着产奶量减少、食欲减退和发烧。主要地，微生物结节双螯菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)等参与IP。IP中涉及的主要细菌是坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)，它是革兰氏阴性、无孢子形成、无鞭毛、不运动、多形性厌氧细菌。此细菌产生脂多糖内毒素，其具有坏死活性并导致皮肤和皮下组织坏死。
DD、ID和IP(它们是最常见的传染性蹄和爪病)在世界范围内偶尔分布，但特别是在集约化牛肉或奶牛生产单元中可能是地方病的。发病率特别取决于天气、一年中的季节、放牧期和圈养系统。IP通常导致跛以及体重显著下降、生育力丧失和产奶量减少。发病率可以在5％至30％之间。在第一次流行病例中，约30％至80％的动物可以显示该疾病的临床表现。然而，IP平均仅占爪病的15％。
令人惊讶的是许多研究者提出DD、ID和IP的病因学因素是相同的微生物，如结节双螯菌(Dichelobacter nodosus)、坏死梭杆菌(Fusobacterium necroforun)和梭杆菌属物种(Fusobacterium，spp)，其首先破坏表皮并允许从密螺旋体属物种(Treponema spp)，如蚀疮溃疡密螺旋体(T.phagedenis)、文氏密螺旋体(T.vincentii)和齿垢密螺旋体(T.denticola)进入更深层组织，以形成DD的临床表现。从受DD、ID和IP影响的组织的病理材料中分离的其他细菌物种是弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogenes)和普雷沃菌属物种(Prevotella spp)。此外，提出病毒在疾病的发病机制中起重要作用。
DD、ID和IP的典型治疗策略是应用抗生素、抗菌制剂和具有抗生素、防腐剂和收敛剂的局部应用垫。在3天期间肌肉内应用青霉素或土霉素(oxitetracelline)显示用于治疗IP的良好结果，但是在治疗ID和DD中不是有效的。
对于IP、ID和DD的治疗，可溶性土霉素、林可霉素-壮观霉素、呋喃西林或磺胺制剂，以及磺胺二甲嘧啶粉末和无水硫酸铜的混合物的局部应用可以提供足够的结果。然而，在治疗之前，必须彻底清洁损伤并且必须除去坏死组织。
为了预防性使用，可以使用含有7至10％硫酸铜或锌或3至5％甲醛溶液的足浴。还可以使用含有土霉素或林可霉素-壮观霉素的足浴。但是，这些溶液可能污染环境，并且在某些地区或国家是禁止的。此方法被接受用于控制IP和ID，但对DD的治疗效果较差。
为了治疗DD、ID和IP，在美国开发了一种密螺旋体菌苗疫苗。显示了用所述疫苗免疫可以减少牛的DD临床症状。但是，在临床试验中发现包括密螺旋体在内的畜群特异性病原体不能提供足够的针对DD的保护。与未接种疫苗的对照动物相比，在干燥期期间给予菌苗的母牛的损伤没有减少。在德国获得了相同的结果。推断治疗不可能成为未来DD的有效治疗、控制或预防策略。市场上不存在相应的商业疫苗。
通过使用不同种类的抗原性成分进行了许多研究以诱导针对坏死梭杆菌的保护。据报道，注射含有白细胞毒素的坏死梭杆菌培养上清液的牛具有由坏死梭杆菌引起的足腐烂的低发生率。用高白细胞毒素产生性坏死梭杆菌菌株的上清液与佐剂混合进行的刺激当在公牛中注射时产生高抗白细胞毒素抗体滴度，并为实验诱导的肝脓肿提供显著保护。坏死梭杆菌菌苗用作免疫牛和羊免于肝坏死的试剂。此外，用0.4％福尔马林灭活来自有毒力的坏死梭杆菌隔离群培养物的细胞。用所述灭活细胞和用活的坏死梭杆菌免疫的小鼠在肝、肺或脾中没有可检测的细菌长达28天。推断用福尔马林杀伤的坏死梭杆菌免疫小鼠赋予针对感染的保护。此外，在经免疫的动物中注射具有白细胞毒性活性的内毒素防止坏死梭杆菌感染的建立。
为了产生此类白细胞毒素疫苗，以增强上清液中白细胞毒素的加工的方式培养坏死梭杆菌细菌。终止细菌生长和白细胞毒素释放，并通过至少灭活含白细胞毒素的上清液制备疫苗。这是通过将含有白细胞毒素的上清液与细菌分离，然后用福尔马林、β-丙内酯、加热、辐射或任何其它已知的灭活方法灭活来完成的。或者，可以使整个培养物失活以形成疫苗。
还已知从生产菌株坏死梭杆菌“0-1”(俄罗斯实验兽医研究所(Russian ResearchInstitute of Experimental Veterinary Medicine))获得的另一种经福尔马林灭活的杀白细胞素-外毒素，其包含1-10％的每1cm含有70-77亿个细胞的所述菌株的灭活细菌质量，甘油，以1∶(0.9-1.1)重量比采用的矿物油“Markol-52”，乳化剂的混合物，盐水中的脾热疫苗株55(俄罗斯兽医病毒学和微生物学研究所(Russian Research Institute ofVeterinary Virology and Microbiology))的活孢子悬浮液和佐剂。因此，针对坏死梭杆菌白细胞毒素免疫动物可以预防与坏死梭杆菌感染有关的疾病，例如牛和羊的肝脓肿，以及牛的ID和IP。
用于预防牛中的坏死细菌病(necrobacteriosis)的已知疫苗包括源自病原体坏死细菌病(坏死梭杆菌)的内毒素和外毒素抗原、福尔马林灭活剂、盐水和基于矿物油和羊毛脂的佐剂。用于坏死细菌病农场动物的已知疫苗包含来自菌株坏死梭杆菌I和II血清型的可溶性抗原的复合物、福尔马林、胶乳和吸附剂佐剂。然而，已知的疫苗含有一类病原体的抗原，并且不为坏死细菌病(具有厌氧性微生物和脓性伤口微生物区系的疾病)提供足够的预防活性。
还已知至少几种用于预防和治疗ID和IP的灭活商业疫苗。已知的是例如用于预防牛中的坏死细菌病的多价疫苗。所述疫苗含有坏死梭杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓棒杆菌、产气荚膜梭菌A型类毒素、产气荚膜梭菌A型的福尔马林灭活抗原、氢氧化铝佐剂和免疫增强剂GMDP(N-acetilglukozamenil-(1-4)-N-acetimuromil-Z-alanin-D-isoglutamine)。还已知疫苗“Nekovak”，其包含灭活的坏死梭杆菌VGNKI N“Kp-1”DEP和/或坏死梭杆菌VGNKI N“Tula”DEP，化脓放线菌(化脓棒杆菌)VGNKI No.4/2334DEP，金黄色葡萄球菌VGNKINo.7315DEP和产气荚膜梭菌A型VGNKI No.28DEP的培养物。该疫苗还含有来自产气荚膜梭菌A型VGNKI No.28DEP的菌株的类毒素和氢氧化铝佐剂。另外，疫苗含有盐溶液，如盐水。
所有已知的疫苗通常都不能引发足够的免疫反应并保护动物免于趾间皮炎和趾间蜂窝织炎。没有针对趾皮炎的有效疫苗。
关于使用灭活的皮肤真菌病皮肤真菌病疫苗的方法是本领域已知的。例如，描述了用具有灭活的红色毛癣菌菌丝悬浮液在兔中针对紫色毛癣菌(Trichophytonpurpureum)感染的主动免疫。同样，EP 393371和WO 9307894公开了包含毛癣菌属和/或小孢子菌属的皮肤真菌的灭活皮肤真菌病疫苗。此外，在WO 98/15284中描述了真菌病疫苗，其包含均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和灭活的均质化酵母芽生孢子。
动物中的皮肤真菌病是皮肤和相关组织的兽传人兽互通性(anthropozoonotic)疾病。临床症状是受影响区域的毛发脱落、充血、脱皮和石棉样痂。牛犊比老年动物更容易受到癣感染。皮肤真菌病通常还以皮肤的局部感染为特征。在牛中，损伤最常见于颈部，头部，并由在皮肤上凸起的灰白色痂皮组成。此外，皮肤真菌病可能导致脱发。据报道引起癣的生物体自感染动物传播给人。动物皮肤真菌病具有重大的社会经济影响。患病的动物需要长期治疗，并且可以将感染传播给动物和人类两者。到目前为止，已经使用局部施用于皮肤受影响区域的各种类型的药物治疗皮肤真菌病。这些包括许多软膏、搽剂、溶液和其他含有杀真菌剂和抑真菌剂的物质。此类处理的缺点是它们不是非常有效，它们需要采取检疫措施和对饲养动物的区域(饲养栏、生态饲养场(vivaria)、农场、动物园、马戏团等)进行消毒。此外，它们需要大量资金用于药物制剂和兽医治疗，并且它们使动物固定困难(对于被圈养的野生动物)。开发灭活疫苗以治疗牛的毛癣菌病，马，猫和狗的皮肤癣菌病，如例如WO93/07894中描述，以及开发活疫苗以治疗毛皮动物和兔(参见USSR专利号835446)，骆驼(参见USSR专利号1190574)等。还开发了用于预防和治疗哺乳动物的真菌病的疫苗(参见WO98/15284)。
因此，本发明的目的是提供用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病的方法的新组合物。本发明的另一个目的是提供用于治疗和/或预防动物，特别是牛科和猪的趾和/或趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎的方法中的组合物。本发明的另一个目的是提供新的疣状毛癣菌菌株。本发明的另一个目的是提供用于治疗和/或预防皮肤癣菌病的方法中的组合物。
这些目的通过权利要求书中限定的主题解决。
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包括”结合使用时，使用词语“一种”或“一个”可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或超过一个/种”的含义一致。
术语“约”意指涵盖叙述值±叙述值的5％，或用于测量给定值的标准误差。
如本文所用，术语“包含”不应解释为限于意指“由…组成”(即排除另外的其他物质的存在)。相反，“包含”意味着可选地可以存在另外的物质。术语“包含”涵盖如特别设想的实施方案，其落入其范围“由…组成”(即排除存在另外的其他物质)和“包含但不由…组成”(即，需要存在另外的其他物质)，前者更优选。
如本文所用，术语“蹄和爪病”特别是指牛科和/或猪中的传染性蹄病和爪病。所述疾病特别是由细菌、真菌和/或病毒引起。特别地，术语“蹄和爪病”指趾皮炎、趾间皮炎和趾间蜂窝织炎。
如本文所用，术语“牛科”特别是指偶蹄类反刍哺乳动物，包括野牛、非洲水牛、水牛、羚羊、瞪羚、绵羊、山羊、麝香鼠(muskoxen)和牛。
如本文所用，术语“跛”特别是指由于感染和组织损伤导致的跛。特别地，术语“跛”是指由于蹄和爪病，更特别地是由于趾皮炎、趾间皮炎和趾间蜂窝织炎引起的跛。
如本文所用，术语“壳聚糖”是指2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖的共聚物，其中脱乙酰化度超过50％，优选更多超过60％、70％、80％或90％。壳聚糖可以以化学方式源自几丁质，其是聚-1，4-β-N-乙酰基-D-葡糖胺，更特别是通过脱乙酰化得到的N-乙酰基-1，4-β-D-吡喃葡糖胺。典型的壳聚糖制剂随制造方法而具有不同的分子量。
现在令人惊讶地发现，包含喜角质真菌或酵母的抗原性物质的疫苗赋予动物中针对趾皮炎、趾间皮炎和趾间蜂窝织炎的良好抗性和预防和治愈效果。特别地，令人惊讶地发现包含均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或灭活的均质化的酵母芽生孢子的疫苗赋予动物中针对趾皮炎、趾间皮炎和趾间蜂窝织炎的良好抗性和预防和治愈效果。
本发明涉及包含喜角质性真菌或喜角质性酵母的抗原性物质的组合物，其用于治疗和/或预防动物蹄和爪病的方法。优选地，动物是哺乳动物，更优选牛科和/或猪，最优选牛。
喜角质性真菌或酵母的抗原性物质可以源自包含抗原的喜角质性真菌或酵母的任何部分，诸如来自菌丝、关节孢子(artrospores)、皮肤真菌(dermatophyte)小分生孢子、酵母芽生孢子等。抗原优选是多糖和/或糖肽。喜角质性真菌或酵母的抗原性物质选自下组：均质化灭活的皮肤真菌小分生孢子、均质化灭活的酵母芽生孢子、酵母芽生孢子的抗原性物质和皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质。因此，组合物特别涉及组合物，其包含均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或均质化的灭活的酵母芽生孢子和/或酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质。
特别地，蹄和爪病导致跛。更特别地，蹄和爪疾是趾皮炎和/或趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎。蹄和爪病和趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝织炎分别可以由结节双螯菌、坏死梭杆菌、梭杆菌、密螺旋体，诸如蚀疮溃疡密螺旋体、文氏密螺旋体、和齿垢密螺旋体、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓隐秘杆菌和普雷沃氏菌(Prevotella spp.)和/或病毒引起。
