BR102019027191A2 - Processo de obtenção de polissacarídeo capsular de s. agalactiae, polissacarídeo capsular de s. agalactiae assim obtido, composição imunogênica e uso - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de polissacarídeo capsular de s. agalactiae, polissacarídeo capsular de s. agalactiae assim obtido, composição imunogênica e uso. a presente invenção se refere ao processo de obtenção de polissacarídeo da cápsula de s. agalactiae, ao polissacarídeo da cápsula de s. agalactiae assim obtido, uma composição imunogênica compreendendo o referido polissacarídeo assim como seu uso contra infecção causada por s. agalactiae. as etapas de encapsulamento por quitosana e liofilização resultaram em processo eficaz, garantindo uma maior estabilidade do produto para armazenamento e elaboração de composições vacinais de uso sublingual. ainda, a presente invenção também se refere a otimização das condições de cultura para melhorar a produção de polissacarídeos da cápsula de s. agalactiae, resultando em níveis maiores de biomassa e consequentemente de cápsula polissacarídica.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE S. AGALACTIAE, POLISSACARÍDEO CAPSULAR DE S. AGALACTIAE ASSIM OBTIDO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E USO Campo da invenção:

[001] A presente invenção se refere ao processo de obtenção de polissacarídeo da cápsula de S. agalactiae, ao polissacarídeo da cápsula de S. agalactiae assim obtido, a um antígeno vacinal, a uma composição imunogênica assim como uso contra infecção causada por S. agalactiae. As etapas de encapsulamento por quitosana e liofilização resultaram em processo eficaz, garantindo uma maior estabilidade do produto para armazenamento e elaboração de composições vacinais de uso sublingual.

[002] Ainda, a presente invenção também se refere a otimização das condições de cultura para melhorar a produção de polissacarídeos da cápsula de S. agalactiae, resultando em níveis maiores de biomassa e consequentemente de cápsula polissacarídica.

Fundamentos da invenção: Microbiota humana e Streptococcus do grupo B

[003] A microbiota normal em seres humanos desenvolve-se por sucessões; ou seja, desde o nascimento até as diversas fases da vida adulta, existe desenvolvimento contínuo, resultando em colônias bacterianas estáveis. Os fatores que controlam a composição da microbiota, em uma dada região do corpo, estão relacionados à natureza do ambiente local, tais como temperatura, pH, água, oxigenação, nutrientes e fatores complexos, assim como da ação de componentes do sistema imunológico. Esta diversidade da composição da microbiota é importante para a manutenção da saúde, para o controle de espécies patogênicas e para a proteção do sistema imunológico primário.

[004] O microrganismo da espécie Streptococcus agalactiae (GBS) já faz parte da microbiota humana, estando presente nos tratos geniturinários e gastrointestinal (ARDOLINO et al., 2016). Alterações hormonais, bem como variações relacionadas com a natureza do ambiente local (como temperatura, pH, água, oxigenação, nutrientes), além de outros fatores complexos relacionados à ação de componentes do sistema imunológico, podem atuar sobre a microbiota significativamente, desequilibrando-a e, assim, favorecendo o crescimento deste microrganismo de forma "patógeno oportunista".

[005] Os microrganismos GBS pertencem ao grupo filogenético Bacteria grupo B em virtude de suas características antigênicas.

Sorotipo capsular do Streptococcus do grupo B

[006] Os GBS diferenciam-se em dez sorotipos distintos relacionados aos determinantes antigênicos da superfície celular, sendo classificados como: Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII e IX. Os dez sorotipos capsulares se distinguem de acordo com a variação da virulência e de antígenos ((FIOLO et al., 2011; FIOLO et al., 2012).

[007] Para Fiolo e colaboradores (2011), entre os dez sorotipos conhecidos, o III é o mais encontrado em doenças que acometem recém-nascidos (meningite e septicemia), o sorotipo Ia - (Speziale et al., 2005) é o mais detectado em amostra vaginal de mulheres grávidas e o sorotipo V tem prevalecido nas infecções em adultos, excluindo mulheres grávidas. No Japão, a maior incidência em recém-nascidos está com os tipos capsulares Ia, Ib e III (MOROZUMI et al., 2015). Para Baker (2000), a incidência de infecção pelo sorotipo Ia tem crescido nas últimas décadas, sendo prevalente com o tipo III nos casos graves de infecção.

Importância da cápsula polissacarídica do Streptococcus do grupo B

[008] A cápsula polissacarídica é um polímero de alta massa molecular, composta de subunidades repetitivas de oligossacarídeos, constituídas por diferentes moléculas de açúcares e unidas por ligações glicosídicas. De acordo com as diferentes estruturas da cápsula, a bactéria é classificada em sorotipos diversos. Essas diferenças químicas dos sorotipos identificados de GBS são associadas à cápsula polissacarídica, que lhes confere o fator de virulência e as propriedades antifagocitárias e antibacterianas. Enfim, a cápsula é responsável pela virulência e pela antigenicidade, protegendo o microrganismo contra a fagocitose pelo sistema imune e conferindo-lhe a resistência aos antibióticos.

Estrutura conformacional da cápsula polissacarídica bacteriana do Streptococcus agalactiae

[009] Polissacarídeos são cadeias poliméricas constituídas por longas cadeias de unidades de monossacarídeos unidos por ligações glicosídicas e moléculas de hidratos de carbono. A cadeia de polissacarídeos é bastante heterogênea e possui enorme diversidade estrutural, contendo modificações da unidade de repetição. Os polissacarídeos capsulares são solúveis em água e têm pesos moleculares na ordem de 100-2.000 kDa, além de serem lineares e consistirem em subunidades que se repetem regularmente de 1 a 6 monossacarídeos.

Conformação da cápsula polissacarídica

[010] A cápsula polissacarídica tem uma sequência específica, entre 2 e 8 resíduos de sacarídeos repetidos com ligação covalente. Mais particularmente, o polissacarídeo capsular de um Streptococcus agalactiae tipo Ia, do grupo B, é um polímero de elevado peso molecular, composto de pentassacarídeos com unidades de repetição: 4) - [α-D- NeupNAc- (2→3)-β-D-Galp (1→4) β-D-GlcpNAc-(1→3)]-β-D- Galp(1β4)-β-D-Glcp-(1) . Os produtos de genes que levam à produção de cápsula polissacarídica (CP) de S. agalactiae tipo Ia são homólogos às proteínas envolvidas na síntese de cápsula polissacarídica (CP) de S. agalactiae tipo III e S. pneumoniae sorotipo 14 (YAMAMOTO et al., 1999).

[011] As propriedades biológicas de polissacarídeos estão relacionadas com a sua composição e estrutura. Muitos fatores, como tipos de açúcar, de ligação, peso molecular ou teor de sulfato de biopolímero, exercem influência sobre a relação entre estrutura e função (GÓMEZ-ORDÓNEZ et al., 2012).

Manifestações clínicas da infecção por Streptococcus agalactiae

[012] Um dos fatores determinantes para a infecção neonatal precoce pelo Streptococcus agalactiae é a presença infecciosa desse microrganismo no trato genital materno no momento do nascimento. O aparelho urinário também é um importante sítio de infecção por essa bactéria, especialmente durante a gravidez, quando usualmente se manifesta como bacteriúria assintomática. Estudos já demonstraram que não existe diferença em relação à frequência da colonização quando se comparam mulheres durante as várias fases da gestação e as não gestantes (MERCER e BRIGGS, 1996).

[013] Aproximadamente 10-30% das mulheres gestantes são colonizadas de maneira patógena por grupo B streptococcus (GBS) na vagina ou no reto (GANOR-PAZ et al. 2015). Como exemplo, estudos mostram que a taxa de colonização por GBS em gestantes na ilha de Cuba é de 27,5% (ALVAREZ CRUZ et al., 2014).

[014] O risco para o recém-nascido adquirir infecção através da transmissão vertical está diretamente relacionado ao número absoluto de microrganismos presentes no canal de parto por ocasião do nascimento e à ausência de anticorpos específicos contra o polissacarídeo capsular do Streptococcus agalactiae, os quais são transferidos da mãe para o recém-nascido nas últimas 10 semanas de gestação (COSTA, 2011; MOROZUMI et al., 2015).

[015] Dessa maneira, o recém-nascido de mãe colonizada, principalmente o pré-termo, é mais suscetível (10 a 15 vezes mais) a desenvolver a doença invasiva precoce. Estudos mostram que de 1% a 2% dos filhos de mulheres com cultura vaginal e/ou retal positiva apresentam sepse neonatal precoce (COSTA, 2011; MOROZUMI et al., 2015).

[016] Ela também pode causar infecção na gestante (15%), o que ocasiona várias complicações, como corioamnionite, endometrite, infecção do trato urinário e de sítio cirúrgico (MERCER e BRIGGS, 1996).

