CN118021944A - 预防治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

预防治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了预防治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，所述疫苗的活性称为GBS CPS‑rP48，所述GBS CPS‑rP48是无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质。采用本发明的疫苗，经3针肌肉注射后，可诱导模型动物产生强特异性抗体滴度，具有双重保护性能，一针可防两病，简化免疫程序，减少免疫次数，降低动物的应激，也节省了劳动力，进一步降低了动物养殖的成本。

Description

预防治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
奶牛乳房炎是指奶牛乳腺实质、间质被致病菌侵入或在外界因素刺激下产生的炎症性疾病，是奶牛养殖业常见三大病之一，可导致牛奶质量、产量下降、受孕率降低、乳房机能丧失。国内外研究表明，奶牛乳房炎病因十分复杂，但主要病因是病原菌感染。B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)又称无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是引起奶牛乳房炎的常见病原菌之一。牛支原体(Mycoplasma bovis，Mb)是另一种重要病原菌，可引起乳房炎、肺炎、关节炎在内的多种疾病，传染性高，传播能力强。
随着人们对食品安全与公共卫生安全的重视度越来越高，使用广谱抗生素治疗乳房炎而造成的药物残留和细菌耐药性问题已无法符合养殖业和奶业健康发展的需求，特别是近日WHO已正式向全球发出禁止动物使用抗生素的建议。因此，奶牛乳房炎疫苗的研发和使用变得尤为重要。但目前奶牛乳房炎商品化疫苗种类较少，多为针对大肠杆菌或金葡菌的灭活疫苗，且仅能在一定范围内减轻奶牛乳房炎的严重程度，在降低感染率和发病率方面效果不明显，存在免疫谱窄、免疫持效期短、免疫活性低，无法诱导机体产生有效细胞免疫应答等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备奶牛乳房炎疫苗。
1.本发明提供了一种预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，它的活性称为GBS CPS-rP48，所述GBS CPS-rP48是无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质；
所述无乳链球菌荚膜多糖提取物按照包括如下步骤的方法制备:用溶菌酶剥离无乳链球菌的荚膜多糖，得到酶解液，对所述酶解液进行离心，收集上清液，所述上清液去除蛋白质后用去离子水透析，得到无乳链球菌荚膜多糖粗提液，将所述无乳链球菌荚膜多糖粗提液通过超滤更换溶剂为pH7.020 mM Tri-HCl&0.25M NaCl，得到待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液；对所述待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是-CH2-N+-(CH3)3，所采用的洗脱程序为两步洗脱，所述两步，第一步洗脱用pH7.0 20mM Tri-HCl&0.25M NaCl作为洗脱液，第二步洗脱用pH7.0 20 mM Tri-HCl&1M NaCl作为洗脱液；将阴离子交换柱层析获得的洗脱峰进行进行凝胶过滤层析，收集含多糖的洗脱峰，得到无乳链球菌荚膜多糖提取物；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括10-600KD；
所述pH7.0 20 mM Tri-HCl&0.25M NaCl由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为0.25M；
所pH7.0 20 mM Tri-HCl&1M NaCl由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为1M；
所述蛋白质rP48为如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；
A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于牛支原体的同源蛋白质。
所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Perresidue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。
上述疫苗中，所述蛋白质rP48为将核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因导入表达载体后，转入大肠杆菌，大量培养诱导上清表达后分离纯化得到的蛋白质。所述分离纯化使用凝胶层析色谱、离子交换色谱进行。蛋白质rP48的色谱峰型单一且对称，纯度＞95％。
上述疫苗中，所述无乳链球菌荚膜多糖具体可来源于Ia血清型无乳链球菌。
上述疫苗中，所述无乳链球菌荚膜多糖提取物的重均分子量为42.7kDa，数均分子量41.4kDa，分子量分布系数为1.03；所述无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1μg/mg；所述无乳链球菌荚膜多糖中的单糖组成为Rha:GlcN:Gal:Glc:GlcNAc的摩尔数比为12.75:2.71:2.59:1:0.57。
上述疫苗中，所述偶联中，无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48的质量比为1.6-2.2倍的无乳链球菌荚膜多糖提取物：1倍的蛋白质rP48。
上述疫苗中，所述偶联为共价键结合，具体可通过碳二亚胺和己二酸二酰肼进行，为所述无乳链球菌荚膜多糖和所述蛋白质rP48通过碳二亚胺(EDAC)缩合多糖羧基与己二酰二肼(ADH)连接。
上述疫苗中，所述偶联的无乳链球菌荚膜多糖和蛋白质rP48的制备方法为：
S1、将所述无乳链球菌荚膜多糖在0℃预混4-二甲氨基吡啶(DMAP)，调节pH值为9.0，加入1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(CDAP)活化多糖15min，超滤除杂，得到活化的荚膜多糖；
S2、将所述蛋白质rP48在4℃预混碳二亚胺(EDAC)，调节pH值为5.7，加入己二酸二酰肼(ADH)衍生蛋白8h，加入1M甘氨酸猝灭反应，超滤除杂得到衍生的蛋白质rP48；
S3、将S1所述活化的荚膜多糖和S2所述衍生的蛋白质rP48在EDAC存在下偶联8h，超滤除杂，经凝胶层析色谱分离纯化后得偶联的荚膜多糖和蛋白质rP48原液。所述原液中多糖含量6.6～8.6μg/μL，载体蛋白含量3.8～4.4μg/μL，多糖/蛋白偶联率1.6～2.2，游离多糖含量≤20％，游离蛋白含量≤10％。
上述疫苗还含有佐剂铝元素、镁元素、IL-12、IL-15、DDA(双十八烷基二甲基溴化铵)，MPL(单磷酰脂质体A)，Quil-A(皂素的纯化物)，RIBI adjuvant(美国RIBI ImmunoChem研究股份有限公司生产)和/或其它佐剂(弗氏佐剂等)。
上述疫苗中，活性成分所述偶联的无乳链球菌荚膜多糖和蛋白质rP48与佐剂铝元素，佐剂镁元素的重量份数比可为多糖：蛋白：铝：镁＝20：10：1000：1000；活性成分在生理盐水中的浓度可为2μg/ml(以多糖浓度计)。
上述疫苗可用于预防和/或治无乳链球菌和/或牛支原体引起的奶牛乳房炎。使用时可单次或多次免疫，每次免疫剂量可为10-14μg活性成分/100kg体重(对象为奶牛)。
本发明还提供预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗的制备方法，为将所述无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质作为活性成分，和佐剂混合，得到预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗。