本发明使用的组合物的喜角质性酵母，特别是酵母芽生孢子的抗原性物质优选属于念珠菌属，更优选属于白色念珠菌物种。喜角质性皮肤真菌，特别是皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质优选属于毛癣菌属和/或小孢子菌属。更优选地，皮肤真菌小分生孢子属于物种疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、马毛癣菌(Trichophyton equinum)，Trichophyton sarkisovii，红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、须毛癣菌、犬小孢子菌(Microsporum canis)和/或石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)。特别地，犬小孢子菌物种可以是犬小孢子菌obesum变种(Microsporum canis var.obesum)和/或犬小孢子菌歪斜变种(Microsporum canisvar.distortum)。
在本发明的一个优选实施方案中，酵母芽生孢子和皮肤真菌小分生孢子从上述物种的菌株中获得，所述菌株已经通过基于孢子产生和/或减毒的定向选择获得。高度优选使用与其来源的任何体表附生株相比在营养培养基中生长更快，分别产生更多的小分生孢子和芽生孢子，在其肌肉内应用后具有更低的毒力和/或无不良反应的菌株。此类菌株的实例是须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458、白色念珠菌DSM-9459。因此，在本发明的特别优选的实施方案中，酵母芽生孢子和皮肤真菌小分生孢子获得菌株须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458、和白色念珠菌DSM-9459。
菌株红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458和白色念珠菌DSM-9459已根据布达佩斯条约在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen“(DSM)，Mascheroder Weg 1B，W-38124Braunschweig，Germany(其目前名称和地址为“Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von MikroorganismenundZellkulturen GmbH”（DMSZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，GERMANY)于1994年10月5日由Basotherm GmbH，Eichendorffweg 5，88396Biberach an der Riss保藏。所述菌株的当前保藏者是申请人，即Dr.IgorPolyakov和Dr.sc.Dr.Liudmila Ivanova，Eberhardtstr.40，89073Ulm。
红色毛癣菌，No.DSM-9469
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9469保藏。该菌株通过基于1985年在人的皮肤上鉴定的体表附生菌株No.533的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognitionand identification，3rd Print，University of Miami Press.Coral Gables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表A中。菌株No.DSM-9469与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。
表A
红色毛癣菌，No.DSM-9470
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9470保藏。该菌株通过基于1990年在人的皮肤上鉴定的体表附生菌株No.535的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognitionand identification，3rd Print，University of Miami Press.Coral Gables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表B中。菌株No.DSM-9470与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。
表B
红色毛癣菌，No.DSM-9471
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9471保藏。该菌株通过基于1990年在人的指甲上鉴定的体表附生菌株No.620的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognitionand identification，3rd Print，University of Miami Press.Coral Gables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表C中。菌株No.DSM-9471与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。
表C
红色毛癣菌，No.DSM-9472
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9472保藏。该菌株通过基于1990年在人的指甲上鉴定的体表附生菌株No.754的孢子产生和减毒的定向选择获得。该菌株使用“Rebell-Taplin”关键词鉴定(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognitionand identification，3rd Print，University of Miami Press.Coral Gables，Florida，USA，1978)。该菌株的生物学特性记载于表D中。菌株No.DSM-9472与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。
表D
红色毛癣菌，No.DSM-9456
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9456保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.008-L的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：ATaxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表E中。菌株No.DSM-9456与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、小分生孢子的大量产生和更低的毒力。
表E
红色毛癣菌，No.DSM-9457
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9457保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.012的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：ATaxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表F中。菌株No.DSM-9457与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。
表F
红色毛癣菌，No.DSM-9458
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9458保藏。该菌株通过基于1989年在人上鉴定的流行性菌株No.047的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：ATaxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表G中。菌株No.DSM-9458与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。
表G
红色毛癣菌，No.DSM-9459
该菌株于1994年10月5日在DSM以流水号DSM-9459保藏。该菌株通过基于1990年在人上鉴定的流行性菌株No.158的培养形态学特征的稳定化和减毒的定向选择获得。该菌株使用Lodder关键词鉴定(Lodder，J：The yeast：ATaxonomic Study.North-HollandPubl.Co.，Amsterdam-London(1970)。该菌株的生物学特性记载于表H中。菌株No.DSM-9459与流行性菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、稳定的生物学特征、生物量的大量产生和更低的毒力。
表H
菌株须毛癣菌DSM-7279根据布达佩斯条约在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen“(DSM)，Mascheroder Weg 1B，W-38124Braunschweig，Germany(其目前的名称和地址是“Leibniz-Institut DSMZ-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH”(DMSZ)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，GERMANY)于1992年10月1日由Boehringer Ingelheim VetmedicaGmbH，6507Ingelheim am Rhein(其目前的地址是Boehringer Ingelheim VetmedicaGmbH，55216Ingelheim am Rhein)保藏。所述菌株的当前保藏者是申请人，即Dr.IgorPolyakov和Dr.sc.Dr.Liudmila Ivanova，Eberhardtstr.40，89073Ulm。
须毛癣菌No.VKPGF-930/1032，No.DSM-7279
菌株以流水号DSM-7279于1992年10月1日保藏于DSM。通过基于在1985年在马上找到的体表附生菌株Nr.1032的孢子产生和减毒的定向选择获得菌株。如上文Rebel，Taplin，同上和Kashkin，同上描述鉴定菌株。该菌株的生物学性质列于表I。菌株VKPGF-930/1032，DSM-7279与体表附生菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生、其更低的毒力和与其抗原的任何反应的缺乏。
疣状毛癣菌，No.DSM-28406
菌株疣状毛癣菌BINO 348由Binomed GmbH(Einsteinstraβe 59，89077 Ulm)根据布达佩斯条约在Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Microorganismen undZellkulturen GmbH，Inhoffenstraβe 7B，38124 Braunschweig，Germany以流水号DSM-28406于2014年2月12日保藏。保藏者已授权申请人提及申请中的保藏生物材料，并已根据EPC第31条规定，无保留且不可撤销地同意向公众提供保藏材料。通过基于在1997年从牛中分离的体表附生菌株Nr.348的孢子产生和减毒的定向选择获得菌株。使用Rebell-Taplin关键词(Rebell，G.，Taplin，D.：Dermatophytes，their recognition andidentification，1978)并根据Kashkin，P.N.et.al.(opredelitel patogennykh，toksigenykh vrednykh dlya cheloveka gribov，1979)鉴定菌株。该菌株的生物学性质列于表J。菌株BINO 348-DSM 28406与体表附生菌株的不同之处在于其在营养培养基中的更快生长、小分生孢子的大量产生、更低的毒力和肌肉内应用抗原后缺乏任何不良反应。
表J.