[017] Outro problema grave que pode ocorrer é o comprometimento da evolução da gestação e do feto, provocando aborto, morte fetal intrauterina, corioamnionite e ruptura de membrana coriônica, levando a parto prematuro, assim como induzindo significativo aumento de recém-nascidos com baixo peso e com infecções no período pós-parto, como pneumonia, infecções cutâneas, ósseas ou articulares e meningite, o que pode causar retardo mental, além de perda de visão e audição nas crianças sobreviventes (CAIAFFA FILHO et al., 1986).

[018] Logo, vê-se a importância de se desenvolverem terapias preventivas de imunização e de se evitarem, assim, os diversos problemas diretos e indiretos descritos (MOROZUMI et al., 2015).

Prevenção atual contra o Streptococcus agalactiae

[019] Atualmente, existem duas estratégias utilizadas no Brasil para a prevenção do Streptococcus agalactiae (COSTA, 2011): (1) antissepsia do canal de parto com gluconato de clorexedina e (2) antibiótico profilaxia intraparto (AIP).

[020] No entanto, ambas as estratégias apresentam riscos para o recém-nascido e para a mãe. Para Costa (2011), as duas estratégias atualmente utilizadas, no Brasil, são consideradas paliativas e pouco eficientes na contenção da infecção, sendo então a imunização preventiva uma alternativa positiva para evitar a contaminação dos neonatos e as possíveis consequências.

Vacinação contra o Streptococcus agalactiae

[021] A imunização de mulheres grávidas com uma vacina GBS representa uma estratégia alternativa para proteger recém-nascidos e crianças pequenas, através da transferência de anticorpos transplacentários e, potencialmente, reduzindo a nova colonização vaginal (KOBAYASHI et al., 2016; BAKER et al., 1988).

[022] Um grande desafio para a saúde pública é desenvolver vacinas eficazes contra doenças infecciosas que tenham relevância global. Muitas das vacinas são desenvolvidas com sorotipos que prevalecem mais em cada país, mas não são otimamente eficazes contra sorotipos comuns a outras partes do mundo. Logo, novas tecnologias e abordagens inovadoras precisam ser usadas para identificar antígenos de GBS que superam a especificidade de sorotipos e que poderiam constituir a base de uma vacina globalmente efetiva contra esse patógeno oportunista (JOHRI et al., 2006).

[023] Sendo assim, a presente invenção apresenta uma alternativa de imunização utilizando o polissacarídeo capsular do S. agalactiae como antígeno, encapsulado em nanopartículas de quitosana e liofilizado o qual é usado em composições pela via sublingual na prevenção e tratamento de infecções causadas por S. agalactiae.

Estado da técnica:

[024] O documento intitulado " Chitosan-based mucosal adjuvants: Sunrise on the ocean" de 2015 refere-se a um artigo de revisão sobre a quitosana e seus derivados como adjuvantes mucosais assim como a sua aplicação clínica. Mais particularmente, ele descreve o uso da quitosana como tendo mucosadesividade, o que prolonga a retenção do antígeno em sítios mucosais. Por outro lado, o presente documento revela que ainda existem obstáculos que precisam ser superados, e que esperam que sistemas de entrega de vacinas à base de quitosana sejam lançados no mercado em breve. Já a presente invenção trata de um processo de obtenção de polissacarídeos da cápsula de S. agalactiae a qual foi encapsulada com quitosana e utilizada como delivery vacinal via mucosas.

[025] O documento intitulado "Mucosal Vaccines: Where Do We Stand" de 2013 trata de um estudo sobre vacinas de mucosas, em que se verificou a resposta imune de mucosa é mais eficientemente induzida pela administração de vacinas sobre superfícies de mucosas. No presente estudo, foram utilizados como exemplo alguns patógenos que colonizam ou invadem as superfícies de mucosa. Adicionalmente, a grande maioria das vacinas é administrada por injeção, incluindo vacinas que protegem contra patógenos adquiridos por mucosa, como o vírus da Influenza e o papiloma humano. Com o objetivo de lançar vacinas de mucosa, a presente invenção encapsulou e liofilizou o antígeno, garantindo assim estabilidade, adesividade às mucosas e absorção do antígeno no sistema imune.

[026] Já o documento intitulado "Stability and freeze-drying of cyclosporine loaded poly (D,L-lactide-glycolide) carriers" de 1999 trata da técnica de liofilização de ciclosporina carregada com PLGA. Apesar de ser conhecida a técnica de liofilização para conferir maior estabilidade, estudos adicionais são necessários, pois cada molécula possui características próprias. Nesse sentido, para a realização da etapa de liofilização da presente invenção, foi realizada a caracterização do polissacarídeo identificando-se a temperatura de transição vítrea, temperatura de colapso e temperatura eutética. Assim, a liofilização foi customizada para o polissacarídeo, através das análises de DSC e MFD Lyostat. A análise térmica em DSC (Differential Scanning Calorimetry - Calorímetro Exploratório Diferencial) identificou a temperatura de transição vítrea (Tg) e temperatura eutética (Teut). A temperatura de colapso (Tc) do polissacarídeo foi determinada pela análise MFD (Microscopie Freeze Drying) Lyostat - microscópio acoplado a um módulo de liofilização.

[027] A publicação internacional WO 2007/100699, refere-se a composições imunogênicas que compreendem micropartículas que compreendem um polímero biodegradável. As composições de micropartículas compreendem também um polissacarídeo catiônico e espécies imunológicas selecionadas de um antígeno, um adjuvante imunológico e uma combinação dos mesmos. O antígeno aqui utilizado pode ser selecionado de agentes bacterianos como S. agalactiae, por exemplo. Como adjuvantes podem ser selecionados bioadesivos e mucoadesivos, entre eles, quitosana e seus derivados. Diferentemente, a presente invenção revela um processo de obtenção de polissacarídeos da cápsula de S. agalactiae liofilizados e encapsulados com nanopartícula de quitosana para imunização via mucosa sublingual, sendo que a liofilização foi customizada baseada na caracterização do polissacarídeo.

[028] Por fim, a patente norte-americana US 8,445,239 refere-se a um processo de fermentação para cultivo de Streptococcus e processo de purificação para obter CPS do mesmo. Mais particularmente, a referida patente trata de um processo de fabricação de uma vacina, em que são empregadas etapas de fermentação, purificação, extração da cápsula e conjugação. Já a presente invenção, apesar de utilizar algumas etapas semelhantes do processo, apresenta adicionalmente a etapa de nanoencapsulamento do antígeno com uma matriz de biopolímero (quitosana) e a etapa de liofilização. Por fim, a presente invenção tem aplicação pela via sublingual, enquanto que a referida patente é para aplicação via injetável.

[029] Ainda, a referida patente norte-americana apresenta em seu processo a suplementação do meio de cultura com biotina, vitaminas diversas e aminoácidos diversos em combinação, porém, a presente invenção apenas utiliza o aminoácido L-prolina para obter um aumento da biomassa e consequentemente aumento da cápsula polissacarídica, simplificando o processo.

[030] Assim, a presente invenção preenche uma lacuna do estado da técnica ao passo que revela um processo de obtenção de cápsula polissacarídica do Streptococcus agalactiae, encapsulada em quitosana e liofilizada para delivery de mucosas sublinguais. Adicionalmente, o referido processo revelou um aumento na biomassa ao utilizar especificamente a L-prolina na etapa de cultivo e fermentação para a obtenção da cápsula polissacarídica.

Breve descrição das figuras:

[031] Para obter uma total e completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referências, conforme se segue.

[032] Figura 1. Análise microscópica do GBS e placa das colônias cultivada em meio BHI de Streptococcus agalactiae Ia em forma de coccus.

[033] Figura 2. Banco de trabalho: condições de cultivo: descontínuo em batelada em Shaker, Erlenmeyer com 100 ml de meio com inóculo GBS, temperatura 37°C, tempo de incubação 12 horas-14 horas, velocidade a 250 rpm no New Brunswick Scientific Excella® Incubator Shaker.

[034] Figura 3. Análise do crescimento celular dos meios de cultivo TSB e BHI - absorbância n=600 nm. Os dados obtidos demonstram que não houve diferença estatística significante: para o crescimento celular, entre o meio BHI e o meio TSB (P value 0,4417), entre a fase exponencial de crescimento.

[035] Figura 4. Modelo do planejamento do Banco Semente, Banco Mestre e Banco de Trabalho com meios BHI e TSB: sem inóculo (branco), suplementado com Inosina, L-Prolina, Ácido Nicotínico e os três suplementos em conjunto.

