KR20160029060A

KR20160029060A - 개질된 내독성 세균 지질다당류(변형체), 개질된 지질다당류들(변형체들)의 조합물, 및 이를 함유한 백신(변형체) 및 약제 조성물(변형체)

Info

Publication number: KR20160029060A
Application number: KR1020167000036A
Authority: KR
Inventors: 페트르 젠나디에비치 아파린; 뱌체슬라브 레오니도비치 르포프; 스타니슬라바 이바노브나 엘키나; 마리나 에두아르도브나 골로비나; 블라디미르 알렉세예비치 레도브; 안나 알렉산드로브나 마르키나; 마리아 에브게네브나 쉐킷
Original assignee: 페트르 젠나디에비치 아파린; 스타니슬라바 이바노브나 엘키나; 마리나 에두아르도브나 골로비나; 뱌체슬라브 레오니도비치 르포프
Priority date: 2013-06-04
Filing date: 2013-06-04
Publication date: 2016-03-14
Also published as: EA201501165A1; KR102125600B1; EA201501165A8; EA031879B1; WO2014196887A1; EP3006450A4; US20160120967A1; EP3006450B1; ES2828373T3; EP3006450A1

Abstract

처음으로, 내독성 세균의 개개 디-, 트리- 및 테트라-아실 S-LPS, 및 이들의 조합 (펜타- 및 헥사-아실 유도체의 첨가 없음)이 유도되었으며, 이의 면역생물학적, 물리화학적 및 화학-약제학적 성질이 연구되었다. 처음으로, 각각 일성분 활성 물질로서 개질된 S-LPS를 개별적으로 함유하거나, 이- 및 삼-성분 활성 물질로서 이들의 조합물을 함유하는 백신 또는 약제 조성물 형태로 이러한 것의 직접적인 임상적 사용의 가능성을 나타낸다. 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물은 높은 안전성 정도를 가지고 낮은 발열원성 및 높은 면역원성을 나타낸다. 상기를 기반으로 하여 개발된 백신 및 약제 조성물은 쇼크-방지 할성, 높은 효능 및 특이성, 및 넓은 스펙트럼의 활성 및 양호한 화학-약제학적 파라미터를 나타낸다.

Description

개질된 내독성 세균 지질다당류(변형체), 개질된 지질다당류들(변형체들)의 조합물, 및 이를 함유한 백신(변형체) 및 약제 조성물(변형체){MODIFIED ENDOTOXIC BACTERIA LIPOPOLYSACCHARIDE (VARIANTS), COMBINATION OF MODIFIED LIPOPOLYSACCHARIDES (VARIANTS) AND, CONTAINING SAME, A VACCINE (VARIANTS) AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION (VARIANTS)}

본 발명은 임상 면역학 및 약리학, 특히 내독성 세균, 상세하게 살모넬라(Salmonella), 에세리키아(Escherichia), 시겔라(Shigella), 보르데텔라(Bordetella), 헤모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오(Vibrio), 클렙시엘라(Klebsiella), 클라미디아(Chlamydya), 코리노박테리움(Corynobacterium)의 개질된 지질다당류, 및 이들의 조합물, 및 이를 포함하는 백신 및 약제 조성물에 관한 것이다.

지질다당류(LPS)는 그램-음성 세균의 내독소(endotoxin)이고 다당류(O-PS) 및 지질 성분들로 이루어진다.

지질 성분은 지질 A로서도 지칭되는 것으로서, 이는 지질다당류들의 내독성 성질을 결정한다[Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Ulmer A.J., Holst O., Brade H., Schmidt G., Mamat U., Grimmecke H.D., Kusumoto S. et al. The chemical structure of bacterial endotoxin in relation to bioactivity. Immunobiology, 1993, Apr; 187(3-5):169-190]. LPS의 다당류 성분은 O-특이적 다당류, 즉 반복 올리고당 단위로 이루어진 O-PS이고, 코어 올리고당에 연결되고 또한 지질 A에 연결된다. O-PS, 코어 및 지질 A의 모두 세 가지 구조 부분으로 이루어진 LPS는 이러한 것이 미생물의 <<활엽(smooth)>> 콜로니의 특징이기 때문에 S-LPS라 불리워진다. O-PS는 병원성 세균을 포함하는 일부 세균의 LPS 구조에는 존재하지 않는다. 이러한 미생물은 여러 경우에 조연 콜로니(rough colony)를 형성하고 R-LPS라 불리워지는 저분자 LPS를 형성하고, 이는 단지 지질 A에 연결된 코어 올리고당을 함유한다. O-PS의 독특한 구조가 S-LPS의 면역특이성을 결정하고, 결과적으로 전체 미생물의 면역특이성을 결정하고, 여러 경우에 S-LPS에 반응하는 숙주에서 유도된 S-LPS-특이적 항체가 세균성 감염에 대해 중요한 역할을 하고 높은 보호 용량을 나타내는 것으로 나타낸다.

그러나, 적응 면역(adaptive immunity)을 활성화시키는 능력 이외에, 심지어 최소 용량의 LPS가 매우 내독성을 나타낸다는 것이 널리 알려져 있다. 미생물에서 현저한 양의 LPS의 출현에 반응하여, 내독성 쇼크(endotoxic shock)의 상태가 일어나며, 이는 백신 및 치료 약물의 성분들로서 LPS의 사용을 배제한다.

LPS의 내독성 성분, 즉 지질 A는 대개 두 개의 포스포릴화된 글루코사민 잔기로 이루어진 이당류로서, 이들 각각이 네 개의 3-하이드록시미리스트산 잔기(HMA)에 의해 (3 및 3' 위치에서) N- 및 O-아세틸화되는데, 이는 1차(primary)로 불리워진다. 두 개의 다른 비-하이드록실화된 고차의 지방산 잔기(통상적으로, 라우르산 및 미리스트산)는 상술된 HMA 잔기들 중 두 개를 O-아세틸화하는데, 이는 2차(secondary)로 불리워진다. 이에 따라, 소위 <<전형적인(classic)>> 지질 A는 6개의 (4개의 1차 및 2개의 2차) 고차 지방산 잔기로 이루어진다[Knirel Yu.A., Valvano M. A. Bacterial Lipopolysaccharides. Structure, Chemical Synthesis, Biogenesis and Interaction with Host Cells. Springer Wien New York, 2011, 440 pp.].

6개의 고차 지방산 잔기를 갖는 <<전형적인>> 지질 A를 함유하지 않고 지질 A에서 보다 적은 수의 지방산 잔기를 함유하는 그램-음성 미생물의 LPS가 낮은 수준의 내독성을 갖는 것으로 여겨진다.

다당류 에피토프에 대한 특이적 방어 항체를 유도하는 이의 능력을 유지하면서 S-LPS의 내독성의 임상적으로 허용 가능한 수준으로의 감소가 면역예방 백신 및 의학적 약물로서, 내독성 세균의 낮은 내독성 개질된 S-LPS, 실제 감염성 제제를 사용하는 주요 가능성을 야기시키는 것으로 여겨진다. <<전형적인>> 지질 A를 함유한 내독성 LPS의 화학적, 효소적, 및 유전적 해독 방법에 의해 제조된 저차의 내독성 유도체로의 변형의 연구는 20년 이전에 시작되었다.