在一个本发明使用的组合物的优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种小分生孢子或两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的小分生孢子的混合物的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。在另一个优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。组合物可以另外包含皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质和/或酵母芽生孢子的抗原性物质，如本文所述。或者或另外，组合物可以另外包含通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种小分生孢子的抗原性材料或两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质的混合物。在进一步优选的实施方案中，组合物包含上文列出的皮肤真菌菌株的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质和上文列出的酵母的一种、两种、三种或四种的酵母芽生孢子的抗原性物质的混合物。在进一步优选的实施方案中，该组合物包含上文列出的酵母之一或两种、三种或四种的混合物的酵母芽生孢子的抗原性材料。该组合物可以另外包含上文列出的皮肤真菌的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或上文列出的一种、两种、三种或四种的均质化的灭活的酵母芽生孢子。或者或另外，组合物可以另外包含通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在一个优选的实施方案中，用于本发明的用途的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、犬小孢子菌、犬小孢子菌obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和石膏样小孢子菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。例如，疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；批发商：“Prostore”LLC，Moscow)是根据该实施方案并且可以用作本发明使用的组合物。Polivac-TM是一种针对诸如猫、狗、马等动物设计的疫苗。或者或另外，组合物可以另外包含通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。例如，疫苗Polivac-T(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；批发商：“Prostore”LLC，Moscow)是根据该实施方案并且可以用作本发明使用的组合物。Polivac-T是专为牛设计的疫苗。组合物可以另外包含如本文中所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和白色念珠菌的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌，特别是须毛癣菌DSM-7279的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。该组合物可另外包含如本文所述的抗原性物质和/或由有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含疣状毛癣菌，特别是疣状毛癣菌DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。该组合物可另外包含如本文所述的抗原性物质和/或由有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含疣状毛癣菌，特别是疣状毛癣菌DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。例如，包括与经典Polivac-TM相比无马毛癣菌和小孢子菌菌株(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)的疫苗Polivac-TM的变型是根据该实施方案并且可以用作本发明使用的组合物。组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、犬毛癣菌、犬毛癣菌obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和石膏样小孢子菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。该组合物可以另外包含如本文描述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、犬毛癣菌、犬毛癣菌obesum变种、犬小孢子菌歪斜变种和石膏样小孢子菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含白色念珠菌，特别是白色念珠菌DSM-9456的均质化的灭活的酵母芽生孢子。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含须毛癣菌、疣状毛癣菌和Trichophyton sarkisovii的均质化的灭活的皮肤真菌微小的混合物。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质。特别优选的是包含疣状毛癣菌，特别是疣状毛癣菌DSM-28406菌株的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质的组合物。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种上面列出的皮肤真菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种上面列出的皮肤真菌和/或一种、两种、三种或四种上面列出的酵母的抗原性物质的的混合物。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种上面列出的皮肤真菌的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质与一种、两种、三种或四种念珠菌属菌株，特别是白色念珠菌，更特别是白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458或白色念珠菌DSM-9459的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。
在进一步优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含一种、两种、三种或四种念珠菌属菌株，特别是白色念珠菌，更特别是白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458或白色念珠菌DSM-9459的芽生孢子的抗原性物质与一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种上面列出的皮肤真菌的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的混合物。
酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质优选包含从喜角质性真菌或酵母中分离的多糖和/或糖肽。包含多糖和/或糖肽的所述抗原性物质可以是抗原非可溶物质(ANMP)、抗原可溶物质(ASMP)或抗原外源物质(AEMP)。喜角质性真菌优选为毛癣菌或小孢子菌物种，更优选为疣状毛癣菌、须毛癣菌、马毛癣菌、Trichophyton sarkisovii、红色毛癣菌、须毛癣菌、石膏样小孢子菌和犬小孢子菌的真菌并且喜角质性酵母优选为念珠菌物种，更优选白色念珠菌的酵母。特别优选的是源自须毛癣菌DSM-7279、疣状毛癣菌DSM-28406、红色毛癣菌DSM-9469、红色毛癣菌DSM-9470、红色毛癣菌DSM-9471、红色毛癣菌DSM-9472、白色念珠菌DSM-9456、白色念珠菌DSM-9457、白色念珠菌DSM-9458和白色念珠菌DSM-9459的抗原性物质。例如，抗原性物质可通过WO 97/07232中公开的方法获得。
通常，为了获得ANMP，属于喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在水性碱性条件下处理，将制备的固相和液相分离，并且分离后用无机酸或有机酸处理固相。在水性碱性条件下的处理优选在约20℃至150℃下用约0.1至5％(w/v)KOH或NaOH进行至多30小时。优选用0.2至1.5M有机酸或0.05至1M无机酸处理固相，并用水溶液洗涤。更具体地，喜角质性真菌或酵母优选在琼脂平板上培养。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。也可以使用其他能确保喜角质性真菌或酵母生长的培养基。将得到的真菌生物质提出并用碱的水溶液处理。随后，分离制备的固相和液相，例如通过离心、过滤或沉降。优选地，通过离心，例如以3500g离心进行分离。这允许良好分离真菌细胞碎片。在水性碱性条件下的处理和分离步骤两者可以重复几次。碱处理后，在酸性水性条件下处理所得的上清液，如上文概述。例如，可以使用HCl或乙酸。用酸处理优选进行约0.5至约3小时。温度优选在约70至约100℃的范围内。用于洗涤的水溶液优选为蒸馏水。有利地，洗涤重复约五次。最后，将固相提出并在注射用水中或在0.1-0.9％的通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖溶液中均质化。均质化优选以约100至约500ml的体积进行。然后优选将颗粒浓度调节至每ml约3000至9000万个颗粒。最后，可以将包含抗原性物质的制剂冻干并在干燥条件下贮存。
通常可以如下获得ASMP：将喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在水性碱性条件下处理，将制备的固相和液相分离，分离后用无机酸或有机酸处理上清液，分离后从上清液中沉淀ASMP。更具体地，在琼脂平板上培养喜角质性真菌或酵母，例如如EP 0564620中所述。一种优选的培养基是例如来自Oxoid的麦芽提取物琼脂。也可以使用其他能确保喜角质性真菌或酵母生长的培养基。将得到的真菌生物质提出并用碱的水溶液处理。优选的碱性水溶液是NaOH或KOH，优选浓度为0.1-5％(w/v)。碱处理优选在约20-150℃下进行最多30小时。在水性碱性条件下处理后，将制备的固相和液相分离，例如通过离心、过滤或沉降。优选地，通过离心实现分离，这确保了真菌细胞碎片的良好分离，例如，在约3500g的力下。在水性碱性条件下的处理以及分离步骤可以重复几次。碱处理和分离后，将所得上清液在酸性水性条件，例如0.2-1.5M有机酸或0.05-1M无机酸下处理。例如，可以使用HCl或乙酸，优选pH值为约pH 2.5至pH 4.5。优选地，在水性酸性条件下的处理在约4至8℃的温度下进行约2至4小时，其中在分离固体和液体层之后发生。在水性酸性条件下的处理以及分离步骤可以重复几次，优选在如上文指出的条件下进行。然后，将来自分离步骤的上清液进行沉淀步骤。优选地，通过添加合适的有机溶剂，例如醇，如低级链烷醇，例如甲醇或乙醇进行沉淀。一体积上清液与2-5体积醇的比率将导致抗原性物质的良好沉淀。也可以使用本领域技术人员已知的其他非醇沉淀方法，例如硫酸铵或其他盐沉淀。然后将固相进行进一步的分离步骤，优选在如上所述的条件下进行。回收所得的固相，并且若需要的话，将其溶解在水溶液中，优选在蒸馏水中，通常体积为约25-100ml。最后，可以将ASMP制剂冻干并在干燥条件下贮存延长的时间段。
通常可以如下获得AEMP：将喜角质性真菌或酵母的真菌细胞在液体培养基中培养，将制备的固相和液相分离，分离后从上清液中沉淀AEMP。更具体地，喜角质性真菌或酵母可以在水溶液中温育或在液体培养基中培养。培养可以持续长达约240至250小时。溶液或培养物的体积在此定义为初级体积(PV)。可以使用蒸馏水以及EP 0564620中描述的培养基。温育或培养后，例如通过离心、过滤或沉降，优选通过在如上文描述的条件下离心分离真菌细胞。任选地，然后将得到的上清液冻干，随后溶解在水溶液中，优选在水中。优选地，水的体积为初级体积(PV)的约0.1至0.2体积。然后将分离后得到的溶液或所得上清液进行沉淀步骤。优选地，通过添加合适的有机溶剂，例如醇，如低级链烷醇，例如甲醇或乙醇进行沉淀。一体积上清液与约1-5体积醇的比率将导致抗原性物质的良好沉淀。也可以使用本领域技术人员已知的其他非醇沉淀方法，例如硫酸铵或其他盐沉淀。回收所得沉淀物，并且若需要的话，将其溶于含水溶剂，优选蒸馏水中。优选地，将约0.5至50mg的沉淀物溶于1ml水性溶剂中。最后，可以将AEMP溶液冻干并在干燥条件下，优选在约2至10℃下贮存延长的时间段。
在本发明的一个高度优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含疣状毛癣菌菌株BINO 348-DSM 28406、其抗原性物质和/或其均质化的灭活的皮肤癣小分生孢子。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖和/或根据本发明的水胶体。