本发明还提供下述任一种应用：
P1、上述的方法在制备奶牛无乳链球菌荚膜多糖-牛支原体rP48蛋白结合疫苗中的应用或在制备调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力药物中的应用；
P2、上述的疫苗在调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力产品中的应用。
所述调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力可为减轻无乳链球菌和/或牛支原体感染后宿主临床症状。
本发明公开了一种荚膜多糖-牛支原体rP48蛋白结合疫苗及其制备办法与应用。所述疫苗的活性成分是无乳链球菌荚膜多糖与牛支原体rP48蛋白共价偶联物。所述制备方法包括：多糖与蛋白的分离纯化，多糖与蛋白的偶联纯化。本发明建立的细菌荚膜多糖分离纯化的工艺，具有操作简单、产量大、成本低、批次稳定等优点。采用本发明所述的多糖蛋白结合疫苗，经3针肌肉注射后，可诱导模型动物产生强特异性抗体滴度，具有双重保护性能，一针可防两病，简化免疫程序，减少免疫次数，降低动物的应激，也节省了劳动力，进一步降低了动物养殖的成本。本发明方法制得的多糖蛋白结合疫苗可用于制备单价、多价无乳链球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗，也可用于制备含有无乳链球菌荚膜多糖-蛋白结合物的联合疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例1中的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉。
图2为本发明实施例1中的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉UV-vis检测结果。
图3为本发明实施例1中测定无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量。最佳吸收波长为485nm。
图4为本发明实施例1中无乳链球菌荚膜多糖红外光谱。
图5为本发明实施例1中无乳链球菌荚膜多糖高效凝胶渗透色谱图。
图6为本发明实施例1中无乳链球菌荚膜多糖离子色谱图。
图7为本发明实施例1中牛支原体rP48基因改造后的序列，将*标出处的TGA定点突变为TGG。
图8为本发明实施例1中rP48蛋白表达菌鉴定结果。图中，M：Marker；-：阴性对照；3、4：rP48阳性表达菌。
图9为本发明实施例1中rP48蛋白表达菌鉴定结果。图中，M：Marker；1、3、5、7：未诱导rP48表达菌蛋白；2、4、6、8：诱导rP48表达菌蛋白。
图10为本发明实施例1中rP48蛋白可溶性分析结果。图中，M：Maker；1：诱导pET-28a表达菌蛋白；2：未诱导rP48表达菌蛋白；3：诱导rP48表达菌蛋白；4：诱导rP48表达菌超裂上清蛋白；5：诱导rP48表达菌超裂沉淀蛋白。
图11为本发明实施例1中rP48蛋白纯化鉴定结果。图中，M：Maker；1：诱导全菌超裂上清；2：Superdex200纯化；3：凝胶层析色谱纯化。
图12为本发明实施例1中多糖蛋白结合物凝胶色谱图。
图13为本发明实施例1中多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48的SDS-PAGE电泳图。
图中，1：rP48，2：多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48。
图14为本发明实施例2中人工感染小鼠临床症状。图14的A：微黄色眼分泌物；图14的B：第四对乳头发黑，腹泻；图14的C：空白对照组乳腺；图14的D：乳腺单个化脓灶；图14的E：乳腺弥散性病变；图14的F：乳腺实质性病变。
图15为本发明实施例2中乳腺组织病理变化，HE染色，标尺50μm。图15的Aw对照P组；图15的B：G5组；图15的C：G6组；图15的D：G7组；图15的E：M6组；图15的F：M7组；图15的G：M8组。
图16为本发明实施例2中乳腺组织分菌鉴定结果。图16的A为GBS感染组(G5组、G6组、G7组)，其中，M：Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；1～4：G5；5～8：G6；9～12：G7。图16的B为Mb感染组(M6组、M7组、M8组)，其中，M：Marker；+：阳性对照；-：阴性对照；1～4：M6；5～8：M7；9～12：M8。
图17为本发明实施例2中乳腺组织炎性因子表达量。图17的A为GBS感染组(G5组、G6组、G7组)；图17的B为Mb感染组(M6组、M7组、M8组)；图中，ns代表无显著性差异；*代表显著性分析结果为P＜0.05；**代表显著性分析结果为P＜0.01；***代表显著性分析结果为P＜0.001；****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
图18是本发明实施例3中小鼠免疫血清总IgG抗体动态监测，注：每组n＝8，所有数据均以平均值±标准差表示；ns：无显著性差异；*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001，****：P＜0.0001。
图19为本发明实施例3中各组血清特异性抗体变化趋势。图19的A为CPS+rP48混合免疫组的结果；图19的B为CPS-rP48偶联免疫组的结果。ns代表无显著性差异；*代表显著性分析结果为P＜0.05；**代表显著性分析结果为P＜0.01；***代表显著性分析结果为P＜0.001；****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
图20为本发明实施例3中各组的抗体阳转率。
图21为本发明实施例3中42d各组血清抗体几何平均滴度对数。ns代表无显著性差异；*代表显著性分析结果为P＜0.05；****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
图22为本发明实施例3中血清中IgG1、IgG2a变化趋势。图22的A为IgG1变化趋势；图22的B为IgG2a变化趋势；图22的A为C为gG2a/IgG1；ns代表无显著性差异；*代表显著性分析结果为P＜0.05；**代表显著性分析结果为P＜0.01；***代表显著性分析结果为P＜0.001；****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
图23为本发明实施例3中各组脾细胞经体外抗原刺激后增殖情况。****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
图24为本发明实施例3中免疫攻菌小鼠临床症状。图24的A：空白对照组攻菌GBS-单个化脓灶；图24的B：空白对照组攻菌Mb-单个化脓灶；图24的C：偶联组攻菌GBS；D：偶联组攻菌Mb。
图25为本发明实施例3中乳腺组织病理变化，HE染色，标尺50μm。
图26为本发明实施例3中免疫攻菌小鼠分离计数。图26的A为攻毒GBS；图26的B为攻毒Mb；图中，*代表显著性分析结果为P＜0.05；****代表显著性分析结果为P＜0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
SPF级BALB/c雌性小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，订单号1308502。
实施例1
多糖与蛋白通过共价键偶联，常见的偶联方法有以下几种：(1)碳二亚胺(EDAC)直接或搭桥偶联：EDAC可缩合多糖羧基与“连接桥”己二酰二肼(ADH)连接，再与载体蛋白羧基连接，EDAC也可与载体蛋白羧基反应生成O-酰基异脲中间体，再与衍生多糖上的胺基反应，形成多糖蛋白结合物；(2)氰酸酯法：氰化物活化多糖的邻位羟基形成氰酸酯，可直接与载体蛋白氨基偶联，也可与ADH连接，ADH上的氨基再连接载体蛋白羧基；(3)胺还原法：利用强氧化剂将多糖末端羟基氧化还原呈醛基，直接与载体蛋白氨基反应生成Schiff碱结构(-RC＝N-)，经还原剂形成稳定的C-N结构；(4)其他：包括肟化学反应、重氮化反应、二硫键连接反应等。N-琥珀酰亚胺-3-二硫代吡啶丙酸(SPDP)是常用的二硫键连接反应试剂，先将SPDP连接到含氨基的组份上，与含疏基的组分发生疏基交换反应，形成以二硫键连接的多糖蛋白结合物。
