ES2828373T3 - Lipopolisacárido modificado (variantes) de bacterias endotóxicas, combinación de lipopolisacáridos modificados (variantes) y una vacuna (variantes), que los contiene, y una composición farmacéutica (variantes) - Google Patents

Abstract

Un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, en el que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende: a) antígeno de polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas; b) núcleo de oligosacárido; y c) ya sea (i) lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo; o (ii) lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres o cuatro residuos acilo.

Description

DESCRIPCIÓN

Lipopolisacárido modificado (variantes) de bacterias endotóxicas, combinación de lipopolisacáridos modificados (variantes) y una vacuna (variantes), que los contiene, y una composición farmacéutica (variantes)

Campo técnico

La invención se refiere a la inmunología clínica y farmacología, en particular a lipopolisacáridos modificados de bacterias endotóxicas, específicamente Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y sus combinaciones, junto con las vacunas y las composiciones farmacéuticas que las comprenden.

Técnica anterior

Los lipopolisacáridos (LPS) son endotoxinas de bacterias gramnegativas y consisten en polisacáridos (O-PS) y componentes lipídicos.

El componente lipídico, que también se conoce como lípido A, determina las propiedades endotóxicas de los lipopolisacáridos (Rietschel ET, Kirikae T., Schade FU, Ulmer AJ, Holst O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke HD, Kusumoto S. y otros. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 1993, abril; 187(3-5): 169-190). El componente polisacárido del LPS es un polisacárido específico de O, O-PS, compuesto de unidades oligosacáridas repetidas y se conecta al núcleo de oligosacárido, que a su vez se conecta al lípido A. Los LPS compuestos por las tres partes estructurales, O-PS, núcleo y lípido A, se denominan S-LPS porque son característicos de las colonias «lisas» de microorganismos. El O-PS está ausente en la estructura de LPS de algunas bacterias, incluidas las bacterias patógenas. Estos microorganismos forman colonias rugosas en muchos casos y producen LPS de bajo peso molecular, los llamados R-LPS, que contienen solo el núcleo de oligosacárido ligado al lípido A. Se ha demostrado que la estructura única del O-PS determina la inmunoespecificidad del S-LPS y como consecuencia de todo el microorganismo y, en muchos casos, los anticuerpos específicos del S-LPS inducidos en el huésped en respuesta al S-LPS desempeñan un papel clave contra la infección bacteriana y exhiben una alta capacidad protectora.

Sin embargo, es bien sabido que, además de la capacidad de activar la inmunidad adaptativa, los LPS, incluso en dosis mínimas, son muy endotóxicos. En respuesta a la aparición de cantidades importantes de LPS en un macroorganismo, se produce un estado de choque endotóxico, que descarta el uso del LPS como componentes de vacunas y fármacos terapéuticos.

El componente endotóxico del LPS, el lípido A, suele ser un disacárido compuesto por dos residuos de glucosamina fosforilados, cada uno de los cuales está N- y O-acetilado (en las posiciones 3 y 3') por cuatro residuos de ácido 3-hidroximirístico (HMA) que se denominan primarios. Otros dos residuos de ácidos grasos superiores no hidroxilados (típicamente ácidos láurico y mirístico) O-acetilan dos de los residuos de HMA mencionados anteriormente, que se denominan secundarios. Por lo tanto, el llamado lípido A «clásico» consiste en seis (cuatro primarios y dos secundarios) residuos de ácidos grasos superiores (Knirel Yu.A., Valvano M. A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien Nueva York, 2011, 440 págs..).

Se cree que los LPS de microorganismos gramnegativos que no contienen lípido A «clásico» con seis residuos de ácidos grasos superiores, pero que contienen un número menor de residuos de ácidos grasos en el lípido A, tienen un nivel reducido de endotoxicidad.

Se cree que la reducción de la endotoxicidad del S-LPS a niveles clínicamente aceptables con la retención de su capacidad para inducir anticuerpos protectores específicos contra epítopos de polisacáridos, conduce a la posibilidad principal de usar S-LPS modificados de baja endotoxicidad de bacterias endotóxicas, agentes infecciosos reales, como vacunas y medicamentos inmunoprofilácticos.

Los estudios de transformaciones de LPS endotóxicos que contienen lípido A «clásico» para reducir los derivados endotóxicos preparados por procedimientos de desintoxicación química, enzimática y genética se iniciaron hace más de 20 años.

De acuerdo con la Patente de Estados Unidos con núm. 4.912.094, los derivados pentaacetilados de R-LPS (compuestos de lípido A con cinco residuos de ácidos grasos) de bacterias endotóxicas - Salmonella enterica sv minnesota y Escherichia coli, se obtuvieron por hidrólisis alcalina controlada de LPS que dio como resultado la escisión selectiva del ácido p-hidroximirístico, que está conectado al extremo reductor de la glucosamina en la posición 3 mediante un enlace éster. Al mismo tiempo, los datos sobre la reducción de la endotoxicidad del R-LPS modificado eran muy limitados; se observó que la toxicidad disminuyó sólo unas 50 veces en la prueba de toxicidad en embriones de pollo. No se llevaron a cabo pruebas farmacéuticas de reducción de la toxicidad para R-LPS (reacciones secundarias y pruebas de pirogenicidad).

De acuerdo con la Patente de Estados Unidos con núm. 6.482.807, el LPS pentaacetilado con endotoxicidad reducida, se obtuvo por ingeniería genética a partir de la bacteria recombinante genéticamente modificada Neisseria meningitidis al bloquear la producción de la forma hexaacetilada de LPS en la célula. Sin embargo, el LPS así obtenido demostró una reducción insignificante de la endotoxicidad (solo se observó una disminución de 100 veces de la endotoxicidad de acuerdo con los datos de prueba para la producción in vitro de TNF-a). La cepa modificada fue solo 7 veces diferente de la cepa inicial al disminuir la actividad en la prueba LAL. No se presentaron los datos del ensayo pirogénico farmacéutico del producto LPS. El producto se describió como un adyuvante, no como un antígeno de vacuna.

En la actualidad, está claro que el LPS pentaacetilado de bacterias endotóxicas retiene un nivel esencial de endotoxicidad en animales de experimentación y, por lo tanto, no pueden encontrar aplicación clínica como componentes de preparaciones farmacéuticas.

De acuerdo con la Patente de Estados Unidos con núm. 4.929.604, se obtuvieron derivados del componente lipídico del LPS de bacterias endotóxicas, compuestos principalmente de residuos primarios de ácido 3-hidroximirístico con aciloxiacil hidrolasa por el procedimiento de hidrólisis enzimática selectiva. Sin embargo, la eliminación de los ácidos grasos secundarios fue incompleta y solo se eliminó del 80 al 90 % de los ácidos grasos secundarios, incluso mediante el uso del período de tiempo máximo de tratamiento enzimático. Por lo tanto, el producto de este tratamiento enzimático es una mezcla de derivados tetraacilados del LPS (que incluye al lípido A con cuatro residuos de ácidos grasos) con derivados penta y hexaacilados sin reaccionar del LPS (que incluye al lípido A con cinco y seis residuos de ácidos grasos, respectivamente) de Escherichia o Haemofilis o Neisseria. Además, se estudiaron las propiedades inmunobiológicas de la mezcla de derivados tetraacilo con derivados penta y hexaacilados, pero no derivados tetraacetilados puros del LPS. Los resultados del estudio fueron insatisfactorios: sólo se observó una disminución de 20 veces en la actividad de la mezcla de LPS modificado en la prueba LAL en comparación con el LPS inicial. La reducción del nivel de pirogenicidad fue insignificante (solo de 2,5 a 3 veces) calculada por el índice de respuesta térmica en la prueba de pirogenicidad en conejos. En el texto de la patente, la evaluación de la disminución del efecto de sensibilización cutánea del LPS desacetilado máximo en estudio en la reacción de Schwartzman se describió de manera contradictoria (disminuyendo de 10 a 100 veces).

La mezcla de derivados penta y tetraacetilados del R-LPS y S-LPS de las bacterias endotóxicas H. influenzae y B. pertussis también se preparó a partir de cepas genéticamente modificadas mediante la transformación de sus sistemas enzimáticos (US 7,005,129 B1; WO 2006065139 A2).

Sin embargo, la mezcla obtenida del LPS mutante tenía una alta endotoxicidad residual y no puede usarse como inmunógenos potenciales para humanos.

Así, los procedimientos de tratamiento enzimático descritos en las patentes que conducen a la producción de la mezcla de derivados tetra, penta y hexaacilados del LPS de bacterias endotóxicas, no dan como resultado una reducción significativa de la endotoxicidad que impida su aplicación clínica como un componente de preparaciones farmacéuticas.

La técnica anterior muestra que las preparaciones de LPS modificado de bacterias endotóxicas que son derivados pentaacilados o una combinación de derivados tetra, penta y hexaacetilados no cumplen en modo alguno los criterios de seguridad clínica. Aparentemente, esta es la razón por la que los autores de las patentes mencionadas anteriormente no realizaron estudios estándar de inmunogenicidad de preparaciones como vacunas candidatas. La preparación del LPS modificado se consideró principalmente para uso como inmunoestimulantes, y por esta razón, no se llevó a cabo el estudio inmunogénico de las preparaciones y la evaluación de la respuesta inmunitaria frente al dominio del antígeno O del LPS.

Debido al insatisfactorio nivel de seguridad del mencionado LPS modificado, producido por una ineficiente desacetilación del lípido A, esta línea de investigación fue prácticamente abandonada. Por lo tanto, desde finales del siglo pasado no se han obtenido patentes y no se han publicado artículos dedicados a la preparación de otros LPS modificados y, en particular, S-LPS modificados a partir de cepas bacterianas endotóxicas reales (genéticamente no modificadas) y su aplicación como unas vacunas potenciales para administración a humanos. La principal posibilidad de usar derivados di, tri y tetraacetilados del LPS de bacterias endotóxicas como vacunas no estaba a la vista de los investigadores. Esta área nunca antes se había considerado como tema de aplicación práctica específica por parte de los vacunólogos.

Los estudios en el campo del diseño de vacunas clínicamente aplicables se han trasladado a otro paradigma, en particular el uso de elementos de escisión del S-LPS - O-PS, fragmento de O-PS-núcleo con residuos de diglucosamina o lípido A obtenido por desacilación total con hidracina como antígeno específico para la conjugación con portadores de proteínas. (US 7.553.490; Konadu E., Shiloach J., Bryla D.A., Robbins J.B., Szu S.C. Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified lipopolysaccharide of Salmonella paratyphi A bound to tetanus toxoid with emphasis on the role of O-acetyls. Infect. Immun., 1996, julio, 64 (7): 2709-15; Pavliakova D., Moncrief J.S., Lyerly D.M., Schiffman G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies of pneumococcal type 14, Escherichia coli K1 and Shigella flexneri type 2a polysaccharides in mice. Infect. Immun., 2000, abril, 68 (4): 2161-6).

Por lo tanto, la técnica anterior no sugiere los lipopolisacáridos modificados reivindicados, derivados puros di, tri y tetraacetilados del LPS de bacterias endotóxicas, y su aplicación clínica como preparaciones de vacunas directas, ya sea como S-LPS individualmente o como combinaciones de los mismos como sustancias activas de dos y tres componentes.

Información sobre el LPS desacilado de la bacteria Porphyromonas gingivalis: el componente de la microflora de la cavidad oral es indirectamente relevante para los objetos reivindicados. De acuerdo con Estados Unidos. La Patente con núm. 7.622.128, derivados penta, tetra, triacetilados del LPS de P. gingivalis se obtuvieron y se demostró la principal posibilidad de usar derivados pentaacetilados y tetraacetilados como inmunomoduladores compuestos por las composiciones correspondientes. Al mismo tiempo, faltan los datos para caracterizar su nivel de seguridad y la posibilidad de su aplicación clínica.