미국특허번호 제4,912,094호에 따르면, 내독성 세균, 즉 살모넬라 엔테리카 sv 민네소타(Salmonella enterica sv minnesota) 및 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)의 (5개의 지방산 잔기를 갖는 지질 A로 이루어진) R-LPS의 펜타-아세틸화된 유도체는 β-하이드록시미리스트산의 선택적 분열을 야기시키는 LPS의 조절된 알칼리성 가수분해에 의해 얻어졌으며, 이는 에스테르 결합에 의해 3-위치에서 글루코사민의 환원 단부에 연결된다. 동시에, 개질된 R-LPS의 내독성의 감소에 대한 데이타는 매우 제한되었으며, 독성이 닭 배아 독성 시험에서 단지 약 50배 감소시킨다는 것이 주지된다. R-LPS에 대한 독성 감소의 약제학적 시험(부반응 및 발열성 시험)이 수행되지 않았다. 미국특허번호 제6,482,807호에 따르면, 감소된 내독성을 갖는 펜타-아실화된 LPS는 유전공학에 의해, 세포에서 헥사-아세틸화된 형태의 LPS의 생산을 차단함으로써 유전학적으로 개질된 재조합 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 세균으로부터 얻어진다. 그러나, 이에 따라 얻어진 LPS는 무의미한 내독성 감소를 나타내었다(단지 100배의 내독성 감소는 시험관내 TNF-α 생산을 위한 시험 데이타에 따라 관찰되었다). 개질된 균주는 LAL-시험에서 활성을 감소시킴으로써 최초 균주와 단지 7배 상이하였다. LPS 생성물의 약제학적 발열성 검정 데이타가 제시되어 있지 않다. 생산물은 백신 항원이 아닌, 어주번트(adjuvant)로서 기술되어 있다.

현재, 내독성 세균의 펜타-아세틸화된 LPS가 실험 동물에서 필수적인 수준의 내독성을 유지하고 이에 따라 이러한 것이 약제학적 제제의 성분들로서 임상적 적용을 발견하지 못할 수 있다는 것이 명확하다.

미국특허번호 제4,929,604호에 따르면, 주로 3-하이드록시미리스트산의 주요 잔기로 이루어진 내독성 세균의 LPS의 지질 성분의 유도체는 선택적 효소적 가수분해의 방법에 의해 아실옥시아실 하이드롤라제로 얻어졌다. 그러나, 2차 지방산의 제거는 불완전하였으며, 2차 지방산의 단지 80 내지 90%는 심지어 최대 시간의 효소 처리를 이용함으로써 제거되었다. 이에 따라, 이러한 효소 처리의 생산물은 LPS의 테트라-아세틸화된 유도체(4개의 지방산 잔기를 갖는 지질 A를 포함함)와 에세리키아 또는 헤모필리스 또는 나이세리아의 LPS의 미반응된 펜타- 및 헥사-아세틸화된 유도체(각각 5개 및 6개의 지방산 잔기를 갖는 지질 A를 포함함)의 혼합물이다. 또한, LPS의 순수한 테트라-아세틸화된 유도체가 아닌, 테트라아실 유도체와 펜타- 및 헥사-아실화된 유도체의 혼합물의 면역생물학적 성질이 연구되었다. 이러한 연구 결과는 만족스럽지 못하였다. 최초 LPS와 비교하여 개질된 LPS의 혼합물의 활성의 단지 20배 감소가 LAL-시험에서 관찰되었다. 발열원성 수준의 감소는 래빗 발열성 시험에서 열적 반응 지수에 의해 계산한 경우 유의미하지 않았다(단지 2.5 내지 3배). 특허 문헌에서, 슈바르츠만 반응에서 연구 중의 최대 탈아세틸화된 LPS의 피부 민감성 효과 감소의 평가는 모순되는 방식으로 기술되었다(10배 내지 100배 감소함).

내독성 H. 인플루엔자 및 B. 백일해 세균의 R-LPS 및 S-LPS의 펜타- 및 테트라-아세틸화된 유도체의 혼합물은 또한 이의 효소 시스템의 변형에 의해 유전적으로 개질된 균주들로부터 제조되었다[US 7,005,129 B1; WO 2006065139 A2]. 그러나, 돌연변이 LPS의 얻어진 혼합물은 높은 잔류 내독성을 가지고, 인간에 대한 잠재적인 면역원으로서 사용되지 못할 수 있다.

이에 따라, 내독성 세균의 LPS의 테트라-, 펜타- 및 헥사-아세틸화된 유도체의 혼합물의 생산을 야기시키는 특허에 기술된 효소 처리의 방법은 약제학적 제조물의 성분으로서 이의 임상적 적용을 방지하는 유의미한 내독성 감소를 야기시키지 않는다.

종래 기술에는, 어떠한 방식으로도 펜타아실화된 유도체, 또는 테트라-, 펜타- 및 헥사아세틸화된 유도체의 조합물인 내독성 세균의 개진될 LPS의 제조물이 임상적 안전성 기준을 충족시키지 못함을 나타낸다. 명확하게, 이는, 상술된 특허의 저자들이 후보 백신으로서 제제의 면역원성의 표준 연구를 수행하지 못하는 이유이다. 개질된 LPS의 제조물은 주로 면역자극제로사 사용하기 위해 고려되는 것이며, 이러한 이유로, LPS의 제조 및 LPS의 O-항원 도메인에 대한 면역 반응의 평가의 면역원 연구(immunogenic study)가 수행되지 않았다.

지질 A의 비효율적인 탈아세틸화에 의해 형성된, 상술된 개질된 LPS의 만족스럽지 못한 안전성 수준으로 인하여, 이러한 연구 라인은 실제적으로 포기되었다. 이에 따라, 지난 세기의 마지막 이후에, 실제 내독성 세균 균주 (유전학적으로 개질되지 않음)로부터의 다른 개질된 LPS 및 특히 개질된 S-LPS의 제조 및 인간에 투여하기 위한 가능성 있는 백신으로서 이의 적용에 관한 어떠한 특허도 등록되지 않았으며, 어떠한 논문도 발표되지 않았다. 백신으로서 내독성 세균의 LPS의 디-, 트리- 및 테트라아세틸화된 유도체를 사용하는 주요한 가능성은 연구자의 견해가 아니다. 이러한 분야는 이전에 백신학자들에 의해 타겟화된 실제 적용의 대상으로서 고려되지 않았다.

임상적으로 적용 가능한 백신의 설계 분야에서의 연구는 다른 패러다임(paradigm), 특히 S-LPS의 분열 요소, 즉 O-PS의 사용, 디글리코사민 잔기를 갖는 O-PS-코어의 분절 또는 단백질 담체와 콘주게이션시키기 위한 특정 항원으로서 하이드라진으로의 전체 탈아실화에 의해 얻어진 지질 A의 사용으로 이동하였다[US 7,553,490; Konadu E., Shiloach J., Bryla D.A., Robbins J.B., Szu S.C. Synthesis, characterization and immunological properties in mice of conjugates composed of detoxified lipopolysaccharide of Salmonella paratyphi A bound to tetanus toxoid with emphasis on the role of O-acetyls. Infect. Immun., 1996, July, 64(7): 2709-15; Pavliakova D., Moncrief J.S., Lyerly D.M., Schiffman G., Bryla D.A., Robbins J.B., Schneerson R. Clostridium difficile recombinant toxin A repeating units as a carrier protein for conjugate vaccines: studies of pneumococcal type 14, Escherichia coli K1 and Shigella flexneri type 2a polysaccharides in mice. Infect. Immun., 2000, Apr., 68(4):2161-6].

이에 따라, 종래 기술은 청구된 개질된 지질다당류, 내독성 세균의 LSP의 순수한 디-, 트리-, 및 테트라-아세틸화된 유도체, 및 S-LPS 개별로서, 2- 및 3-성분 활성 물질로서 이의 조합으로서 직접 백신 약물 제조물로서 이의 임상 적용을 시사하지 않고 있다.