目前已上市的多糖蛋白结合疫苗包括针对肺炎链球菌的PfizerPfizerGSKMSD针对流感嗜血杆菌的GSK针对脑膜炎奈瑟球菌的NovartisSanofiNovartis等。市售多糖蛋白结合疫苗中的蛋白载体多为破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉类毒素变体(CRM197)等强免疫原性蛋白，但这类蛋白刺激产生的蛋白抗体与疾病预防无关，仅具有载体效应，没有充分发挥蛋白抗原的作用。同时，这类蛋白未经甲醛或戊二醛脱毒，因而存在着“毒性逆转”的风险。类毒素是高致敏原性物质，也存在疫苗接种后“过敏反应”等安全隐患。多糖蛋白结合疫苗可同时产生针对多糖和蛋白的免疫应答，为多联疫苗的开发提供了思路，开发同时具有保护性抗原及佐剂功能的载体蛋白对拓展多糖蛋白结合疫苗的使用领域具有重要的应用意义。
本疫苗的抗原成分如下：
(1)Ia血清型无乳链球菌：记载于非专利文献“武乃雯,陈鹏,朱春燕等.奶牛无乳链球菌性乳房炎的传播途径分析[J].中国兽医杂志,2021,57(06):13-18.”，公众可从申请人处获得以重复本发明。抗原成分：荚膜多糖(其它途径获得的Ia型无乳链球菌制备的荚膜多糖起同样的作用)。
(2)牛支原体Hubei-1株：记载于非专利文献“Fu P,Sun Z,Yu Z,Zhang Y,Shen J,Zhang H,Xu W,Jiang F,Chen H,Wu W.Enzyme linked aptamer assay:based on acompetition format for sensitive detection of antibodies to Mycoplasma bovisin serum.Anal Chem.2014Feb 4；86(3):1701-9.doi:10.1021/ac4042203.Epub 2014Jan22.PMID:24417693.”，公众可从申请人处获得以重复本发明。抗原成分：P48蛋白。
1.荚膜多糖的制备
1.1.收集菌沉
采用THB培养基(北京索莱宝科技有限公司产品，货号：LA1860)对Ia血清型无乳链球菌进行种子(批扩增培养，并连续传代至第4-5代进行大批量培养：每升培养基添加15g葡萄糖以达到增菌目的，培养6h后每升培养基继续添加10g葡萄糖，每2h用NaOH调节pH为7.2，待细菌生长进入对数生长后期时停止培养，4℃12000r/min离心得到细菌沉淀，用pH7.210mM PBS缓冲液洗涤菌体三次，得到细菌沉淀。
1.2粗提多糖
用pH值8.0的10mM Tris-HCl缓冲液重悬步骤1.1中获得的细菌沉淀，每升菌沉使用5mg溶菌酶(北京索莱宝科技有限公司产品，货号：L8120)剥离荚膜多糖，37℃200r/min孵育8h，重复2次，得到酶解液，12000r/min离心15min，离心后取上清，将上清液1/3体积的Sevage试剂(由三氯甲烷和正丁醇按照4:1的体积比混合而成)加入上清液中，4℃充分振荡混合20min后12000r/min离心10min，吸取上层水相和下层有机相继续振荡混合，重复操作直至水相和有机相的中间层无变性蛋白，取水相进行透析，透析采用的半透膜(北京索莱宝科技有限公司，货号：YA1083)的截留分子量为3.5kDa，在去离子水中透析4h、8h、14h更换透析液，充分除去残留有机溶液，得到无乳链球菌荚膜多糖粗提液；
1.3精提多糖
将步骤1.2的无乳链球菌荚膜多糖粗提液通过超滤更换溶剂为pH值7.0的20mMTri-HCl&0.25M NaCl(由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为0.25M)，得到待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液，对所述待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液进行阴离子交换柱层析，经离子交换色谱Resource Q(A液：pH7.0 20 mM Tri-HCl&0.25M NaCl，B液：pH7.0 20mM Tri-HCl&1M NaCl，监测：UV215、260、280，流速：2mL/min)去除杂质。所述Resource Q购自Cytiva，货号：17117901，阴离子交换基团是-CH2-N+-(CH3)3，所采用的纯化模式为流穿模式，所采用的洗脱程序为两步洗脱。所述两步，第一步洗脱用pH7.0 20 mM Tri-HCl&0.25M NaCl作为洗脱液(由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为0.25M)，此时多糖与柱填料不结合，多糖上样即可洗脱收集，而核酸蛋白杂质结合在柱上；第二步洗脱用pH7.0 20 mM Tri-HCl&1M NaCl作为洗脱液(由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为1M)，将核酸蛋白杂质洗脱弃去。对于Ia型无乳链球菌荚膜多糖仅在UV215有吸收，在UV260、280无吸收；核酸及蛋白在UV215、260、280都有吸收，所以只收集UV215有吸收的洗脱峰即为糖峰。
再经凝胶层析柱HiLoad 16/600 Superdex 200pg(A液：0.15M NaCl，监测：UV215、260、280，流速：1mL/min)分离纯化，收集洗脱峰。所述HiLoad 16/600 Superdex 200pg购自Cytiva，货号：28989335，所采用的洗脱缓冲液是：由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为0.15M，仅收集UV215有吸收的洗脱峰。对于Ia型无乳链球菌荚膜多糖仅在UV215有吸收，在UV260、280无吸收；核酸及蛋白在UV215、260、280都有吸收，所以只收集UV215有吸收的洗脱峰即为糖峰。
透析除盐后用真空冻干机冻干获得精制的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉(CPS多糖)。
1.4多糖检定
1.4.1物理检查
步骤1.3获得的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉的照片见图1，外观为白色疏松体，加入无菌生理盐水后迅速溶解为均匀一致的澄清液体，无异物、无凝块。
1.4.2化学检定
将步骤1.3获得的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉称重后溶于ddH2O，以10mg/mL浓度进行纯度检验。
(1)UV-vis检测：
为了检测无乳链球菌荚膜多糖的紫外最大吸收峰，依据2020版《中国药典》三部0401紫外-可见分光光度法的规定，用Nanodrop测190～840nm紫外全波长吸收值及光谱。无乳链球菌荚膜多糖经UV-vis检测，结果见图2，无乳链球菌荚膜多糖最大峰值为195nm，且在260nm和280nm无吸收峰，说明核酸蛋白残留量极少。
(2)核酸含量：
为了检测无乳链球菌荚膜多糖的核酸残留含量，依据2020版《中国药典》三部0401紫外-可见分光光度法的规定，用Nanodrop测紫外260nm波长处的吸收值。经紫外-可见分光光度法检测，无乳链球菌荚膜多糖冻干粉中核酸含量为0.75～0.13μg/mg(提取多糖检测核酸杂质的实验做了多次，这里给出的范围是多次的实验结果汇总)。
(3)蛋白含量：
为了检测无乳链球菌荚膜多糖的蛋白残留，依据2020版《中国药典》三部0731蛋白质测定方法的规定，使用Bradford法对无乳链球菌荚膜多糖中的蛋白杂质进行定量，以BSA浓度作为横坐标、OD595nm作为纵坐标建立标曲，将测得的OD595nm带入标曲方程，测得无乳链球菌荚膜多糖中蛋白杂质含量为6.10～9.72μg/mg(提取多糖检测蛋白杂质的实验做了多次，这里给出的范围是多次的实验结果汇总)。
(4)糖含量