[036] Figura 5. Análise do crescimento celular no meio de cultura TSB com diferentes suplementos nutricionais (I-Inosina, P - L-Prolina, N - ácido nicotínico.

[037] Figura 6. Esquema de purificação do polissacarídeo, com as etapas de inativação, eliminação de dendritos celulares, ácidos nucleicos, tratamento enzimático, ultrafiltração e secagem.

[038] Figura 7. Curvas padrões de glicose, galactose e sacarose, assim como a mistura dos três na proporção de 2:2:1.

[039] Figura 8. Difração de raio X do PS após serem realizados novo cultivo e purificação.

[040] Figura 9. Picos cromatográficos a partir da reação de acetilação para identificação da identidade através da análise por cromatografia gasosa.

[041] Figura 10. Espectro 1D do polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae. A região dos sinais anoméricos foi magnificada para melhor visualização. Os sinais designados como GF1, R1, GA1, G1 e GN1 referem-se aos sinais dos prótons anoméricos β-D-Glcf, α-L-Rhap, β-D-Galp, β-D-Glcp e β-D-GlcpNAc, respectivamente. A Tabela 19 apresenta maiores informações relacionadas ao deslocamento químico 1H/13C das unidades de β-D-glicofuranose, α-L-ramnopiranose, β-D-galactopiranose, β-D-glicopiranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina.

[042] Figura 11. Caracterização NMR por 2D 1H/13C HSQCed (A) e sinais anoméricos magnificados para melhor visualização dos sinais (B).

[043] Figura 12. Espectro 2D 1H/13C HSQC editado do polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae. No painel A, a região dos sinais anoméricos foi magnificada para melhor visualização dos sinais. No painel B, a região típica dos sinais do anel de açúcares mostra o assinalamento dos principais resíduos identificados. A nomenclatura dos sinais encontra-se descrita na Figura 20. A Tabela 10 apresenta maiores informações relacionadas ao deslocamento químico 1H/13C das unidades de β-D-glicofuranose, α-L-ramnopiranose, β-D-galactopiranose, β-D- glicopiranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina.

[044] Figura 13. Espectro de caracterização de NMR por 2D 1H/1H phase-TOCSY do exopolissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia). Ambos os painéis, A e B, correspondem à região dos sinais anoméricos identificados para a amostra. No painel A, são mostradas as correlações intra e inter-resíduos identificados para β-D-Glicofuranose e α-L-Ramnopiranose, enquanto, no Painel B, são mostradas as correlações intra e inter-resíduos identificadas para β-D-Galactopiranose, β-D-Glicopiranose e β-D-N-acetil-Glicopiranosamina. A Tabela 10 apresenta maiores informações relacionadas ao deslocamento químico 1H/13C das unidades assinaladas.

[045] Figura 14. Estruturas aproximadas para o polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia.). As estruturas 1 e 2 correspondem às duas possíveis cadeias que fazem parte da composição da estrutura deste polissacarídeo. As estruturas foram montadas com base nos dados obtidos através dos experimentos de NMR e CGMS.

[046] Figura 15. Cadeia estrutural proposta pelo trabalho realizado por Yamamoto e colaboradores (1999) na qual, pode-se identificar que a maioria dos açúcares são semelhantes, mas a estrutura capsular diverge da presente invenção.

[047] Figura 16. Análise de DSC com a identificação de temperatura de transição vítrea, temperatura de fusão e a temperatura eutética.

[048] Figura 17. Análise da temperatura de colapso pelo Lyostat. (A) Temperatura ambiente -líquido +25° C, (B) Temperatura eutética -23.1°C (C) Temperatura de colapso -33,7°C.

[049] Figura 18. Aparência final do cake liofilizado do PS.

[050] Figura 19. Dados brutos de obtenção do potencial zeta e distribuição do tamanho de partícula.

[051] Figura 20. Título de anticorpos séricos IgG total.

[052] Figura 21. Concentração de anticorpos sIgA total.

Descrição detalhada da invenção:

[053] A presente invenção se refere ao processo de obtenção de polissacarídeo da cápsula de S. agalactiae, ao polissacarídeo da cápsula de S. agalactiae assim obtido, ao antígeno vacinal, a uma composição imunogênica assim como uso contra infecção causada por S. agalactiae. As etapas de encapsulamento por quitosana e liofilização resultaram em processo eficaz, garantindo uma maior estabilidade do produto para armazenamento e elaboração de composições vacinais de uso sublingual.

[054] Mais particularmente, a invenção será melhor detalhada conforme a seguir.

Caracterização, cultivo e fermentação

[055] A cepa de Streptococcus agalactiae foi adquirida do Núcleo de Coleção de Micro-organismo do Instituto Adolfo Lutz IAL - São Paulo. A referência da cepa: Streptococcus agalactiae (CT) - INCQS 00128, ATCC 12386 (ATCC - The American Type Culture Collection), correspondente às cepas bacterianas sorotipo Ia - Streptococcus agalactiae 090A, sob a referência: Cepa: O90A (E. Todd Aronson Wamoscher).

Pureza e contaminação

[056] O método de coloração de Gram foi realizado para se avaliar a pureza da cultura e como identificação bioquímica do grupo gram-positivo.

[057] Através da avaliação microscópica, foi confirmada a sua morfologia. Para o plaqueamento, foram utilizadas 3 placas de Petri com meio BHI (Sigma), armazenadas em estufa bacteriana, à temperatura de 37°C, por 18 horas (Figura 1).

Confirmação de identidade

[058] A confirmação da identidade foi realizada por metodologia de espectrofotometria de massa MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight); ou seja, dessorção/ionização por laser assistido por matriz (Tabela 1).
Tabela 1. Identificação de espécie assumida (escore acima de 2); ou seja, identidade perfeitac

[059] A coloração de GRAM da cepa GBS sorotipo IA revelou suas características típicas: forma de coccus, coloração violeta azulada, sem a presença morfológica de outros microrganismos. Em ensaio de crescimento em meio de TPP Agar, foi possível visualizar apenas um tipo morfológico de colônia bacteriana, demonstrando sua uniformidade e sua pureza.

Organização do Banco Mestre e do Banco de trabalho

[060] Expansão: a expansão da cepa semente liofilizada, adquirida do Núcleo de Coleção de Microorganismos do Instituto Adolfo Lutz, foi realizada em 0,5 ml de meio Brain Heart Infusion (BHI) marca Merck S.A., contendo: substratos nutritivos (extrato de cérebro, coração e peptona - 27,5 g.L-1), D-glucose (2,0 g.L-1), cloreto de sódio (5,0 g.L-1) e fosfato dissódico de hidrogênio (2,5 g.L-1). A cepa ressuspensa foi bem homogeneizada e toda a suspensão foi transferida para o Erlenmeyer estéril contendo 250 ml de Meio BHI da empresa Merck S.A., para preparação do pré-inóculo. O frasco foi incubado sob as seguintes condições: temperatura 37°C, tempo de incubação 12 horas, velocidade a 250 rpm no shaker New Brunswick Scientific Excella® Incubator Shaker. O protocolo de cultivo do Streptococcus agalactiae foi estabelecido a partir das recomendações do "Certificado de Análise e Dados Técnicos" do Banco de Micro-organismos do Instituto Adolfo Lutz.

[061] Banco Mestre: o volume da cultura do banco semente expandido a ser transferido para o banco mestre foi calculado de acordo com a equação:
Vin = Vcult x 0,1/DOin
Onde:
Vin = volume da cultura do inóculo a ser transferido para o meio de cultura
Vcult = volume de meio de cultivo
DOin= densidade ótica a 600 nm da cultura do inóculo

[062] Baseado nesta equação, foram transferidos 2 ml para um frasco Erlenmeyer contendo 100 ml de meio BHI, pH 7.2-7.4 e incubado na temperatura de 37°C, tempo de incubação 12 horas, velocidade a 250 rpm no shaker New Brunswick Scientific Excella® Incubator Shaker.

[063] Após 12 horas e cultivo do banco mestre, foram adicionados 50g de glicerol (20% do p/v), para garantir que, após o congelamento, não se formasse cristal e a membrana bacteriana não se rompesse quando o microrganismo fosse ressuspenso. As amostras foram aliquotadas em microtubos eppendorf, no volume de 1 ml, sendo armazenadas no freezer a -60°C. Foram congelados 200 microtubos eppendorfs contendo banco mestre de GBS, de modo a termos material suficiente até o término do projeto e, caso necessário, novas culturas fossem realizadas, permitindo a condução de outros estudos com a mesma cepa.

Banco de Trabalho

[064] Para o Banco de Trabalho, foram utilizados 2 ml do banco mestre para cada Erlenmeyer com 100 ml. Foram cultivados dois meios: BHI e TSB (Figura 2) conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2. Composição dos meios de cultura de BHI e TSB (fabricante Merck S.A), utilizados para expansão do inóculo e fermentação, constantes no rótulo.