구강 미생물상(oral cavity microflora)의 성분인 포르피로모나스 깅기발리스(Porphyromonas gingivalis) 세균의 탈아실화된 LPS에 대한 정보는 청구된 목적과 간적접으로 관련되어 있다. 미국특허번호 제7,622,128호에 따르면, P. 강기발리스 LPS의 펜타-, 테트라-, 트리-아세틸화된 유도체가 얻어지지 않았으며, 주요 가능성은 상응하는 조성물로 이루어진 면역조절제로서 펜타아세틸화된 및 테트라아세틸화된 유도체를 사용을 나타내었다. 동시에, 이의 안전성 수준 및 이의 임상적 적용의 가능성을 특징분석하기 위한 데이타는 존재하지 않았다.

P. 깅기발리스는 상당히 낮은 내독성 및 발열원성을 갖는 LPS를 형성시키며(염증전 사이토카인을 활성화시키는 능력을 1000배 감소시키고 내독소 E. 콜라이 세균으로부터 LPS와 비교하여 갈락토사민 모델에서 독성을 100배 감소시킴), 먼저, 이는 지질 A의 구조적 특징에 의해 설명되었다. P. 깅기발리스는 구강의 국소적인 낮은 세기의 감염증의 제제로서, 이러한 감염증에 대한 방어 항원으로서 이의 LPS의 사용은 예방 백신화에서 특별한 방법의 개발을 필요로 한다[Darveau R. P., Cunningham M.D., Bailey T., Seachord C., Ratcliffe K., Bainbridge B., Dietsch M., Page R.C., Aruffo A. Ability of bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr., 63(4):1311-7; Bainbridge B. and Darveau R. P. Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide: an Unusual Pattern Recognition Receptor Ligand for the Innate Host Defense System. Acta. Odontol. Scand., 2001, 59:131-8]. LPS P. 강기발리스 지질 A에서 지방산 중 약 절반이 특이하게 분지된 구조를 가지고 홀수의 탄소 원자를 함유하여, 이러한 LPS가 <<전형적인>> 지질 A를 함유한 내독성 세균의 LPS와 크게 구별되는 것을 나타내었다. 내독성 세균의 개질된 S-LPS의 일부에 청구된 대상의 가장 가까운 유사체는 오로지 공식적인 이유로 미국특허 제4,912,094호 및 WO 9514026 A1호의 기술적 해법이다.

이러한 특허의 적절치 않게 넓은 특허청구범위에서, 일반적인 구조식은 큰 그룹의 개질된 S-LPS, R-LPS 및 내독성 세균의 개질된 지질 A에 의해 특징되며, 전자의 경우에 단지 S. 엔테리카 종 민네소타 및 E. 콜라이의 R-LPS 및 지질 A의 펜타-아세틸화된 유도체, 및 후자의 경우에 E. 콜라이, 해모필리스 인플루엔자 및 슈도마니스 에루지노사 지질 A의 테트라-아세틸화된 유도체가 실제적으로 얻어졌고, 면역생물학적 성질에 대해 연구되었다.

미국특허번호 제4,912,094호에서의 데이타가 상기에서 논의되었으며, WO 9514026 A1호에서의 정보는 보다 상세히 논의된다.

상술된 세균의 지질 A의 트리-아세틸화된 유도체는 내독소 반응의 주요 매개체, 즉 생체 내에서 TNF-α, 및 또한 다른 염증전 사이토카인의 주요 매개체, 즉 IL-6의 강력한 유도물질이다[유사 특허 RU 2154068 C2호로부터의 데이타]. 시험관내 PMN의 배양물에서, 지질 A의 트리-아세틸화된 유도체는 LPS 웨스트팰(Westphal)과 비교하여 더욱더 높은 TNF-α 생산을 유도하였다.

이와 관련하여, 문헌 WO 9514026 A1호 및 유사한 특허에서 LAL-시험에서의 이의 낮은 활성(1000배 감소)을 기반으로 한 개질된 지질 A의 제조물의 낮은 내독성에 대한 결론이 발견되지 않았다. LPS의 내독성의 평가는 단지 리물루스 단백질(Limulus protein)의 겔-형성 활성을 기반으로 한 시험관내 LAL-시험을 기반으로 하여 불완전하여 생체 내에서 시험 결과를 무시하고, 이는 전염증성 사이토카인의 생성을 반영한다(혈장 농도, 발열원성, 부반응). 얻어진 생성물의 발열원성 수준에 대한 데이타가 존재하지 않고, 이에 따라 안전성에 대한 데이타가 존재하지 않는다.

명시된 문헌의 후속의 저자 공개문은 필수적인 잔류 내독성 및 안전성 수준을 갖는, 항암 면역 약물의 성분으로서 개발된 트리- 및 테트라-아실화된 지질 A가 전통적인 백식 약물로서 허용 가능하지 않는다는 것을 입증하였다[Brandenburg K., Lindner B., Schromm A., Koch M.H.J., Bauer J., Merkli A., Zbaeren C., Davies J.G., Seydel U. Physicochemical characteristics of triacyl lipid A partial structure OM-174 in relation to biological activity. Eur. J. Biochem., 2000, v. 267, pp. 3370-7]. 개질된 지질 A는 백신으로서 사용되지 못할 수 있으며(이는 O-PS 세균 항원을 함유하지 않음), 이는 이의 낮은 발열원성을 지지하는 데이타의 부재로 인하여 추가 성분, 즉 어주번트로서 이를 사용의 측면에서 문제가 된다.

상기를 고려하여, 본 출원의 저자에 의해 수행되고 실시예 1에 기술된, 전염증성 사이토카인의 생체내 유도 및 E. 콜라이 OM-174로부터 트리-아세틸화된 지질 A에 의한 TNF-α인 내독성 반응의 매개체 및 이에 따라 각각 디-, 트리-, 및 테트라아세틸화된 내독성 세균 S-LPS의 비교 연구의 완전히 예상되지 못한 결과가 존재하였다.

개질된 지질 A와 구별하여, 내독성 세균의 상응하는 개질된 S-LPS는 내독성 쇼크의 불량한 유발 물질이고, 실험실 동물 및 인간 피검체에 대해 낮은 발열원성 및 내독성을 나타낸다.

이러한 본래 결과는 S-LPS의 면역생물학적 성질에 대한 다당류 성분의 기여의 일반적으로 허용되는 측면에서 특정 교정(correction)을 도입하고, 또한 내독성 세균의 LPS의 개질의 크기와 이의 안전성 및 면역원성 수준의 최적의 비율 간의 상관관계를 확립시킬 수 있고, 이는 이의 임상적 사용의 관점을 여는 것이다.

본 발명의 목적은

(i) 내독성 세균의 순수한 개개의 (펜타- 및 헥사아실화된 유도체의 불순물이 존재하지 않은) 개질된 S-LPS (디-, 트리- 및 테트라-아실화된 유도체), 및 이들의 조합물의 제조;

(ii) 각각 개개 일성분 또는 2- 및 3-성분 활성 물질로서 이들의 조합물로서 개질된 S-LPS를 함유한 명시된 대상을 기반으로 한 백식 및 약제 조성물의 개발이다.