使用苯酚-硫酸法测定精制的无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量，见图3，以浓度为横坐标、OD485nm为纵坐标，建立D-Glc标曲，将测得的OD485nm带入标曲公式，测得精制的无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1～218.2μg/mg(提取多糖检测糖含量的实验做了多次，这里给出的范围是多次的实验结果汇总)，1L菌液可获得15.4～16.8mg无乳链球菌荚膜多糖。
(5)无菌及内毒素检验
无菌检查符合规定，细菌内毒素检查(鲎试验定量)≤0.25EU/mL。
(6)红外光谱分析
利用傅里叶变换红外光谱仪FT-IR650对多糖压片进行扫描记录。无乳链球菌荚膜多糖的红外光谱结果如图4，糖类的特征吸收峰在3600-3200cm-1、3392cm-1，分别是-OH、O-H的伸缩振动吸收峰。此外，在1641cm-1有可能归属于结晶水的吸收峰，在2935cm-1有可能归属于C-H伸缩振动的吸收峰，在1654cm-1、1560cm-1有可能归属于C＝O伸缩振动的吸收峰，在1450cm-1有可能归属于C-H变角振动的吸收峰，在1378cm-1、1321cm-1有可能归属于C＝O对称伸缩振动的吸收峰，在1230cm-1、1039cm-1有可能归属于O-H变角振动的吸收峰，在896cm-1有可能归属于吡喃环β-端基差向异构的C-H变角振动的吸收峰，在835cm-1有可能归属于吡喃环α-端基差向异构的C-H变角振动吸收峰。
(7)分子量测定
利用高效凝胶渗透色谱法检测，结果见图5，发现无乳链球菌荚膜多糖主要组分分布在42kDa，占总糖85.1％，重均分子量(Mw)为42.7kDa，数均分子量(Mn)41.4kDa，分散性(分子量分布系数(PDI)＝Mw/Mn)为1.03，说明分子分布均一、集中。
(8)单糖组成
利用离子色谱法检测，结果见图6，发现无乳链球菌荚膜多糖的单糖组成摩尔数比为鼠李糖(Rha):盐酸氨基葡萄糖(GlcN):半乳糖(Gal):葡萄糖(Glc):N-乙酰-D氨基葡萄糖(GlcNAc)＝12.75:2.71:2.59:1:0.57。
2蛋白的制备
2.1 pET-28a-rP48表达载体构建
结合Mb Hb-1在NCBI Genbank上的全基因组序列(登陆号CP002513)，参考Mycoplasmabovis P48-like protein gene(登陆号AY557344.1)，设计去除信号肽序列的引物对，由P48-F和P48-R组成(见表1)。
表1 P48基因克隆引物信息
表注：下划线指示的为保护碱基+酶切位点序列。
以牛支原体Hubei-1株的基因组为模板，以P48-F和P48-R为引物扩增了P48基因，分析序列(借助ExPASyProParam、ProtScale、SignalP Serve分析氨基酸序列)后将牛支原体P48基因中的翻译色氨酸的密码子TGA定点突变为TGG，去除了信号肽，增加了保护碱基和酶识别位点。设计含保护碱基和酶切位点的引物对，由rP48-F和rP48-R组成(表1)，合成并鉴定改造后rP48基因(如SEQ ID No.1所示：其中SEQ ID No.1第5-10位为NcoⅠ酶识别位点，SEQ ID No.1第13-1314位为rP48基因编码序列，编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；SEQ ID No.1第1315-1320为XhoⅠ酶识别序列)。
以NcoⅠ和XhoⅠ双酶切，与表达质粒pET-28a(+)(北京索莱宝科技有限公司，货号：P3110产品)以NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收的骨架相连接，得到重组表达载体pET-28a-rP48。重组表达载体pET-28a-rP48是以SEQ ID No.1的第5-1320位替换原表达质粒pET-28a(+)上NcoⅠ和XhoⅠ识别位点间的小片段(含酶识别位点)间的小片段，保持其它序列不变，得到的重组表达载体。重组表达载体pET-28a-rP48表达蛋白质rP48，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
将重组表达载体pET-28a-rP48转入感受态Transetta(DE3)(北京全式金生物技术股份有限公司产品，货号CD801-02)。以rP48-F和rP48-R(见表1)为引物进行PCR鉴定，鉴定结果见图8。取PCR鉴定呈阳性的单菌落，即得到导入pET-28a-rP48的大肠杆菌菌液，将该重组菌命名为DE3/pET-28a-rP48。
2.2rP48蛋白表达及纯化
37℃200r/min大量培养表达菌DE3/pET-28a-rP48至OD600nm为0.6时添加终浓度为1mM IPTG继续培养6h，离心得到细菌沉淀，用pH7.2无菌PBS洗涤菌体三次，50mL无菌PBS重悬，冰浴超声破碎40min，离心取上清，先用Ni-NTA亲和层析树脂粗纯rP48蛋白(取2mL加入空柱内，调节阀门3s/滴，缓慢加入20mL ddH2O，待要流净时，缓慢加入10mL BindingBuffer。缓慢加入超裂收集的上清，4℃5s/滴，收集流穿液，再次上柱。缓慢加入20mLWashing Buffer，4℃5s/滴，取1.5μL流穿液混合28.5μL 1×考马斯亮蓝G-250，检验杂蛋白是否完全流出，如未流净，可继续加入Washing Buffer。缓慢加入10mL Elution Buffer，4℃静置20min，调节阀门7s/滴，每隔10s检验是否有蛋白流出，流穿液加入考马斯亮蓝G-250变蓝时开始收集，变褐时停止收集。将收集到的蛋白加入ddH2O润洗过的超滤管，4℃3000g离心浓缩，升速3降速3，用pH9.0 20mM Tris HCl换液5次以上，以达到去除咪唑的目的。取20μL蛋白样品，加入4μL 6×Protein Loading Buffer，煮沸10min，瞬离后进行SDS-PAGE电泳鉴定)，后超滤换液到pH9.0 20 mM Tris HCl经凝胶层析色谱HiLoad 16/600 Superdex200pg分离纯化(A液：pH9.0 20 mM Tris HCl，监测：UV280，流速：1mL/min。洗脱缓冲液是：pH值为9.0的20mM Tri-HCl；收集洗脱时间为85-95min之间的洗脱液。操作过程：样品4℃12000r/min离心30min后吸取上清或0.22μm滤器直接过滤，等待上柱；所有上柱缓冲液经0.22μm真空过滤杯过滤，超声脱气15min。用ddH2O冲洗pure25的A、B泵头后将泵头放置于ddH2O中，启动UNICORN系统，选择泵洗，将A1、B1泵头转移到pH9.0 20 mM Tris HCl，再进行泵洗。选择流速：1mL/min、UV：280nm、alarm pre column pressure：0.45Mpa，先拧松HiLoad 16/200 Superdex 200pg色谱柱的下端堵头，卸上端堵头，待peek管有液体流出时连接柱子，固定好柱子后再卸下端堵头，待柱子下端有液体流出时连接peek管。待各参数平衡后，在monitors选择auto zero UV。选择1mL上样环连接仪器上样阀loopE、loopF，用20mL注射器吸取pH9.0 20 mM Tris-HCl，从syr口推入，冲洗上样环。用1mL注射器吸取稍多于1mL的样品，从syr口推入，推完后不要卸下注射器，上样阀切换至inject，待2倍以上样品环体积的缓冲液流过后，上样阀切换为manual load。设置UV大于10mAU时开始收集，每管收集1mL，小于10mAU时停止收集。待UV趋近于0且曲线持续走平时，可继续下个样品上样或收柱，收柱时先装下堵头，再装上堵头，用ddH2O泵洗仪器。取峰尖对应的20μL蛋白样品，加入4μL6×Protein Loading Buffer，煮沸10min，瞬离后进行SDS-PAGE电泳鉴定)。结果表明纯化得到48kDa的重组蛋白即rP48。rP48的氨基酸序列是SEQ ID No.2。