在本发明的进一步高度优选的实施方案中，如上概述的实施方案的疣状毛癣菌的皮肤真菌小分生孢子是疣状毛癣菌菌株BINO 348-DSM 28406的皮肤真菌小分生孢子。然而，如上概述的本发明的实施方案还可另外包含疣状毛癣菌菌株BINO 348-DSM 28406的皮肤真菌小分生孢子。
在另一个高度优选的实施方案中，本发明使用的组合物包含疣状毛癣菌BINO348-DSM 28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和白色念珠菌的均质化的灭活的酵母芽生孢子的混合物。该组合物可以另外包含如本文所述的抗原性物质和/或通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖和/或根据本发明的水胶体。
因此，本发明还涉及疣状毛癣菌菌株DSM-28406。在另一方面，本发明涉及疣状毛癣菌DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子。此外，本发明涉及疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌小分生孢子的抗原性材料，包括ANMP、AEMP和ASMP。
此外，本发明涉及疣状毛癣菌菌株DSM-28406、疣状毛癣菌DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌小分生孢子的抗原性材料，包括ANMP、AEMP和ASMP，用于人和/或兽医药物。特别地，本发明涉及疣状毛癣菌菌株DSM-28406、疣状毛癣菌DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质，用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病，动物中的跛、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝织炎和皮肤癣菌病和人中的疣的方法。动物优选为哺乳动物，更优选为牛科和/或猪，最优选为牛。
此外，本发明涉及包含疣状毛癣菌菌株DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的组合物。本发明还涉及包含疣状毛癣菌菌株DSM-28406的皮肤癣菌小分生孢子的抗原性物质的组合物。本发明的组合物优选为药物组合物。本发明还涉及包含疣状毛癣菌菌株DSM-28406的均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子的组合物，用于人和/或兽医药物，特别是用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病，和动物中的跛、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝织炎、皮肤癣菌病和人中的疣的方法。本发明还涉及包含疣状毛癣菌菌株DSM-28406的皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质的组合物，其用于人和/或兽医药物，特别是用于治疗和/或预防动物中的蹄和爪病，和动物中的跛、趾皮炎、趾间皮炎、趾间蜂窝织炎、皮肤癣菌病和人中的疣的方法。动物优选为哺乳动物，更优选为牛科和/或猪，最优选为牛。
疣状毛癣菌菌株DSM-28406的皮肤真菌分生孢子的抗原性物质，包括ANMP，ASMP和AEMP通过如上文对酵母芽生孢子和/或皮肤真菌分生孢子的抗原性物质一般性概述的相同方法可获得。
本发明使用的组合物和本发明的组合物在下文中概述为“本发明的组合物”。包含仅一种菌株的皮肤真菌小分生孢子或仅一种菌株的酵母芽生孢子的本发明的组合物可以如下制备：
(a)分别在合适的固体培养基上培养皮肤真菌和酵母，收获并均质化皮肤真菌，和
(b)灭活步骤(a)中获得的匀浆物。
包含皮肤真菌小分生孢子和/或酵母芽生孢子的混合物的本发明的组合物可以如下制备：
(a)分开在合适的固体培养基上分别培养一种皮肤真菌菌株和两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种不同的皮肤真菌菌株，分开收获每种培养物并均质化每种培养物，和
(b)任选地，分开在合适的固体培养基上分别培养一种酵母菌株和两种、三种或四种不同的酵母菌株，分别收获每种培养物并均质化每种培养物，和(c)组合和灭活步骤(a)中获得的和步骤(b)中任选获得的匀浆物。
上文描述的制备方法的皮肤真菌的生长优选在培养瓶中的琼脂和麦芽汁上进行。优选地，培养进行约15至约30天。优选地，培养在约26℃至约28℃的温度下进行。
上文描述的制备方法的酵母的生长优选在培养瓶中的麦芽提取物-琼脂或琼脂Sabouraud上进行。优选地，培养进行约4至约7天。优选地，培养在约28至约37℃的温度下进行。
在分别培养皮肤真菌和酵母后，将步骤均质化以获得细悬浮液。优选地，均质化在去离子水中，在包含约0.1至0.3％发酵水解肌肉蛋白或约0.1至1％大豆或猪肉蛋白胨与约5至6％葡萄糖和约0.1至1％酵母提取物组合的的水溶液或在包含0.1-0.9％(w/v)的通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖的水溶液中进行。
用于均质化的合适体积为约100至500ml。优选地，将分生孢子和芽生孢子的浓度分别分别调节至约3000至约9000万个分生孢子和芽生孢子/ml或约25万至约50万，更优选约25万至约40万个分生孢子和芽生孢子/ml。然后，可以用蒸馏水，生理盐溶液，如例如氯化钠或另一种合适的溶液将悬浮液任选另外调节至分别约4000万、5000万或6000万个小分生孢子和芽生孢子/ml，或调节至分别约25万至约50万，更优选至约25万至约40万小分生孢子和芽生孢子/ml。
在制备混合物的情况下，优选将单一悬浮液分别调节至每ml的相同量的小分生孢子和芽生孢子，并将等体积的每种悬浮培养物在单一容器中混合。
优选地，通过使用硫柳汞、甲醛和/或2-丙内酯进行灭活。用于灭活的试剂可以直接添加到细胞悬浮液中。优选通过以约1：11000至约1∶2500(w/v)的比率加入硫柳汞进行灭活。还优选通过加入甲醛以达到约0.2％至约0.4％(v/v)的终浓度来灭活。随后，优选温育混合物。温育可以在约20℃至约37℃的温度下进行约1至30天。优选在室温下温育约1至3天，在37℃下温育约5至7天，在室温下温育约30天或在约26℃至28℃下温育约30天。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物的小分生孢子处于肿胀状态和/或具有胚芽管。更优选地，至少50％的芽生孢子和/或小分生孢子处于肿胀状态和/或具有胚芽管。
皮肤真菌的肿胀状态和/或胚芽管可以例如通过第二温育步骤获得。所述第二温育步骤优选在均质化之后和如上文所述的灭活之前进行。为了进行第二培养步骤，将小分生孢子悬浮液置于含有第一温育步骤的相同培养基的单独容器中。第二培养步骤优选进行约10至约48小时。第二培养步骤优选在约28℃的温度下进行。优选地，继续第二培养步骤，直到至少50％的小分生孢子显示出肿胀或发芽状态，并且不超过约7-10％的细胞显示第二菌丝体分支。与常规小分生孢子相比，肿胀和发芽小分生孢子的直径增加约1.2或更多。
由有机羧酸或其盐改性的壳聚糖也可以称为壳聚糖变体或壳聚糖衍生物。它优选通过使壳聚糖与有机羧酸或其盐接触而获得。所述接触优选通过将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育来进行，更优选通过将壳聚糖在戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸的氯化物的水溶液中温育来进行。特别是，所述温育通过混合和/或在搅拌下进行。
因此，通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖优选通过包括以下的方法获得：
(a)将壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育。
在一个优选的实施方案中，首先将壳聚糖在酸性水性条件下溶解，然后通过将pH值增加至约8.0至约8.5的pH值进行沉淀，然后如上所述在有机羧酸或其盐的水性溶液中温育它。
因此，通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖优选通过包括以下的方法获得(i)将壳聚糖溶解在酸的水溶液中
(ii)增加pH值直至壳聚糖沉淀
(iii)回收沉淀的壳聚糖，和
(a)将回收的步骤(iii)的壳聚糖在有机羧酸或其盐的水溶液中温育。
步骤(a)的有机羧酸或其盐优选具有约2至约5，更优选约2.3至约4.9的pK。更优选地，所述有机羧酸是戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸的氯化物。所述羧酸有机酸或其盐优选以约0.2至约22.5M的浓度使用。温育壳聚糖和步骤(iii)的回收的壳聚糖，以及如步骤(a)中概述的有机羧酸或其盐的水溶液导致壳聚糖的溶液、壳聚糖的改性和/或凝胶形成。优选地，步骤(a)中的水性溶液的pH值为约5至约6或约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。优选地，壳聚糖的改性在包含约1mM至约100mM有机羧酸或其盐的水溶液，更优选约1mM至约10mM中进行。
优选地，进行步骤(a)直至将壳聚糖改性和溶解。优选通过将壳聚糖与有机羧酸或其盐的水溶液混合或通过在水性条件下悬浮壳聚糖并将有机羧酸加入悬浮液中来进行。优选在搅拌下进行约1-约72小时，更优选约24-约48小时。步骤(a)可以包括添加另外的酸，或者可以在另外的酸存在下进行。所述其他酸优选为无机酸、有机酸或所述无机酸或有机酸的盐。优选地，无机酸是HCl或H2SO4，并且有机酸是谷氨酸、对氨基苯甲酸或乳酸。优选以一定的量添加或存在无机酸或有机酸，以将步骤(a)的混合物的pH值调节至约5至约6或约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0的pH值。添加另外的酸可以支持壳聚糖的溶解和/或改性，例如，通过减少溶解改性壳聚糖所必需的时间。
步骤(a)中或者(若该方法包括步骤(i))对于步骤(i)的壳聚糖的浓度优选是每升约1g至约20g壳聚糖，更优选每升约5g至约15g壳聚糖，最优选每升约8至约10g壳聚糖。
用于步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖可以是商品化的壳聚糖或从包含壳聚糖的任何天然来源，例如包含壳聚糖的生物质分离的壳聚糖。或者，可以使用几丁质，其在步骤(a)之前或者(若该方法包括步骤(i))在步骤(i)之前脱乙酰化以获得壳聚糖。所述几丁质可以是商品化的，或者它可以从包含几丁质的天然来源，例如包含几丁质的生物质分离。用于几丁质和/或壳聚糖分离的生物质优选是真菌、昆虫和/或甲壳类动物的生物质。几丁质的脱乙酰化可以通过本领域已知的方法进行，例如，通过使用过量的氢氧化钠(NaOH)作为试剂和水作为溶剂或通过酶法进行。从天然来源中分离壳聚糖和/或几丁质也可以通过本领域已知的方法进行。
用于步骤(a)，或(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约62％至约95％，更优选约80％至约94％，更优选约89％至约93％或约93％至约98％，约93％至95％，约95％至约98％，或至少60％，更优选至少70％，80％，90％或95％的脱乙酰化度，或约60％至约100％，更优选约80％至约95％，甚至更优选约90％至约95％，最优选约77％至约80％的脱乙酰化度。用于步骤(a)，或(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约50Da至约700kDa，特别是约15kDa至约500kDa，更特别是约15kDa至约150kDa，或约80kDa至约200kDa，约150kDa至约300kDa，约100kDa至约250kDa或约300kDa至约700kDa的分子量或平均分子量。
用于步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))用于步骤(i)的壳聚糖优选具有约50至400MPas，更优选约70至约150MPas或约151至约350MPas的粘度。
在步骤(a)，或者(若该方法包括步骤(i))步骤(i)中使用壳聚糖之前，可以通过高压灭菌对壳聚糖进行灭菌。所述灭菌可以导致根据本发明的改性壳聚糖是毒性较低的，任何受试者较好耐受和/或导致较少的无意副作用。
优选地，通过使用弱酸水溶液，优选通过有机酸或其盐，更优选通过乙酸、戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸或葡糖醛酸或其盐，特别是戊酸的氯化物进行步骤(i)。优选地，以约0.8％至约2％的浓度使用酸。步骤(i)优选在搅拌下进行。搅拌可以进行约2小时至约24小时。优选地，进行步骤(i)直至获得凝胶或凝胶悬浮液。可以除去未溶解的颗粒，例如通过过滤。例如，具有200μm至300μm的单元的金属网格可以用于此类过滤。
优选地，通过增加步骤(i)中获得的凝胶或凝胶悬浮液的pH值进行步骤(ii)，直至形成沉淀物。优选地，它在搅拌下进行。优选地，它通过在水性碱性条件下处理壳聚糖来进行，更优选在包含约0.1至约25.0％碱的水性碱性条件下进行。在优选的实施方案中，碱是NaOH。优选地，所述步骤在约4℃至约55℃的温度下进行。优选地，处理进行约20分钟至约2小时，更优选约30分钟至约70分钟，但它也可以需要长达约24小时。优选地，通过将碱加入步骤(i)的凝胶或凝胶悬浮液中来增加pH值。优选地，增加pH值以获得约8.0至约8.5的pH。步骤(ii)可以导致壳聚糖的进一步脱乙酰化。它还可以导致根据本发明的改性壳聚糖是毒性较小的，任何受试者较好耐受和/或导致较少的无意副作用。