본 발명에 의해 제공된 기술된 결과는

(a) 높은 안전성 수준(내독소 반응, 즉 오한, 열, 빈맥, 개개 개질된 S-LPS 또는 이의 조합이 지원자에게 비경구적으로 200 mcg 이하의 단일 용량으로 투여될 때 동맥혈압의 증가가 존재하지 않음);

(b) 낮은 발열원성(전통적인 LPS 웨스트팔(Westphal)과 비교하여 래빗 발열성 시험에서 개개 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 발열 용량의 1,000 내지 10,000배 감소; 명시된 산물이 지원자에게 비경구적으로 최대 200 mcg의 단일 용량으로 투여될 때 미열, 최대 37.6℃의 온도 반응);

(c) 쇼크-방지 활성(개개의 개질된 S-LPS 또는 이의 조합의 예비-투여는 치사 용량의 내독소의 투여에 의해 유도된 내독성 쇼크를 일으키는 80% 동물 생존율을 제공한다. 또한, 명시된 생성물의 투여는 패혈성 쇼크의 규정을 제공하고 18 내지 30시간 동안 복막염의 발달을 늦춘다);

(d) 높은 효능 및 특이성(개개의 개질된 S-LPS 또는 이들의 조합물로 지원자 및 실험 동물의 면역화는 높은 수준의 LPS-특이적 및 O-항원 특이적 IgG, IgA, IgM의 생산을 결정한다: 실험 감염증 모델에서 항체의 4배 혈청변환 및 직접 동물 보호);

(e) 광범위한 스펙트럼의 작용(두 개 또는 수 개의 혈청 타입을 기준으로 하여 개개의 개질된 S-LPS 또는 이의 조합물을 함유한 조합된 다가 백신의 개발);

(f) 발열원성 감소 및 면역원성 향상과 관련한 개질된 S-LPS의 조합물에 대해 관찰된 상승 효과;

(g) 개개의 개질된 S-LPS 뿐만 아니라 이의 조합의 양호한 화학-약학적 특징(열안정성, 연장된 저장 기간, 환경적 내성).

처음으로, 내독성 세균의 개개의 (펜타- 및 헥사아실화된 유도체의 불순물이 존재하지 않는) 디-, 트리- 및 테트라아실화된 S-LPS, 및 또한 이의 조합물이 얻어졌으며, 이의 면역생물학저, 물리-화학적, 화학-약제학적 성질들이 조사되었다.

청구된 대상의 소스와 관련하여 특허청구범위를 명확하게 하기 위하여, 본 출원인은 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 속의 <<내독성 세균>>의 개념을 정의해야 한다.

이러한 세균은 감염 질환 또는 내독소 부자연스러운 형태의 LPS 분자를 형성시키는 다른 환경적 소스를 갖는 환자로부터 얻어진 천연의 유전학적으로 개질되지 않은, 그램-음성 세균의 균주라 불리워지며, 이는 자유 형태 세포와 결합된 형태의 높은 독성 및 발열원성 및 높은 지질 A(펜타- 또는 헥사아실화된)의 아실화 정도에 의해 특징된다. 세균의 내독소 균주, 즉 내독소 LPS의 활성 생산자에 의해 유도된 감염 공정의 과정은 분명한 온도 반응, 열 및 전신성 염증 반응 증후군(Systemic Inflammatory Response Syndrome; SIRS)의 다른 징후에 의해 부담된다.

다른 한편으로, 저-내독소, 그램-음성, 천연 발생 세균은 100 내지 1000배 낮은 내독성을 갖는다. 이에 따라, 이는 상피 세포 수용체, PMN, TNF-α, IL-6의 유사한 활성화 수준을 달성하기 위해 내독성 세균 세포(E. coli)의 양과 비교하여 100 내지 1000배 이상의 세포의 저-내독성 세균(헬리코박터 파일로리, P.깅기발리스, 트레포네마 팔리둠)을 필요로 한다[Darveau R. P.,Cunningham M.D., Bailey T., Seachord C., Ratcliffe K., Bainbridge B., Dietsch M., Page R.C., Aruffo A. Ability of Bacteria associated with chronic inflammatory disease to stimulate E-selectin expression and promote neutrophil adhesion. Infect. Immun., 1995, Apr., 63(4):1311-7].

저-내독성 세균은 맹독성이 아니거나, 이러한 것은 낮은 세기를 야기시키고, 종종 준임상 형태의 점막 감염증을 야기시키는데, 이는 이러한 것이 종종 "보이지 않은 세균"이라 불리워지는 이유이다. 저-내독성 세균의 LPS는 항상 이의 낮은 내독성, 즉 낮은 정도의 지질 A 아실화(트리- 또는 테트라아실화), 탈포스포릴화 형태의 지질 A, 독특한 지방산 구조의 원인이 되는 구조적 특징을 갖는다[Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity. J. Endotoxin Res., 2001, v.7, pp. 167-202.].

하나 이상의 반복 단위로 이루어진 O-특이적 다당류, 코어 올리고당 및 두 개의 아실 잔기를 갖는 전부 O-탈아실화된 지질 A를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)가 얻어졌다.

청구된 지질다당류는 85% 이상의 순도(실시예 2B)를 가지고, 인간을 포함한 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대한 방어를 발생시키고(실시예 2D, 3F), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 가지고, 인간을 포함한 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 3F, 4C), 래빗 발열성 시험에서 최대 100 mcg/kg의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

하나 이상의 반복 단위로 이루어진 O-특이적 다당류, 코어 올리고당 및 세 개의 아실 잔기를 갖는 일부 O-탈아실화된 지질 A를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)가 얻어졌다.

청구된 지질다당류는 80% 이상의 순도를 가지고(실시예 2B), 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대해 보호를 형성시키고(실시예 2D, 3C, 3F), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 할성을 가지고(실시예 3D), 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

하나 이상의 반복 단위로 이루어진 O-특이적 다당류, 코어 올리고당, 및 4개의 아실 잔기를 갖는 일부 O-탈아실화된 지질 A를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)가 얻어졌다.

청구된 지질다당류는 80% 이상의 순도를 가지고(실시예 2B), 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대한 보호를 형성시키고(실시예 2D), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 가지고, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/k 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

임의 비율로 디아실화된 유도체 및 트리아실화된 유도체를 포함하는 개질된 지질다당류(S-LPS)의 조합물이 얻어졌다. 청구된 조합물은 디아실화된 지질다당류 유도체와 비교하여 면역원성 향상과 관련하여 상승 효과를 나타내고(실시예 2D), 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대한 보호를 형성시키고(실시예 2D), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 가지고, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 3C), 래빗 발열원성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

임의 비율로 디아실화된 유도체 및 테트라아실화된 유도체를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)의 조합물이 얻어졌다. 청구된 조합물은 디-아실화된 지질다당류 유도체와 비교하여 면역원성 향상과 관련하여 상승 효과를 나타내고(실시예 2D), 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대해 보호를 형성시키고(실시예 2D), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 가지고, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 3C), 래빗 발열원성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

임의 비로 트리-아실화된 유도체 및 테트라-아실화된 유도체를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)의 조합물이 얻어졌다. 청구된 조합물은 테트라-아실화된 지질다당류 유도체와 비교하여 면역원성 향상과 관련하여 상승 효과를 나타내고, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대해 보호를 형성시키고(실시예 2D), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 나타내고, 인간을 포함하는 포유도울에서 면역계 반응 조절제이고, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

임의 비로 디-아실화된 유도체, 트리-아실화된 유도체, 및 테트라-아실화된 유도체를 포함하는 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)의 조합물이 얻어졌다. 청구된 조합물은 디-아실화된 및 트리-아실화된 지질다당류 유도체와 비교하여 면역원성 향상과 관련하여 상승 효과를 나타내고(실시예 2D, 3F), 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 조합에 대한 보호를 형성시키고(실시예 2D, 3F, 3C), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크방지 활성을 가지고(실시예 3D), 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 3F, 4B, 4C), 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

그램-음성 세균에 의해 야기된 감염성 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 백신이 개발되었다.

청구된 백신은 예방학적 및/또는 치료학적 유효량의 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 이의 디-아실화된 또는 트리-아실화된 또는 테트라-아실화된 유도체를 포함한다. 청구된 백신은 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대한 보호를 형성시키고(실시예 3C, 3F), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공한다(실시예 3D). 청구된 백신에서, 개질된 지질다당류는 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 3B). 청구된 백신은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있으며, 이는 안정화제 또는 보존제, 또는 어주번트, 또는 등장화제, 또는 이들의 조합물 (실시예 3A)일 수 있다. 또한, 백신은 비콘주게이션된 형태 뿐만 아니라 콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함할 수 있다. 한편, 콘주게이션된 형태의 지질다당류로 이루어진 백신은 추가적으로, 운반 단백질, 즉 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드, 또는 P. 에루기노사 외부단백질 A, 또는 다른 단백질을 함유한다(실시예 3H, 3I).