[065] Os dados obtidos demonstram que não houve diferença estatística significante: para o crescimento celular, entre o meio BHI e o meio TSB (P value 0,4417), entre a fase exponencial de crescimento (P = 0,9691), para o double time (tempo em horas para replicação bacteriana), pois, no meio BHI, ocorreu em 0,28/h e, no meio TSB, em 0,31/h; a taxa de velocidade específica de crescimento foi de 0,22 DO, para o meio TSB, e 0,15 DO, para o meio BHI (figura 3). Assim, seguindo as boas práticas de produção de produtos biológicos, que não recomendam o uso de produtos de origem animal para evitar a contaminação por príons, o meio de cultura TSB é considerado o mais indicado para presente invenção.

[066] A partir da análise das rotas metabólicas do banco de dados KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), foram adicionados três aditivos nutricionais, que poderiam melhorar as diferentes rotas metabólicas e a produção de cápsula polissacarídica. Foram escolhidos os suplementos: Inosina, L-prolina e Ácido nicotínico (Tabela 3).
Tabela 3. Suplementos escolhidos para serem adicionados ao meio de cultivo, objetivando estimular as rotas metabólicas e aumentar a produção de cápsula polissacarídica.

[067] Em 2 frascos, cada um contendo 100 ml de meio de cultura base BHI, e o outro TSB, foram adicionados 2 ml do banco mestre de GBS. Após 12 horas, o cultivo foi transferido, repicado em mais 4 frascos com 100 ml para cada meio de cultura (total 8 frascos), sendo que foram mantidos 2 frascos de meio BHI e meio TSB sem inóculo - denominados como brancos (Figura 4) .

[068] As condições de cultivo foram às mesmas anteriores. Foram adicionados 150 mg de cada suplemento, de acordo com a Tabela 4.
Tabela 4. Tabela descritiva dos experimentos de cultivos celulares com respectivos meios de cultura e suplementos nutricionais, correspondente à primeira fase de pré-inóculo (FI) e posterior cultivo do inóculo (FII). Os frascos foram identificados de A até N, com meios de cultura TSB (meio de soja) e BHI (infusão de cérebro e coração) com os suplementos: inosina, L-prolina e ácido nicotínico, em condições de cultivo descontínuo em batelada: temperatura 37°C, tempo de incubação 12 horas, pH 7,2-7,4, velocidade a 250 rpm no New Brunswick Scientific Excella® Incubator Shaker

[069] A densidade ótica (DO) da cultura celular foi determinada por espectrofotômetro de luz visível a 600 nm, no equipamento Spectra Mx Plus 384. Meio de cultivo puro sem inóculo (branco) foi utilizado como zero da densidade ótica. Quando a absorbância ultrapassava os valores de 0,5, as amostras eram diluídas e o resultado multiplicado pelo valor da diluição para determinação da curva de crescimento celular.

[070] Assim, o crescimento celular foi avaliado através da análise turbidimétrica a cada 1 hora, por espectrofotometria no equipamento Biophotometer Eppendorf, com absorbância a 600nm. Todas as análises foram realizadas em duplicatas (Figura 5). Pela análise de variância ANOVA, não houve diferença estatística significante no crescimento celular utilizando-se diferentes suplementações. Porém, o meio suplementado com L-Prolina apresentou um double time de 0,14/h (8,4 min) em relação aos outros suplementos ou isento de suplemento. O meio que continha os três suplementos (Inosina, L-prolina e ácido nicotínico) resultou em double time 0,17/h (10,2 min).

[071] Aplicou-se a ferramenta de Bonferroni (tabela 5) para análise de comparabilidade entre as curvas de crescimento celular.
Tabela 5. Análise estatística de Bonferroni com os três suplementos (Inosina, L-prolina e ácido nicotínico).

[072] Analisando as diferenças entre os diferentes suplementos, pode-se identificar que o meio TSB sem suplementação apresentou diferença estatística significativa com o meio suplementado com os três diferentes nutrientes concomitantes (ácido nicotínico, L-prolina e inosina). Assim como com o meio suplementado apenas com ácido nicotínico comparado com o meio com inosina, houve piora na curva de crescimento. Podemos afirmar que, quando ocorreu a suplementação dos três diferentes nutrientes, não ocorreu melhora no crescimento, mas desordem na rede metabólica.

[073] Após o final do processo, a biomassa foi quantificada, como demonstrado na Tabela 6.
Tabela 6. Quantificação da biomassa seca produzida (mg/ml) com o meio TSB e com os diferentes suplementos I (inosina), N (ácido nicotínico), P (L-prolina) e I_N_P (composição dos três nutrientes)

[074] O meio contendo L-Prolina foi o que resultou maior quantidade de biomassa, como demonstrado na Tabela 6 acima.

[075] Adicionalmente, a produção de cápsula polissacarídica em meio suplementado foi analisada a partir da metodologia de fenol sulfúrico, utilizando-se o açúcar arabinose como padrão (Tabela 7).
Tabela 7. Concentração de polissacarídeo (μg/ml) no meio TSB adicionado com os diferentes suplementos e a relação de concentração de polissacarídeo por biomassa

[076] Apesar da L-Prolina ter mostrado uma curva de crescimento menor do que o TSB sozinho e o TSB com Inosina, a relação de concentração de PS/biomassa foi maior com o meio contendo L-Prolina, confirmando a via convergente do Banco de Dados do Kegg.

[077] Por este motivo, foi escolhido o suplemento com L-prolina, devido à produção de biomassa ser ligeiramente maior do que a dos outros meios e relação de concentração PS/biomassa também ser maior.

Purificação para extração do polissacarídeo (PS)

[078] Após o crescimento celular, foi adicionado 0,1% de Cetavlon (brometo de cetiltrimetilamônio). Após agitação para solubilização do Cetavlon, o cultivo celular foi mantido em repouso para que houvesse a inativação por lise celular. As amostras com Cetavlon foram centrifugadas no equipamento marca HERMLE Z32HK, por 5 minutos, com rotação de 8.000 rpm (6580 rcf - força centrífuga relativa).

[079] O volume relativo, correspondente ao precipitado, corresponde a aproximadamente a 1/10 do volume de cultivo. Por sua vez, o precipitado foi lavado 3 vezes com cloreto de sódio 0,9%, com volume relativo a 6 vezes o volume do precipitado. Em todas as lavagens, o sobrenadante foi descartado e, por fim, os pellets foram ressuspensos, até 10 ml, com cloreto de cálcio 0,9%. A segunda etapa da purificação foi realizada através de concentração em membrana com capacidade de retenção de biomoléculas acima de 30 kDa (membrana polietersulfona Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter, Merck).

[080] O concentrado foi armazenado a -60°C em tubos Falcon para realização das próximas etapas de purificação (figura 6) .

[081] A próxima etapa de purificação seguiu os procedimentos:
1. Descongelamento do PS pré-concentrado, por exemplo, 150 mL4
2. Acréscimo de 20% NaCl 2M (w/v), por exemplo 30 mL para 150 mL do PS

• a. Mantido sob agitação por no mínimo 1 hora

3. Centrifugação para separação do precipitado e sobrenadante, por exemplo na faixa de 3.500 rpm (1260 rcf) - aproximadamente 30 minutos - temperatura ambiente

• a. Coleta do sobrenadante, descarte do precipitado por método de filtração

4. Ao sobrenadante, acréscimo de 9% papaína (p/v)

• a. Homogeneização e mantido em banho-maria por exemplo a 60°Cpor no máximo 24 horas.

5. Centrifugação para coleta do sobrenadante a aproximadamente por 3.500 rpm (1260 rcf) - por no mínimo 60 minutos - em temperatura ambiente

• a. Coleta do sobrenadante, descarte do precipitado

6. Ao sobrenadante, acréscimo de volume relativo de 30% (v/v) álcool etílico absoluto PA (Synth)
7. Centrifugação a a aproximadamente por 8.000 rpm (6580 rcf) - por no mínimo 60 minutos - temperatura ambiente

• a. Descarte do precipitado, coleta do sobrenadante

8. No sobrenadante, foi acrescido 80% (v/v) álcool etílico absoluto PA (Synth)
9. Centrifugação para coleta do precipitado, por exemplo a 8.000 rpm (6580 rcf) - 60 minutos - temperatura ambiente

• a. Descarte do sobrenadante, coleta do precipitado

10. O precipitado foi ressuspenso em água ultrapura
11. Filtragem com Filtro 0,22μm preferencialmente, ou outro capaz de separar o sobrenadante do precipitado
12. Liofilização e armazenamento Quantificação relativa dos açúcares no polissacarídeo

[082] Para a quantificação dos açúcares presentes no polissacarídeo, foi utilizado o método fenol-sulfúrico (CUESTA et al., 2003; DUBOIS et al., 1956; Dische e Shettles, 1948).