步骤(iii)优选通过离心步骤(ii)中获得的混合物或悬浮液来进行。离心优选以约4000至约6000转/分钟进行，更优选以约5000转/分钟进行。离心优选进行长达60分钟。
可获得改性壳聚糖的方法可以包括另外的步骤。例如，可以将步骤(ii)中获得的产物均质化。优选地，均质化步骤在封闭的无菌匀浆器中进行。或者或另外，可以透析步骤(a)中获得的产物。透析优选在封闭系统中进行，以除去盐的游离离子和低分子量化合物。优选地，通过错流过滤(cross filtration)约1至约6小时，或者通过对馏出水进行膜过滤约24至约48小时进行透析。
或者或另外，可获得改性壳聚糖的方法可以包括制备终产物的进一步步骤。终产物的制备可以包括稀释获得的产物。优选地，通过加入水，更优选无菌注射用水稀释产物。然而，产物也可以在任何其它合适的水溶液中稀释。或者或另外，终产物的制备可以包括添加一种或多种另外的化合物，例如稀释剂或防腐剂。合适的防腐剂是例如氯甲酚、硫柳汞和福尔马林。最后，可以灭菌终产物。优选地，通过在约65℃至约80℃的温度下加热，优选进行约40至50分钟来进行灭菌。优选地，将所述灭菌重复一次、两次、三次、四次或五次。
优选地，终产物具有每升约0.02g至约2g改性壳聚糖，更优选每升约0.04至约1g改性壳聚糖的浓度。
在优选的实施方案中，可获得改性壳聚糖的方法包括如实施例中描述的步骤。例如，该方法可以包括以下步骤：
-任选地对壳聚糖进行灭菌，例如，通过高压灭菌，
(i)将壳聚糖溶解在酸的水性溶液中，特别是在乙酸存在下，
-任选地除去未溶解的颗粒，例如通过过滤，
(ii)增加pH值直至壳聚糖沉淀，
(iii)回收沉淀的壳聚糖，
-任选地在水性条件下均质化回收的壳聚糖，
(a)将步骤(iii)的回收的壳聚糖或均质化的回收的壳聚糖在有机羧酸或其盐的水性溶液中温育，任选地在另外的无机酸或有机酸存在下，
-任选地透析步骤(a)中获得的产物，
-任选地添加其他化合物，例如稀释剂或防腐剂，和
-任选地对最终产品进行灭菌，例如，通过加热。
优选地，如上概述的步骤的顺序对应于上面列出的顺序。然而，如本领域技术人员所知，只要实现相同的效果，可以改变单一步骤的顺序。例如，可以在如上所述的方法的各个阶段中添加稀释剂如水。
在本申请的一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是聚氨基糖胶体，优选水胶体。在本申请的另一个优选的实施方案中，水胶体是壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体、壳聚糖-对氨基苯甲酸-水胶体或壳聚糖-戊酸-水胶体。在本申请的另一个优选的实施方案中，壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体具有化学式：(C6H11O4N)x(C8H13O5Ny(C6H10O7)z(H2O)m。优选地，壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体具有以下分子量：x*(161)+y*(203)+z*(194.14)+m*(18)。在本申请的另一个优选的实施方案中，壳聚糖-对氨基苯甲酸-水胶体具有化学式：(C6H11O4N)x(CaH13O5N)y(C7H7O2N)z(H2O)m。优选地，壳聚糖-对氨基苯甲酸-水胶体具有以下分子量：x*(161)+y*(203)+z*(137.14)+m*(18)。在本申请的另一个优选的实施方案中，壳聚糖-戊酸-水胶体具有化学式：(C6H11O4N)x(C8H13O5N)y(C5H10O2)z(HCl)z(H2O)m。优选地，壳聚糖-戊酸-水胶体以下分子量：x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36.5)+m*(18)。
在本申请的另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是天然白色至微黄色粘性液体。优选地，改性的壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体具有典型的羧酸气味，优选典型的戊酸气味。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体含有约0.2％戊酰氯(pentanoly chloride)、或0.2％葡糖醛酸、或0.2％对氨基苯甲酸。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体含有约1.0％戊酰氯。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体含有来自干燥壳聚糖的1％壳聚糖残余物。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体具有约10至约1000mOsmol，优选约10至约200mOsmol，最优选约100mOsmol。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至5％(w/v)壳聚糖和0.001至5％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸的氯化物或
(ii)0.1％至5％(w/w)壳聚糖和0.001至5％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至3％(w/v)壳聚糖和0.001至2％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物，或
(ii)0.1％至3％(w/w)壳聚糖和0.001至2％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至1.2％(w/v)壳聚糖和0.001至1％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸氯化物，或
(ii)0.1至1.2％(w/w)壳聚糖和0.001至1％(w/w)葡糖醛酸或对氨基苯甲酸或其盐。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至1.2％(w/v)壳聚糖和
(ii)0.01至0.44％(w/v)戊酸或其盐，优选戊酸的氯化物。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至1.2％(w/w)的壳聚糖和
(ii)0.001至0.6％(w/w)葡糖醛酸或其盐。
在另一个优选的实施方案中，改性壳聚糖、壳聚糖衍生物或壳聚糖变体是水胶体，其包含：
(i)0.1％至1.2％的壳聚糖和
(ii)0.006至1％(w/w)对氨基苯甲酸或其盐。
优选地，水胶体的壳聚糖是式[X]n的化合物，其中n表示约1至约5000的整数，特别是约300至约4000的整数，并且X具有下式(1)：
其中构成所述化合物的X残基的约2％至约38％，更优选约5％至约20％通过乙酰化修饰，并且其中构成所述化合物的全部或部分X残基被有机羧酸或其盐改性。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的水胶体的剩余百分比由分散介质，优选水或水和氯化氢(HCl)提供。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的水胶体用作稀释液，优选稀释0至10倍。
在一个示例性实施方案中，改性的壳聚糖可通过以下程序获得：
具有例如67％的脱乙酰化、粘度50-200mPas的壳聚糖可以用作原料。通过高压灭菌将40克壳聚糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水。向所得悬浮液中加入40ml乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将混合物在无菌容器中搅拌约24小时，直至获得凝胶悬浮液。通过细胞尺寸200μm-300μm的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向所制备的混合物中滴加4N氢氧化钠(NaOH)以获得最终pH 8.0。此后含有壳聚糖的白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌约30分钟。在不断搅拌下，向悬浮液中滴加4mL戊酸氯化物。将获得的悬浮物搅拌1小时。分离片状物和未溶解的颗粒，随后重悬浮于4升无菌注射用水中。在搅拌下，加入4N盐酸以获得5.0的pH。将所得凝胶在封闭系统中透析以除去盐的游离离子和低分子量化合物。透析后，制备终产物。为了获得终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将3升改性壳聚糖凝胶调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克氯甲酚的氯甲酚溶液。将所得悬浮液调节至30升的体积。将得到的无菌产物在无菌条件下分配到小瓶中。
若对于如本文所述的方法步骤没有给出特定的温度范围，则步骤优选在室温和/或约10℃至约40℃的范围内进行，更优选在约20℃至约30℃的范围内进行。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物具有每ml约4000至约9000万个芽生孢子的浓度，高度优选的是每ml约4000万至6000万个孢子的浓度。若组合物用于肌肉内施用，则这些浓度是特别优选的。在进一步优选的实施方案中，本发明的组合物具有约20至约40万个孢子/ml的浓度，高度优选的浓度为约25万至约30万个孢子/ml。若组合物用于皮内肌肉内施用，则这些浓度是特别优选的。
在进一步优选的实施方案中，本发明的组合物具有每ml约4000至约6000万个皮肤真菌小分生孢子和/或酵母芽生孢子的抗原性物质颗粒的浓度。
在进一步优选的实施方案中，通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖的浓度优选在约0.1％至约0.9％(w/v)的范围内，更优选在约0.1至约0.3％(w/v)的范围内，更优选在约0.1至约0.3％(w/v)的范围内。
令人惊讶的是，发现若本发明的组合物另外包含用有机羧酸或其盐改性的壳聚糖，则均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或灭活的均质化的酵母芽生孢子可以以小约50倍的剂量使用。
本发明的组合物可以另外包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或支持物。
本发明的组合物能够调节免疫系统，即它们具有免疫刺激性质。它们可以用作预防受试者免于如本文概述的疾病的疫苗。或者或另外，它们可以用于针对如本文概述的疾病治疗和治愈受试者。组合物可以通过已知的施用途径施用，如例如胃肠外、通过肌肉内注射、通过皮内注射、通过经皮注射和/或局部，优选皮肤。它们可以在缺乏或存在一种或多种另外的免疫刺激物质的情况下施用。在一个实施方案中，将所述一种或多种另外的免疫刺激物质分别施用于本发明的组合物。在另一个实施方案中，一种或多种另外的免疫刺激物质包含在本发明的组合物中或添加到本发明的组合物中。
所述一种或多种免疫刺激物质优选为佐剂，优选选自下组：维生素E乙酸酯、o/w乳剂、磷酸铝、氧化铝、氢氧化铝/甲基纤维素凝胶、油乳剂、muramil-二肽、弗氏佐剂和皂苷和/或至少一种细胞因子，优选选自下组：IL 2、IL 12和INF-γ。
在更优选的实施方案中，本发明的组合物另外包含通过有机羧酸或其盐改性的壳聚糖或根据本发明的水胶体。
在优选的实施方案中，本发明的组合物是疫苗和/或用作疫苗。
本发明还涉及包含上文描述的喜角质性真菌或喜角质性酵母的抗原性物质的药物组合物。此类药物组合物可以另外包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
在另一方面，本发明涉及包含如上所述的喜角质性真菌或喜角质性酵母的抗原性物质的组合物，其用于通过疗法治疗动物体的方法中。此类方法通常包括给受试者施用有效量的如上所述的喜角质性真菌或喜角质性酵母的抗原性物质或如上文所述的组合物或药物组合物。受试者可以是例如动物，特别是哺乳动物，更优选牛科和/或猪，最优选牛。特别地，如上所述的喜角质性真菌或喜角质性酵母的抗原性物质或如上所述的组合物或药物组合物可以用于治疗或预防如上所述的蹄和爪病的方法中。治疗方法可包括治疗和/或预防皮肤、腿、蹄、爪、足背和/或趾间间隙的细菌性、霉菌性和/或病毒性感染。此类感染可以由结节双螯菌、坏死梭杆菌、梭杆菌、密螺旋体，诸如蚀疮溃疡密螺旋体、文氏密螺旋体、和齿垢密螺旋体、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓隐秘杆菌和普雷沃氏菌(Prevotella spp.)和/或病毒引起。。
在根据本发明的治疗(和/或预防)方法中使用的剂量和施用途径取决于待治疗的特定疾病/感染部位。施用途径可以是例如肠胃外，通过肌肉内注射、通过皮内注射、通过经皮注射、局部、皮肤或任何其它施用途径。
例如，在治疗和/或预防牛中的蹄和爪病，特别是ID、DD和/或IP的方法中使用的剂量和施用途径可以如下：
以下实施例解释了本发明，但不认为是限制性的。
实施例1
使用针对动物皮肤癣菌病的疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛中的趾和/或趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下文所述。
实施例2
使用针对牛皮肤癣菌病的疫苗Polivac-T(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下文所述。
实施例3
将物种须毛癣菌DSM-7279的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在4个Roux烧瓶中培养。将每种培养物在28℃培养18天。