分离纯化结果见图9-图11：图9是rP48蛋白表达菌的筛选：为了筛选出rP48蛋白表达量高的单菌落，将鉴定的阳性表达菌扩大培养，取5mL用IPTG诱导表达，另5mL不做处理，进行SDS-PAGE鉴定，筛选到一株rP48蛋白高表达菌。图10是rP48蛋白的可溶性分析：为了鉴定rP48蛋白的表达方式，取IPTG诱导pET-28a空表达菌全菌蛋白、未诱导rP48表达菌全菌蛋白、IPTG诱导rP48表达菌全菌蛋白、IPTG诱导P48表达菌超裂上清蛋白、IPTG诱导P48表达菌超裂沉淀蛋白进行SDS-PAGE鉴定。由图10可见，重组表达的rP48蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达，大小约为48kDa。图11是rP48蛋白的纯化鉴定：大量表达rP48蛋白，先用Ni-NTA亲和层析纯化去除大部分杂蛋白，进一步通过凝胶层析色谱对rP48蛋白进行纯化，纯化后进行SDS-PAGE鉴定，经过两步纯化，获得纯度较高的rP48蛋白，纯化结果见图11。
2.3 rP48蛋白表达及纯化
利用Bradford法检测纯化的rP48蛋白浓度，以BSA浓度作为横坐标、OD595nm作为纵坐标建立标曲，将稀释后rP48蛋白测得的OD595nm带入标曲方程，测得每升表达菌DE3/pET-28a-rP48可表达约160mg rP48蛋白。
3多糖蛋白结合物的制备
3.1 ADH衍生P48
在0.01M EDAC(碳二亚胺)存在下用0.25M ADH(己二酸二酰肼，CAS号75499-44-4)衍生步骤2.3纯化的2mL 5mg/mL rP48蛋白，调节pH值为5.7，4℃低速混合8h，加入1M甘氨酸溶液猝灭反应，调pH7.0，透析除去EDAC和ADH，透析外液为0.15M NaCl。得到衍生蛋白rP48。
3.2 CDAP活化多糖
称取步骤1.3精制的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉，用0.15M NaCl溶解，预混1/10体积的pH值9.0的2.5M DMAP(4-二甲氨基吡啶)，0℃用0.1M HCl或0.1M NaOH调节pH值为9.0，在0℃左右加入CDAP(CAS号59016-56-7)活化无乳链球菌荚膜多糖，CDAP与无乳链球菌荚膜多糖质量比为1:1，保持0℃pH值9.0活化15min，透析除去DMAP和CDAP，透析外液为0.15MNaCl，得到CDAP活化的无乳链球菌荚膜多糖。
3.3偶联纯化
在0.01M EDAC存在下缩合步骤3.2活化的CDAP活化的无乳链球菌荚膜多糖和步骤3.1获得的衍生蛋白rP48，无乳链球菌荚膜多糖和蛋白rP48质量比为1:1，调pH值为5.7，4℃低速混合8h，调pH7.0，透析除去EDAC，透析外液为0.15M NaCl，超滤浓缩后经凝胶层析柱HiLoad 16/600Superdex 200pg(A液：0.15M NaCl，监测：UV280，流速：1mL/min)分离纯化后，收集高分子偶联部分，超滤浓缩获得多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48的原液。多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48(偶联产物)原液凝胶色谱图见图12。发生的偶联为碳二亚胺(EDAC)直接或搭桥偶联：EDAC可缩合多糖羧基与“连接桥”己二酰二肼(ADH)连接，再与载体蛋白羧基连接，EDAC也可与载体蛋白羧基反应生成O-酰基异脲中间体，再与衍生多糖上的胺基反应，形成多糖蛋白结合物。CDAP将CPS邻位羟基活化为氰酸酯，可直接与载体蛋白氨基偶联；也可与ADH连接，ADH上氨基再与蛋白上羧基偶联。本方法是蛋白羧基与ADH上氨基偶联，CDAP活化CPS羟基为氰酸酯，氰酸酯与ADH连接，此时ADH上连着蛋白。这种方法的好处是，偶联物中既有直接偶联也有搭桥偶联，增加了偶联效率。
3.4结合物分析
3.4.1定性分析
为了对多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48原液进行定性分析，探究其分子量变化，取偶联产物GBS CPS-rP48进行SDS-PAGE鉴定，对照为rP48蛋白，结果见图13，由于多糖通过共价键与rP48蛋白偶联，且偶联物分子量较大，导致偶联物变性后在PAGE胶上呈现连续的蛋白条带分布。由于产物此时未纯化，故48kDa处还残有未偶联蛋白。
3.4.2定量分析
利用苯酚-硫酸法、Bradford法分别测定多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48原液中糖、蛋白含量，将测得OD值代入标曲公式，多糖蛋白结合物GBS CPS-rP4原液中无乳链球菌荚膜多糖含量6.6～8.6μg/μL，载体蛋白rP48含量3.8～4.4μg/μL，多糖/蛋白偶联率1.6～2.2(偶联率＝结合物中的糖含量(总糖-游离糖)/结合物中的蛋白含量(总蛋白-游离蛋白))。利用脱氧胆酸钠法、凝胶层析色谱法分别测得多糖蛋白结合物GBS CPS-rP48原液中游离多糖含量≤20％，游离蛋白含量≤10％(历次数据为游离多糖8.8％～16.1％，游离蛋白5.4％～7.9％)。
实施例2
本实施例建立BALB/c小鼠乳房炎病理损伤动物模型，用于本发明多糖蛋白结合疫苗的效果评价。
1分组及免疫
1.1分组
将32只泌乳鼠(SPF级BALB/c雌性小鼠，11周龄)随机分为7组，分别是对照P组：无菌PBS/100μL(8只)、G5组：GBS105CFU/100μL(4只)、G6组：GBS106CFU/100μL(4只)、G7组：GBS107CFU/100μL(4只)、M6组：Mb 106CCU/100μL(4只)、M7组：Mb 107CCU/100μL(4只)、M8组：Mb 108CCU/100μL(4只)。每组的注射物和剂量见表1:
表1人工感染泌乳小鼠分组
1.2人工感染
分别取生长到对数末期的无乳链球菌(GBS)菌液和牛支原体(Mb)菌液，制备相应浓度的菌悬液，离心吸弃培养基后用无菌PBS洗3遍，再用100μL无菌PBS重悬备用。用消毒小鼠第四对乳头及其周围皮肤，用眼科镊侧夹起乳头旁皮肤，背面打光，透过光线可用肉眼观察到乳腺的大小和位置，注射器在乳头旁进针，深度3～4mm，每组按照表1的注射物和剂量进行注射。
1.3临床症状观察及评分
感染后观察小鼠的精神状态和第四对乳房状况，48h后记录体重，根据表2进行评分。
表2小鼠症状评分标准表
计分 48h体重变化 精神状态 第四对乳房剖检变化
0 增加或减少≤1.5g 正常 正常
1 减少1.5g～2.5g 站立不稳、不愿站立 轻微化脓灶(＜25％)
2 减少2.5g～3.5g 颤抖、嗜睡 多个化脓灶(25％～75％)
3 减少3.5g～4.5g 抽搐、腹泻、拒食 实质性病变(＞75％)
4 减少＞4.5g 濒死、死亡 乳腺实变(100％)
结果见表3和图14，感染组小鼠体重较对照组P相比下降明显，高剂量组的体重下降幅度最大。对照组小鼠被毛光滑，较为活泼，第四对乳房柔软无变化；G5组小鼠被毛粗乱，剖检可见单个化脓灶；G6组小鼠被毛粗乱，不喜运动，第四对乳房触摸变硬，个别乳头颜色变深，剖检可见乳腺存在弥散性病变，偶见化脓灶，部分乳腺组织实质化；G7组小鼠眼分泌物增加、体温下降、抽搐，第四对乳房触摸变硬，乳头变黑，肛周有粪污，且粪便发黄夹杂血丝等全身症状，剖检可见乳腺组织完全实质化；M6组小鼠剖检乳腺组织可见单个化脓灶；M7组小鼠精神沉郁，剖检可见弥散性病变；M8组小鼠被毛粗乱、不喜运动，第四对乳房触摸变硬，剖检后乳腺组织有明显化脓灶，部分实质化。GBS感染组临床症状评分：G7＞G6＞G5，分别为8.25、5.75、2.25；Mb感染组临床症状评分：M8＞M7＝M6，分别为4.75、1、1，GBS感染组症状整体比Mb感染组严重，GBS感染组症状随剂量增大而加重，Mb感染组症状随剂量增大加重程度不明显，特别是M6、M7组，这可能与Mb毒力有关。
表3人工感染小鼠临床症状计分
2样本采集及处理
感染48h后将小鼠脱颈处死，75％酒精浸泡消毒后放入解剖盘，以仰卧位固定于解剖盘，迅速剪开腹中线皮肤，不用剪开腹膜，观察并记录乳腺组织的病理变化，无菌分离出第四对乳腺，左侧取整个乳房(乳头+乳管+乳腺)置于足量4％PFA中固定，右侧只取乳腺，称重后用无菌眼科剪剪碎按1:10(g:mL)比例加入无菌PBS，加入研磨钢珠(去RNA酶)后放入组织破碎仪中以28次/s的速率破碎6min，得到的组织匀浆液-80℃保存备用。
2.1组织切片制备及染色