[083] A curva padrão foi determinada pela análise das concentrações variadas de glicose, galactose, sacarose e mistura dos 3 açúcares com concentrações variando de 0,1 a 1 mg/ml. A concentração das amostras foi calculada através da curva padrão, considerando-se o fator de diluição.

Pesagem da massa seca: concentração de polissacarídeo

[084] Os valores das variáveis foram obtidos de acordo com as equações abaixo:
PS total (mg)=Cps*V/1000
sendo Cps a concentração de polissacarídeo (μg/ml) e V o volume da fração (mL).

[085] Ainda, a concentração de polissacarídeo total determinada pelo método fenol-sulfúrico. Foram utilizados como padrão de referência, os seguintes açúcares: Glicose, Galactose, sacarose e a mistura destes três componentes na proporção 2:2:1 (figura 7). A concentração foi calculada pela média dos valores absolutos obtidos em cada curva padrão (Tabela 8).

[086] A escolha dos padrões de açúcares teve como base as análises de cromatografia gasosa e pelos estudos conduzidos por outros pesquisadores como: Kogan e colaboradores (1996), que descrevem o polissacarídeo streptococcus grupo B sorotipo VIII contendo D-glicose, D-galactose, L-ramnose e ácido siálico na razão molar 1: 1: 1: 1 e os estudos de Berti e colaboradores (2014) e Yamamoto et al 1999 o GBS sorotipo IX contendo: Glcp, glucose; Galp, galactose; GlcpNAc, N-acetylglucosamine; GlcpN, glucosamina; NeupNAc, N-ácido acetylneuraminico.

[087] Pela análise fenol sulfúrico, calculou-se a concentração de polissacarídeo a partir de uma cultura de 50 ml. Foi obtido em média 114,43 μg de polissacarídeo purificado (2,4 μg/ml).
Tabela 8. Dosagem de polissacarídeo a partir do método fenol sulfúrico e leitura em espectrofotômetro (meio de cultura utilizado: TSB suplementado com L-prolina)

Identificação de cristalinidade - Difração de Raios-X

[088] A difração de raios-X foi realizada para caracterização e identificação da cristalinidade do PS.

[089] Foi utilizado o equipamento X Ray Difractometer, marca Rigaku, modelo Ultimat, tubo de cobre (radiação Kα = 154A), potência de trabalho 40 KV, 30 mA, software de análise, Jade 6.5 e o resultado apresentado na Figura 8, em que o padrão de difração de raios X não mostrou nenhum pico característico, o que indica que a estrutura é completamente amorfa. Os resultados mostram que o polissacarídeo isolado apresenta comportamento semelhante a outros isolados polissacarídicos (SUMATHI, 2002; KONG et al., 2015; DOGAN et al., 2015).

Identificação da composição monossacarídica — cromatografia gasosa CGMS

[090] O polissacarídeo (5 mg) foi submetido a dois ciclos de metilação. O polissacarídeo metilado foi hidrolisado com 5 mol/L de ácido trifluoroacético por 4h, à temperatura de 100°C, reduzido com boro-hidreto; os alditóis foram acetilados com anidrido acético: piridina (1:1 v/v). Os acetatos de alditol dos açúcares metilados foram dissolvidos em clorofórmio e analisados numa unidade de cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GCMS-QP2010 Shimadzu, Japão) com uma coluna Restek RTX-5MS (KIRCHER,1960). O gás de transporte foi o hélio, em gradiente de temperatura de 110°C a 250°C, com variação de 2°C/min. As temperaturas de injetor, fonte de íons e interface foram de 260°C, 200°C e 230°C, respectivamente. Diferentes períodos de tempo para a hidrólise do polissacarídeo metilado foram testados (de 1 a 4 h), para assegurar a hidrólise total das unidades constitutivas, mas sem perda significativa de resíduos de xilose. Os resultados da composição monossacarídica, que foram obtidos a partir da reação de acetilação e análise por CG, identificou ramificações de fucose, manose, glicose, galactose e N-acetil-glucosamina (Figura 9).

[091] A partir da análise da porcentagem de composição (tabela 9), verificou-se que o PS produzido por esse microrganismo trata-se de uma Rhamnoglucana bem heterogênea, contendo ramificações de fucose, manose, glicose, galactose e N-acetil-glucosamina (Tabela 9).
Tabela 9. Composição do PS do Streptococcus agalactiae Ia a partir da reação de acetilação para identificação da identidade através da análise por CG.
Identificação da estrutura - Ressonância Magnética

(NMR)

[092] Os espectros 1D e 2D 1H do polissacárido da cápsula GBS foram analisados utilizando-se um espectrómetro de RMN de 500 MHz (Bruker Biospin, Rheinstetten, Alemanha) com uma sonda de ressonância tripla (SANTOS et al., 2017). Aproximadamente 10 mg da amostra foram dissolvidos em 0,5 mL de óxido de deutério 99,9% (Cambridge Isotope Laboratory, Cambridge, MA). Todos os espectros foram registrados em 310K com supressão do sinal da água de contaminação proveniente da troca do átomo de deutério pelo átomo de hidrogênio da umidade do ambiente durante a manipulação das amostras. Para os espectros de 1D e 1H RMN, 32 médias foram registradas por amostra, usando um tempo de repetição igual a 1s. Para os experimentos 2D 1H/1H-TOCSY (espectroscopia correlacionada total) e 1H/13C HSQC (heteronuclear single quantum coherence), os espectros foram registrados usando uma ciclagem de fases dos pulsos do tipo TPPI (incremento de fase da proporção temporal) para detecção de quadratura na dimensão indireta. Os espectros de fase-TOCSY foram executados com 2048 × 1024 pontos com um campo de spinlock de 10 kHz e um tempo de mistura de 80 ms.

[093] Os espectros bidimensionais de 1H/13C Multiplicity-Edited HSQC foram registrados com 256 médias por amostra. A configuração do número de incremento foi ajustada para 64 e novamente utilizada a ciclagem de fase dos pulsos por TPPI para detecção de quadratura na dimensão indireta. Foram utilizados 1024 × 512 pontos, com pulsos retangulares de fase alternada, globalmente otimizados (GARP) para desacoplamento. Os desvios químicos foram apresentados em relação ao sinal de CH3 dos resíduos de a-L-ramnose usualmente encontrados nos polissacáridos da cápsula de GBS (Ravenscroft el al., 2017; Kogan et al., 1996).

[094] O espectro 1D 1H/13C HSQC editado do polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia) encontra-se na figura 10.

[095] A região dos sinais anoméricos foi magnificada para melhor visualização (Figura 11). No painel A, a região dos sinais anoméricos foi magnificada para melhor visualização dos sinais. No painel B, a região típica dos sinais do anel de açúcares mostra o assinalamento dos principais resíduos identificados. Ver a tabela 10 para mais informações relacionadas ao deslocamento químico 1H/13C das unidades de β-D-glicofuranose, α-L-ramnopiranose, β- D-galactopiranose, β-D-glicopiranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina.

[096] A região típica dos sinais do anel de açúcares mostra o assinalamento dos principais resíduos identificados.

[097] Já o espectro 2D 1H/1H phase-TOCSY do polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia) mostra as correlações intra e inter-resíduos identificadas para β-D-glicofuranose, α-L-ramnopiranose, β-D-galactopiranose, β-D-glicopiranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina (Figuras 12 e 13).

[098] Já o deslocamento químico 1H/13C (ppm) das unidades de α-L-ramnopiranose, β-D-glicopiranose, β-D-galactopiranose, β-D-glicofuranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina identificadas na estrutura do polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia) encontra-se na Tabela 10.
Tabela 10. Deslocamento químico 1H/13C (ppm) das unidades de β-D-glicofuranose, α-L-ramnopiranose, β-D-galactopiranose, β-D-

glicopiranose e β-D-N-acetil-glicopiranosamina identificadas na estrutura do exopolissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia.). Os sinais em itálico representam as ligações glicosídicas identificadas no espectro 2D 1H/1H phase-TOCSY.

[099] Foram propostas duas possíveis estruturas aproximadas para o polissacarídeo extraído da parede celular de Streptococcus agalactiae (sorotipo Ia). As estruturas (figura 14) foram montadas com base nos dados obtidos através dos experimentos de NMR e CGMS.