청구된 백신은 예방학적 및/또는 치료학적 유효량의 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS)의 조합물, 즉 디-아실화된 및 트리-아실화된 유도체 또는 디-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 디-아실화된, 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체의 조합물을 포함한다. 청구된 백신은 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합물에 대한 보호를 형성시키고(실시예 3C, 3F), 패혈성 및/또는 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공한다(실시예 3D). 청구된 백신에서, 개질된 지질다당류의 조합물은 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 3B). 청구된 백신은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있으며, 이는 pH 안정화제 또는 보존제, 또는 어주번트, 또는 등장화제, 또는 이들의 조합일 수 있다(실시예 3A). 또한, 백신은 비콘주게이션된 형태 뿐만 아니라 콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함할 수 있다. 한편, 콘주게이션된 형태의 지질다당류로 이루어진 백신은 추가적으로, 운반 단백질, 즉 디프테리아 톡소이드 또는 파상풍 톡소이드, 또는 P. 에루기노사 외부단백질 A, 또는 다른 단백질을 함유한다(실시예 3G).

개개 S-LPS 및 이의 조합물을 기반으로 한 청구된 백신이 가장 넓은 스펙트럼의 항체를 보호 면역성의 효능의 중요 인자로서 여겨질 수 있는, LPS 분자의 상이한 도메인(O-PS, 외부 코어, 내부 코어)의 다양한 항원 결정자로 동시에 유도시킬 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 또한, 다가 백신의 개발의 가능성은 모노백신 변형체 각각이 그램-음성 세균의 가장 유행하는 유의민한 균주에 대해 특이적인 항원을 함유한다는 다가 백신의 개발 가능성이 나타났다(실시예 3I).

유효량의 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 이의 디-아실화된 또는 트리-아실화된, 또는 테트라-아실화된 유도체를 포함한 약제 조성물이 개발되었다. 청구된 약제 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 4C)이며, 이의 제형에 함유한 개질된 지질다당류는 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

청구된 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있으며, 이는 보존제 또는 안정화제, 또는 용매, 또는 이들의 조합일 수 있다. 청구된 약제 조성물은 광범위한 스펙트럼의 약리학적 활성을 가지고 특히 인플루엔자 A H1N1 바이러스에 의해 야기된 감염증에 대한 효과적인 치료학적 항바이러스 작용을 나타낸다(실시예 4B). 또한, 약제 조성물은 염증전 사이토카인의 생산 증가와 관련된, 병리학적 상태의 교정을 위한 면역관용성 효과를 나타낸다(실시예 4C).

유효량의 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 디-아실화된 및 트리-아실화된 유도체 또는 디-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 디-아실화된, 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체의 조합물을 포함하는 약제 조성물이 개발되었다. 청구된 약제 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이며(실시예 4B, 4C), 이의 포뮬레이션에 함유된 개질된 지질다당류의 조합물은 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

청구된 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 타겟화된 첨가제를 포함할 수 있으며, 이는 보존제 또는 안정화제, 또는 용매, 또는 이들의 조합일 수 있다. 청구된 약제 조성물은 광범위한 스펙트럼의 약리학적 활성을 가지고 특히 인플루엔자 A H1N1 바이러스에 의해 야기된 감염증에 대해 효과적인 치료학적 항바이러스 작용을 나타낸다(실시예 4B). 또한, 약제 조성물은 전염증 사이토카인의 생산의 증가과 관련된, 병리학적 상태의 교정을 위한 면역관용성 효과를 나타낸다(실시예 4C).

또한, 다른 클래스의 약제-유사체와 비교하여 청구된 약제(백신 및 약제 조성물)의 확실한 장점이 이의 우수한 화학적 및 약리학적 특징, 즉 LPS 분자에 대해 널리 공지된 열적 안정성이며, 환경적 내성에 대해 이의 연장된 저장 기간에 대한 가능성을 제공하는 것이 주지되어야 한다.

내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 이의 디-아실화된 또는 트리-아실화된, 또는 테트라-아실화된 유도체의 사용은 또한, 약제의 제작에서 청구된다. 한편, 개질된 지질다당류는 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합물에 대한 보호를 형성시키고(실시예 2D, 3C), 패혈성 및 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하고(실시예 3D), 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 4C); 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2B).

약제는 인간을 포함하는 포유동물에 비경구, 경구, 직장, 질내, 경피, 설하 및 에어로졸 투여를 위해 의도된다. 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 디-아실화된 및 트리-아실화된 유도체 또는 디-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 디-아실화된, 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체의 조합물의 용도는 약제의 제작에서 청구된다. 한편, 개질된 다당류의 조합물은 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합에 대한 보호를 형성시키고(실시예 2D, 3F), 패혈성 및 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 제공하고(실시예 3D), 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제이고(실시예 3F, 4B, 4C), 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

약제는 인간을 포함하는 포유동물에 비경구, 경구, 직장, 질내, 경피, 설하 및 에어로졸 투여를 위해 의도된다.

개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 이의 디-아실화된 또는 트리-아실화된, 또는 테트라아실화된 유도체는 세균, 바이러스 및 다른 감염증에 대한 백신의 제작에서 면역자극 담체로서 청구된다. 한편, 개질된 지질다당류는 방어 항원 또는 합텐과 콘주게이션되는데, 이는 바람직하게 합성 또는 단백질, 또는 다당류 특성을 갖는다. 개질된 다당류는 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C). 개질된 지질다당류(S-LPS), 즉 디-아실화된 및 트리-아실화된 유도체 또는 디-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체, 또는 디-아실화된, 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 유도체의 조합물의 용도는 세균, 바이러스 및 다른 감염증에 대한 백신의 제작에서 면역자극 담체로서 청구된다. 한편, 개질된 지질다당류는 방어 항원 또는 합텐과 콘주게이션되며, 이는 바람직하게 합성 또는 단백질, 또는 다당류 특성을 갖는다. 개질된 지질다당류의 조합물은 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성이다(실시예 2C).