P. gingivalis produce LPS con endotoxicidad y pirogenicidad bastante bajas (con una capacidad de disminución de 1000 veces para activar citocinas proinflamatorias y con una toxicidad 100 veces menor en el modelo de galactosamina comparado con el lPs de la bacteria endotóxica E. coli), en primer lugar, se explica por las características estructurales del lípido A.

P. gingivalis es un agente de infección local de baja intensidad de la cavidad oral y el uso de su LPS como antígeno protector contra esta infección requiere el desarrollo de enfoques especiales en la vacunación preventiva. (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey T., Seachord C., Ratcliffe K., Bainbridge B., Dietsch M., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, abril, 63 (4): 1311-7; Bainbridge B. y Darveau R. P. Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide: an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System. Acta. Odontol. Scand., 2001, 59:131-8.).

Se demostró que aproximadamente la mitad de los ácidos grasos del lípido A en el LPS de P. gingivalis tenían una estructura inusualmente ramificada y contienen un número impar de átomos de carbono, lo que distingue drásticamente este LPS del LPS de las bacterias endotóxicas que contienen el lípido A «clásico».

Los análogos más cercanos de los objetos reivindicados en la parte del S-LPS modificado de bacterias endotóxicas son únicamente por razones formales las soluciones técnicas de la Patente de Estados Unidos con núm. 4,912,094 y WO 9514026 A1.

En las reivindicaciones de patentes irrazonablemente amplias de estas patentes, la fórmula estructural general se caracteriza por un gran grupo de S-LPS modificado, R-LPS y lípido A modificado de bacterias endotóxicas, mientras que solo los derivados pentaacetilados del R-LPS y lípidos A de S. entérica sv minnesota y E. coli en el primer caso y los derivados triacetilados y tetraacetilados del lípido A de E. coli, Haemophilus influenzae y Pseudomonas aeruginosa en el último caso, prácticamente se obtuvieron y estudiaron para determinar sus propiedades inmunobiológicas.

Los datos en la Patente de Estados Unidos con núm. 4,912,094 se discutieron anteriormente, mientras que la información en WO 9514026 A1 está sujeto a discusión en detalle.

Los derivados triacetilados del lípido A de las bacterias mencionadas anteriormente fueron poderosos inductores de un mediador clave de la reacción de endotoxinas: el TNF-a en vivo, y también de otra citocina proinflamatoria: IL-6 (datos de patente análoga RU 2154068 C2). En el cultivo de PMN in vitro los derivados triacilados del lípido A indujeron una producción de TNF-a incluso mayor en comparación con el LPS de Westphal.

En este sentido, las conclusiones sobre la baja endotoxicidad de las preparaciones de lípido A modificado en base a su baja actividad en la prueba LAL (disminución de 1.000 veces) en el documento WO 9514026 A1 y en las patentes análogas son infundadas. La evaluación de la endotoxicidad del LPS es incompleta solo sobre la base de la prueba LAL in vitro en base a la actividad formadora de gel de la proteína Limulus, que ignora los resultados de la prueba en vivo, que refleja la producción de citocinas proinflamatorias (concentración plasmática, pirogenicidad, reacciones secundarias). No hay datos sobre el nivel de pirogenicidad y, por tanto, sobre la seguridad de los productos obtenidos.

Las publicaciones posteriores de los autores de los documentos indicados demuestran que el lípido A tri y tetraacilado desarrollado como componente de medicamentos inmunitarios contra el cáncer, que tienen endotoxicidad residual esencial y un nivel de seguridad, no son aceptables como medicamentos de vacunas tradicionales (Brandenburg K., Lindner B., Schromm A., Koch M.H.J., Bauer J., Merkli A., Zbaeren C., Davies J.G., Seydel U. Características fisicoquímicas de la estructura parcial de triacil lípido A OM-174 en relación con la actividad biológica. EUR. J. Biochem., 2000, v. 267, págs. 3370-7). El lípido A modificado no se puede utilizar como vacuna (no contiene antígeno bacteriano O-PS) y esto es un problema en términos de su uso como componente adicional - adyuvante debido a la ausencia de datos que apoyen su baja pirogenicidad.

A la luz de lo anterior, hubo resultados absolutamente inesperados del estudio comparativo de la inducción en vivo de la citocina proinflamatoria y del mediador de la reacción de endotoxina - TNF-a por el lípido A triacetilado de E. coli OM-174 y por tanto el S-LPS di, tri y tetraacetilado de bacterias endotóxicas, respectivamente, que se realizó por los autores de la presente solicitud y que se describe en el Ejemplo 1.

A diferencia del lípido A modificado, los S-LPS modificados correspondientes de las bacterias endotóxicas eran malos inductores de choque endotóxico y exhiben baja pirogenicidad y endotoxicidad para animales de laboratorio y sujetos humanos.

Estos resultados originales introducen ciertas correcciones en la visión generalmente aceptada de la contribución del componente polisacárido a las propiedades inmunobiológicas del S-LPS, y también permiten establecer una correlación entre el grado de modificación del LPS de las bacterias endotóxicas y la relación óptima de sus niveles de seguridad e inmunogenicidad, lo que abre las perspectivas de su uso clínico.

Fujimoto y otros (2003) describen los requisitos estructurales para la actividad endotóxica y antagonista de los derivados del lípido A.

Ohto y otros (2012) describen evidencia estructural de la propiedad agonista del lípido IVa en el TLR4/MD-2 de ratón.

4.912.094 de Estados Unidos proporciona lipopolisacáridos modificados que son menos endotóxicos y mantienen sus propiedades antigénicas e inmunoestimulantes.

Li y otros (2011) describen un protocolo de una sola etapa para el aislamiento combinado de fosfolípidos y lípido A de subespecies de Francisella seguida de análisis mediante el uso de espectrometría de masas en tándem de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz. Este análisis mostró que las membranas bacterianas se remodelaron rápidamente para adaptarse a los cambios en las condiciones ambientales de crecimiento y pueden ser importantes para la patogénesis de Francisella.

Divulgación de la invención

El objeto para el que se solicita protección es como el que se define en las reivindicaciones.

La presente invención proporciona un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, en el que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende:

a) antígeno de polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas;

b) núcleo de oligosacárido; y

c) ya sea

(i) lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo; o

(ii) lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres o cuatro residuos acilo.

La presente invención también proporciona una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo.

La presente invención también proporciona una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo, y (c) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo.

La presente invención también proporciona una combinación de lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo. La presente invención también proporciona una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo.

La presente invención también proporciona una composición que contiene el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de la invención o la combinación de lipopolisacáridos modificados de la invención para su uso en el tratamiento o profilaxis del choque séptico o choque endotóxico o en el tratamiento de la influenza o para uso como una vacuna terapéutica o preventiva para infecciones bacterianas o víricas.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de la invención o la combinación de lipopolisacáridos modificados de la invención.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de la invención o la combinación de lipopolisacáridos modificados de la invención. Los objetivos de las invenciones reivindicadas son:

(i) preparación de S-LPS modificado individual puro (libre de impurezas de derivados penta y hexaacilados) de bacterias endotóxicas (derivados di, tri y tetraacilados) y combinaciones de los mismos;

(ii) desarrollo de vacunas y composiciones farmacéuticas sobre la base de los objetos indicados que contienen el S-LPS modificado como monocomponente individual o combinaciones de los mismos como sustancia activa de dos y tres componentes, respectivamente.

Los resultados técnicos, que se proporcionan por las invenciones reivindicadas, son:

(a) alto nivel de seguridad (no hay reacciones a las endotoxinas: escalofríos, fiebre, taquicardia, aumento de la presión arterial cuando se administraron parenteralmente los S-LPS modificados individuales o combinaciones de los mismos a voluntarios en una dosis única de hasta 200 mcg);

(b) baja pirogenicidad (disminución de 1.000 a 10.000 veces de la dosis pirogénica de S-LPS modificado individual y combinaciones de los mismos en la prueba de pirogenicidad en conejo en comparación con el LPS de Westphal clásico; reacción leve, hasta 37.6 °C de temperatura cuando los productos indicados se administraron parenteralmente a voluntarios en una dosis única de hasta 200 mcg);

(c) actividad antichoque (la preadministración de S-LPS modificado individual o combinaciones de los mismos proporciona una tasa de supervivencia del 80 % de los animales que se someten a un choque endotóxico inducido por la administración de una dosis letal de endotoxina; además, la administración de los productos indicados proporciona la corrección del choque séptico y ralentiza el desarrollo de la peritonitis durante 18-30 horas);

(d) alta eficiencia y especificidad (la inmunización de voluntarios y animales de experimentación con el S-LPS modificado individual o combinaciones de los mismos determina la producción de altos niveles de IgG, IgA, IgM específicos de LPS y específicos de antígeno O; seroconversión cuatro veces mayor de anticuerpos y protección animal directa en modelos experimentales de infección);

(e) acción de amplio espectro (desarrollo de vacunas multivalentes combinadas que contienen S-LPS modificado individual o sus combinaciones sobre la base de dos o varios serotipos);

(f) efecto sinérgico observado para las combinaciones de S-LPS modificado con respecto a la reducción de la pirogenicidad y la potenciación de la inmunogenicidad;

(g) buenas características químico-farmacéuticas de los S-LPS modificados individuales, así como sus combinaciones (termoestabilidad, período de almacenamiento prolongado, resistencia ambiental).

Por primera vez, se obtuvieron S-LPS individuales (libres de impurezas de derivados penta y hexaacilados) di, tri y tetraacilados de bacterias endotóxicas y también combinaciones de los mismos y se investigaron sus propiedades inmunobiológicas, físico-químicas, químico-farmacéuticas.

Para aclarar el alcance de las reivindicaciones con respecto a las fuentes de los objetos reivindicados, debemos definir una noción de «bacterias endotóxicas» de los géneros de Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium.

Dichas bacterias deben denominarse cepas de bacterias gramnegativas naturales no modificadas genéticamente, que se obtienen de pacientes con enfermedades infecciosas u otras fuentes ambientales que producen una forma agonista endotóxica de moléculas de LPS, que se caracterizan por una alta toxicidad y pirogenicidad en formas libres o asociadas con células y alto grado de acilación del lípido A (penta o hexaacilado). El curso del proceso infeccioso inducido por cepas endotóxicas de bacterias, productoras activas de LPS endotóxico, se ve afectado por aparentes reacciones de temperatura, fiebre y otros signos del Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS).

Por otro lado, las bacterias gramnegativas, de baja endotoxicidad y de origen natural tienen una endotoxicidad de 100 - 1.000 veces menor. Por lo que requiere de 100 - 1.000 veces más células de bacterias de baja endotoxicidad (Helicobacter pylori, P.gingivalis, Treponema pallidum) en comparación con la cantidad de células de bacterias endotóxicas (E. coli) para lograr el nivel similar de activación de los receptores de células epiteliales, los PMN, el TNF-a, la IL-6. (Darveau R.P., Cunningham M.D., Bailey T., Seachord C., Ratcliffe K., Bainbridge B., Dietsch M., Page R.C., Aruffo A. Capacidad de las bacterias asociadas con la enfermedad inflamatoria crónica para estimular la expresión de E-selectina y promover la adhesión de neutrófilos. Infect. Immun., 1995, abril, 63 (4): 1311-7).

Las bacterias de baja endotoxicidad son libres de virulencia o causan formas de infecciones de las mucosas de baja intensidad, a menudo subclínicas, por eso a menudo se las llama "bacterias invisibles". El LPS de las bacterias de baja endotoxicidad siempre tiene características estructurales que son responsables de su baja endotoxicidad: bajo grado de acilación del lípido A (tri o tetraacilación), forma desfosforilada del lípido A, estructura única de ácidos grasos (Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J. Endotoxin Res., 2001, v.7, págs. 167-202.). Se obtuvo un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Un polisacárido específico de O, que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A totalmente O-desacilado con dos residuos acilo.

El lipopolisacárido reivindicado no tiene menos del 85 % de pureza (Ejemplo 2B), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 2D, 3F), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3F, 4C), y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Un polisacárido específico de O, que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado con tres residuos acilo.