切片制备后HE染色，借助显微镜观察组织的形态学变化，结果见图15。对照组偶见局部乳腺组织有少量炎细胞浸润，腺泡壁结构完整、轮廓清晰，上皮细胞完整、排列整齐；G5组切片可见局部皮下组织、腺泡和导管内及间质均有炎性细胞浸润，局部导管扩张，上皮细胞脱落；G6组切片可见皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎细胞浸润，局部大量炎细胞浸润并形成脓性囊腔；局部导管扩张，部分腺泡结构消失；G7组切片可见皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎性细胞浸润，乳腺组织变性、坏死，局部腺腔内有嗜碱性分泌物，局部组织中可见大量细菌聚集，腺泡结构消失；M6组切片少量腺泡内有炎性细胞浸润，局部皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎细胞浸润；M7组切片个别皮下组织内有大量炎细胞浸润灶，大部分乳腺泡内有较多炎细胞分布，皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎细胞浸润，并形成脓性囊腔，部分腺泡结构消失；M8组切片皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎细胞浸润；局部腺泡和导管内及间质均有炎细胞浸润，可见脓性囊腔，腺泡结构崩解。GBS感染组与Mb感染组组织病变程度与剂量呈正相关，低剂量组炎性细胞浸润，高剂量组腺泡崩解、组织变性坏死。
2.2分离鉴定
2.2.1 GBS感染组
GBS感染的各组每只鼠取100μL乳腺组织匀浆液，选择合适稀释度均匀涂布于血平板，3个重复，37℃倒置培养48h。菌落数在30～300之间视为有效计数。无菌枪头挑取血平板上的疑似菌落，接入含1mL THB培养基的无菌Ep管内，37℃200rpm培养4h，进行菌液PCR鉴定，所用引物序列见表4中的CFB-F和CFB-R。结果见图16的A，获得与预期一致、大小为303bp的特异性条带，结合PCR结果和测序结果确定分离菌为GBS。
2.2.2 Mb感染组
Mb感染的各组每只鼠取100μL乳腺组织匀浆液经0.45μm滤器过滤后，从中取400μL接入含3.6mL Mb液体培养基的透明玻璃试管中，记作管1，振荡混匀后从中取400μL菌液接入下一支含3.6mL Mb液体培养基的试管中，直至稀释到管10。同时设置阴性对照(不接种，仅含培养基)。37℃5％CO2静置培养72～96h，观察各个试管颜色变化，取颜色变化的最末一支稀释度作为菌液CCU。取菌液4℃12000rpm离心20min，收集菌沉，提取基因组DNA进行PCR鉴定，所用引物序列见表4中的Mb-F和Mb-R。结果见图16的B，获得与预期一致、大小为442bp的特异性条带，结合PCR结果和测序结果确定分离菌为Mb。
表4 GBS与Mb鉴定引物信息
2.3炎性因子测定
采用qPCR检测小鼠乳腺组织中IL-2(引物：IL-2qF和IL-2qR)、IL-6(引物：IL-6qF和IL-6qR)、TNF-α(引物：TNF-αqF和TNF-αqR)炎性细胞因子的表达量，以GAPDH为内参(引物：GAPDH qF和GAPDH qR)，所用的引物信息见表5:
表5荧光定量qPCR引物信息
结果见图17，IL-2、IL-6、TNF-α表达量均随感染剂量的增加而上升。在GBS感染组中，IL-2表达量在G5、G6、G7组与对照组均有极显著差异(P＜0.0001)；IL-4表达量在G5、G6、G7组与对照组有极显著差异(P＜0.01)；TNF-α表达量在G6、G7组与对照组有极显著差异(P＜0.01)，在G5组与对照组有显著差异(P＜0.05)。在Mb感染组中，IL-2表达量在M8组与对照组有极显著差异(P＜0.01)，在M7组与对照组有显著差异(P＜0.05)，在M6组与对照组无差异；IL-4表达量在M7、M8组与对照组有极显著差异(P＜0.01)，在M6组与对照组无差异；TNF-α表达量在M7、M8组与对照组有显著差异(P＜0.05)，在M6组与对照组无差异。
实施例3
本实施例用于说明多糖结合疫苗免疫学特性，分别比较由纯多糖、纯蛋白、多糖蛋白混合物、多糖蛋白结合物作为抗原免疫小鼠产生的特异性抗体的差异。
1免疫实验
1.1分组及免疫
1.1.1分组
将40只8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠分为5组，分别是空白对照组(8只)、CPS多糖组(8只)、rP48蛋白组(8只)、CPS+rP48混合组(8只)、CPS-rP48偶联组(8只)。
1.1.2疫苗配制
空白对照组：所用疫苗的活性成分(抗原)为无菌生理盐水，每剂体积100μL，含25μL ImjectTMAlum Adjuvant，即1mg铝元素和1mg镁元素，其余75μL为抗原，佐剂与抗原在室温低速混合吸附30min。
CPS多糖组：所用疫苗的活性成分(抗原)为20μg CPS多糖，以实施例1步骤1.3精制的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉为溶质，以无菌生理盐水为溶剂配制，得到抗原溶液，无乳链球菌荚膜多糖每剂20μg，每剂疫苗体积100μL，含25μL ImjectTMAlum Adjuvant，即1mg铝元素和1mg镁元素，其余75μL为抗原溶液，佐剂与抗原在室温低速混合吸附30min。
rP48蛋白组：所用疫苗的活性成分(抗原)为10μg rP48蛋白，以实施例1步骤2.3纯化的rP48蛋白为溶质，以无菌生理盐水为溶剂配制，rP48蛋白每剂10μg，每剂疫苗体积100μL，含25μL ImjectTMAlum Adjuvant，即1mg铝元素和1mg镁元素，其余75μL为抗原溶液，佐剂与抗原在室温低速混合吸附30min。
CPS+rP48混合组：所用疫苗的活性成分(抗原)为20μg CPS多糖和10μg rP48蛋白混合物，以实施例1步骤1.3精制的无乳链球菌荚膜多糖冻干粉和步骤2.3纯化的rP48蛋白为溶质，以无菌生理盐水为溶剂配制，无乳链球菌荚膜多糖每剂20μg，rP48蛋白每剂10μg，每剂疫苗体积100μL，含25μL ImjectTMAlum Adjuvant，即1mg铝元素和1mg镁元素，其余75μL为抗原溶液，佐剂与抗原在室温低速混合吸附30min。
CPS-rP48偶联组：所用疫苗的活性成分为含有20μg CPS多糖和10μg rP48蛋白的偶联物，按照实施例1步骤3的方法制备多糖蛋白结合物，其中无乳链球菌荚膜多糖和蛋白rP48质量比为2:1，以制备的多糖蛋白结合物为为溶质，以无菌生理盐水为溶剂配制，无乳链球菌荚膜多糖每剂20μg，rP48蛋白每剂10μg，每剂疫苗体积100μL，含25μL ImjectTMAlumAdjuvant，即1mg铝元素和1mg镁元素，其余75μL为抗原溶液，佐剂与抗原在室温低速混合吸附30min。
1.1.3免疫程序
3针(每针1剂疫苗)分别于0、14、28d注射，前2针经左右腿部肌肉注射，第3针经第四对乳腺注射。
1.2样本采集及处理
分别于0、7、14、21、28、35、42、49d眼眶采集血液，37℃静置1h后4℃继续静置过夜，4℃2000rpm离心10min分离血清。49d脱颈处死小鼠，无菌采集脾脏，分离脾淋巴细胞。
1.3血清抗体动态监测
1.3.1血清总抗体动态监测
用间接ELISA检测所有免疫组血清中的特异性抗体，用pH9.650mM碳酸钠/碳酸氢钠包被液(北京索莱宝科技有限公司产品，货号：C1050)将各组抗原稀释至对应浓度：对照组包被生理盐水，多糖组包被10μg无乳链球菌多糖，蛋白组包被4μg rP48蛋白，混合组包被含10μg无乳链球菌多糖和4μg rP48蛋白的混合物，偶联组包被含10μg无乳链球菌多糖和4μg rP48蛋白的结合物。每孔100μL，每个样设置3个重复，4℃静置过夜。拍干包被液后，每孔加入300μL 1×PBST，洗板机1000r/min 5min，甩干孔内液体，吸水纸上拍干，重复3次。用1×PBST配制5％脱脂奶溶液，每孔200μL，37℃静置2h后洗涤。用1×PBST配制1％脱脂奶溶液，1:100稀释待检血清，每孔100μL，37℃静置1h后洗涤。用1×PBST配制1％脱脂奶溶液，1:5000稀释HRP Goat anti Mouse IgG(H+L)(购自ABclonal，货号：AS003)，每孔100μL，37℃静置1h后洗涤。避光将TMB(购自北京索莱宝科技有限公司，货号：PR1210)中A、B液按1:1比例混合，每孔100μL，室温避光显色10min，加入2M H2SO4终止显色。终止后5min内，测定OD450nm。