将真菌质量提出并在500ml去离子水中均质化。然后用生理氯化钠盐溶液将小分生孢子的悬浮液调节至每ml 6千万的小分生孢子。通过直接对细胞悬浮液添加甲醛至最终0.4％(v/v)将匀浆物灭活。将混合物在37℃温育5-7天。将所得组合物装瓶，按照常规已知方法检查无菌性、安全性和小分生孢子量，并可以在4-10℃冷藏保存。使用根据该方法可获得的疫苗来预防和治疗牛中的趾间趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例4
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在10个Roux烧瓶中培养。将每种培养物在26℃培养25天。
将真菌质量提出并在300ml去离子水中均质化。对于每种匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml 8000万。然后用蒸馏水将小分生孢子的悬浮液调节至每ml 4000万个小分生孢子。通过直接对细胞悬浮液添加甲醛以达到0.5％(v/v)将匀浆物灭活。将混合物在37℃温育5天。将所得组合物装瓶，按照常规方法检查无菌性、安全性和小分生孢子的量，并在4-8℃下贮存。使用根据该方法可获得的疫苗来预防和治疗牛中的趾间、趾皮炎和趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例5
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在8个Roux烧瓶中培养。将每种培养物在27℃下培养30天。
将真菌质量提出并在400ml去离子水中均质化。对于每种匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml 7000万。然后用蒸馏水将小分生孢子的悬浮液调节至每ml 6千万的小分生孢子。通过直接对细胞悬浮液添加甲醛以达到0.3％(v/v)将匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育7天。将所得组合物装瓶，按照常规方法检查无菌性、安全性和小分生孢子的量，并在4-8℃下贮存。使用根据该方法可获得的疫苗来预防和治疗牛中的趾间、趾皮炎和趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例6
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在9个Roux烧瓶中培养。将每种培养物在28℃下培养25天。
将皮肤真菌的真菌质量提起并在与5％葡萄糖和0.1％酵母提取物组合的500ml0.3％发酵水解肌肉蛋白的水溶液中均质化。对于匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml4000万。然后将小分生孢子的悬浮液在28℃下发酵1天，直到65％的小分生孢子具有胚芽管。发酵后，用生理氯化钠溶液洗涤细胞悬浮液。通过将硫柳汞以1∶25000(w/v)的比率直接添加到细胞悬浮液中来使匀浆物灭活。将混合物在室温下温育30天。将所得组合物装瓶，根据可接受的方法检查无菌性、安全性和免疫原性特性，并可以在4-10℃冷藏贮存。使用根据该方法可获得的组合物来自预防和治疗牛中的趾间、趾皮炎、趾间蜂窝织炎和皮肤癣菌病，如下所述。
实施例7
使用包括与经典Polivac-TM相比无马毛癣菌和小孢子菌菌株的针对动物皮肤癣菌病的Polivac-TM疫苗的变型(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下文所述。
实施例8
使用针对动物皮肤癣菌病的疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：““Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例9
使用针对动物皮肤癣菌病的疫苗Polivac-TM(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛的趾和/或趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例10
使用针对动物皮肤癣菌病的疫苗Polivac-T(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；经销商：“Prostore”LLC，Moscow)来预防和治疗牛的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例11
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在10个Roux烧瓶中培养。将培养物在28℃下培养28天。
将真菌质量提起并在500ml去离子水中均质化。在匀浆物中将小分生孢子的浓度调节至每ml 5000万。然后用蒸馏水将小分生孢子的悬浮液调节至每ml 5000万个小分生孢子。
将物种白色念珠菌DSM-9456在麦芽提取物琼脂或琼脂Sabouraud上培养，例如在3个Roux烧瓶中培养。将培养物在30℃下培养4天。用生理氯化钠溶液洗去芽生孢子。将悬浮液中的芽生孢子浓度调节至每ml 6000万。将等体积的悬浮液中的每种培养物在单一容器中混合。通过添加甲醛以在细胞悬浮液中达到0.4％(v/v)使匀浆物灭活。将混合物在37℃温育6天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例12
将物种白色念珠菌DSM-9456在琼脂Sabouraud上培养，例如在7个Roux烧瓶中培养。将培养物在37℃下培养7天。用无菌水洗去芽生孢子。将悬浮液中的芽生孢子浓度调节至每ml 4000万。通过添加甲醛以在细胞悬浮液中达到0.5％(v/v)来使匀浆物灭活。将混合物在37℃下温育7天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例13
将通过戊酸氯化物改性的壳聚糖溶液添加到针对牛皮肤癣菌病的疫苗Polivac-T(制造商：“Vetbiochim”LLC，Moscow；Distributor：“Prostore”LLC，Moscow)中以达到0.1％(w/v)的终浓度。小分生孢子的浓度为每ml 4000万。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例14
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在7个Roux烧瓶中培养。将培养物在26℃下培养27天。
将皮肤真菌的真菌物质提出，并在500ml 0.2％通过对氨基苯甲酸改性的壳聚糖的水溶液中均质化。对于每种匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml 5000万。通过直接对细胞悬浮液添加甲醛以达到0.5％(v/v)的终浓度使匀浆物灭活。将混合物在37℃温育7天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎和/或皮肤癣菌病，如下所述。
实施例15
将物种白色念珠菌DSM-9456在麦芽提取物-琼脂上培养6个Roux烧瓶。将培养物在35℃培养7天。用生理氯化钠溶液洗去芽生孢子。
将真菌物质提出并在500ml通过戊酸氯化物改性的壳聚糖溶液的水性溶液中均质化。将小分生孢子的浓度调节至匀浆中的每ml 8000万。通过直接对细胞悬浮液添加甲醛以最终达到0.2％(v/v)使匀浆物灭活。将混合物在37℃温育7天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例16
根据该方法可获得的级分由包含多糖和/或糖肽的抗原性不溶性物质(ANMP)组成，如WO 97/07232中所公开。将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在10个Roux烧瓶中培养。将培养物在28℃下培养28天。
将得到的真菌生物质提出并用碱水性溶液处理。优选的水性碱性溶液是浓度为3％(w/v)的NaOH。碱处理优选在80℃下进行最多6小时。在水性碱性溶液条件下处理后，通过在约3500g的力下离心分离制备的固相和液相。碱处理后，将固相用0.2M乙酸处理，在70℃的温度添加到固相达1小时。酸性处理后，用蒸馏水洗涤固相。洗涤重复三次。最后，将固相提出并在500ml注射用水中均质化。将颗粒浓度调节至6000万/ml终产物。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例17
根据该方法可获得的级分由包含多糖和/或糖肽的抗原性不溶性材料(ANMP)组成，如WO97/07232中所公开。在9个Roux烧瓶中在琼脂/麦芽汁上培养物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物。将培养物在27℃下培养25天。将得到的真菌生物质提出并用碱的水性溶液处理。优选的水性碱性溶液是KOH，优选浓度为2％(w/v)。碱处理优选在60℃下进行最多10小时。在水性碱性溶液条件下处理后，通过在约3500g的力下离心分离制备的固相和液相。将在水性碱性条件下的处理重复两次，以及通过在约3500g的力下离心进行分离步骤。碱处理后，将固相用0.5M HCl处理，在80℃的温度下添加到固相达1.5小时。酸性处理后，将固相用蒸馏水洗涤两次。最后，将固相提出并在500ml包含0.3％通过戊酸氯化物改性的壳聚糖的水溶液中均质化。对于每种匀浆物，将颗粒浓度调节至每ml 6000万。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例18
从壳聚糖制备产物。在两个阶段中制备产物。在第一阶段中，获得浓缩的改性壳聚糖凝胶，在第二阶段中获得终产物，其可以用于施用。
第一步骤。使用具有脱乙酰化80％，粘度2751-3250mPas的壳聚糖作为原料。通过高压灭菌将40克多糖灭菌，并在搅拌下加入3.5升注射用水。在得到的悬浮液中加入40ml乙酸。用注射用水将最终体积调节至4升。将悬浮的多糖在无菌容器中搅拌24小时直至获得凝胶悬浮液。通过孔径200μm-300μm的金属网格过滤除去未溶解的颗粒。向所得悬浮液中滴加4N氢氧化钠(NaOH)直至悬浮液的pH为8.0。此后包含壳聚糖的白色片状物沉淀。将悬浮液搅拌30分钟。在恒定搅拌下将8mL乳酸滴加到悬浮液中。将获得的悬浮物质再搅拌1小时。将片状物和未溶解的颗粒与悬浮液分离并重悬于4升注射用水中。在搅拌下加入4N盐酸直至pH达到5.6。将所得悬浮液在封闭系统中透析，以除去盐的游离离子和低分子量化合物。所得悬浮液是浓缩的改性壳聚糖凝胶。改性壳聚糖浓度为约0.8％至约1％。透析后，使用多糖制备终产物。
第二步骤。为了获得包含在第一步骤中获得的改性壳聚糖的终产物，通过在搅拌下加入无菌注射用水将第一步骤的所得悬浮液调节至25升体积。然后，向混合物中加入500ml含有30克氯甲酚的氯甲酚溶液作为防腐剂。将所得悬浮液调节至30升的体积。在无菌条件下将所得无菌产品分配到小瓶中。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎，如下所述。
实施例19
将物种疣状毛癣菌DSM-28406的皮肤真菌培养物在琼脂/麦芽汁上培养，例如在8个Roux烧瓶中培养。将培养物在28℃下培养30天。
将皮肤真菌的真菌物质提起并在500ml 0.1％通过戊酸氯化物改性的壳聚糖水溶液中均质化。对于每种匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml 40万。通过将甲醛直接添加到细胞悬浮液以最终达到0.4％(v/v)使匀浆物灭活。将混合物在37℃温育7天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎和/或皮肤癣菌病，如下所述。
实施例20
在6个Roux烧瓶中在琼脂/麦芽汁上培养物种须毛癣菌DSM-7279的皮肤真菌培养物。将培养物在26℃培养20天。
将皮肤真菌的真菌物质提出并在400ml 0.2％通过对氨基苯甲酸改性的壳聚糖水溶液中均质化。对于每种匀浆物，将小分生孢子的浓度调节至每ml25万。通过将甲醛直接添加到细胞悬浮液以最终达到0.3％(v/v)使匀浆物灭活。将混合物在37℃温育6天。使用根据该方法可获得的组合物来预防和治疗牛中的趾间和/或趾皮炎和/或趾间蜂窝织炎和/或皮肤癣菌病，如下所述。
实施例21
用各种组合物处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。以10天的间隔通过肌肉内注射施用组合物两次。对于每次应用，组合物剂量为5ml。
表2中显示了结果。
未观察到应用组合物后的常见或局部反应。用如实施例1至18中所述产生的不同组合物处理的治疗效力是40％-64％。
实施例22
用各种组合物处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。以7-10天的间隔通过皮内注射施用组合物两次。组合物剂量总共0.4ml，其注射入动物的两个部位中。
表3中显示了结果。
未观察到应用组合物后的常见或局部反应。用根据实施例19和20产生的不同组合物处理的治疗效力是约85％-87％。
实施例23
用各种药物处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。如下施用根据实施例15制备的组合物：以10天间隔在一个部位处以5ml剂量2次肌肉内。
疾病的临床表现：
+恢复，或灰色，无疼痛
++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛
+++恢复，或＞2cm，黄色，中等疼痛