El lipopolisacárido reivindicado no tiene menos del 80 % de pureza (Ejemplo 2B), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 2D, 3C, 3F), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico (Ejemplos 3D) y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos, y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Un polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado con cuatro residuos acilo.

El lipopolisacárido reivindicado no tiene menos del 80 % de pureza (Ejemplo 2B), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 2D), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos, y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo la combinación de lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende derivados diacilados y triacilados en cualquier relación. La combinación reivindicada exhibe un efecto sinérgico con respecto a la potenciación de la inmunogenicidad en comparación con el derivado de lipopolisacárido diacilado (Ejemplo 2D), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 2D), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3C), y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo la combinación de lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende derivados diacilados y tetraacilados en cualquier relación. La combinación reivindicada exhibe un efecto sinérgico con respecto a la mejora de la inmunogenicidad en comparación con el derivado de lipopolisacárido diacilado (Ejemplo 2D), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 2D), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3C), y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo la combinación de lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende derivados triacilados y tetraacilados en cualquier relación. La combinación reivindicada exhibe un efecto sinérgico con respecto a la potenciación de la inmunogenicidad en comparación con el derivado de lipopolisacárido tetraacilado, genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 2D), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos, y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Se obtuvo la combinación de lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende derivados diacilados, triacilados y tetraacilados en cualquier relación. La combinación reivindicada exhibe un efecto sinérgico con respecto a la potenciación de la inmunogenicidad en comparación con los derivados de lipopolisacáridos diacilados y triacilados (Ejemplo 2D, 3F), genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos, 2D, 3F, 3C), tiene actividad antichoque para el choque séptico y/o endotóxico (Ejemplo 3D) y es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3F, 4B, 4C), y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

La vacuna se desarrolló para la profilaxis y/o el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias gramnegativas.

La vacuna reivindicada comprende la cantidad preventiva y/o terapéuticamente efectiva del lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, su derivado diacilado o triacilado, o tetraacilado. La vacuna reivindicada genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3C, 3F), y proporciona profilaxis y/o corrección del curso del choque séptico y/o endotóxico (Ejemplo 3D). En la vacuna reivindicada, los lipopolisacáridos modificados son apirógenos para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 3B).

La vacuna reivindicada puede comprender aditivos farmacéuticamente aceptables, que pueden ser estabilizadores o conservantes del pH, o adyuvantes, o agentes de isotonicidad, o combinaciones de los mismos (Ejemplo 3A). Además, la vacuna puede comprender el lipopolisacárido modificado en forma no conjugada, así como conjugada. Mientras tanto, la vacuna, que se compone por la forma conjugada del lipopolisacárido, contiene adicionalmente una proteína transportadora, a saber, toxoide diftérico o toxoide tetánico, o exoproteína A de P. aeruginosa u otras proteínas (Ejemplo 3H, 3I).

La vacuna reivindicada comprende la cantidad preventiva y/o terapéuticamente efectiva de la combinación de los lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas: derivados diacilados y triacilados o derivados diacilados y tetraacilados, o derivados triacilados y tetraacilados, o derivados diacilados, triacilados y tetraacilados. La vacuna reivindicada genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplos 3C, 3F), y proporciona profilaxis y/o corrección del curso del choque séptico y/o endotóxico (Ejemplo 3D). En las vacunas reivindicadas, las combinaciones de los lipolisacáridos modificados son apirógenas para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 3B).

La vacuna reivindicada puede comprender aditivos farmacéuticamente aceptables, que pueden ser estabilizadores o conservantes del pH, o adyuvantes, o agentes de isotonicidad, o combinaciones de los mismos (Ejemplo 3A). Además, la vacuna puede comprender el lipopolisacárido modificado en forma no conjugada, así como conjugada. Mientras tanto, la vacuna, que se compone por la forma conjugada del lipopolisacárido, contiene adicionalmente una proteína transportadora, a saber, toxoide diftérico o toxoide tetánico, o exoproteína A de P. aeruginosa u otras proteínas (Ejemplo 3G).

Debe señalarse que las vacunas reivindicadas sobre la base del S-LPS individual y combinaciones de los mismos pueden inducir simultáneamente el espectro más amplio de anticuerpos contra varios determinantes de antígenos de diferentes dominios de la molécula de LPS (O-PS, núcleo externo, núcleo interno), que puede considerarse como un factor importante de la eficiencia de la inmunidad protectora. Además, se ha demostrado la posibilidad de desarrollo de una vacuna multivalente en la que cada una de las variantes de la monovacuna contiene un antígeno específico de la cepa de bacterias gramnegativas más epidémicamente significativa (Ejemplo 3I).

La composición farmacéutica se desarrolló al comprender la cantidad efectiva del lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, su derivado diacilado o triacilado, o tetraacilado. La composición farmacéutica reivindicada es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 4C); el lipopolisacárido modificado que contiene en su formulación es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

La composición farmacéutica reivindicada puede comprender aditivos farmacéuticamente aceptables, que pueden ser conservantes o estabilizadores, o disolventes, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica reivindicada tiene una actividad farmacológica de amplio espectro y exhibe notablemente una acción antivírica terapéutica efectiva contra la infección que causa el virus de la influenza A H1N1 (Ejemplo 4B). Además, la composición farmacéutica exhibe un efecto tolerogénico para la corrección de condiciones patológicas, asociado con una mayor producción de citocinas proinflamatorias (Ejemplo 4C).

La composición farmacéutica se desarrolló al comprender la cantidad efectiva de la combinación de los lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas, los derivados diacilados y triacilados o los derivados diacilados y tetraacilados, o los derivados triacilados y tetraacilados, o los derivados diacilados, triacilados y tetraacilados. La composición farmacéutica reivindicada es el modulador de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, que incluye a los humanos (Ejemplo 4B, 4C); las combinaciones de los lipopolisacáridos modificados que contienen en su formulación son apirógenas para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

La composición farmacéutica reivindicada puede comprender aditivos específicos farmacéuticamente aceptables, que pueden ser conservantes o estabilizadores, o disolventes, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica reivindicada tiene una actividad farmacológica de amplio espectro y exhibe notablemente una acción antivírica terapéutica efectiva contra la infección que causa el virus de la influenza A H1N1 (Ejemplo 4B). Además, la composición farmacéutica exhibe un efecto tolerogénico para la corrección de condiciones patológicas, asociado con una mayor producción de citocinas proinflamatorias (Ejemplo 4C).

También debe señalarse que la ventaja indudable de los medicamentos reivindicados (vacunas y composiciones farmacéuticas) en comparación con los medicamentos análogos de otras clases son sus excelentes características químicas y farmacéuticas: termoestabilidad, que se conoce bien para las moléculas de LPS, al proporcionar la posibilidad de su período de almacenamiento prolongado, relativa resistencia ambiental.

En la fabricación de un medicamento también se divulga el uso del lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, su derivado diacilado o triacilado o tetraacilado. Mientras tanto, el lipopolisacárido modificado genera protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de los mismos al inducir una síntesis de anticuerpos IgG, IgA, IgM antibacterianos específicos en mamíferos, incluidos los humanos (Ejemplos 2D, 3C), proporciona profilaxis y/o corrección del curso del choque séptico y endotóxico (Ejemplo 3D), modulador de la respuesta del sistema en mamíferos, incluidos humanos (Ejemplo 4C); y es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2B).

El medicamento está destinado a la administración parenteral, peroral, rectal, intravaginal, transdérmica, sublingual y en aerosol a mamíferos, incluidos los seres humanos.

El uso de las combinaciones de los lipopolisacáridos modificados (S-LPS) de bacterias endotóxicas: derivados diacilados y triacilados o derivados diacilados y tetraacilados, o derivados triacilados y tetraacilados, o diacilados, derivados triacilados y tetraacilados se divulgan en la fabricación de un medicamento.

Mientras tanto, las combinaciones de los polisacáridos modificados generan protección contra Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de ellos al inducir una síntesis de anticuerpos antibacterianos específicos IgG, IgA, IgM en mamíferos, incluidos los humanos (Ejemplos 2D, 3F), proporcionan actividad antichoque para el choque séptico y endotóxico (Ejemplo 3D), son los moduladores de la respuesta del sistema inmunológico en mamíferos, incluidos los seres humanos (Ejemplos 3F, 4B, 4C); y son apirógenos para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

El medicamento está destinado a la administración parenteral, peroral, rectal, intravaginal, transdérmica, sublingual y en aerosol a mamíferos, incluidos los seres humanos.

El uso del lipopolisacárido modificado (S-LPS), su derivado diacilado o triacilado o tetraacilado, se reivindica como vehículo inmunoestimulante en la fabricación de una vacuna contra infecciones bacterianas, virales y de otro tipo.

Mientras tanto, el lipopolisacárido modificado se conjuga con un antígeno protector o hapteno, que preferiblemente

tiene naturaleza sintética o proteica o polisacárido.

El polisacárido modificado es apirógeno para un conejo en una dosis de hasta 100 mcg/kg en la prueba de

pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

El uso de las combinaciones de lipopolisacáridos modificados (S-LPS) - derivados diacilados y triacilados o

derivados diacilados y tetraacilados, o derivados triacilados y tetraacilados, o diacilados, triacilados y los derivados

tetraacilados se reivindican como vehículo inmunoestimulante en la fabricación de una vacuna contra infecciones

bacterianas, virales y de otro tipo.

Mientras tanto, los lipopolisacáridos modificados se conjugan con antígeno protector o hapteno, que preferiblemente

tienen naturaleza sintética o proteica o polisacárida.

Las combinaciones de los lipopolisacáridos modificados son apirógenas para un conejo en una dosis de hasta 100

mcg/kg en la prueba de pirogenicidad en conejo (Ejemplo 2C).

Breve descripción de los dibujos

Las invenciones se ilustran mediante las siguientes figuras.

La figura 1 muestra los gráficos de la producción en vivo de TNF-a, el mediador de la reacción de endotoxina, y

de citoquina proinflamatoria IL-6 en sueros sanguíneos después de la administración intravenosa a los ratones

del lípido A triacilado de E. coli OM174 (A y B) y del LPS de Westphal de E. coli O:111B4 (C) en base a los datos

de la patente RU 2154068. En este caso, el eje vertical representa los valores para las concentraciones de TNF-a (pg/mL) y los valores para las concentraciones de IL-6 (ng/mL). El eje horizontal (A y B) representa los valores

para la dosis de inyección de la preparación OM174 (mg/kg) a los ratones. El eje vertical (C) representa el valor

de la dosis de inyección de LPS (mg/ml; control positivo) y solución salina (solución de NaCl al 0,85 %; control

negativo) a los ratones.

Las líneas continuas representan las líneas de extrapolación de los valores de las dosis para OM174: 0,20; 2,00;

2,01; 3,40 y 28,10 (A y B) y los valores de las dosis para el LPS de Westphal de E. coli O:111B4: 0,002; 0,020;

0,200 y 2,000 (C).

La figura 2 muestra el espectro de 13C-NMR del 2a S-LPS desacilado de S. flexneri.

La figura 3 muestra las fotografías de las trazas de tinción de plata obtenidas después de SDS-PAGE para las

muestras del LPS de Westphal original (A) y el S-LPS modificado (B) de S. flexneri 2a (1A, 1B), E. coli O:55 (2A,

2B), K. pneumoniae (3A, 3B), S. enterica sv typhi O:901 (4A, 4B).

La figura 4 muestra el espectro de masas ESI-MS del lípido A obtenido del S-LPS diacilado de S. flexn La figura 5 muestra el espectro de masas ESI-MS del lípido A obtenido del S-LPS triacilado de S. flexn La figura 6 muestra el espectro de masas ESI-MS del lípido A obtenido del S-LPS tetraacilado de S. fle La figura 7 muestra el espectro de 13C-NMR del S-LPS pre desacilado de S. enterica sv typhi O: 901.