본 발명의 하기 도면에서 예시된다.
도 1은 특허 RU 2154068호로부터의 데이타를 기반으로 한 트리-아실화된 지질 A E. 콜라이 OM174 (A 및 B) 및 웨스트팔 LPS E. 콜라이 O:111B4 (C)의 마우스에 대한 정맥 투여 후 혈청에서 내독소 반응의 매개체 TNF-α 및 전염증성 사이토카인 IL-6의 생체내 생산의 그래프를 도시한 것이다. 이러한 경우에, 수직축은 TNF-α 농도(pg/mL)에 대한 수치 및 IL-6 농도(ng/mL)에 대한 수치를 나타낸다. 수평축은 마우스에 소정 용량의 제조물 OM174 (mg/kg)를 주입하기 위한 수치를 나타낸다(A 및 B). 수직축 (C)은 마우스에 소정 용량의 LPS (mg/mL; 양성 대조군) 및 염수 용액(0.85% NaCl 용액; 음성 대조군)의 주사를 위한 수치를 나타낸다. 진한 선은 OM174에 대한 용량 수치(0.20; 2.00; 2.01; 3.40 및 28.10 (A 및 B)), 및 웨스트팔 LPS E 콜라이드 O:111B4에 대한 수치(0.002; 0.020; 0.200 및 2.000 (C))에 대한 외삽법 라인을 나타낸 것이다.
도 2는 S. 플렉스네리 2a 탈아실화된 S-LPS의 ¹³C-NMR-스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 본래 LPS 웨스트팔 (A) 및 개질된 S-LPS (B) S. 플렉스네리 2a (1A, 1B), E. 콜라이 O:55 (2A, 2B), K. 뉴모니애 (3A, 3B), S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 (4A, 4B)의 샘플에 대한 SDS-PAGE 후에 얻어진 은 염색트랙의 사진을 도시한 것이다.
도 4는 S. 플렉스네리 2a 디-아실화된 S-LPS로부터 얻어진 지질 A의 ESI-MS 질량-스펙트럼을 도시한 것이다.
도 5는 S. 플렉스네리 2a 트리-아실화된 S-LPS로부터 얻어진 지질 A의 ESI-MS 질량-스펙트럼을 도시한 것이다.
도 6은 S. 플렉스네리 2a 테트라-아실화된 S-LPS로부터 얻어진 지질 A의 ESI-MS 질량-스펙트럼을 도시한 것이다.
도 7은 사전-탈아실화된 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 S-LPS의 ¹³C-NMR-스펙트럼을 도시한 것이다.
도 8은 마우스 당 25 mcg의 용량에서 2-acLPS, 3-acLPS 4-acLPS S. 플렉스네리 2a로 제조된 제조물, 및 또한 이들의 조합물(각각 성분 질량비 1:1:1, 3:1, 1:1 및 3:1를 갖는 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) 및 (2-acLPS + 4-acLPS)), 및 웨스트팔 LPS S. 플렉스네리 2a로 제조된 제조물로 마우스의 1차(A) 및 2차(B) 면역화 후에 IgG 항체 생산(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 9는 마우스 당 25 mcg의 용량에서 2-acLPS, 3-acLPS 4-acLPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901로 제조된 제조물, 및 또한 이의 조합물(성분 질량비 각각 1:1:1, 3:1, 1:1 및 3:1을 갖는 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) 및 (2-acLPS + 4-acLPS)), 및 웨스트팔 LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901로 제조된 제조물로 마우스의 1차(A) 및 2차(B) 면역화 후 IgG 항체 생산(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 10은 마우스 당 25 mcg의 용량에서 2-acLPS 및 3-acLPS K. 뉴모니애로 제조된 제조물, 및 또한 성분 질량비 1:1:1을 갖는 이의 조합물 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), 및 웨스트팔 LPS K. 뉴모니애로 제조된 제조물로 마우스의 1차(A) 및 2차(B) 면역화 후 IgG 생산(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 11은 2-acLPS, 3-acLPS 및 4-acLPS E. 콜라이 O:55로 제조된 제조물 및 또한 각각 성분 질량비 1:1:1, 3:1, 1:1 3:1을 갖는 이들의 조합물 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS) 및 (2-acLPS + 4-acLPS), 및 Westphal LPS E. 콜라이 O:55로 제조된 제조물을 마우스 당 25 mcg의 용량으로 마우스르 1차(A) 및 2차(B) 면역화시킨 후 IgG 생성(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 12는 마우스 당 25 mcg의 다당류 또는 20 mcg의 단백질의 용량에서 면역자극 담체와 함께 Vi-항원 및 테타누스 톡소이드(TT)로 제조된 콘주게이션, 즉 성분 질량비 1:1:1을 갖는 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS) S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합물, 및 또한 순수한 Vi-항원 및 TT로 마우스의 1차(A) 및 2차(B) 면역화 후 IgG 항체 생산(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 13은 마우스당 100 mcg의 용량의 다가 이질-장티푸스-에세리키아 백신, 및 또한 이의 개개 성분들, 즉 마우스 당 25 mcg 용량의 질량비 1:1:1의 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), S. 플렉스네리 2a 또는 S. 손네이, 또는 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, 또는 E. 콜라이 O:55의 조합물로 마우스의 1차(A) 및 2차(B) 면역화 후에 IgG 항체 생산(15일)의 다이아그램을 도시한 것이다. 수직 축은 역가 혈청 희석의 수치를 나타낸다.
도 14는 소정 용량의 LD100의 독성 인플루엔자 균주 A 서브타입 H1N1로 감염된 두 마우스 그룹의 생존율의 그래프를 도시한 것이다.

바람직한 구체예

실시예 1

마우스에 내독성 세균의 개질된 S- LPS 및 개질된 지질 A의 정맥내 (i.v.) 투여 후 내독소 반응의 매개체 TNF-α의 생체내 유도

특허 RU 2154068호로부터의 데이타에 따르면, E. 콜라이, H.인플루엔자 및 P. 에루기노사의 트리-아실화된 및 테트라-아실화된 지질 A는 내독성 반응의 매개체, 즉 TNF-α의 강력한 유도 물질이다. 표 1은 마우스에 E. 콜라이 OM-174 및 Westphal LPS E. 콜라이 O:111B4의 트리-아실화된 지질 A(3-acLA)의 i.v. 투여 후 혈청에서 생체 내 TNF-α 생산과 관련한 도 1(A, B, C)에서의 그래프로부터 외삽된 데이타를 나타낸다. E. 콜라이 OM-174 트리-아실화된 지질 A와 상업적으로 입수 가능한 내독소 Westphal LPS E. 콜라이 O:111B4 간의 생체 내 TNF-α의 유도에 대해 단지 10배 차이가 검출되었으며, 이는 백신 또는 백신 성분(어주번트) 둘 모두로서 이의 사용을 배제하고, E. 콜라이 트리-아세틸화된 지질 A의 필수적인 내독성이 존재한다는 것의 증거이다.

표 1

특허 RU 2154068호로부터의 데이타에 의해 마우스에 E. 콜라이 OM-174 트리-아실화된 지질 A 및 Westphal LPS E. 콜라이 O:111B4의 i.v. 투여 후 혈청에서 내독소 반응의 매개체인 TNF-α의 생체내 생산

실제 장내 세균 S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, E. 콜라이 O:55, K. 뉴모니애로부터 얻어진, 디-아실화된 S-LPS (2-acLPS), 트리-아실화된 S-LPS (3-acLPS), 테트라-아실화된 S-LPS (4-acLPS) 및 상응하는 디-아실화된 지질 A (2-acLA), 트리-아실화된 지질 A (3-acLA), 테트라-아실화된 지질 A (4-acLA)의 i.v. 투여 후 내독소 반응의 매개체인 TNFα의 생체내 유도의 비교 연구는 동물 혈청에서의 사이토카인 농도의 유의미한 차이를 나타내었다. 얻어진 데이타는 표 2에 제공되며, 이러한 경우에, 언급된 세균의 개질된 S-LPS 및 지질은 실시예 2A에 따라 얻어졌다. TNF-α의 양을 제조업체 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 시험 시스템 Quantikine Mouse TNF-α/ TNFSF1A (R&D Systems, USA)를 이용하여 마우스 혈청에서 결정하였다. 동물 혈청 혈액 샘플을 투여 후 90분에 채취하였다.

표 2에 기술된 데이타는, 개질된 지질 A와는 상반되게, 장내 세균의 상응하는 개질된 S-LPS가 내독성 쇼크의 매개체인 TNF-α의 불량한 유도 물질이고 백신 제조물로서 사용될 수 있다는 것을 입증한다.

표 2

마우스에 장내 세균으로부터의 개질된 S-LPS 및 개질된 지질 A의 i.v. 투여 후 2시간 후 혈청 중 TNF-α 농도(pg/mL)

실시예 2

내독성 세균의 개개의 개질된 S- LPS 및 이들의 조합물의 제조 및 특징분석

A. 내독성 세균의 개개의 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 제조

S. 플렉스네리 2a의 세균 배양물을 딥 배양(deep cultivation)에 의해 액체 배지에서 제조하였다. 액체 상으로부터 세균 세포의 분리를 플로우 원심분리(flow centrifuge)에 의해 수행하였다. 얻어진 습윤 세포를 먼저 염수 용액으로 세척하고 이후에 물로 세척하고, 이후에 이러한 것을 동결건조하였다.