++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛
表4中显示了结果。
未观察到应用后的常见或局部反应。治疗效力是约70％。
实施例24：剂量滴定研究
用各种药物处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。治疗性应用根据实施例14制备的组合物：以7天间隔在一个部位处3次肌肉内。
疾病的临床表现：
+恢复，或灰色，无疼痛
++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛
+++恢复，或＞2cm，黄色，中等疼痛
++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛
表5中显示了结果。
未观察到应用后的常见或局部反应。用剂量5ml处理的效力是约63％且对于3ml为28％。
实施例25
处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。治疗性应用根据实施例14制备的组合物：肌肉内，以10天间隔以5ml剂量在一个部位处2次。
研究的汇总：
处理前
动物量/具有跛的肢体量 100/138
最后一次处理后52至54天
动物量/具有跛的肢体量 29/29
健康动物量71
具有跛的肢体的脱脂(Degrease of limbs with lameness)78.99％
实施例26-剂量滴定研究
完成针对DD、ID和IP处理母牛。预防性应用根据实施例14制备的组合物：肌肉内，以10天间隔的2次。
研究疾病的临床表现：
+恢复，或灰色，无疼痛
++治愈中，＜2cm，黄色，轻微疼痛
+++恢复，或＞2cm，黄色，中等疼痛
++++急性疾病＞2cm，红色，相当大的疼痛
表6中显示了结果。
未观察到应用组合物后的常见和局部反应。用剂量1ml和2.5ml处理的效力是约93％。来自对照组的45只动物(约21％)具有DD、ID和IP的临床症状。
表7中显示了结果。
用剂量1ml和2.5ml处理的效力是约87％-89％。来自对照组的59只动物(约27％)具有DD、ID和IP的临床症状。
表8中显示了结果。
用剂量1ml处理的效力是约70％并且用剂量2.5ml处理的效力是约53％。来自对照组的154只动物(约72％)具有DD、ID和IP的临床症状。此研究证明了用剂量1.0ml预防性处理动物。免疫的持续时间是约5.5个月。
实施例27
完成针对DD、ID和IP处理母牛。预防性应用根据实施例14制备的组合物：肌肉内，以10天间隔以5ml剂量2次。
研究的汇总：
处理组1中的动物
处理前观察
动物量/DD、ID和IP的临床表现 100/100
最后一次处理后160至175天
动物量/具有跛的肢体的量 100/10
健康动物量 90
治疗效力 90％
用安慰剂(对照)处理组2中的动物
处理前观察
动物量/DD、ID和IP的临床表现 100/100
最后一次应用安慰剂后160至175天
动物量/具有以下表现的动物量
DD、ID和IP的临床症状 100/48
健康动物量 52
观察时间期间患病动物的量 48％
通过局部应用无菌药物(aseptic medicine)或抗生素处理具有疾病临床症状的对照组(安慰剂)的所有动物。在IP的情况下，使用抗生素的肌肉内注射。
实施例28
用各种组合物处理具有跛和趾间间隙损伤(其对于DD、ID和IP是典型的)的临床证据的母牛。通过以10天间隔在一个部位处肌肉内注射两次施用组合物。对于每次应用，组合物的剂量是5ml。
表9中显示了结果。
实施例29.水胶体
化学名称：壳聚糖-戊酸-水胶体
小标题：聚氨基糖-戊酸-水复合物(Hydrocomplex)
结构式：
化学式：(C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C5H10O2)z(HCl)z(H2O)m
一般特性
分子量：x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36.5)+m*(18)
外观：天然白色至浅黄色粘性液体，具有典型的气味
溶解度：溶解于：水
气味：典型，类似物戊酸
密度：1.002
pH值：5.5
贮存：保持避光；在4°-8℃的冰箱中在容器中贮存，避空气
稳定性：在上文描述的条件下36个月
化学名称：壳聚糖-4-氨基苯甲酸-水胶体
小标题：聚氨基糖-对氨基苯甲酸-水复合物
结构式：
化学式：(C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C7H7NO2)z(H2O)m
一般特性
分子量：x*(161)+y*(203)+z*(137.14)+m*(18)
外观：浅黄色至黄色粘性液体
化学名称：壳聚糖-葡糖醛酸-水胶体
小标题：聚氨基糖-葡糖醛酸-水复合物
结构式：
化学式：(C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C6H10O7)z(H2O)m
一般特性
分子量：x*(161)+y*(203)+z*(194.14)+m*(18)
外观：浅黄色至黄色粘性液体
实施例30.壳聚糖-戊酸-水胶体的制备
纯化壳聚糖80/100和80/200，AS-No.：9012-76-4，
将氨基-N-乙酰基-D-葡糖胺在单独的容器中灭菌，并进行以获得药物质量的壳聚糖。
试剂溶液
将无菌氨基-N-乙酰基-D-葡糖胺在此无菌水中在搅拌下再悬浮15分钟。在搅拌下(24小时)将400ml乙酸加入悬浮液中直至获得清澈溶液。
纯化步骤
向该溶液中逐滴(小心地)加入4N氢氧化钠溶液以获得pH8.0至8.5。所得溶液沉淀成白色质量。将所得的悬浮液搅拌不少于30分钟。通过过滤将残余物与液相分离。
再悬浮
将沉淀物再悬浮在等量的纯化(无菌)水(注射用水(Pharm.Eur.))(40μl，初始量)中。测量80ml戊酰氯。在搅拌条件下，将戊酰氯逐滴加入悬浮液中。搅拌所得悬浮液直至溶液清澈。加入1.6g硫柳汞(40μg/mL)。清澈溶液是活性成分(水胶体)。获得的多糖胶体(CVHC)在4℃至8℃下贮存。对于终产物，得到具有限定的生物活性的水溶液。
制备的反应步骤的概述
1.壳聚糖+水→悬浮液
悬浮液+HAc(24h)→壳聚糖-HAc-溶液
2.纯化步骤
2.1.壳聚糖-HAc-溶液+4N NaOH→(pH 8-8.5)壳聚糖+NaAc+H2O
2.2.壳聚糖+NaAc+H2O→H2O+NaAc
→壳聚糖(固体，纯化)
3.产生
壳聚糖(固体)+H2O+戊酰氯→
壳聚糖+戊酸+H2O+HCl→CVHC(壳聚糖-戊酸-水胶体)
产生是基础材料壳聚糖的纯化步骤和在过程中与第二试剂戊酰氯的反应的组合。
此第一个关键步骤是壳聚糖的沉淀，以获得药物质量的纯化壳聚糖的总量。
在过程控制中：监测反应时间和pH值以获得定量沉淀。
测试壳聚糖的药物质量：
测试中间体的质量(壳聚糖药物质量)
在水中的溶解度：将约250mg壳聚糖沉淀物的样品重悬于1ml纯化水中
目标：无法获得溶解度
质量：若不能检测到固体材料量的减少，则满足。
在较强酸中的溶解度：平行地，将相同量的沉淀物悬浮在1ml HCl(3N)中
目标：总体溶解
质量：若可以检测到固体材料总量的溶液，则满足。
第二个关键步骤是对活性成分的溶解过程。视觉进行控制：应当溶解沉淀物的总量。
实施例31.使用UV/VIS光谱法检查身份
使用根据欧洲药典2.2.25的测试方法。
装置：分光光度计Jasco 7800
测量条件：带宽2nm
范围200-600nm
用溶剂的空白校正
温度：25℃
UV-Cell：12.5x 45mm semi-micro，10mm路径长度UV级二氧化硅
溶剂：H2O
测试溶液：将壳聚糖HCl、壳聚糖-HAc、壳聚糖、壳聚糖-戊酸-水胶体和戊酸的适当样品分别溶解在上述溶剂中。将该混合物摇动，然后在超声波浴中超声处理5分钟。
分别对壳聚糖HCl、壳聚糖-HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体和戊酸，根据光谱学的一般基本原理和具有特定发色团基团和取代基的化学结构的吸收最大值可以预期为：200nm。
无法分析壳聚糖的吸收最大值，因为壳聚糖是一种水不溶性固体，其在典型的有机溶剂中也不能溶解。
所有光谱的比较显示无显著性或结构改性如芳香键等。基于原始材料的测量的光谱和文献数据，测量的光谱对应于预期的光谱。因此，上述测量数据证实预期结构的特性。
实施例32.IR-吸收分光光度法
使用根据欧洲药典2.2.24的测试方法。
为了鉴定活性成分壳聚糖-戊酸-水胶体，将不同壳聚糖-衍生物的一系列IR光谱与产物和戊酸的光谱进行比较。
1.方法和装置
装置红外分光光度计FT/IR 410 Jasco
范围：4000cm-1至600cm-1
测试样品：将4.8mg壳聚糖的混合物，或4mg壳聚糖-HCl的混合物或3.8mg乙酸壳聚糖和100mg KBr的混合物小心研磨，并且压成合适的溴化钾盘，或壳聚糖-戊酸-水胶体的膜或NaCl板(对于戊酸)
测量条件：
背景校正：实际
温度20℃
测量的光谱直接对应于来自数据库的文献光谱。
结果：上述测量数据确认测试物质的身份。
2.不同IR-谱的数据
活性成分中的戊酸的IR信号非常小至不可见。
与文献数据的比较：基于原始材料的测量光谱和文献数据，测量的CVHC谱对应于探察的光谱。
结果：上述测量的数据确认探察结构的身份。
实施例33.13C-NMR-光谱学分析
使用根据欧洲药典2.2.33的测试方法。
a)壳聚糖的13C-NMR谱
1.方法和装置
装置Bruker AMX 500AVANCE
测量条件
扫描频率：对于以下各项为125MHz：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺、壳聚糖-戊酸-水胶体、戊酸
温度：对于以下各项为300K：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体、戊酸；
对于以下各项为301K：葡糖胺HCl和N-乙酰葡糖胺
溶剂：对于以下各项为D2O：壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺；
对于壳聚糖-戊酸-水胶体为DMSO-D6
对于戊酸为CDCl3
浓度：对于壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、壳聚糖-戊酸-水胶体；
对于以下各项为约15mg/0.5ml：葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺和戊酸
校正：对于壳聚糖、壳聚糖HCl、壳聚糖HAc、葡糖胺HCl、N-乙酰葡糖胺
对于壳聚糖-戊酸-水胶体为DMSO-D6
对于戊酸为CDCl3
1.结果
a)壳聚糖的13C-NMR-光谱学分析
溶液中的测量：根据中性溶剂中缺少的溶解度，溶液中的测量是不可能的。
固态中的测量：固态中的测量是不可能的。还有，在长测量条件(时间)后，无可接受的信号出现。
结构：壳聚糖的NMR-鉴定是不可能的。
b)壳聚糖HCl的13C-NMR-光谱学分析
结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。c)壳聚糖HAc的13C-NMR-光谱学分析
结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。d)葡糖胺HCl的13C-NMR-光谱学分析
与文献数据的比较：测量的光谱直接对应于来自数据的文献光谱。
结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。
e)N-乙酰葡糖胺的13C-NMR-光谱学分析
结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。
f)壳聚糖-戊酸-水胶体的13C-NMR-光谱学分析
结果：上述测量的数据确认提出结构的身份。
g)戊酸的13C-NMR-光谱学分析
与文献数据的比较：测量的光谱直接对应于来自数据的文献光谱。
结果：上述测量的数据确认测试物质的身份。
实施例34.用于分析新产物壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHC)中壳聚糖和杂质的TLC方法
使用根据欧洲药典2.2.27的测试方法。
本部分呈现了用于鉴定CVHC的薄层层析的程序和数据以及使用的溶剂混合物中的Rf值和在UV光(365nm和254nm)，可见光下和用典型的显现试剂检测时的点颜色。
任何种类的葡糖胺的原始基础原始材料是来自昆虫或螃蟹的天然材料几丁质。这些生物聚合物的单体结构是N-乙酰基-葡糖胺。
对于药物和其他用途，在大多数情况下，脱乙酰几丁质是典型的。此种所得到的生物聚合物是所谓的壳聚糖，其可以被改性为水溶性离子化合物。此壳聚糖的单体结构理论上应当是葡糖胺。
因为脱乙酰化步骤不完全进行，所以壳聚糖具有N-乙酰葡糖胺(乙酰化)和葡糖胺(脱乙酰化)单元的混合结构。壳聚糖-戊酸-水胶体是一种新的聚氨基糖-戊酸水复合物。因此，N-乙酰基-葡糖胺和葡糖胺的阳性分析测试结果应当是不可能的。若将单体片段作为残留杂质包埋，则应当可以以其水溶性离子化合物壳聚糖HCl和壳聚糖HAc的形式鉴定壳聚糖。
1.方法
| 装置 | Camag层析罐系统 |
| TLC板 | Merck Si60F 254预包被的板 |
| 条件 | 避光和室饱和 |
| 温度 | 20-25℃ |
| 显色： | 垂直显色 |
层析条件
| 样品溶液 | 参见单一分析物 |
| 应用 | 30μl |
| 干燥 | 气流中最小2分钟 |
| 运动范围 | 80mm |
流动相
| 溶剂 | 丙酮 | 水 | 25％氨水 | - |
| 混合物 | 20 | 10 | 5 | - |
2.分析和结果
a)壳聚糖
样品制备
样品：水中悬浮的壳聚糖
1)装置：回流冷凝器
条件：在回流中(145℃)加热约30分钟
2)装置：超声浴
条件：于45℃超声处理约30分钟
3)装置：回流冷凝器