La figura 8 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización

primaria (A) y secundaria (B) de ratones con preparaciones hechas con 2-acLPS, 3-acLPS 4-acLPS S. flexneri

2a, y también combinaciones de los mismos (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS), (3-acLPS+4-acLPS), (2-acLPS+3-acLPS) y (2-acLPS+4-acLPS) con relación de masa del componente 1:1:1, 3:1, 1:1 y 3:1, respectivamente, y la

preparación hecha con Westphal LPS S. flexneri 2a, a una dosis de 25 mcg por ratón. El eje vertical representa

el valor de la dilución del suero del título.

La figura 9 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización

primaria (A) y secundaria (B) de ratones con preparaciones hechas con 2-acLPS, 3-acLPS 4-acLPS S. enterica

sv typhi O:901, y también combinaciones de los mismos (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS), (3-acLPS+4-acLPS), (2-acLPS+3-acLPS) y (2-acLPS+4-acLPS ) con relación de masa de componentes 1:1:1, 3:1, 1:1 y 3:1,

respectivamente, y la preparación hecha con Westphal LPS S. enterica sv typhi O:901, a una dosis de 25 mcg

por ratón. El eje vertical representa el valor de la dilución del suero del título.

La figura 10 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización

primaria (A) y secundaria (B) de ratones con preparaciones hechas con 2-acLPS y 3-acLPS. K. pneumoniae, y

también combinaciones de los mismos (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) con relación de masa de componentes

1:1:1, y preparación hecha con Westphal LPS K. pneumoniae, a una dosis de 25 mcg por ratón. El eje vertical

representa el valor de la dilución del suero del título.

La figura 11 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización

primaria (A) y secundaria (B) de ratones con preparaciones hechas con 2-acLPS, 3-acLPS y 4-acLPS E. coli

O:55, y también combinaciones de los mismos (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS), (3-acLPS+4-acLPS), (2-acLPS+3-acLPS) y (2-acLPS+4-acLPS ) con relación de masa de componentes 1:1:1, 3:1, 1:1 3:1, respectivamente, y la

preparación hecha con Westphal LPS E. coli O:55, a una dosis de 25 mcg por ratón. El eje vertical representa el

valor de la dilución del suero del título.

La figura 12 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización

primaria (A) y secundaria (B) de ratones con conjugaciones hechas con antígeno Vi y toxoide tetánico (TT) con

portador inmunoestimulante - la combinación de (2- acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. enterica sv typhi O:901 con

una relación de masa de componentes 1:1:1, y también antígeno Vi puro y TT, a una dosis de 25 mcg de polisacárido o 20 mcg de proteína por ratón. El eje vertical representa el valor de la dilución del suero del título. La figura 13 muestra los diagramas de producción de anticuerpos IgG (día 15) después de la inmunización primaria (A) y secundaria (B) de ratones con la vacuna multivalente de disentería-tifoidea-escherichia a una dosis de 100 mcg por ratón, y también componentes individuales de la misma. combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa 1:1:1, S. flexneri 2a o S. sonnei, o S. entérica sv typhi O:901, o E. coli O:55, a una dosis de 25 mcg por ratón. El eje vertical representa el valor de la dilución del suero del título.

La figura 14 muestra gráficos de las tasas de supervivencia de dos grupos de ratones, infectados con una dosis de LD100 de la cepa virulenta de influenza A subtipo H1N1.

Realizaciones preferentes

Ejemplo 1.

En vivo inducción de TNF-a el mediador de la reacción de endotoxina después de la administración intravenosa (iv) del S-LPS modificado y los lípidos A modificados de bacterias endotóxicas a los ratones de acuerdo con los datos de la patente RU 2154068, lípidos A triacilados y tetraacilados de E. coli, H. influenzae y P. aeruginosa son potentes inductores del mediador de la reacción de endotoxina-TNF-a. La tabla 1 representa los datos extrapolados de los gráficos de la figura 1 (A, B, C) relacionados con la producción in vivo de TNF-a en suero después de la administración iv de lípido A triacilado (3-acLA) de E. coli OM-174 y Westphal LPS E. coli O:111B4 a los ratones. Solo se detectó una diferencia de 10 veces para la inducción de TNF-a en vivo Entre E. coli Lípido A triacilado OM-174 y endotoxina Westphal LPS disponible comercialmente E. coli O: 111 B4, es evidencia de que existe endotoxicidad esencial del lípido A triacetilado de E. coli, excluyendo su uso como vacuna o como componente de vacuna (adyuvante).

Tabla 1

El estudio comparativo de la inducción en vivo de TNF-a, el mediador de la reacción de endotoxina, después de la administración intravenosa del S-LPS diacilado (2-acLPS), S-LPS triacilado (3-acLPS), S-LPS tetraacilado (4-acLPS) y los correspondientes lípidos A diacilados (2-acLA), lípidos A triacilados (3-acLA), lípidos A tetraacilados (4-acLA), obtenidos de enterobacterias reales S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901, E. coli O:55, K. pneumoniae, ha revelado diferencias significativas en la concentración de citocinas en sueros animales. Los datos obtenidos se proporcionan en la Tabla 2, en este caso el S-LPS modificado y los lípidos de las bacterias mencionadas se obtuvieron según el Ejemplo 2A. La cantidad de TNF-a se determinó en sueros de ratón mediante el uso del sistema de prueba Quantikine Mouse TNF-a/TNFSF1A (R&D Systems, EE. UU.) mediante ELISA de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante. Se tomaron muestras de sangre de suero animal 90 minutos después de la administración.

Los datos presentados en la Tabla 2 demuestran que, en contraste con los lípidos A modificados, los S-LPS modificados correspondientes a las enterobacterias son malos inductores de TNF-a, el mediador del choque endotóxico, y pueden usarse como preparaciones de vacunas.

Tabla 2

Ejemplo 2

Preparación y características de los S-LPS modificados individuales de bacterias endotóxicas y combinaciones de los mismos.

A. Preparación de los S-LPS modificados individuales de bacterias endotóxicas y combinaciones de los mismos

El cultivo bacteriano de S. flexneri 2a se preparó en medio líquido mediante cultivo profundo. La separación de las células bacterianas de la fase líquida se realizó mediante centrifugación de flujo. Las células húmedas obtenidas se lavaron primero con solución salina, luego con agua y luego se liofilizaron.

Se extrajeron 20 g de células bacterianas secas por el procedimiento de Westphal (Westphal O., Luderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien. Angew. Chemie., 1954, vol. 66, págs.

407-17) con fenol acuoso al 45 % caliente de 68-70 °C; Se obtuvieron 960 mg de LPS crudo a partir de la fase acuosa seguida de diálisis y liofilización sucesivas y luego se volvió a disolver en una solución tampón TRIS 0,05 M, pH = 7,2, que contenía CaCl2 y MgCl2 al 0,01 % (p/p), se añadió RNAsa y DNAsa a una concentración de 100 mcg/mL y 10 mcg/mL, respectivamente, y después de 16 horas de agitación a 37 °C, la mezcla de reacción se trató con proteinasa K (20 mcg/mL) durante 2 horas a 55 °C. La solución resultante se dializó mediante el uso de la instalación Vladisart para la ultrafiltración con el límite de paso de la membrana de 50 kDa.

La solución dializada se concentró y luego se liofilizó para dar 530 mg de LPS aislado, que contenía no más del 2 % (p/p) de proteína, determinado por el procedimiento de Bradford (Bradford MM Un procedimiento rápido y sensible para la cuantificación de cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión proteína-colorante. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, págs.248-54), y no más del 2 % (p/p) de ácido nucleico, determinado por el procedimiento Spirin (Spirin AS A.S. Spectrophotometric determination of the total amount of nucleic acids. Biochemistry, 1958, v. 23, núm. 4, pág. 656).

El LPS preparado se caracterizó por los datos de SDS-PAGE, que demostraron la imagen «clásica» de un conjunto de bandas correctamente alternas, cada una de ellas correspondía a una molécula de S-LPS con un número definido de unidades repetidas en la cadena de polisacárido específica de O, además de la más rápida La zona migratoria (la más baja) correspondió a R-LPS (Figura 31A).

LPS aislado de células bacterianas secas S. flexnerí 2a se disolvió en amoniaco acuoso, la solución obtenida se agitó en una placa magnética y luego se enfrió de 5 - 10 °C. La mezcla de reacción se neutralizó con ácido clorhídrico al 10 %; la solución obtenida se vertió en un volumen de etanol de 8-10 veces con agitación, la precipitación se separó por centrifugación y luego el procedimiento de precipitación se repitió dos veces, el precipitado obtenido se disolvió en alcohol y luego la solución obtenida se liofilizó. Por lo tanto, se obtuvo S-LPS parcialmente desacetilado puro, lo que se demostró mediante datos de electroforesis (Figura 3; 1A). Se preparó S-LPS parcialmente desacilado compuesto de residuos de ácidos grasos di-, tri- o tetra (derivados di, tri y tetraacilados - 2-acLPS, 3-acLPS y 4-acLPS) en el componente lipídico variando la condición de degradación alcalina de S. flexnerí 2a LPS, en particular, la temperatura y el tiempo de reacción de saponificación y también la concentración de hidróxido de amoníaco.

B. Estructura, composición y propiedades físico-químicas de los S-LPS modificados individuales

Los datos sobre la composición de ácidos grasos se obtuvieron en base al análisis del lípido A de cada S-LPS extraído de cada S-LPS mediante hidrólisis suave (AcOH al 1 %, 100 grados, 1 hora).

Las figuras 4, 5 y 6 representan espectros de masas típicos de lípidos A, preparados a partir de S-LPS desacilado S. flexnerí 2a. Las señales características en los espectros de masas son m/z 871, 1053 y 1279 (excluidas las contribuciones de m/z). Estas señales principales en cada espectro corresponden a derivados di (Figura 4), tri (Figura 5) y tetraacilados (Figura 6) del lípido A, respectivamente. Es necesario notar una ausencia total de señales de derivados penta y hexaacilados (m/z 1506 y 1716 respectivamente) en los espectros de masas de los lípidos A desacilados, cuya intensidad fue muy alta en los espectros del lípido A desde el S-LPS inicial.

Para la evaluación de la relación entre los componentes mayoritarios y secundarios/minoritarios en los productos obtenidos de S-LPS desacilado, se midió la intensidad de las señales correspondientes en los espectros de masas. Se tuvo en cuenta la intensidad de los picos correspondientes no solo a los derivados mono y difosforilados. En el caso de S-LPS diacilado, el contenido de la sustancia principal fue del 91 % (p/p), en el caso del triacilado, 85 % (p/p), y en el caso del tetraacilado, 88 % (p/p). Se realizó espectrometría de masas de alta resolución con ionización por electropulverización y detección de iones mediante resonancia ion-ciclotrón en un espectrómetro Bruker Daltonics, modelo Apex II, con imán 7 (Tesla).

Además, el análisis de LPS y S-LPS parcialmente desacilado obtenido se llevó a cabo mediante espectros de 13C-NMR. La espectroscopía de 13C-RMN se realizó mediante el espectrómetro Bruker, modelo DRX-500, con el software XWINNMR y secuencias de impulsos del fabricante. El registro de espectros se realizó en D2O (99: 95 %) con acetona como estándar (31,5 ppm). La comparación de los espectros de 13C-NMR del S-LPS inicial y parcialmente desacilado mostró su identidad completa, excepto la señal amplia, correspondiente a los residuos de metileno de ácido graso del lípido A en la región de 30-34 ppm, cuya intensidad integral se redujo significativamente en espectros de S-LPS obtenidos después de la degradación alcalina. Además, el análisis comparativo de los espectros de RMN de 13C demuestra que no hay cambios en la estructura primaria de las unidades de repetición O-PS durante la modificación (desacilación) de LPS.