[100] Comparando a estrutura da cadeia proposta com o trabalho realizado por Yamamoto e colaboradores (1999) pode-se identificar que os açúcares são semelhantes, mas a estrutura capsular diverge. Esta diferença pode ser proveniente do meio de cultivo utilizado, meio Todd-Hewitt - Becton Dickinson -contendo 3,1g de infusão de coração, 20g peptona, 2g dextrose, 2g cloreto de sódio, 0,4g de fosfato de sódio e 2,5g de carbonato sódico em um litro, suplementado com 2% glicose e 1.5% Na2HPO4, que possivelmente estimulou rotas metabólicas divergentes e consequentemente a construção da estrutura da cadeia polissacarídica (Figura 15) .

Liofilização do polissacarídeo

[101] A vantagem da liofilização do PS é o aumento do tempo de estabilidade. A liofilização caracteriza-se pela secagem rápida de uma substância previamente congelada, por meio da sublimação, e tem como objetivo principal a remoção de qualquer solvente no estado sólido, transformando-o em gasoso, sem passar pelo estado líquido. A liofilização divide-se em três etapas: na primeira, o material é congelado, o que envolve a aquisição de uma matriz sólida; a seguir, no segundo estágio, a água é sublimada sob pressão reduzida. Quando toda a água livre congelada for removida por sublimação, encerra-se a secagem primária. Na terceira etapa, ocorre a secagem secundária, ou dessorção, na qual a água presa na estrutura molecular do núcleo é removida por aumento da temperatura até que o produto alcance a umidade residual desejada, ou seja, uma secagem a vácuo (por pressão reduzida).

[102] Para identificar os parâmetros da liofilização, foram realizadas as análises de DSC e Lyostat.

[103] A análise térmica em DSC (Differential Scanning Calorimetry - Calorímetro Exploratório Diferencial) foi realizada no equipamento marca Perkin Elmer precisely, DSC 4000. O objetivo foi a determinação da temperatura de transição vítrea para posterior otimização no processo de liofilização. Foram utilizados recipientes (cadinhos) de alumínio contendo aproximadamente 10 mg de amostra. Inicialmente, a amostra foi estabilizada à temperatura ambiente de 25°C e, posteriormente, foi resfriada até -55° C, em taxa de resfriamento de 10°C/min, com isotermas de 3 minutos. O cadinho vazio foi utilizado como referência. A análise térmica por DSC determinou a temperatura de transição vítrea (Tg) e temperatura eutética (Teut). Os resultados das temperaturas foram: tf = - 1,25°C (temperatura de fusão), Te = -24,54°C (temperatura eutética) e Tg = -26,61°C (transição vítrea). Os resultados encontram descritos na Figura 16.

[104] PS por ter uma estrutura amorfa, não tem uma rede cristalina que sofrerá de maneira uniforme o congelamento e nucleação, consequentemente tem uma faixa de transição estrutural, sendo sua temperatura de transição vítrea -26,6° C. Estes parâmetros de liofilização são muito importantes para um maior controle na nucleação, que influencia na textura do material congelado e nas características morfológicas finais do produto seco. Neste caso, para se controlar a nucleação, a redução do tempo da secagem primária é importante, garantindo-se a uniformidade do congelamento.

[105] A temperatura de colapso (Tc) do polissacarídeo foi determinada por um MFD (Microscopie Freeze Drying) Lyostat - microscópio acoplado a um módulo de liofilização (Lyostat 2, modelo FDCS 196, Linkam Instruments, Surrey, UK), equipado com sistema de congelamento por nitrogênio líquido (LNP94/2) e controlador de temperatura programável (TMS94, Linkam). A pressão utilizada durante as análises foi de 100 mTorr, através de uma bomba de vácuo (Edwards E2M1.5, Linkam). Amostras com 1 μL foram pipetadas sobre uma placa de quartzo de 16 mm, coberta com placa de vidro. Posteriormente, foram congeladas até -60° C e a pressão do sistema reduzida. A observação direta do congelamento e da liofilização foi realizada com microscópio de luz polarizada Nikon, modelo Elipse E600 (Nikon, Japão).

[106] A análise do PS por microliofilização Lyostat determinou a temperatura de colapso em -33,7°C (Figura 17).

[107] A temperatura de congelamento obtido pelo Lyostat foi de -23,1°C - que não difere muito do obtido pela técnica de DSC (-24,54°C).

[108] O polissacarídeo foi liofilizado a partir dos parâmetros provenientes do DSC e do Lyostat 2. A liofilização foi realizada em um aparelho liofilizador FTS Systems modelo TDS-00209-A, microprocessado com secador controlado de bandejas (Dura-Stop, Dura-Dry-MP). As amostras foram acondicionadas em frascos com 2 ml de PS purificado ressuspendido em água ultrapura (concentração de 1mg/ml).

[109] A partir da análise acima, o processo de liofilização foi definido utilizando-se os parâmetros achados conforme Tabela 11. A aparência final do cake liofilizado encontra-se na Figura 18.
Tabela 11. Ciclo de congelamento e ciclo de secagem a partir dos parâmetros obtidos no DSC e Liostat

Encapsulamento em Nanopartícula de quitosana Preparação da Nanopartícula

[110] Nanopartículas de quitosana foram preparadas com os seguintes reagentes: quitosana de baixo peso molecular (50-190 KDa) (Sigma-Aldrich 448869, CAS 9012-76-4) IV, tripolifosfato de sódio 85% (Sigma-Aldrich, CAS 7758-29-4), ácido acético glacial P.A. (Synth), cloreto de sódio P.A. (Synth), PS de Streptococcus agalactiae e proteína OVA acoplada, glicerol (Sigma-Aldrich, G6279, CAS: 56-81-5), água ultrapura (Milli-Q) e vitamina B9 líquida.

[111] Para a formação das nanopartículas, duas soluções distintas foram utilizadas: a primeira, contendo quitosana diluída em uma solução de ácido acético (1%) em água (volume/volume), a 2mg/ml (pH final 5;0); a segunda, composta por uma solução de tripolifosfato de sódio (TPP) à concentração de 1mg/ml, na qual foi adicionado o antígeno PS de Streptococcus agalactiae, conjugado com a proteína, à concentração de 0,160mg/ml e solução de vitamina B à concentração de 0,150mg/ml.

[112] Os passos para a preparação da Nanopartícula foram: 1) preparação da solução de quitosana; 2) preparação da solução de TPP; 3) formação da Nanopartícula.

[113] Solução de quitosana - passos para preparação de 30 ml de quitosana a 2mg/ml: em um béquer, foram medidos e adicionados 300uL (0,3ml) de ácido acético glacial. Foram acrescidos 15ml de solução salina a 0,9%. Pesados 0,06g de quitosana em pó e transferidos para um béquer. Acrescido à preparação de solução salina a 0,9% e ácido acético glacial, preparada anteriormente. A solução resultante foi homogeneizada em um agitador magnético (500 rpm, temperatura ambiente, por 2-4 horas até solubilização total). Foi ajustado o pH 5 com NaOH 1M e completou-se com solução salina a 0,9% até o volume final de 30 ml. Após a homogeneização da solução, a solução foi filtrada no filtro Millipore 0,22 um com uma seringa com agulha 3. Deixou-se a solução de quitosana por 48 horas em estado de repouso na geladeira 4°C.

[114] Solução de TPP - passos para preparação de 30 ml de tripolifosfato de sódio a 1 mg/ml (TPP): foram pesados 30 mg de TPP e adicionados 30 ml de água ultrapura. Solubilizado bem, tudo foi homogeneizado com um agitador magnético 500 rpm, por 30 minutos a 25°C.

[115] Formação da suspensão de Nanopartícula (proporção 3:1 - quitosana:TPP massa/massa) - processo de geleificação iônica: um béquer de 50 ml de capacidade foi agitado a 750 rpm, em agitador magnético, com 6 ml da solução de quitosana (2mg/ml). Foram adicionados a esta solução 100μL de Tween 20. Com uma seringa com capacidade de 10 ml, foi adicionada a solução de quitosana, uma solução de TPP, ora com PS de GBS, ora com PS acoplado com proteína, ora acrescido de PS com proteína e vitamina B9. Esta adição de TPP foi realizada de maneira contínua, à temperatura de 25°C, sob agitação contínua, a 750 rpm. Após a adição, foi mantida, sob agitação, por 1 hora, à temperatura de 25 °C.

[116] Em microtubos de 2 ml, foram colocados, no fundo do tubo, 10 ul de glicerol. Adicionou-se 1 ml de suspensão de nanopartículas em cada tubo, que foi centrifugada a 11.750 rpm por 30 minutos, a 25°C. Retirou-se o sobrenadante com uma micropipeta. Foi ressuspendido o precipitado com água Milli-Q, sendo centrifugado novamente a 11.750 rpm, por 30 minutos, a 25°C. Foi descartado o sobrenadante com micropipeta e ressuspendido o centrifugado com água filtrada.