结果见图18：所有试验组IgG抗体水平随针次和时间呈上升趋势，显著高于对照组(P＜0.0001)。CPS-rP48结合组IgG抗体水平最高，rP48蛋白组次之，CPS-rP48结合组与rP48蛋白组之间差异极显著(P＜0.0001)，CPS-rP48结合组与rP48蛋白组之间的差异从首免后7d已经开始显现，CPS-rP48结合组与rP48蛋白组的IgG抗体水平从二免后7d迅速升高，到二免后14d有略微回落，但随着三免的进行，抗体水平迅速升至高位，随后一直保持至观察末期即首免后49d。CPS+rP48混合组高于CPS多糖组、NS对照组，但CPS+rP48混合组、CPS多糖组、对照组之间无差异(P＞0.05)。需要指出的是，混合组包被的是CPS和rP48蛋白混合物，CPS自身无法吸附酶标板，阻碍了rP48蛋白与酶标板的吸附，最终导致读数极低。为了解决CPS无法吸附酶标板的问题，制备CPS-BSA结合物，用于检测血清中的CPS特异性抗体。1.3.2结合物、混合组血清特异性抗体动态监测
由于结合组及混合组的免疫物为双抗原，包被P48蛋白以检测P48蛋白特异性抗体，包被无乳链球菌多糖-BSA偶联物以检测无乳链球菌多糖特异性抗体，分别在酶标板上包被10μg无乳链球菌多糖、4μg rP48蛋白、含10μg无乳链球菌多糖和4μg BSA蛋白的结合物、4μg BSA蛋白，其他步骤同1.3.1。
结果见图19：CPS+rP48混合组小鼠血清中rP48特异性IgG水平趋势同rP48蛋白组一致，CPS特异性IgG水平极低。CPS-rP48结合组血清中rP48特异性IgG水平与CPS特异性IgG水平随着针次和时间呈上升趋势，首免后14d，CPS特异性IgG与rP48特异性IgG之间无差异(P＞0.05)；二免后14d，rP48特异性IgG水平上升迅速，导致CPS特异性IgG与rP48特异性IgG之间有极显著差异(P＜0.0001)；三免后，rP48特异性IgG水平持续保持高位，CPS特异性IgG水平继续上升，至观察末期即首免后49d，rP48特异性IgG水平与CPS特异性IgG水平差距逐渐缩小。
1.4血清抗体阳转率
将空白对照组OD450nm平均值的2.1倍定为CUT-OFF值，高于该值判为阳转，计算各组小鼠血清阳转百分率(％)，结果见表6和图20：CPS-rP48偶联组在首免后14d达到100％，rP48蛋白组、CPS+rP48混合组在首免后21d达到100％。
表6各组特异性抗体阳转情况
1.5血清抗体几何平均滴度
选取各组42d血清，从1:100开始进行二倍稀释，用间接ELISA方法检测血清中特异性抗体效价，包被P48蛋白以检测P48蛋白特异性抗体，包被无乳链球菌多糖-BSA偶联物以检测无乳链球菌多糖特异性抗体。依照公式(1)计算各组几何平均滴度(GMT)。
结果见图21和表7，CPS-rP48偶联组中rP48效价＞CPS+rP48混合组中rP48效价＞CPS-rP48偶联组中CPS效价＞rP48蛋白组效价＞CPS+rP48混合组中CPS效价＞CPS多糖组效价，其GMT分别为144816、36204、27917、5382、259、130，CPS-rP48偶联组中CPS效价与CPS多糖组效价有极显著差异(P＜0.0001)，CPS-rP48偶联组中rP48效价与rP48蛋白组效价有极显著差异(P＜0.0001)，CPS+rP48混合组中CPS效价与CPS多糖组效价无差异(P＞0.05)。
表742d各组抗体几何平均滴度
1.6特异性抗体亚型IgG1、IgG2a
采用间接ELISA对CPS-rP48偶联组小鼠血清中的rP48特异性IgG亚型、CPS特异性IgG亚型进行检测。二抗使用HRP Goat Anti-Mouse IgG2a、HRP Goat Anti-Mouse IgG1，其余步骤同1.3.1。
用pH9.650mM碳酸钠/碳酸氢钠包被液(购自北京索莱宝科技有限公司，货号：C1050)将抗原稀释至对应浓度：分别用4μg rP48蛋白、含10μg无乳链球菌多糖和和4μg BSA蛋白的结合物包被，每孔100μL，每个样设置3个重复，4℃静置过夜。拍干包被液后，每孔加入300μL 1×PBST，洗板机1000r/min 5min，甩干孔内液体，吸水纸上拍干，重复3次。用1×PBST配制5％脱脂奶溶液，每孔200μL，37℃静置2h后洗涤。用1×PBST配制1％脱脂奶溶液，1:100稀释待检血清，每孔100μL，37℃静置1h后洗涤。用1×PBST配制1％脱脂奶溶液，1:2000稀释HRP Goat Anti-Mouse IgG2a、HRP Goat Anti-Mouse IgG1(购自ABclonal，货号：AS065、AS066)，每孔100μL，37℃静置1h后洗涤。避光将TMB(自北京索莱宝科技有限公司，货号：PR1210)中A、B液按1:1比例混合，每孔100μL，室温避光显色10min，加入2M H2SO4终止显色。终止后5min内，测定OD450nm。
结果见图22。从IgG1变化趋势来看，首免后14～21d，IgG1迅速上升至高位，rP48IgG1与CPS IgG1有极显著差异(P＜0.0001)，首免后28d有略微回落，但随着三免进行，IgG1持续上升，至观察期结束即首免后49d，IgG1仍在上升，但rP48 IgG1与CPS IgG1之间的差异缩小。IgG2a的变化趋势与IgG1一致，IgG2a在二免后有所上升，三免后持续上升，但rP48IgG2a与CPS IgG2a之间无显著差异(P＞0.05)。从IgG2a/IgG1比值来看，偶联组rP48特异性IgG和CPS特异性IgG都呈现出先降低再升高的趋势，降低是由于免疫前期IgG1增幅远超IgG2a，升高是由于免疫后期IgG1趋于稳定，而IgG2a开始逐渐上升，增强了小鼠的Th1型免疫应答，免疫后期出现了细胞免疫的趋势。
1.7T淋巴细胞增值试验
分离首免后49d小鼠脾淋巴细胞，在体外经免疫原再次刺激后，使用MTT法进行细胞增殖测定，依照公式(2)计算刺激指数(SI)。
结果见图23，CPS-rP48偶联组小鼠脾淋巴细胞增殖指数显著高于rP48蛋白组、CPS多糖组、CPS+rP48混合组(P＜0.0001)。
2攻毒保护试验
2.1分组及免疫
将24只8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠分为5组，分别是空白对照组(6只)、多糖组(3只)、蛋白组(3只)、多糖蛋白混合组(6只)、多糖蛋白偶联组(6只)，另有12只8周龄SPF级BALB/c雄性小鼠以待合笼。
疫苗配制同步骤1.1.2，免疫程序同步骤1.1.3，一免后7d的当天下午5点对雌鼠腹腔注射10UI孕马血清促性腺激素促进同期发情，以雌雄2:1的比例合笼。
2.2攻菌及样本采集
泌乳7d进行攻菌，已免疫小鼠攻菌分组见表8，105CFU GBS指以无乳链球菌(GBS)按照105CFU/100μL的剂量人工感染，106CFU Mb指以牛支原体(Mb)按照106CCU/100μL的剂量人工感染，人工感染方式同实施例2的步骤1.2。
表8已免疫小鼠攻菌分组
免疫小鼠 空白组 多糖组 蛋白组 混合组 偶联组
105CFU GBS 3只 3只 3只 3只
106CFU Mb 3只 3只 3只 3只
于感染后观察小鼠的精神状态和第四对乳房状况，并记录体重。48h脱颈处死，取一侧乳腺组织分离计数鉴定，另一侧PFA固定制备组织切片。
2.3临床症状观察及评分
空白组小鼠攻菌后体重较对照组相比下降明显，偶联组攻菌后的体重下降幅度最大。空白对照小鼠攻菌GBS后被毛粗乱，第四对乳房触摸变硬，剖检可见乳腺存在弥散性病变，偶见化脓灶；空白对照小鼠攻菌Mb后被毛粗乱，剖检可见乳腺存在弥散性病变，偶见化脓灶；偶联组小鼠攻菌GBS后被毛光滑，进食正常，第四对乳房柔软无变化，剖检乳腺组织无异常；攻菌Mb的偶联组小鼠被毛光滑，进食正常，第四对乳房柔软无变化，剖检偶见单个化脓灶；多糖组小鼠攻菌GBS后被毛粗乱，第四对乳房触摸变硬，剖检乳腺组织偶见化脓灶；蛋白组小鼠攻菌Mb后，个别乳腺组织有点状化脓灶；混合组小鼠攻菌GBS后被毛粗乱，第四对乳房触摸变硬，剖检乳腺组织偶见化脓灶；混合组小鼠攻菌Mb后，个别乳腺组织有点状化脓灶(见图24)。GBS感染组临床症状评分见表9：空白组＞多糖组＞混合组＞偶联组，分别为4、3、2.7、0.3。Mb感染组临床症状评分：空白组＞混合组＞蛋白组＞偶联组，分别为2.3、1.7、1.3、0.7。偶联组在所有感染组中评分最低，且偶联组GBS感染组评分低于Mb感染组，说明多糖蛋白结合疫苗对乳腺起到了一定的保护作用。
表9免疫攻菌小鼠临床症状计分
2.4样本采集及处理