La Figura 2 muestra el espectro de 13C-NMR representativo de S-LPS diacilado de S. flexneri 2a, en el que el espectro de la región que pertenece al componente polisacárido es completamente idéntico al espectro de O-PS aislado del correspondiente S-LPS no modificado. Coincidencia completa de los datos espectrales obtenidos con los datos de la literatura (Andrei V. Perepelov, Vyacheslav L. L'vov, Bin Liu, Sofya N. Senchenkova, Maria E. Shekht, Alexander S. Shashkov, Lu Feng, Petr G. Aparin, Lei Wang, Yuriy A. Knirel. A similarity in the O-acetylation pattern of the Oantigens of Shigella flexneri types 1a, 1b, 2a. Carbohydr. Res., 2009, vol. 344, págs. 687-92) indica que el producto preparado es S-LPS desacilado con cadenas largas de O-PS, porque no hay señales que pertenezcan al núcleo de oligosacáridos en el espectro.

El contenido de proteínas y ácidos nucleicos en las preparaciones obtenidas no superó el 1 % (p/p). El S-LPS nativo se extrae de células bacterianas secas S. enteríca sv typhí o E. colí O:55 mediante el procedimiento mencionado anteriormente (Ejemplo 2A) y luego se sometió a tratamiento alcalino para obtener S-LPS preacilado, a partir del cual se aislaron adicionalmente sus di, tri, tetraacilados individuales. Espectro de 13C-NMR de S-LPS predesacilado S. enteríca sv typhí se repite en la Figura7. S-LPS individuales di, tri y tetraacilados de la bacteria K. pneumoníae se extrajeron de una muestra comercialmente disponible de S-PLS de bacterias K. pneumoníae (Sigma L4288) por el mismo enfoque. Los datos de electroforesis (Figura3, 2A - 4B) muestran que los productos son S-LPS, aislados de S. enteríca sv typhí O:901, K. pneumoníae, E. colí O:55.

Las sustancias liofilizadas se obtuvieron antes para el estudio de las propiedades inmunobiológicas de combinaciones de S-LPS desacilado de bacterias endotóxicas. La sustancia de la combinación de dos componentes se preparó mediante la disolución de 2-acLPS y 3-acLPS; 2-acLPS y 4-acLPS; 3-acLPS y 4-acLPS en la relación de masa requerida en agua apirógena, y luego se liofilizó la solución obtenida. La sustancia de la combinación de tres componentes se preparó que contenía 2-acLPS, 3-acLPS y 4-acLPS en una relación de masa 1:1:1 de manera similar.

C. Pirogenicidad de S-LPS modificados individuales y combinaciones de los mismos.

El nivel de endotoxicidad bajo y clínicamente aplicable de la preparación de SLPS desacilados individuales de bacterias endotóxicas y combinaciones de los mismos se demostró mediante estudios especiales de pirogenicidad en animales de experimentación. en vivo y mediante estudios clínicos de pirogenicidad y seguridad. Pirogenicidad de preparaciones de S-LPS modificados individuales - 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS y combinaciones de los mismos -(2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS), (3-acLPS+4-acLPS), ( 2-acLPS+3-acLPS), (2-acLPS+4-acLPS) de S flexneri 2a, S. entérica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli O:55 bacterias, y también LPS, obtenido de S. flexneri 2a por el procedimiento clásico de Westphal se determinó en comparación con la vacuna comercial de antígeno Vi. La prueba se realizó en conejos Chinchilla que pesaban entre 2,8 y 3,05 kg de acuerdo con los requisitos de la Farmacopea Europea (Farmacopea europea, 7ma edición, julio de 2010, págs. 162-163) y los requisitos del Reglamento Técnico de la OMS para las vacunas de polisacáridos Vi (Requisitos para la vacuna contra la fiebre tifoidea de polisacárido Vi. Serie de Informes Técnicos de la OMS No 840, 1994, Anexo 1). Después de la administración intravenosa de cada preparación, se midió la temperatura rectal del conejo tres veces a intervalos de 1 hora. Se consideró que un fármaco era apirógeno si el aumento total de la temperatura no excedía 1,15 °C. Los resultados de la prueba se dan en la Tabla 3. 2-acLPS S flexneri 2a y S enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli O:55 son preparaciones altamente apirógenas. En la prueba de pirogenicidad en conejo, las dosis apirógenas de administración fueron 34, 21, 37 y 14 mcg/kg respectivamente. Para el derivado de S-LPS diacilado, el parámetro de pirogenicidad excede en gran medida los requisitos del Comité de Expertos de la OMS para la vacuna de polisacárido Hib (Recomendaciones para la producción y control de vacunas conjugadas contra Haemophilus influenzae tipo b. Serie de Informes Técnicos de la OMS, No 897, 2000). 3-acLPS también es un producto apirógeno. Dosis apirógenas de administración de 3-acLPS S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli O:55 eran 0,2; 0,1; 0,1 y 0,1 mcg/kg respectivamente. Por tanto, la reducción de la toxicidad de 3-acLPS excede los parámetros correspondientes para 4-acLPS, sin embargo es inferior a 2-acLPS de acuerdo con el grado de desintoxicación.

Tabla 3

(continuación)

El parámetro de pirogenicidad de 3-acLPS cumple con los requisitos del Comité de Expertos de la OMS para la vacuna polisacárida Hib. Las preparaciones 4-acLPS S. flexneri 2a y S. entérica sv typhi O:901, son moderadamente apirógenas; dosis de las mismas de hasta 0,025 mcg/kg son apirógenas cuando se administran por vía intravenosa. Las combinaciones de tres componentes de S-LPS desacilado individual (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de las bacterias S. flexneri 2a y S. entérica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli O:55, en una relación de masa de componentes de 1:1:1, han mostrado una pirogenicidad baja en la prueba de pirogenicidad en conejos. Las dosis de las combinaciones mencionadas de hasta 0,6 mcg/kg de peso de conejo son apirógenas cuando se administran por vía intravenosa. La evaluación comparativa del parámetro más sensible de la reducción en vivo de la endotoxicidad (pirogenicidad) demuestra la ventaja de la combinación de tres componentes en comparación con 3-acLPS y 4-acLPS que son componentes de esta combinación. El efecto sinérgico de su acción antipirógena se observa en la relación de masas dada: la mezcla del 2-acLPS menos pirógeno con los 3-acLPS y 4-acLPS más pirógenos, atenúa aproximadamente de 3-5 veces la endotoxicidad residual y da como resultado un aumento de la dosis apirógena en las combinaciones, en particular hasta 8 veces en el caso de 4-acLPS. Cabe señalar que esta combinación de tres componentes ha proporcionado un efecto sinérgico razonablemente aparente en cualquier relación de masa de los componentes que contienen en la composición, en particular, en la siguiente relación de masa: (45:45:10); (45:10:45); (10:45:45). Combinaciones de dos componentes de S-LPS desacilado individuales - (2-acLPS+3-acLPS), (2-acLPS+4-acLPS) y (3-acLPS+4-acLPS) de S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli Las bacterias O:55 también han exhibido la interacción sinérgica de los componentes con respecto a la reducción de la endotoxicidad residual de 3-acLPS o 4-acLPS en cualquier relación de masa de los componentes que contienen las composiciones. Sin embargo, las combinaciones de dos componentes de (2-acLPS+3-acLPS) y (2-acLPS+4-acLPS) que contienen 2-acLPS no menos de la mitad del peso total (Tabla 3) tienen un efecto sinérgico máximo, que permite admitirlos. el más prometedor en términos de seguridad. Entonces, la combinación de (2-acLPS+3-acLPS) S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi O:901 en una relación de masa de componentes 1:1 ha mostrado una pirogenicidad baja (la administración de dosis a conejos es de 1.0 y 0.5 mcg/kg respectivamente), y la combinación de (2-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa de componentes 3:1 tiene resultados comparables nivel de pirogenicidad. La dosis apirógena específica de 3-acLPS en combinación de dos componentes aumenta de 3 a 5 veces, y de 4-acLPS, hasta dos veces.

D. La inmunogenicidad del S-LPS modificado individual y combinaciones de los mismos

Se inmunizaron por vía intraperitoneal (i.p.) dos grupos de ratones F1 (CBAXC57B1/6) con preparaciones del S-LPS modificado individualmente: 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS y combinaciones- (2-acLPS+3-acLPS+4 -acLPS) en relación de masa de componentes 1:1:1, (3-acLPS+4-acLPS) en relación de masa de componentes 3: 2, (2-acLPS+3-acLPS) en relación de masa de componentes 1:1, (2- acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 3:1 de S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli O:55 bacterias, y también con LPS, obtenido a partir de las bacterias antes mencionadas por el procedimiento clásico de Westphal a una dosis de 25 mcg por ratón.

El día 15 después de la inmunización, se tomaron muestras de sueros de sangre animal para evaluar los niveles de anticuerpos IgG específicos de S-LPS mediante el procedimiento ELISA. Se utilizaron LPS con serotipos O relevantes para la adsorción en microplacas. Para estudiar la respuesta inmunitaria secundaria, los mismos grupos de ratones fueron inmunizados nuevamente a una dosis de 25 mcg por ratón un mes después de la inyección primaria. El día 15 después de la inmunización secundaria se tomaron nuevamente muestras de sueros sanguíneos. Los resultados obtenidos muestran que el derivado diacilado de S-LPS de S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli La bacteria O:55 es menos inmunogénica que los derivados tri y tetraacilados e induce una baja respuesta inmunitaria primaria en animales de laboratorio (Figura 8A, 9A, 11A). Además, derivado diacilado de K. pneumoniae induce la respuesta inmunitaria primaria más alta (Figura 10A). Nivel de la respuesta inmunitaria secundaria de IgG en animales de laboratorio después de la inmunización con 2-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901 y E coli O:55 fue significativamente mayor en comparación con la respuesta inmunitaria primaria, sin embargo, fue menor en 8,0; 8,0 y 7,4 veces en comparación con la respuesta inmunitaria secundaria al 3-acLPS y fue menor en 12,0; 11,7 y 10,2 veces en comparación con la respuesta inmunitaria secundaria a 4-acLPS, aislado de bacterias homológicas (Figura 8B, 9B, 11B). Al mismo tiempo, la respuesta inmunitaria secundaria de IgG al 2-acLPS K. pneumoniae se diferenció sólo en 2,4 veces en comparación con los del 3-acLPS (Figura 10B).

Los niveles de producción de anticuerpos IgG en la respuesta primaria al 3-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901 y E. coli O:55 fueron menores en 3,0; 1,1 y 3,4 veces, respectivamente, en comparación con la respuesta primaria al 4-acLPS con el serotipo relevante (Figura 8A, 9A, 11A). La respuesta inmunitaria secundaria después de la inmunización de animales de laboratorio con 3-acLPS S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901 y E. coli O:55 fue alto (el título de anticuerpos excedió 1600, 4000, 1800), pero al mismo tiempo fue ligeramente menor en comparación con la respuesta a 4-acLPS con el serotipo relevante (Figura 8B, 9B, 11B). 4-ACLPS S. flexneri 2a, S enterica sv typhi O:901 y E. coli O:55 indujo la respuesta inmunitaria primaria en animales de laboratorio en 3,0; 1,1 y 3,4 veces mayor en comparación con los del 3-acLPS (Figura 8A, 9A, 11A). El nivel de respuesta inmunitaria secundaria después de la inmunización de animales de laboratorio con 4-acLPS fue de 1,4; 1,5 y 1,2 veces mayor en comparación con los de 3-acLPS con serotipo relevante (Figura 8B, 9B, 1B). Una inmunogenicidad ligeramente mayor del antígeno 4-acLPS aparentemente causada por un alto grado de acilación de su lípido A y, por lo tanto, tiene la capacidad pronunciada para formar agregados en comparación con el otro S-LPS modificado, especialmente en comparación con 2-acLPS.