条件：在回流中(145℃)加热约30分钟
4)过滤：0.45μm滤器
使用清澈的滤液进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检测
备选：有机溶剂中的溶解由于壳聚糖的缺少的溶解度而显示相等的结果。
结果：水性或有机溶剂，如甲醇等中的壳聚糖的可接受的溶解是不可能的。壳聚糖的合适的溶解仅在壳聚糖HCl或壳聚糖HAc产生下在较强的酸，如HCl或HAc中是可能的。
b)壳聚糖HCl
使用5mg壳聚糖HCl/ml H2O进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检测
结果：化合物纯度：一个主要点。
c)壳聚糖HAc
使用5mg壳聚糖HAc/ml H2O进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
结果：化合物纯度：一个主要点。
d)葡糖胺HCl
使用5mg葡糖胺HCl/ml H2O进行分析。用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
结果：化合物纯度：一个主要点。
e)N-乙酰葡糖胺
使用5mg N-乙酰葡糖胺/ml H2O进行分析。用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
结果：化合物纯度：一个主要点。
f)壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHC)
CVHC是高粘性的水性凝胶。使用两滴CVHC进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
结果：化合物纯度：一个主要点。
g)戊酸
使用1μl戊酸(纯)进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
结果：化合物纯度：一个主要点。
3.TLC分析结果的比较
来自TLC的上述结果显示了没有可以用上文测试的特定衍生化试剂检测的单体或二聚体结构的证据。检测和Rf值“0”显示壳聚糖-戊酸-水胶体与相关化合物壳聚糖HCl和壳聚糖HAc的相似性。未能用此TLC系统特异性鉴定戊酸。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。
实施例35.用于分析性检测壳聚糖-戊酸-水胶体中的戊酸的TLC方法
1.方法和参数
建立新的TLC系统以进行成分戊酸的鉴定和纯度测试。
| 装置 | Camag层析罐系统 |
| TLC板 | Merck Si60F 254预包被的板 |
| 条件 | 避光和室饱和 |
| 温度 | 20-25℃ |
| 显色： | 垂直显色 |
层析条件
| 干燥 | 气流中最小2分钟 |
| 运动范围 | 80mm |
流动相
| 溶剂 | 乙酸乙酯 | - | - | - |
| 混合物 | 100 | - | - | - |
2.结果
a)戊酸(纯)
使用2μl戊酸(纯)进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg
b)壳聚糖-戊酸-水胶体(CVHV)
使用45μl壳聚糖-戊酸-水胶体，纯(与先前的测试相比，这是高约850被的戊酸量)进行分析。
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg
可以用此TLC-系统鉴定纯戊酸。不能在纯化合物壳聚糖-戊酸-水胶体中检测胶体整合的戊酸。检测和Rf值“0”5显示壳聚糖-戊酸-水胶体与其它相关壳聚糖化合物的相似性。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。上述结果确认提出的结构的身份。
实施例36.用高真空和较高的温度从壳聚糖-戊酸-水胶体消除戊酸
方法：对干燥评估损失(特殊方法)
装置：速度循环真空浓缩器
条件：5mbar
温度：60℃
时间：1周
端点：恒定质量
外观：玻璃状质量
结果气味：无典型的来自戊酸的气味
样品制备
用水部分再溶解
外观：高粘性凝胶
TLC-分析
装置：Camag层析罐系统
TLC-板：Merck Si 60F 254预包被板
条件：避光和室饱和
温度：20-25℃
显色：垂直显色
层析条件
样品溶液，参见上文
应用：5μl
干燥：气流中最小2分钟
运动范围：80mm
流动相
| 溶剂 | 乙酸乙酯 | - | - | - |
| 混合物 | 100 | - | - | - |
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
TLC层析后用此显现试剂的戊酸检测限：0.03μg
结果：凭借高真空和较高的温度，发生壳聚糖-戊酸-水胶体的不成比例(disproportion)。可以通过绝对无来自戊酸的典型气味显示戊酸的消除。可以通过TLC分析显示戊酸的消除：无在Rf值0.56处游离戊酸的典型点。可以在Rf值0处鉴定壳聚糖或壳聚糖化合物。壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或壳聚糖衍生物的溶液。
实施例37.在溶剂的情况下壳聚糖-戊酸-水胶体的不成比例
在乙酸乙酯中将壳聚糖-戊酸-水胶体的结构分解成戊酸和壳聚糖化合为。
样品制备
装置：分离漏斗，蒸发器
液体-液体分布：20ml壳聚糖-戊酸-水胶体和10ml乙酸乙酯
条件：摇动约5分钟并且等待相分离
相分离：收集乙酸乙酯相
浓缩步骤：用蒸发器将约10ml浓缩成液体残留物(含水)
再溶解：在1ml甲醇中
均质化：离心步骤约5min 12.000rpm
相分离：上部相：清澈的甲醇溶液
下部相：高粘性凝胶
上部和下部相的TLC分析(参见上文)
a)上部相(清澈的甲醇溶液)的分析
TLC分析
装置：Camag层析罐系统
TLC板：Merck Si 60F 254预包被板
条件：避光和室饱和
温度：20-25℃
显色：垂直显色
层析条件
样品溶液：清澈甲醇溶液
应用：5μl
干燥：气流中最小2分钟
运动范围：80mm
流动相
| 溶剂 | 乙酸乙酯 | - | - | - |
| 混合物 | 100 | - | - | - |
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
用显现试剂的检测限：0.03μg
结果：上部相是清澈的甲醇溶液。可以用TLC在此溶液中分解水胶体后鉴定戊酸。用TLC不能检出壳聚糖或壳聚糖化合物。
b)分析下部相(高粘性凝胶)
TLC-分析
装置：Camag层析罐系统
TLC板：Merck Si 60F 254预包被板
条件：避光和具有室
温度：20-25℃
显色：垂直显色
层析条件
样品溶液：高粘性凝胶，完全再溶于水中
应用：30μl
干燥：气流中最小2分钟
运动范围：80mm
流动相
| 溶剂 | 乙酸乙酯 | - | - | - |
| 混合物 | 100 | - | - | - |
用UV-荧光和VIS检测
| 荧光波长 | 254nm | 365nm | VIS |
| 化合物信号 | 无 | 无 | 无 |
| 杂质 | 无 | 无 | 无 |
用显现试剂检
用显现试剂的检测限：0.03μg
结果：下部相是高粘性凝胶，溶于水中。通过TLC在此相中不能检出戊酸。可以通过TLC在下部相(凝胶)中鉴定壳聚糖或壳聚糖化合物。
结果的汇总
结果：壳聚糖-戊酸-水胶体可以仅是聚氨基糖胶体，而非用水中的戊酸得到的壳聚糖或聚糖衍生物的溶液。上述结果确认提出的结构的身份。
实施例38.相对密度的评估
由于壳聚糖-戊酸-水胶体的高粘性，根据欧洲药典2.2.5的测试方法，用密度瓶/比重瓶评估密度是不可能的。
1.通过称重的测试方法
装置：250ml容量瓶
天平：Sartorius MC 1LC 2200S
温度计：具有刻度(min 0.5℃)和不超过60℃的范围的温度计
结果1.001[d20 20]
活性成分是水凝胶，因此理论密度应当高于1.0。测量的数据确认提出的物质的身份。
2.用液体密度计的测试方法
使用根据欧洲药典2.2.5的测试方法。
装置：250ml容量瓶
液体密度计：Widder 1573°，20℃-M100-DIN 12791Klasse H
温度计：具有刻度(min 0.5℃)和不超过60℃的范围的温度计
测量条件：温度20+/-0.5℃，用电子恒温箱
结果1.002[d20 20]
活性成分是水凝胶，因此理论密度应当高于1.0。测量的数据确认提出的物质的身份。
实施例39.硫酸灰分
使用根据欧洲药典2.4.14的测试方法。
测试
实施例40.干燥后的损失
基于此
建立测定干燥后损失的合适的方法。
1.用于测试壳聚糖HCl、壳聚糖和壳聚糖HAc的方法和参数
样品制备
容器的预处理：在合适的称重瓶中放置物质，所述称重瓶先前在以下使用的条件下干燥。
填充：物质填充不高于5毫升
转运：用合适的盖密封称重瓶
PC法：“较高的真空下”
修改的药典方法2.2.32(EP)“在干燥器中的真空”
装置：干燥器
干燥时间：至恒定的重量
干燥温度：25℃±2℃
真空：用特定的泵得到的持久的4-8mbar
干燥试剂：五氧化二磷(Diphosporuspentoxide)(新鲜)
2.壳聚糖-戊酸-水胶体中壳聚糖干燥后损失的评估(特殊方法)
用比重测定测量评估壳聚糖-戊酸-水胶体中的壳聚糖含量。
装置：速度循环真空浓缩器
方法：评估干燥后的损失(特殊方法)
测量条件
压力：5mbar
温度：60℃
时间：1周
端点：恒定质量
外观：玻璃状质量
测量：测试溶液4ml壳聚糖-戊酸-水胶体
重复：10次
结果气味：无典型的来自戊酸的气味
称重
平均值40，04mg
标准偏差0，236643191
相对标准偏差0，591016961
方差0，056
结果：干燥物质的称重显示良好的相似性。基于此测量，壳聚糖-戊酸-水胶体中的壳聚糖含量是1％。
结果的比较
主要成分应当是水胶体凝胶。测量的数据确认化合物的结构。
实施例41.渗量的评估
可以完成渗量的评估，其是溶液的熔解点的降低的间接测量。
装置：Halbmicro Osmometer Knauer
测量条件：外部冷却系统
范围：0-1600mOsmol
方法：冷冻
测试程序
在11Wasser中于20℃用标准溶液400mOsmol/Kg：12，687g NaCl校正
重复：2次
容器：特定的玻璃小瓶
样品：壳聚糖-戊酸-水胶体
测试溶液：1，无稀释
2，1：5稀释
量：各150μl
校正
测量
结果：壳聚糖-戊酸-水胶体渗量的测量显示相对较低的含量。若没有壳聚糖和戊酸的溶液或悬浮液，则渗透反应性组分的测量含量可以仅如此之低。高粘性胶凝化合物可以仅是水胶体。
结果：上述的测量数据确认提出物质的身份。
Claims (14)
1.包含源自疣状毛癣菌DSM-28406，须毛癣菌DSM-7279或白色念珠菌DSM-9456的喜角质性真菌和/或喜角质性酵母的抗原性物质的组合物在制备用于治疗和/或预防在牛科和/或猪中的蹄和爪病的药物中的用途，其中所述蹄和爪病选自下组：趾皮炎、趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎，并且所述抗原性物质包含喜角质性真菌和/或喜角质性酵母的抗原。
2.根据权利要求1的用途，其中所述喜角质性真菌和/或酵母的抗原性物质包含均质化的灭活的皮肤真菌小分生孢子和/或均质化的灭活的酵母芽生孢子和/或皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质和/或酵母芽生孢子的抗原性物质。
3.根据权利要求2的用途，其中所述皮肤真菌小分生孢子的抗原性物质和/或酵母芽生孢子的抗原性物质包含包括多糖和/或糖肽的不溶于水性溶液中的抗原性物质(ANMP)，包括多糖和/或糖肽的可溶于水性溶液中的抗原性物质(ASMP)，或包括多糖和/或糖肽的抗原性外源物质(AEMP)。
4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述蹄和爪病导致跛。
5.权利要求2至3中任一项的用途，其中所述小分生孢子在肿胀状态中和/或具有芽管。
6.权利要求2至3中任一项的用途，其中所述芽生孢子和/或小分生孢子已经用硫柳汞、甲醛和/或2-丙内酯灭活。
7.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述组合物另外包含一种或多种免疫调节物质。
8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述组合物另外包含通过戊酸、乳酸、对氨基苯甲酸、葡糖醛酸或戊酸的氯化物改性的壳聚糖或水胶体，所述水胶体包含：
(i)0.1％至5％w/v壳聚糖和0.001至5％w/v戊酸，或戊酸的氯化物或
(ii)0.1％至5％w/w壳聚糖和0.001至5％w/w葡糖醛酸或对氨基苯甲酸。
9.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述组合物是药物组合物。
10.权利要求9的用途，其中所述药物组合物是疫苗。
11.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述牛科是牛。
12.疣状毛癣菌菌株DSM–28406。
13.疣状毛癣菌菌株DSM–28406，疣状毛癣菌DSM–28406的均质化灭活的皮肤真菌小分生孢子或抗原性物质在制备用于治疗和/或预防动物中选自趾皮炎、趾间皮炎和/或趾间蜂窝织炎的蹄和爪病、跛、或皮肤癣菌病和/或人中的疣的人和/或兽医药物中的用途，所述抗原性物质包含疣状毛癣菌菌株DSM–28406的抗原，包括疣状毛癣菌菌株DSM–28406的皮肤真菌小分生孢子的ANMP、AEMP和ASMP。
14.权利要求13的用途，其中所述人和/或兽医药物是疫苗。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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