[117] O primeiro sobrenadante foi guardado para posterior análise de teor proteico de OVA pelo método de BCA.

Determinação da taxa de encapsulamento

[118] A eficiência de encapsulamento foi calculada de maneira indireta, por ensaio de proteína por método de BCA (Acido Bi-cinconínico). Foi calculada a concentração de proteína no primeiro sobrenadante do centrifugado, após a formação da Nanopartícula. A proteína alvo foi a OVA (Sigma-Aldrich). A curva padrão foi realizada com albumina de soro bovino (BSA - Sigma Aldrich) em concentrações que variaram de 0,2 mg/ml a 1 mg/ml. Foi realizada a leitura de absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda 550nm, leitor de microplacas (Biotek - PowerWave XS2).

[119] Foi calculada a concentração de proteínas dos grupos 2 (nano com proteína e polissacarídeo acoplados), 3 (nano com polissacarídeo), 4 (nano vazia) e 7 (nano com PS, proteína e vitamina). Os grupos 3 e 4 são controles negativos, pois não apresentam proteínas nas suas formulações; desse modo, o resultado da concentração de proteína no sobrenadante no grupo 2 e no grupo 7 foi obtido através da média da subtração do grupo 2, menos a do grupo 3, e do grupo 2, menos a do grupo 4. O mesmo cálculo foi feito para o grupo 7.

[120] A capacidade de encapsulamento em relação à OVA foi de 92,8% dos grupos que continham PS. De acordo com Bexiga (2018), a eficiência de encapsulação da ovalbumina, em carboximetilquitosana medida por espectroscopia de fluorescência usando Ova-FITC foi de 17%. Para Gonzales (2015) foi de 30,9% com OVA e Yoshida (2012) foi de 88,7% com BSA, em Nanopartícula de quitosana. Para Bexiga (2018), a baixa taxa de encapsulamento pode ser atribuído ao ponto isoelétrico da ovalbumina (4.7) carregado negativamente sob as condições de preparação (~pH 7), que gera uma repulsão elétrica entre ovalbumina e carboximetilquitosana também carregada negativamente sob o pH da síntese de nanopartículas. Provavelmente uma boa taxa de encapsulamento foi obtida pela presente invenção devido a presença de polissacarídeo que altera as cargas de superfície da OVA.

Análise de espalhamento dinâmico da luz (DLS) — tamanho da Nanopartícula

[121] As amostras de polissacarídeo purificado foram acopladas com OVA, nanoencapsuladas em nanopartíclas e tiveram seu diâmetro hidrodinâmico, bem como sua polidispersão, avaliados por espalhamento da luz no instrumento Zetasizer Nano S (Malvern - DTS Ver. 5.03 MAL1020400 (Malvern Instruments) a 25°C.

[122] O DLS (Dinamic Light Scattering) mede a intensidade de luz espalhada por uma partícula, a partir do movimento browniano e da equação de Stocken-Einstein. Este método ilumina as partículas com luz laser, analisando-se as flutuações de intensidade de luz dispersa. Também foi determinado o índice de polidispersão, determinando-se a heterogeneidade de distribuição de tamanhos das nanopartículas no sistema, que varia de 0 a 1. Quanto maior o número de populações com diferentes tamanhos, maior é o índice de polidispersão. As medidas foram avaliadas no instrumento Malvern Instruments - Malvern - DTS Ver. 5.03 Zetasizer Nano S MAL1020400 a 25°C.

[123] O potencial Zeta determina a mobilidade eletroforética das partículas e está associado à medição do potencial da superfície das nanopartículas, em função da dissociação de grupos funcionais presentes na superfície das partículas ou em função da adsorção das espécies iônicas presentes na solução coloidal (ANDRADE, 2018; SCHAFFAZICK et al., 2003). As amostras foram analisadas no Laboratório de Sistemas Biomiméticos, no Instituto de Química da Universidade de São Paulo.

[124] Para a leitura, utilizou-se uma cubeta de quartzo (capacidade 3,5 ml), na qual foram pipetados 1,0 ml da amostra desejada e 2,5 ml de água filtrada; a leitura foi realizada a 25° C.

[125] Na Tabela 12 foram apresentados os resultados de diâmetros hidrodinâmicos medidos por DLS. As NPs-vazias (nanopartículas vazias) mostraram diâmetro menor do que quando encapsuladas com PS, proteína ou vitamina.
Tabela 12. Tamanho médio e índice de polidispersão (PdI) das Nanopartícula de quitosana 2mg/ml e TPP 1 mg/ml nos diferentes grupos de imunização

[126] O índice de polidispersão está dentro do esperado (abaixo de 0.3) que demonstra a distribuição de diâmetro hidrodinâmico bimodal.

[127] A figura 19 mostra os dados brutos de obtenção da distribuição do potencial Zeta e distribuição do tamanho por intensidade.

Imunização de mucosas sublinguais

[128] A determinação da antigenicidade foi feita em 48 camundongos BALB/c, fêmeas (provenientes do Biotério da Faculdade de Medicina da USP), com 4 semanas de idade, pesando em média 16 g, alimentados com ração e água ad libitum, mantidos no Biotério, na proporção de 3 camundongos por gaiola.

[129] O esquema de imunização foi baseado em três doses sublinguais, com intervalo de 1 semana entre elas e duas doses intraperitoneal (conforme Tabela 13).

[130] As inoculações foram feitas com os animais sedados por isoflurano inalatório. As imunizações foram realizadas com amostras na concentração final de 7,5 μg de PS, 7,5 μg OVA e 4,5 μg de vitamina.
Tabela 13. Esquema de inoculação e coleta de sangue dos camundongos. O esquema de imunização foi baseado em três doses sublinguais, com intervalo de 1 semana entre elas e duas doses intraperitoneal.

[131] A quantificação de anticorpo IgG sérico específico para polissacarídico e a dosagem de IgA total salivar foram determinadas por ensaio imunoenzimático (ELISA).

[132] A quantificação de IgG iniciou-se pela sensibilização de uma placa com 96 poços com 100μL/poço de uma solução de BSA (200μg/ml) em tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6, incubada por 15 horas, a 4° C. Na sequência, as placas foram lavadas 3 vezes com solução PBS-Tween 20 (PBS-T 0,05%). Posteriormente, foram incubados 20μg/ml de PS do GBS com periodato de sódio 0,06M em tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6, por 18 horas, a 4° C, no escuro. Após a sensibilização completa, houve o bloqueio das placas com uma solução 0,05% PBS-Gelatina, por 1h, à temperatura ambiente. Na sequência, as placas foram lavadas 3 vezes com solução PBS-Tween 20 (PBS-T 0,05%). Foram acrescentados 200 μL do soro previamente diluído na concentração 1/10 em PBS acrescido de 0,05% BSA e, subsequentemente, diluídos na proporção ½, incubados por 1 hora, a 37° C. Após nova lavagem com PBS-T, adicionaram-se 100 μL/poço de uma solução contendo anticorpo anti-camundongo conjugado à peroxidasse marca KPL (peroxidase labeled antibody to mouse IgG (0,1 mg/ml), diluído 1:1000. Incubou-se tudo por 1 hora, a 37° C. Subsequentemente, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T. Foram adicionados 100 μL de uma solução tampão de citrato contendo 400μg/mL de OPD marca Sigma Aldrich (o-fenildiamina phenyendiamin 99,5%) e 5μL/ml de peróxido de hidrogênio 10% por 30 minutos, por 30 minutos, no escuro, em temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 μL de ácido sulfúrico 3M após 30 minutos e submetida à leitura de placa no comprimento de onda a 492 nm. O título de anticorpo foi determinado pela dose imunoreativa efetiva 50%.

[133] A quantificação de sIgA iniciou-se pela sensibilização de uma placa com 96 poços. A quantificação de anticorpo sIgA foi realizada através do seguinte procedimento: coating com 100 μL/poço das salivas dos camundongos (10μL salina adicionado com 90 μL bicarbonato tampão 0,1 M pH 9,6) e coating com o controle positivo: diluições em série a partir de 100μL/poço de uma solução (20 μL IgAk (IgAk marca Tepc15 - Sigma) adicionado com 80 μL bicarbonato tampão), incubado por 18h, temperatura refrigerada 4°C.

[134] Na sequência, as placas foram lavadas 3 vezes com solução PBS-Tween (PBS-T 0,05%). As cavidades livres foram bloqueadas com 100 μL/poço de uma solução de PBS com leite Molico 0,5%, incubadas por 2 horas, à temperatura ambiente, 25°C. Na sequência, as placas foram lavadas 3 vezes com solução PBS-Tween (PBS-T 0,05%).