Las combinaciones de S-LPS modificadas individuales de bacterias endotóxicas demuestran un alto potencial inmunogénico a pesar de la modificación esencial de la estructura canónica de su dominio de lípido A. Entonces, la combinación de tres componentes (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) indujo la respuesta inmunitaria primaria al antígeno O de S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi, K. pneumoniae, E. coli O:55 a una relación de masa de componentes 1:1:1, el nivel del cual era bastante alto y no difería significativamente del nivel de respuesta al LPS de Westphal clásico, obtenido de la cepa bacteriana relevante (Figura 8A, 9A, 11A). Por lo tanto, se determinó que los potenciales inmunogénicos de inmunógeno S-LPS modificado de baja endotóxicos y LPS endotóxicos y pirogénicos, preparados por el procedimiento de Westphal, eran aproximadamente iguales, lo que indica que la combinación consiste en asociados especiales altamente inmunogénicos con diferente grado de acilación. de S-LPS modificado que proporcionó el efecto sinérgico para mejorar sus propiedades inmunogénicas.

Entonces, combinaciones de tres componentes de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. flexneri 2a, S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae y E. coli O:55 bacterias indujeron la respuesta inmunitaria secundaria de IgG a una relación de masa de componentes 1:1:1 después de la inmunización de animales de laboratorio, que fue 32,0; 33,6; 8,0 y 32,0 veces mayor en comparación con la respuesta al 2-acLPS; fue 4,0; 4,2; 3,3 y 4,3 veces mayor en comparación con la respuesta al 3-acLPS y fue de 2,7; 2,8; y 3,1 veces mayor en comparación con la respuesta al 4-acLPS (Figura 8B, 9B, 11B). Al mismo tiempo, la dosis administrada del S-LPS modificado individual en la composición de estas combinaciones es sólo el 33 % (p/p) de la dosis administrada como un monocomponente apropiado. Cabe señalar que esta combinación de tres componentes de S-LPS proporcionó un efecto sinérgico más o menos pronunciado dirigido al aumento de la inmunogenicidad en cualquier relación de masa de componentes, particularmente, en la siguiente relación de masa: (10:45:45); (45:10:45); (45:45:10).

Combinaciones de dos componentes del S-LPS modificado individualmente -(2-acLPS+3-acLPS), (2-acLPS+4-acLPS) y (3-acLPS+4-acLPS) de S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi O:901, K. pneumoniae, E. coli Las bacterias O:55 también exhiben la interacción sinérgica con respecto al aumento de la inmunogenicidad en cualquier relación de masa de los componentes que las contienen. Además, la respuesta inmunitaria secundaria más alta a los antígenos O de Salmonella o Shigella fue inducida por las combinaciones de (2-acLPS+3-acLPS) en una relación de masa de componentes 1:1, (3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa de componentes 3:1 y (2-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 3:1. Por lo tanto, el nivel de respuesta de IgG fue el más alto para la combinación (3-acLPS+4-acLPS) en la relación de masa del componente 3:1 de S. flexneri 2a y para la combinación (2-acLPS+3-acLPS) en la relación de masa del componente 1:1 de S. enterica sv typhi O:901 (Figura 8B, 9B). Cabe señalar que la combinación de tres componentes proporciona un efecto sinérgico más pronunciado en comparación con la combinación de dos componentes. Por lo tanto, se determinaron niveles de respuesta de IgG ligeramente más altos después de la inmunización con combinación de tres componentes en el estudio de inmunogenicidad comparativo de la combinación de tres componentes de S. flexneri 2a y S. enterica sv typhi Bacterias O:901 en una relación de masa de componentes 1:1:1 y combinaciones de dos componentes homólogos de bajo pirógeno de antígenos O de (2-acLPS+3-acLPS), (3-acLPS+4-acLPS) y (2- acLPS+4-acLPS) a una relación de masa del componente 1:1, 3:13:1, respectivamente (Figura 8A, 9A).

Por tanto, la inmunogenicidad de las combinaciones del S-LPS modificado se determina mediante la composición, la cantidad y la relación de masa de los componentes. La combinación de tres componentes puede considerarse la combinación más eficaz. Mientras tanto, la inmunogenicidad de las combinaciones del S-LPS modificado también está definida por la estructura (serotipo) del antígeno O de las enterobacterias. Para el número de serotipos, el elevado aumento de los anticuerpos IgG se puede lograr también utilizando combinaciones de dos componentes de bajo pirógeno del S-LPS modificado.

Ejemplo 3

Vacunas que contienen S-LPS modificado de bacterias endotóxicas y combinaciones de los mismos

A. Uso del S-LPS modificado y combinaciones de los mismos en la fabricación de la vacuna no conjugada (medicamento)

La preparación de la vacuna no conjugada incluye la síntesis de los derivados di, tri y tetraacilados individuales de S-LPS y combinaciones según los Ejemplos 2A, 2B y el posterior llenado aséptico de viales o jeringas con una solución que contiene la sustancia activa y farmacéuticamente aceptable. aditivos especiales, que pueden ser estabilizadores de pH, conservantes, adyuvantes, agentes de isotonicidad o combinaciones de los mismos. La dosis de vacunación contiene: forma no conjugada del S-LPS modificado o una combinación de formas no conjugadas del S-LPS modificado en una cantidad de 0,010 mg a 10 mg; fenol (conservante), no más de 0,75 mg, con adición de cloruro de sodio, 4,150 mg, fosfato de sodio dibásico, 0,052 mg y fosfato de sodio monobásico, 0,017 mg; agua para inyección estéril libre de pirógenos: 0,5 ml (PA 42-2620-97, EP iV 2002).

B. Pirogenicidad de la vacuna no conjugada

Pirogenicidad de la vacuna que contiene 2-acLPS, 3-acLPS, combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 1:1:1, S. flexneri 2a; 2-acLPS, 3-acLPS, combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa de componentes 1:1:1, S. enterica sv typhi O:901 se determinó y se comparó con la pirogenicidad del comercial Vacuna de antígeno Vi. Todas las preparaciones de vacuna administradas fueron apirógenas a una dosis de 0,050 mcg/kg por peso de conejo. Los resultados de la prueba se proporcionan en la Tabla 4.

Tabla 4

C. Propiedades protectoras de la vacuna no conjugada

La evaluación de las propiedades protectoras de las vacunas que contienen la combinación del S-LPS modificado se realizó en modelos experimentales de la disentería (Prueba de Sereny; Sereny B. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol., Acad.Sci. Hung., 1962, v.9, págs. 55-60) e infección tifoidea (prueba de protección activa del ratón).

Para estudiar la formación de la inmunidad protectora de la mucosa contra shigella en cobayas, se inmunizaron dos veces animales de laboratorio que pesaban de 200-250 g con un intervalo de 10 días por vía subcutánea (s.c.) en la región posterior con la vacuna, que incluye el 3-acLPS o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa 1:1:1 o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS) en una relación de masa de 3:1 de S. flexneri 2a en las dosis de 25 y 50 mcg por animal. Los animales de control recibieron solución salina en lugar de la preparación de vacuna. Diez días después de la última inmunización, se indujo queratoconjuntivitis disentería (prueba de Sereny) en los animales experimentales y de control mediante la introducción en la suspensión de células de la conjuntiva ocular de cepa virulenta de S. flexneri 2a a una dosis cercana al ID100 (109 células), y en una dosis cercana a la 2ID100 (2x109 células), en 30 mcL de solución salina estéril. Todos los animales del grupo de control, infectados con una dosis de 2x109 células, y el 90 % de los animales en el grupo de control, infectados con una dosis de 109 células, desarrollaron queratoconjuntivitis disentería (Tabla 5).

Inmunización con vacuna, incluida la combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. flexneri 2a en una relación de masa 1:1:1, a una dosis de 25 mcg, proporcionó una tasa de protección ocular en el 75 % de los animales de experimentación infectados con una dosis de 109 células; La tasa de protección ocular fue del 60 % cuando se infectaron a una dosis de 2x109 células. La inmunización con vacuna a una dosis de 50 mcg proporcionó una tasa de protección ocular en el 70 % de los animales experimentales infectados a una dosis de 109 células; La tasa de protección ocular fue del 60 % cuando se infectaron a una dosis de 2x109 células.

La tasa de protección ocular contra la disentería experimental cuando los conejillos de indias fueron inmunizados con vacunas, que incluye al 3-acLPS o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS) en una relación de masa 3:1 de la bacteria S. flexneri también varió del 55 al 75 %.

Por lo tanto, se registró una inmunidad pronunciada contra la disentería mucosa después de la inmunización s.c. de animales con una vacuna que contenía 3-acLPS o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa 1:1:1 o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS) en una relación de masa 3:1 de S. flexneri 2a.

Tabla 5

Para estudiar la inmunidad protectora contra la fiebre tifoidea, el grupo de prueba de ratones (CBAXC57B1/6) F1 se inmunizó por vía intraperitoneal con un gradiente de dosis de vacuna, que incluye el 3-acLPS de S. enterica sv typhi O:901 y también con una vacuna que contiene la combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. enterica sv typhi O:901 en una relación de masa 1:1:1. Los animales de control recibieron solución salina. Después de 12-14 días, ambos grupos de animales se infectaron por vía intraperitoneal con 1.000 células (mc) de la cepa virulenta de la fiebre tifoidea de S. entérica sv typhi Ty2 núm. 4446 a una dosis de 80 LD50 en solución salina estéril que contiene 5 % (p/p) de mucina tipo III (Sigma, EE. UU.) según el protocolo de Joo (Joo I., Pusztai Z., Juhasz V.P. Capacidad protectora del ratón de las preparaciones de referencia internacional de la vacuna contra la fiebre tifoidea. Z. Immun. Forsch. Exp. Ther., 1968, v.135, págs. 365-72). La tasa de supervivencia de los animales en ambos grupos se registró durante 3-5 días.

Tabla 6

Como se desprende de la Tabla 6, la prueba de protección activa de ratones mostró la eficiencia protectora esencial para las vacunas reivindicadas. Entonces la vacuna, que incluye la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. entérica sv typhi O:901 en una relación de masa 1:1:1 tiene una eficiencia protectora comparable con la preparación de vacuna TYPHIM-Vi en la prueba en ratones y cumple los requisitos de estandarización cuantitativa de la actividad protectora para las vacunas contra la fiebre tifoidea. D. Actividad antichoque de la vacuna no conjugada.

La protección animal del choque endotóxico se realizó mediante inmunización profiláctica intraperitoneal de grupos de prueba de ratones (CBAXC57B1/6) F1 con vacuna, que incluye la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. sonnei en una relación de masa 1:1:1 y la vacuna que contiene una combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de E. coli O:55 en una relación de masa 1:1:1, en dosis de 50, 100 y 200 mcg/por ratón (que son equivalente a 2,5; 5 y 10 mg/kg, respectivamente) en 0,5 ml de solución de cloruro de sodio al 0,9 % 72 horas antes de la inducción del choque endotóxico. El choque endotóxico se indujo por la administración intraperitoneal de endotoxina estándar de E. coli O:55 (Sigma-Aldrich, EE. UU.) a una dosis de 2 mg/por ratón (100 mg/kg), que es aproximadamente 4 LD100. Al grupo de control se le administró por vía intraperitoneal 0,5 ml de solución salina mediante el mismo esquema. La tasa de supervivencia de los animales se evaluó durante 3 días después de la inyección de endotoxina (Tabla 7).

Tabla 7

Como se desprende de la Tabla 7, a pesar de la reducción de la endotoxicidad, las vacunas declaradas son preparaciones profilácticas efectivas en una dosis de 100 y 200 mcg/ratón que proporciona 80 % y del 40-60 %, respectivamente, de la tasa de supervivencia de los animales experimentales asociada con la carga endotóxica masiva (4 LD100) y, como resultado, la corrección del mecanismo patógeno del choque endotóxico. Al mismo tiempo, la vacuna, incluida la combinación del S-LPS modificado, S. sonnei tuvo una actividad antichoque más pronunciada que la análoga E. coli Vacuna O:55.