分别于0、7、14、21、28、35、42、49d眼眶采集血液，37℃静置1h后4℃继续静置过夜，4℃2000rpm离心10min分离血清。49d脱颈处死小鼠，无菌采集脾脏，分离脾淋巴细胞。
2.5组织切片制备及染色
乳腺组织病理变化见图25，空白对照组切片个别皮下组织内有大量炎细胞浸润灶，大部分乳腺泡内有较多炎细胞分布，皮下组织、腺泡和导管内及间质均有较多炎细胞浸润，并形成脓性囊腔，部分腺泡结构消失；偶联组有少量炎细胞浸润，腺泡壁结构完整、轮廓清晰，上皮细胞偶见脱落，说明多糖蛋白结合疫苗对乳腺起到了一定的保护作用。
2.6攻菌后分离计数
对三免后泌乳7d的小鼠进行攻菌后分离鉴定的结果见表10和图26，偶联组分离GBS菌数＜多糖组分离GBS菌数＜空白组分离GBS菌数，偶联组分离Mb菌数＜蛋白组分离Mb菌数＜空白组分离Mb菌数，偶联组分菌GBS、Mb菌数在所有感染组中最低，与空白对照组有显著差异(P＜0.05)，说明多糖蛋白结合疫苗有帮助清除乳腺内GBS、Mb的能力。
表10免疫攻菌小鼠分离计数
实施例4
本实施例用于说明多糖结合疫苗稳定性和安全性，判定疫苗是否符合规定的质量要求及安全性程度。
1不同批次质量指标检查
结合物外观检查依据2020版《中国药典》三部中有关多糖结合疫苗的规定；pH值依据2020版《中国药典》三部0631pH值测定法的规定；蛋白质检查依据2020版《中国药典》三部0731Bradford法的规定；游离蛋白检查采用分子凝胶色谱法，收取游离蛋白测定含量；游离多糖检查采用脱氧胆酸钠酸沉淀结合物中蛋白质，将结合多糖与游离多糖分离，离心取上清，苯酚-硫酸法测上清游离多糖的含量，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的糖含量，计算游离多糖的含量，结果见表11。
表11不同批次结合物质量指标检定
2异常毒性试验
依据2020版《中国药典》三部1141异常毒性检查法的规定，随机挑选5只8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠，体重17～20g，记录注射前体重，将0.5mL偶联物溶液(含20μg无乳链球菌荚膜多糖和10μg牛支原体P48蛋白)缓慢注入小鼠腹腔，注射后观察7d，记录体重。结果见表12，试验观察期内，动物全部健存，且无异常反应，动物体重均增加，异常毒性试验成立。
表12异常毒性试验
3重复给药(免疫)毒性试验
按步骤2免疫后，观察受试动物三天内未出现异常症状，继续饲养至第七天，受试动物健存、正常、体重增加。于第八天再次重复给予步骤2同剂量、同途径接种给药，再连续观察7d，记录体重。结果见表13，试验观察期内，动物全部健存，且无异常反应，动物体重均增加，重复给药(免疫)毒性试验成立，
表13重复给药(免疫)毒性试验
4急性毒性试验
随机挑选5只8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠，体重17～20g，注射前记录体重，按步骤2的5倍剂量缓慢注入小鼠体内，注射后观察14d，记录体重。结果见表14，试验观察期内，动物全部健存，且无异常反应，动物体重均增加，急性毒性试验成立。
表14急性毒性试验
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗，其特征在于：所述疫苗的活性称为GBS CPS-rP48，所述GBS CPS-rP48是无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质；
所述无乳链球菌荚膜多糖提取物按照包括如下步骤的方法制备:用溶菌酶剥离无乳链球菌的荚膜多糖，得到酶解液，对所述酶解液进行离心，收集上清液，所述上清液去除蛋白质后用去离子水透析，得到无乳链球菌荚膜多糖粗提液，将所述无乳链球菌荚膜多糖粗提液通过超滤更换溶剂为pH7.020 mM Tri-HCl&0.25M NaCl，得到待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液；对所述待纯化的无乳链球菌荚膜多糖液进行阴离子交换柱层析，收集洗脱峰；所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是-CH2-N+-(CH3)3，所采用的洗脱程序为两步洗脱，所述两步，第一步洗脱用pH7.020mM Tri-HCl&0.25M NaCl作为洗脱液，第二步洗脱用pH7.020 mM Tri-HCl&1MNaCl作为洗脱液；将阴离子交换柱层析获得的洗脱峰进行进行凝胶过滤层析，收集含多糖的洗脱峰，得到无乳链球菌荚膜多糖提取物；所述凝胶过滤层析所用的层析介质的分离范围包括10-600KD；
所述pH7.020 mM Tri-HCl&0.25M NaCl由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mM Tri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为0.25M；
所pH7.020 mM Tri-HCl&1M NaCl由溶剂和溶质组成的pH值为7.0的溶液，溶剂为20mMTri-HCl缓冲液，溶质为NaCl且其在溶液中的浓度为1M；
所述蛋白质rP48为如下A1)或A2)的蛋白质：
A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；
A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于牛支原体的同源蛋白质。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述无乳链球菌荚膜多糖提取物的重均分子量为42.7kDa，数均分子量41.4kDa，分子量分布系数为1.03；所述无乳链球菌荚膜多糖中的糖含量为200.1μg/mg；所述无乳链球菌荚膜多糖中的单糖组成为Rha:GlcN:Gal:Glc:GlcNAc的摩尔数比为12.75:2.71:2.59:1:0.57。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于：所述偶联，无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48的质量比为1.6-2.2倍的无乳链球菌荚膜多糖提取物：1倍的蛋白质rP48。
4.根据权利要求1-3中任一所述的疫苗，其特征在于：所述偶联通过碳二亚胺和己二酸二酰肼进行。
5.根据权利要求1-4中任一所述的疫苗，其特征在于：所述无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联的方法为：
S1、将所述无乳链球菌荚膜多糖在0℃预混4-二甲氨基吡啶，调节pH值为9.0，加入1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯活化多糖15min，超滤除杂，得到活化的荚膜多糖；
S2、将所述蛋白质rP48在4℃预混碳二亚胺，调节pH值为5.7，加入己二酸二酰肼衍生蛋白8h，加入1M甘氨酸猝灭反应，超滤除杂得到衍生的蛋白质rP48；
S3、将S1所述活化的荚膜多糖和S2所述衍生的蛋白质rP48在EDAC存在下偶联8h，超滤除杂，经凝胶层析色谱分离纯化后得无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质。
6.根据权利要求1-5中任一所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗还含有佐剂。
7.预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求1-6任一中所述无乳链球菌荚膜多糖提取物和蛋白质rP48偶联得到的物质作为活性成分，和佐剂混合，得到预防和/或治疗无乳链球菌和牛支原体所致疾病的疫苗。
8.根据权利要求1-6中任一所述的疫苗在调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力产品中的应用。
9.权利要求7所述的方法在制备奶牛无乳链球菌荚膜多糖-牛支原体P48蛋白结合疫苗中的应用。
10.权利要求7所述的方法在制备调控无乳链球菌和/或牛支原体致病力药物中的应用。
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