20 g의 건조된 세균 세포를 Westphal 방법(Westphal O., Luderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysacchariden Gram-negativer Bakterien. Angew. Chemie., 1954, vol. 66, pp.407-17)에 의해 68 내지 70℃에서 고온의 45% 수성 페놀로 추출하고, 960 mg의 미정제 LPS를 수성 상으로부터 수득하고, 이후에 연속적으로 투석 및 동결건조하고, 이후에 이를 0.01% (w/w) CaCl₂ 및 MgCl₂를 함유한 pH=7.2의 0.05M TRIS-완충 용액에 다시 용해시키고, RNAse 및 DNAse를 각각 100 mcg/mL 및 10 mcg/mL의 농도로 첨가하고, 37℃에서 16시간 교반한 후에, 반응 혼합물을 55℃에서 2시간 동안 프로테이나제 K (20 mcg/mL)로 처리하였다. 얻어진 용액을 50 kDa의 막 통과 한계를 갖는 한외여과를 위해 Vladisart 설치를 이용하여 투석하였다.

투석된 용액을 농축시키고, 이후에 동결건조하여, Bradford 방법[Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, vol. 72, pp. 248-54]에 의해 측정하는 경우에 2%(w/w) 이하의 단백질을 함유하고 Spirin 방법[Spirin A.S. Spectrophotometric determination of the total amount of nucleic acids. Biochemistry, 1958, v. 23, No. 4, p. 656]에 의해 측정하는 경우에 2%(w/w) 이하의 핵산을 함유한 530 mg의 단리된 LPS를 수득하였다.

제조된 LPS를 SDS-PAGE 데이타에 의해 특징분석하였으며, 이는 한 세트의 정확하게 고대하는 밴드의 <<전형적인>> 그림을 나타내는데, 이들 각각은 O-특이적 다당류 사슬에서 명확한 수의 반복 단위를 갖는 S-LPS 분자에 해당하며, 또한 가장 빠르게 이동하는 (최저) 구역은 R-LPS에 해당한다(도 3. 1A).

건조된 세균 세포 S. 플렉스네리 2a로부터 단리된 LPS를 수성 암모니아에 용해시키고, 얻어진 용액을 자석 플레이트 상에서 교반하고, 이후에 5 내지 10℃로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 10% 염산에 의해 중화시키고, 얻어진 용액을 교반하면서 8 내지 10배 부피의 에탄올에 붓고, 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 이후에 침전 절차를 2회 반복하고, 얻어진 침전물을 알코올에 용해시키고, 이후에 얻어진 용액을 동결건조시켰다. 이에 따라, 순수한 일부 탈아세틸화된 S-LPS를 수득하였으며, 이는 전기영동 데이타에 의해 입증된다(도 3. 1A). 지질 성분에서 디- 또는 트리-, 또는 테트라 지방산 잔기(디-, 트리- 및 테트라-아실화된 유도체, 즉 2-acLPS, 3-acLPS 및 4-acLPS)로 이루어진 일부 탈아실화된 S-LPS를 S. 플렉스네리 2a LPS의 알칼리성 분해의 조건, 특히 비누화 반응의 온도 및 시간 및 또한 암모니아 하이드록사이드의 농도를 변화시킴으로써 제조하였다.

B. 개개의 개질된 S-LPS의 구조, 조성 및 물리화학적 성질

지방산 조성에 대한 데이타를 온화한 가수분해(1% AcOH, 100도, 1시간)에 의해 각 S-LPS로부터 추출된 각 S-LPS의 지질 A의 분석을 기반으로 하여 획득하였다. 도 4, 도 5 및 도 6은 탈아실화된 S-LPS S. 플렉스네리 2a로부터 제조된, 지질 A의 통상적인 질량-스펙트럼을 나타낸 것이다. 질량-스펙트럼에서 특징적인 신호는 m/z 871, 1053 및 1279이다(m/z의 기여(contribution) 제외). 각 스펙트럼에서 이러한 주요 신호는 각각 지질 A의 디-(도 4), 트리- (도 5) 및 테트라-아실화된 (도 6) 유도체에 해당한다. 탈아실화된 지질 A의 질량-스펙트럼에서 펜타- 및 헥사-아실화된 (각각 m/z 1506 및 1716) 유도체의 신호의 완전한 부재를 주목하는 것이 필수적이며, 이의 세기는 초기 S-LPS로부터 지질 A의 스펙트럼에서 매우 높았다.

얻어진 탈아실화된 S-LPS의 산물에서 주요 성분과 소수/소수 성분 간의 비의 평가를 위하여, 질량-스펙트럼에서 상응하는 신호의 세기를 측정하였다. 모노- 및 디포스포릴화된 유도체에 해당하는 피크 세기가 고려되었다. 디-아실화된 S-LPS의 경우에, 주요 물질의 함량은 91 % (w/w)이었으며, 트리-아세틸화된 경우에, 85 % (w/w), 및 테트라-아실화된 S-LPS의 경우에 88 % (w/w)이었다. 전기분무를 갖는 고해상동 질량-분광법 및 이온-사이클로트론 공명을 이용한 이온 검출을 Bruker Daltonics 분광계, 모델 Apex II (자석 7 (Tesla)을 구비함) 상에서 수행하였다.

또한, LPS 및 얻어진 일부 탈아실화된 S-LPS의 분석을 ¹³C-NMR 분광법에 의해 수행하였다. ¹³C-NMR-분광법을 제조업체로부터의 XWINNMR 소프트웨어 및 임펄스 시퀀스와 함께, Bruker 분광계, 모델 DRX-500에 의해 수행하였다. 스펙트럼의 등록을 표준물로서 아세톤(31.5 ppm)을 함유한 D₂O(99:95%)에서 수행하였다. 초기의 및 일부 탈아실화된 S-LPS의 ¹³C-NMR-스펙트럼의 비교는 넓은 신호를 제외하고 이의 완전한 동일성을 나타내는데, 이는 30 내지 34 ppm의 영역에서 지질 A로부터의 지방산의 메틸렌 잔기에 해당하며, 이의 적분 세기는 알칼리성 분해 후 얻어진 S-LPS의 스펙트럼에서 유의미하게 감소되었다. 추가적으로, ¹³C NMR-스펙트럼의 비교 분석은 LPs의 개질(탈아실화) 동안 O-PS 반복 단위의 주요 구조를 변화시키지 않음을 나타낸다.

도 2는 디-아실화된 S-LPS S. 플렉스네리 2a의 예시적인 ¹³С-NMR-스펙트럼을 도시한 것으로서, 여기서 다당류 성분에 속하는 영역의 스펙트럼은 상응하는 비개질된 S-LPS로부터 단리된 O-PS의 스펙트럼과 완전히 일치한다. 얻어진 스펙트럼 데이타와 문헌 데이타[Andrei V. Perepelov, Vyacheslav L. L'vov, Bin Liu, Sof'ya N. Senchenkova, Maria E. Shekht, Alexander S. Shashkov, Lu Feng, Petr G. Aparin, Lei Wang, Yuriy A. Knirel. A similarity in the O-acetylation pattern of the O-antigens of Shigella flexneri types 1a, 1b, 2a. Carbohydr. Res., 2009, vol. 344, pp.687-92]와의 완전한 일치는 제조된 생성물이 긴 O-PS 사슬을 갖는 탈아실화된 S-LPS임을 나타내는 것인데, 왜냐하면, 스펙트럼에서 올리고당 코어에 속하는 신호가 존재하지 않기 때문이다.