La protección animal del choque séptico se realizó mediante inmunización profiláctica i.p. de grupos de prueba de ratones (CBAXC57B1/6) F1 con vacuna, incluida la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. sonnei en una relación de masa 1:1:1 y vacuna que contiene una combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de E. coli O:55 en una relación de masa 1:1:1, en una dosis de 10 y 50 mcg por ratón (que son equivalentes a 0,5 y 2,5 mg/kg, respectivamente) dos veces con un intervalo de 30 días antes de la simulación de choque séptico. La simulación de choque séptico se llevó a cabo 18 días después de la inmunización secundaria. El grupo de control consistió en animales postoperatorios intactos (Tabla 8).

La simulación del choque séptico (peritonitis experimental) se realizó mediante un procedimiento de ligadura y punción cecal (modelo CLP). Los grupos de ratones de prueba y de control se anestesiaron con anestesia general, se abrió el peritoneo, se evisceraron el ciego y el apéndice. El ciego se ligó en el área adyacente al apéndice y se pinchó dos veces con una aguja 22G. El contenido del ciego se extruyó a través de los orificios formados para la contaminación de la cavidad peritoneal del contenido intestinal, luego se devolvieron los órganos al abdomen y se cosió la cavidad abdominal.

Tabla 8

(continuación)

Como se desprende de la Tabla 8, la inmunización de animales con las vacunas reivindicadas a una dosis de 10 mcg/ratón se considera más efectiva si suprime el desarrollo de la peritonitis experimental (durante 30 y 18 horas en comparación con el grupo de control) y aumenta la tasa de supervivencia de sepsis (durante 36 y 24 horas en comparación con el grupo de control).

E. Seguridad de la vacuna no conjugada

Vacuna contra la disentería, que incluye la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. flexneri 2a en una relación de masa del componente 1:1:1, y la vacuna que comprende la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. entérica sv typhi O:901 en una relación de masa del componente 1:1:1, a una dosis de 50 mcg de antígeno que contiene 0,5 ml de solución tampón de fenol-fosfato como disolvente y producto de comparación, se inyectó vacuna de antígeno Vi tifoideo "Vianvac", a una dosis de 25 mcg, por vía subcutánea en el tercio superior del hombro a tres grupos de 20 voluntarios adultos. Se estudiaron las reacciones de temperatura a la inyección del fármaco, los efectos secundarios generales y las reacciones locales de los voluntarios durante los primeros tres días después de la inmunización. La vacuna que contiene una combinación del S-LPS modificado de S. flexneri 2a ha mostrado un alto perfil de seguridad para los voluntarios adultos. Se encontraron reacciones de temperatura en el rango de 37,1-37,5 °C en solo el 5 % de los voluntarios, no hubo reacciones de temperatura más altas y efectos secundarios generales; la reacción local (dolor en el lugar de la inyección) se detectó solo en un voluntario (Tabla 9). Se encontraron reacciones de temperatura en el rango de 37,1-37,5 °C en solo el 10 % de los voluntarios inmunizados con una combinación que contiene la vacuna del S-LPS modificado de S. entérica sv typhi O:901 o la vacuna de antígeno Vi tifoideo "Vianvac" (Tabla 9).

Tabla 9

(continuación)

Se estudió la producción de citocinas proinflamatorias para evaluar la seguridad de las vacunas reivindicadas cuando se administraron por vía parenteral (subcutánea) a humanos. Las vacunas, que incluyen las combinaciones de S-LPS modificado de S. flexneri 2a y S. entérica sv typhi O:901, a una dosis de 50 mcg de antígeno, que contenía 0,5 ml de solución tampón fenol-fosfato como disolvente, se inyectaron por vía subcutánea a voluntarios en la superficie exterior del tercio superior del hombro.

Después de la inmunización, los voluntarios estuvieron bajo la supervisión de un médico durante 5 días. El primer día de supervisión se sometieron a reconocimientos médicos a las 2, 4, 6 y 24 horas después de la inyección de preparados farmacológicos. Para estudiar el estado de las citocinas, se tomaron muestras de sangre de las venas de los voluntarios antes de la inyección de las vacunas reivindicadas (0 horas) y 2, 4 y 6 horas después de la administración. De acuerdo con los datos de la literatura, TNF-a, IL-1p, IL-6 organizan una tríada de citocinas proinflamatorias: mediadores básicos de la sepsis (Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxin levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. Ana. Interno. Med., 1993; 119: 771-78.). La administración intravenosa de LPS de Westphal de E. coli a una dosis de 0,06 a 0,2 ng/kg proporciona el aumento del nivel de TNF-a e IL-6 circulantes en 2-100 veces (Taudorf S., Krabbe KS, Berg RMG, Pedersen BK, Moller K. Human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin. Vaccine Immunol., 2007; 14 (3): 250-55), mientras que en el experimento por inmunización a voluntarios con vacuna que contiene una combinación del S-LPS modificado de S. flexneri 2a y con la vacuna contra la fiebre tifoidea que contiene una combinación del S-LPS modificado de S. enterica sv typhi O:901, en una dosis de 50 mcg (que equivale a 0,8 a 1 mcg/kg), las concentraciones de citocinas proinflamatorias fueron bajas y no difieren significativamente de los del suero tomado de voluntarios antes de la inyección de la vacuna (Tabla 10). Al mismo tiempo, la concentración de TNF-a aumentó un poco a las 2 horas, de IL-6 a las 4 horas después de la administración de las vacunas reivindicadas y la concentración de IL-1p no cambió prácticamente y se mantuvo en el nivel basal.

Tabla 10

(continuación)

F. Inmunogenicidad de la vacuna no conjugada

La respuesta inmunitaria del voluntario se investigó después de una única inmunización subcutánea en el tercio superior del hombro de grupos de prueba de 20 voluntarios adultos con vacunas que incluían el S-LPS modificado y la combinación del S-LPS modificado S. flexneri 2a, y también la vacuna que contenía la combinación. del S-LPS modificado de S. entérica sv typhi O:901, a una dosis de 50 mcg de antígeno, conteniendo en 0,5 mL de solución tampón fenol-fosfato como solvente. La inmunización secundaria se realizó de la misma manera después de 30 días después de la inmunización primaria. Se tomaron sueros de sangre para investigación de voluntarios antes de la vacunación y después de 30 días después de la vacunación primaria y secundaria, respectivamente.

Los anticuerpos de las principales clases de S. flexneri 2a y anti-LPS específicos S. entérica sv typhi O:901 se determinaron mediante el uso del procedimiento ELISA utilizando anticuerpos anti-IgA, anti-IgG y anti-IgM específicos de isotipo conjugados con HRP. La inmunogenicidad de la vacuna se evaluó mediante un aumento 4 veces mayor de los niveles de anticuerpos específicos contra LPS en sueros inmunes - seroconversión en comparación con los niveles de suero de fondo.

Tabfa 11

La uununogemcidad de vacunas que contienen el S-LPS modificado de S.flexnen 2a y las combinaciones de los S-LPS de S. JJexneti 2a y S. ejiierica sv typhi 0:901 (vacunación primaria)

Tabla 12

La inmunogimcidad di vacuna* qtie contienen #1 S-LPS modificado di S. Jlgxnen 2a y las combinaciones de los S-LPS de S.Jlexneri 2a y 5. entérica sv typhi 0:901 (vacunación

secundaria)

Se encontró que se observaron niveles altos de anticuerpos IgA específicos ya sea por frecuencia de detección o título final después de la inmunización primaria y secundaria de voluntarios con vacunas que contienen combinaciones del S-LPS modificado. S. flexneri 2a y S. entérica sv typhi O:901 (Tabla 11, 12).

La frecuencia de detección de 4 veces y más aumento de títulos de anticuerpos IgA anti-LPS después de la inmunización con una combinación de vacuna que contiene el S-LPS modificado S. flexneri 2a fue del 80 % después de la inmunización primaria y secundaria, la frecuencia máxima de detección de 4 veces la seroconversión de Ig de anticuerpos IgG en el 70 % de los casos se detectó después de la inmunización secundaria.

Se encontró un aumento de 4 veces y más en el título de anticuerpos IgA anti-LPS después de la inmunización primaria y secundaria con la combinación de vacuna que contiene el S-LPS modificado S. enterica sv typhi O:901 en el 70 y el 75 % de los voluntarios, respectivamente, la detección máxima La frecuencia de seroconversiones 4 veces o más de anticuerpos IgG en voluntarios vacunados fue del 80 % después de la inmunización primaria.

Aumento de títulos de 4 veces y más de anticuerpos IgA específicos después de la inmunización primaria y secundaria con una vacuna que contiene 3-acLPS S. flexneri 2a se encontró en el 40 y el 40 % de los voluntarios, respectivamente. La frecuencia de 4 veces y más seroconversiones de anticuerpos IgG fue 40 y 40 % en voluntarios vacunados después de la inmunización primaria y secundaria con 3-acLPS S. flexneri 2a, respectivamente.

Aumento del nivel de anticuerpos IgM específicos de LPS en voluntarios inmunizados con vacunas, que incluye ambas combinaciones del S-LPS modificado S. flexneri 2a y 3-acLPS S. flexneri 2a fue insignificante y dio lugar después de la inmunización secundaria a 10 y 15 % de 4 veces y más seroconversiones, respectivamente.

Aumento de la frecuencia de la seroconversión de anticuerpos IgM en voluntarios inmunizados con una combinación que contiene la vacuna del S-LPS modificado S. enterica sv typhi O:901 fue significativo y fue del 55 % después de la inmunización primaria y del 60 % después de la inmunización secundaria. Se registró una respuesta inmunitaria secundaria en voluntarios inmunizados con una vacuna que incluía 2-acLPS S. flexneri 2a, como aumento de anticuerpos IgA e IgG contra LPS S. flexneri 2a.

Por lo tanto, los resultados del ensayo han demostrado una alta inmunogenicidad para humanos de la vacuna contra la disentería, que contiene la combinación del S-LPS modificado. S. flexneri 2a y vacuna contra la fiebre tifoidea que contiene una combinación del S-LPS modificado S. enterica sv typhi O:901. Los anticuerpos específicos fueron presentados por las clases de anticuerpos IgA e IgG, los más importantes para la inmunidad de la mucosa.

G. Uso de combinaciones del S-LPS modificado como vehículo inmunoestimulante en la fabricación de vacuna conjugada (medicamento)

La combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 1:1:1 se obtuvo de S. enterica sv typhi O:901 bacterias de acuerdo con los Ejemplos 2A y 2B. Para generar grupos funcionales activos en S-LPS modificado, la combinación obtenida se sometió a oxidación parcial con peryodato seguida de oxidación de grupos aldehído generados a carboxílicos. Entonces, el S-LPS modificado parcialmente oxidado se puede conjugar con antígenos de vacuna mediante cualquiera de los procedimientos conocidos. Este estudio utilizó un procedimiento de conjugación con antígeno polisacárido - antígeno Vi de cápsula o antígeno proteico - toxoide tetánico (TT) usando 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC).

La conjugación de la combinación parcialmente oxidada del S-LPS S. enterica sv typhi O:901 modificado con el antígeno Vi o TT se llevó a cabo en una solución de cloruro de sodio 0,2 M en presencia de EDC durante 4-18 horas manteniendo el valor de pH 5,6 por pH- stat. Los conjugados se purificaron a partir de biopolímeros iniciales no conjugados e impurezas de bajo peso molecular en una columna de Sepharose CL-6B usando una solución de cloruro de sodio 0,2 M como eluyente. Las fracciones, que contenían conjugados y eluían cerca del volumen vacío de la columna, se combinaron para el llenado posterior en viales estériles con la adición de aditivos especiales farmacéuticamente adecuados, como los que usaban estabilizadores de pH o conservantes, o adyuvantes, o agentes de isotonicidad o combinaciones de los mismos.

La vacuna conjugada de combinación del S-LPS modificado S. enterica sv typhi O:901 con antígeno Vi contenía 50 % (p/p) de antígeno Vi activo serológico determinado por procedimiento ELISA. Pero el conjugado de vacuna de la misma combinación con TT contenía 40 % (p/p) de masa proteica, determinada por el procedimiento de Bradford (Bradford MM Un procedimiento rápido y sensible para la cuantificación de cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión proteína-colorante. Anal. Biochem. 1976, v. 72, págs. 248-54).