[135] Foram pipetados 100 μL/poço de uma solução contendo anticorpo IgAα (marca Sigma) conjugado à peroxidase e diluído 1:2000, sendo incubada por 2 horas, a 25° C. Na etapa final, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS-T e incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente, no escuro, com 100 μL de uma solução tampão de citrato contendo 400μg/mL de OPD marca Aldrich (o-phenyendiamin 99,5%) e 5μL/ml de peróxido de hidrogênio 10%. Ά reação foi cessada com 50 μL de ácido sulfúrico 3M e a absorbância foi medida a 492 nm. O título de anticorpo foi determinado como sendo a diluição na qual se obtém uma D.O. 0,1.

Grupos de imunização

[136] Os animais foram divididos em grupos (G) de 6 camundongos cada, sendo mantido 3 animais em cada gaiola (Tabela 14). Os camundongos dos grupos G1, G2, G3, G4, G7 e G8 foram imunizados via sublingual, nos dias 0, 7 e 14. Os camundongos dos grupos G5 e G6 foram imunizados via intraperitoneal, nos dias 0 e 14. Foi coletado sangue, via mandibular, nos dias 7, 14 e 28, após a primeira imunização, para titulação de anticorpos totais.
Tabela 14. Grupos de controle de imunização e número de animais utilizados. Os animais foram divididos em grupos (G) de 6 camundongos cada. Os camundongos dos grupos G1, G2, G3, G4, G7 e G8 foram imunizados via sublingual, nos dias 0, 7 e 14. Os camundongos dos grupos G5 e G6 foram imunizados via intraperitoneal, nos dias 0 e 14. Foi coletado sangue, via mandibular, nos dias 7, 14 e 28, após a primeira imunização, para titulação de anticorpos totais.

[137] Após a coleta do soro, esse material biológico e a saliva, com 0,1% de inibidores de proteases, foram armazenados no freezer para análises posteriores de IgG e sIgA.

Análise estatística

[138] Os soros dos camundongos imunizados foram avaliados individualmente e testados em triplicada para titulação de IgG sérica total. O resultado da titulação foi obtido pela determinação da dose efetiva (LEINIKKI e PASSILA 1977), onde o soro positivo foi construído através da inoculação intraperitoneal (Nanopartícula com polissacarídeo e OVA). A vantagem deste método de determinação é ser reprodutivo; suas desvantagens são o trabalho de cálculo e o método incomum de expressar resultado - este método assume o paralelismo da dose resposta.

[139] Para IgA total, o método foi quantitativo, no qual foram determinados, para cada grupo de imunização, a média geométrica e o erro padrão da quantidade de sIgA na saliva.

[140] Comparações entre os camundongos imunizados com o conjugado e os controles foram realizadas por análise de variância (ANOVA fator único), com ferramenta de Bonferrone. A significância estatística estabelecida foi de p < 0,05.

[141] Como resultado, os grupos imunizados apresentaram diferença estatística pela análise de variância do teste IgG sérica. O teste IgG sérica total mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior reatividade no teste de ELISA. Pela comparação múltipla de Bonferrone, o grupo 2 apresentou diferença estatística de todos os outros grupos (valor p=0.0001). O grupo 7 não apresentou diferença significativa em relação ao grupo 3 e o grupo 3 e 7 apresentaram diferença significante com todos os grupos com exceção da diferença entre eles. O grupo 1, 4 e 8 apresentaram resultados esperados, pois não apresentaram título suficiente para reagir com o polissacarídeo. Os grupos 5 e 6 foram utilizados como grupo de controle negativo e positivo respectivamente (figura 20 e Tabela 15).
Tabela 15. Análise estatística de Bonferrone entre os grupos imunizados, avaliando-se o título de anticorpo sérico IgG contra polissacarídeo.

[142] A vacinação sublingual induziu anticorpos sIgA no epitélio das mucosas bucais, que indica que houve estímulo pela vacina nas células do NALT de IgA secretora.

[143] A partir da análise de variância no teste IgA, pode-se verificar diferença estatística entre os grupos. O teste IgA mostrou que o grupo G2 (Nanopartícula com Polissacarídeo e Proteína acoplados) foi o que teve maior produção de IgA, seguidos pelos grupo 7 (nanopartícula acoplado com PS e Proteína)(Figura 21 e Tabela 16).
Tabela 16. Análise estatística ANOVA com ferramenta de Bonferrone entre os grupos imunizados, avaliando-se a concentração de anticorpo secretor sIgA total.

[144] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Processo de obtenção de polissacarídeo capsular de S. agalactiae, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas:

   • a) Cultivo e fermentação da cepa da bactéria S. agalactiae,
   • b) Purificação e extração da cápsula polissacarídica,
   • c) Liofilização e
   • d) Encapsulamento.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa da bactéria S. agalactiae pode ser selecionada de A90 e ATCC 12386.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio de cultivo da referida bactéria é selecionado de BHI e TSB, preferivelmente TSB, e compreende ainda aminoácidos selecionados do grupo de ácido nicotínico, inosina e L-prolina, preferivelmente L-prolina.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a relação de concentração de polissacarídeo (mg/ml) por biomassa (mg) varia de 0,68-1,85.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a relação de concentração de polissacarídeo (mg/ml) por biomassa (mg) é 1,85.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende as etapas de:

   • a) Precipitação do caldo fermentado da etapa a) com detergente catiônico que pode ser de dodecil sulfato de sódio e brometo de cetiltrimetilamônio, preferivelmente brometo de cetiltrimetilamônio e inativação por lise celular,
   • b) Centrifugação por no mínimo 5 minutos a 8.000 rpm ou até separação do precipitado,
   • c) Lavagem do precipitado com cloreto de sódio a 0,9% e descarte do sobrenadante,
   • d) Ressuspensão dos pellets com cloreto de cálcio a 0,9%,
   • e) Concentrado obtido e armazenado a -60°C,
   • f) Descongelamento do concentrado,
   • g) Acréscimo de 20% de NaCl a 2M (p/v) e manutenção sob agitação por no mínimo 1 hora,
   • h) Centrifugação para coleta do sobrenadante e descarte do precipitado na faixa de 3.500 rpm por aproximadamente 30 minutos a 25°Cou até separação do sobrenadante,
   • i) Adição de 9% de papaína (p/v) ao sobrenadante com a homogeneização e manutenção em banho-maria a temperatura aproximada de 60°C por no máximo 24 horas,
   • j) Centrifugação para separação do precipitado do sobrenadante na faixa de 8.000 rpm por 60 minutos a 25°C ou até separação do sobrenadante Descarte do precipitado e coleta do sobrenadante.
   • k) Adição ao sobrenadante de 80% (v/v) de álcool etílico absoluto PA,
   • l) Centrifugação a 8.000 rpm por 60 minutos a 25°C ou até separação do precipitado, com descarte do sobrenadante e coleta do precipitado,
   • m) Ressuspensão do precipitado em água ultrapura,
   • n) Filtragem com filtro a 0,22 μm e
   • o) Liofilização e armazenamento.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa c) foi customizada, em que o polissacarídeo compreende os seguintes parâmetros:

   • a) temperatura de fusão (Tf) de -1,25°C,
   • b) temperatura de transição vítrea (Tg) de -26,61°C,
   • c) temperatura eutética (Te) de -24,54°C e
   • d) temperatura de colapso (Tc) de -33,7°C.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a liofilização compreende o ciclo de congelamento em que a temperatura "Shelf" varia de -40 a -35°C e o ciclo de secagem em que a temperatura "Shelf" varia de -35°C a 15°C.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa d) o encapsulamento é realizado em nanopartículas de quitosana, em que as referidas nanopartículas compreendem quitosana de baixo peso molecular de 50-190 KDa, tripolifosfato de sódio a 85%, ácido acético glacial P.A, cloreto de sódio P.A, polissacarídeo de S. agalactiae e proteína OVA acoplada, água ultrapura e vitamina B9 líquida.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que apresenta uma taxa de encapsulamento de 92,8%.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que apresenta um índice de polidispersão (Pdl) abaixo de 0,3.
12. Polissacarídeo capsular de S. agalactiae obtido de acordo com o processo definido nas reivindicações 1 a 11, caracterizado por compreender 28,38% de rhamnose, 13,19% de manose, 37,5% de glicose, 10,76% de galactose, 1,6% de fucose, 1,15% de N-acetil glucosamina.
13. Antígeno vacinal, caracterizado pelo fato de que compreende o polissacarídeo conforme definido na reivindicação 12.
14. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende o antígeno vacinal conforme definido na reivindicação 13.
15. Uso do antígeno vacinal, conforme definido na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição vacinal para prevenção ou tratamento de uma infecção causada por S. agalactiae.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a composição vacinal é para ser administrada pela via mucosa sublingal.

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