Una dosis de vacunación de vacuna conjugada contiene: conjugado de combinación del S-LPS modificado, de 0,010 a 0,200 mg; fenol (conservante), no más de 0,75 mg, con adición de cloruro de sodio, 4,150 mg, fosfato de sodio dibásico, 0,052 mg y fosfato de sodio monobásico, 0,017 mg; agua para inyección estéril libre de pirógenos, 0,5 ml (PA 42-2620-97, EP IV 2002).

H. Inmunogenicidad de vacunas conjugadas

Se estudió la respuesta inmunitaria del ratón para los conjugados de polisacárido Vi-antígeno y proteína TT con portador inmunoestimulante - combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) de S. enterica sv typhi O:901 en una relación de masa del componente 1:1:1.

Se inmunizaron por vía i.p. grupos de ratones F1 (CBAXC57Bl/6) mediante el conjugado de antígeno Vi mencionado anteriormente y antígeno Vi puro a una dosis de 25 mcg de polisacárido por ratón. El conjugado indujo una respuesta inmunitaria humoral y 15 días después de su inyección única se detectó un aumento de 5,8 veces la cantidad de anticuerpo IgG en sueros de sangre periférica animal en comparación con la respuesta del antígeno Vi puro por el procedimiento ELISA. (Figura 12A).

Para estudiar la respuesta inmunitaria secundaria, los mismos grupos de ratones se reinmunizaron con la vacuna indicada a una dosis de 25 mcg de polisacárido por ratón un mes después de la administración primaria. El día 15 después de la reinmunización con conjugado se registró un aumento de 8,2 veces de la cantidad de anticuerpo IgG anti-Vi. (Figura 12B).

Conjugado de proteína TT con portador inmunoestimulante - combinación del S-LPS modificado S. entérica sv typhi O:901 y TT puro también se administró por vía i.p. a grupos de ratones F1 (CBAXC57B1/6) a una dosis de 20 mcg de proteína por ratón. Se determinó la respuesta inmunitaria humoral inducida por conjugado después de una única inyección y en el día 15 se determinó el aumento de 3 veces la cantidad de anticuerpo IgG en sueros de sangre periférica animal en comparación con la respuesta de TT puro (Figura 12A).

Para estudiar la respuesta inmunitaria secundaria, los mismos grupos de ratones se reinmunizaron con la vacuna indicada a una dosis de 20 mcg de proteína por ratón después de un mes de la administración primaria. El día 15 después de la reinmunización con conjugado se registró un aumento de 6,4 veces en la cantidad de anticuerpo IgG anti-TT. (Figura 12B).

Cabe señalar que los niveles de anticuerpos específicos de O contra el portador inmunoestimulante - combinación del S-LPS modificado S. entérica sv typhi O:901, inducido por conjugado con TT, también aumentó: en la respuesta primaria en 3,2 veces y en la secundaria 1,5 veces (Figura 12A y B). Por lo tanto, se observó un aumento adicional de la respuesta inmunitaria tanto para el antígeno proteico como para el portador cuando se administró conjugado de S-LPS con portador proteico.

I. Vacuna multivalente contra la disentería-tifoidea-Escherichia coli

Preparar una sustancia vacuna polivalente contra Shigella flexneri o shigelosis sonnei, fiebre tifoidea y enterohemorrágico. E. coli O:55 infección en fracciones de masa iguales de la sustancia de combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de componentes 1:1:1 de serotipo S. flexneri 2a, S. sonnei, S. entérica sv typhi O:901 y E. coli O:55, obtenidos según los Ejemplos 2A y 2B se disolvieron en agua libre de pirógenos. La forma de vacuna final se preparó de acuerdo con el Ejemplo 3A.

La inmunogenicidad de la vacuna multivalente contra la disentería - tifoidea-Escherichia coli se determinó mediante pruebas en ratones FI (CBAXC57B1/6), que fueron inmunizados por vía i.p. con vacuna polivalente a una dosis de 100 mcg por ratón. Componentes de la vacuna polivalente - combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de 1:1:1 S. flexneri 2a o S. sonnei o S. enterica sv typhi O:901 o E. coli O:55 también se inyectaron por separado a diferentes grupos de ratones a una dosis de 25 mcg por ratón. A los 15 días se tomaron muestras de sueros de sangre de animales. Para estudiar la respuesta inmunitaria secundaria, los mismos grupos de ratones se volvieron a inmunizar con las preparaciones de fármacos indicadas a una dosis de 100 o 25 mcg por ratón un mes después de la inyección primaria. El día 15 después de la inmunización secundaria se tomaron muestras de sueros de sangre animal. respuesta inmunitaria inducida por vacuna multivalente después de la inmunización primaria y secundaria. Al mismo tiempo, la vacuna multivalente superó el título de anticuerpos IgG para todos sus componentes individuales: tifoidea S. enterica sv typhi O:901, disentería S. flexneri 2a y disentería S. sonnei y Escherichia coli O:55 hasta el nivel en comparación con el nivel de respuesta después de la administración separada del componente correspondiente a una dosis de 25 mcg (Figura 13A, B).

Así, la vacuna multivalente de Disentería-Tifoidea-Escherichia coli induce simultáneamente una respuesta inmunitaria en ratones a los antígenos S-LPS modificados, aislados de 4 cepas de bacterias, relacionados con tres familias diferentes de bacterias endotóxicas.

Ejemplo 4

Composición farmacéutica que contiene el S-LPS modificado y combinaciones de ellos

A. Uso del S-LPS modificado y combinaciones de ellos en la fabricación de la composición farmacéutica (medicamento)

La preparación de la composición farmacéutica incluye la síntesis del S-LPS modificado y combinaciones de los mismos según los Ejemplos 2A y 2B con el posterior llenado aséptico de viales o jeringas con una solución que contiene la sustancia activa y aditivos especiales farmacéuticamente adecuados, según los cuales se pueden usar estabilizadores de pH, conservantes, adyuvantes, agentes de isotonicidad o combinaciones de los mismos. La dosis terapéutica de la composición farmacéutica contiene: combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa de componentes 1:1:1, S. enterica sv typhi O:901 salmonella, de 0,010 a 50,000 mg; fenol (conservante), no más de 0,75 mg, con adición de cloruro de sodio, 4,150 mg y fosfato de sodio monobásico, 0,017 mg; agua para inyección estéril libre de pirógenos, 0,5 ml (PA 42-2620-97, EP IV 2002).

B. Acción antiviral de la composición farmacéutica

Acción antiviral de la composición farmacéutica que contiene la combinación (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 1:1:1 de S. entérica sv typhi O:901 salmonella se estudió en ratones blancos. Los grupos de prueba y control de ratones machos (por cada 10 animales en el grupo) que pesaban entre 18-20 g fueron infectados con el virus virulento de la influenza A H1N1 a una dosis de LD100, después de que estos animales en los grupos de prueba fueran tratados mediante la administración diaria i.p. de la preparación del fármaco compuesto por una combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa del componente 1:1:1 S. entérica sv typhi O:901, a una dosis de 100 mcg por animal. Los grupos de control de ratones recibieron solución salina de manera similar. La tasa de supervivencia de los animales se determinó durante dos semanas después de la infección. La tasa de supervivencia de los ratones fue del 0 % en el grupo de control y del 40 % en el grupo de prueba (Figura 14). Al mismo tiempo, la esperanza de vida promedio de los grupos de prueba fue estadísticamente válida más alta (p> 0,001) que en los de control. Por lo tanto, los datos experimentales obtenidos demuestran que la composición farmacéutica reivindicada tiene el efecto de modular las reacciones del sistema inmunológico.

C. El efecto tolerogénico de la composición farmacéutica

Se inmunizaron por vía i.p. grupos de prueba de (CBA * C57Bl/6) ratones FI con composiciones farmacéuticas que contenían 2-acLPS S. entérica sv typhi 0:901 o 3-acLPS S. enterica sv typhi 0:901, o una combinación de (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) en una relación de masa 1:1:1 S. enterica sv typhi 0:901, en una dosis de 50, 100 y 200 mcg/ratón, respectivamente (que son equivalentes a 2,5; 5 y 10 mg/kg) en 0,5 mL de cloruro de sodio al 0,9 % (solución salina) antes de 72 horas a la inyección de endotoxina-LPS estándar E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, EE. UU.) A una dosis de 2 mg/ratón (que equivale a 100 mg/kg), es decir LD100. El grupo de control de ratones se inyectó por vía i.p. 0,5 mL de solución salina por el mismo esquema.

La cantidad de TNF-a se determinó en sueros de sangre de ratón con el sistema de prueba Quantikine Mouse TNF-a/TNFSF1A (R&D Systems, EE. UU.) Mediante el procedimiento ELISA de acuerdo con el protocolo estándar del fabricante. Se extrajo sangre de los animales después de 90 minutos después de la inducción del choque endotóxico. Los resultados de la prueba se presentan en la Tabla 13.

Tabla 13

La preadministración de ratones con la composición farmacéutica reivindicada proporcionó la reducción de en vivo La producción de TNF-a por macrófagos a un nivel por debajo de 500 pg/mL, mientras que en el grupo de control el mismo nivel fue más de 900 pg/mL (Tabla 13). La supresión dependiente de la dosis de la producción de TNF-a bajo inmunización con las composiciones farmacéuticas reivindicadas demuestra su efecto tolerogénico, que puede usarse para la corrección de varios estados patológicos asociados con la hiperproducción de citocinas proinflamatorias.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, en el que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende:

a) antígeno de polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas;

b) núcleo de oligosacárido; y

c) ya sea

(i) lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo; o

(ii) lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres o cuatro residuos acilo.

2. El lipopolisacárido modificado de la reivindicación 1, que es un lipopolisacárido que comprende el lípido A que contiene dos residuos acilo.

3. Lipopolisacárido modificado de la reivindicación 2, que es al menos 85 % puro.

4. El lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de la reivindicación 1, en el que el lipopolisacárido modificado (S-LPS) es un lipopolisacárido que comprende lípido A que contiene tres residuos acilo.

5. El lipopolisacárido modificado (S-LPS) de la reivindicación 4, que es al menos 80 % puro.

6. El lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de la reivindicación 1, en el que el lipopolisacárido modificado (S-LPS) es un lipopolisacárido que comprende lípido A que contiene cuatro residuos acilo.

7. Lipopolisacárido modificado de la reivindicación 6, que es al menos 80 % puro.

8. El lipopolisacárido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que es un lipopolisacárido de bacterias endotóxicas seleccionadas del grupo que comprende Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Haemophilus, Neisseria, Campylobacter, Vibrio, Klebsiella, Chlamydya, Corynobacterium y combinaciones de las mismas.

9. Una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo.

10. Una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo, y (c) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo.

11. Una combinación de lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A completamente O-desacilado que contiene dos residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo.

12. Una combinación de los lipopolisacáridos modificados, en la que dicho lipopolisacárido modificado está libre de lipopolisacáridos que contienen lípido A que tiene cinco residuos acilo o seis residuos acilo, que comprende (a) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene tres residuos acilo, y (b) un lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas, que comprende: Antígeno polisacárido específico de O que consiste en una o más unidades repetidas, núcleo de oligosacárido y lípido A parcialmente O-desacilado que contiene cuatro residuos acilo.

13. Una composición que contiene el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la combinación de lipopolisacáridos modificados de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 para su uso en el tratamiento o profilaxis del choque séptico o choque endotóxico o en el tratamiento de la influenza o para su uso como vacuna terapéutica o preventiva para infecciones bacterianas o víricas.

14. Una vacuna que comprende el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la combinación de lipopolisacáridos modificados de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

15. Una composición farmacéutica que comprende el lipopolisacárido modificado (S-LPS) de bacterias endotóxicas de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la combinación de lipopolisacáridos modificados de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.