얻어진 제조물에서 단백질 및 핵산의 함량은 1%(w/w)를 초과하지 않는다. 천연 S-LPS를 상술된 방법(실시예 2A)에 의해 건조된 세균 세포 S. 엔테리카 sv 티파이 또는 E. 콜라이 O:55로부터 추출하고, 이후에 이를 알칼리 처리하여 사전-탈아실화된 S-LPS를 수득하고, 이로부터 이의 개개 디-, 트리-, 테트라-아실화된 것을 추가로 단리시켰다. 사전-탈아신화된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이의 ¹³C-NMR-스펙트럼은 도 7에 나타내었다. K.뉴모니애 박테리움으로부터의 개개의 디-, 트리- 및 테트라-아실화된 S-LPS를 동일한 방법에 의해 K.뉴모니애 세균 (Sigma L4288)의 S-PLS의 상업적으로 입수 가능한 샘플로부터 추출하였다. 전기영동 데이타(도 3, 2A 내지 4B)는 생성물이 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55로부터 단리된 S-LPS임을 나타낸다.

내독성 세균의 탈아실화된 S-LPS의 조합물의 면역생물학적 성질의 연구 전에 동결건조된 물질을 수득하였다. 2-성분 조합의 물질을, 비발열성 물에서 요망되는 질량비로 2-acLPS 및 3-acLPS; 2-acLPS 및 4-acLPS; 3-acLPS 및 4-acLPS를 용해시킴으로써 제조하였고, 이후에 얻어진 용액을 동결건조하였다. 유사한 방식으로 질량비 1:1:1의 질량비로 2-acLPS, 3-acLPS 및 4-acLPS를 함유한 3-성분 조합의 물질을 제조하였다.

C. 개개의 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 발열원성

내독성 세균의 개개의 탈아실화된 S-LPS 및 이들의 조합물의 제조의 낮은 및 임상적으로 적용 가능한 내독성 수준을 실험 동물에서 생체 내에서의 특수 발열원성 연구에 의해 그리고 발열원성 및 안전성의 임상 연구에 의해 입증하였다. S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 개개의 개질된 S-LPS, 즉 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS 및 이들의 조합물, 즉 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS), (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS), 및 또한 전통적인 Westphal 방법에 의해 S. 플렉스네리 2a로부터 얻어진 LPS의 제조물의 발열원성을 상업적 Vi-항원 백신과 비교하여 결정하였다. 시험을 유럽 약전 요건(European Pharmacopoeia.7-th Edition, July 2010, pp. 162-163) 및 Vi-다당류 백신에 대한 WHO 기술적 규제 요건(Requirements for Vi-polysaccharide typoid vaccines. WHO Technical Report Series No.840, 1994, Annex 1)에 따라 2.8 내지 3.05 kg 체중의 친칠하 래빗에서 수행하였다. 각 제조물의 i.v. 투여 후에, 래빗 직장 온도를 1시간 간격으로 3회 측정하였다. 전체 온도 상승이 1.15℃를 초과하지 않는 경우에 약물이 비발열성인 것으로 여겨진다. 시험 결과는 표 3에 제공된다.

2-acLPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55는 고도의 비발열성 제조물이다. 래빗 발열성 시험에서, 비발열 용량의 투여는 각각 34, 21, 37 및 14 mcg/kg이다. 디-아실화된 S-LPS 유도체에 대하여, 발열원성 파라미터는 다당류 Hib 백신에 대한 WHO 전문가 위원회의 요건을 크게 초과한다[Recommendations for the production and control Haemophilis influenzae type b conjugate vaccines. WHO Technical Report Series, No.897, 2000]. 3-acLPS는 또한 비발열성 생성물이다. 비발열 용량의 3-acLPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K 뉴모니애, E. 콜라이 O:55의 투여는 각각 0.2; 0.1; 0.1 및 0.1 mcg/kg이다. 이에 따라, 3-acLPS 독성 감소는 4-acLPS에 대한 상응하는 파라미터를 초과하지만, 독물제거 정도에 따라 2-acLPS 보다 낮다.

표 3

S. 플레스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K. 뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 개개의 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 발열원성의 비교 평가

3-acLPS의 발열원성의 파라미터는 다당류 Hib-백신에 대한 WHO 전문가 위원회의 요건을 충족시킨다. 4-acLPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901은 중간 정도의 비발열성 제조물이며, 최대 0.025 mcg/kg의 이의 용량은 정맥내로 투여될 때 비발열성이다. 1:1:1의 성분 질량비의 S. 플레스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K. 뉴모니애, E. 콜라이드 O:55 세균의 개개 탈아실화된 S-LPS의 3-성분 조합, 즉 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS)는 래빗 발열성 시험에서 낮은 발열원성을 나타내었다. 래빗 체중 1 kg 당 최대 0.6 mcg이 언급된 조합물의 용량은 정맥내로 투여될 때 비발열성이다. 생체내 내독성 감소의 가장 민감한 파라미터, 즉 발열원성의 비교 평가는 이러한 조합의 성분인 3-acLPS 및 4-acLPS와 비교하여 3성분 조합의 장점을 나타낸다. 이의 발열방지 작용의 상승 효과는 제공된 질량비에서 관찰되는데, 낮은 발열성 2-acLPS와 보다 높은 발열성 3-acLPS 및 4-acLPS의 혼합은 잔류 내독성을 약 3 내지 5배 약화시키고 조합에서 특히 4-acLPS의 경우에 최대 8배의 비발열성 용량의 증가를 야기시킨다. 이러한 3-성분 조합이 조성물에 함유된 성분들의 임의 질량비에서, 특히 하기 질량비 (45:45:10); (45:10:45); (10:45:45)에서 적절하게 명확한 상승 효과를 제공한다는 것이 주지되어야 한다. S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 개개의 탈아실화된 S-LPS의 2-성분 조합 (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) 및 (3-acLPS + 4-acLPS)은 또한, 조성물에 함유되는 성분들의 임의 중량비에서 3-acLPS 또는 4-acLPS의 잔류 내독성 감소와 관련하여 성분들의 상승적 상호작용을 나타내었다. 그러나, 최대 중량의 1/2 이상의 2-acLPS를 함유한 (2-acLPS + 3-acLPS) 및 (2-acLPS + 4-acLPS)의 2-성분 조합(표 3)은 최대 상승 효과를 갖는데, 이는 안전성 측면에서 가장 유망하다는 것을 인정하는 것이다. 이에 따라, 성분 질량비 1:1의 (2-acLPS+ 3-acLPS) S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합은 낮은 발열원성을 나타내었으며(래빗에 대한 투여 용량은 각각 1.0 및 0.5 mcg/kg임), 성분 질량비 3:1의 (2-acLPS+4-acLPS)의 조합은 유사한 발열원성 수준을 갖는다. 2 성분 조합에서 3-acLPS의 특정 비발열성 용량은 3 내지 5배 증가하며, 4-acLPS에 대하여 최대 2배 증가한다.

D. 개개의 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 면역원성

두 그룹의 (CVAXC57B1/6) F1 마우스를 S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 개개의 개질된 S-LPS, 즉 2-acLPS, 3-acLPS, 4-acLPS, 및 성분 질량비 1:1:1의 조합 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS), 성분 질량비 3:2의 (3-acLPS + 4-acLPS), 성분 질량비 1:1의 (2-acLPS + 3-acLPS), 성분 질량비 3:1의 (2-acLPS + 4-acLPS)의 제조물로 복강내(i.p.)로 면역접종하고, 또한 마우스 당 25 mcg의 용량으로 전통적인 Westphal 방법에 의해 상술된 세균으로부터 얻어진 LPS로 면역접종하였다.

면역접종 후 15일에, ELISA 방법에 의한 S-LPS 특이적 IgG 항체 수준을 평가하기 위해 동물 혈청 샘플링을 수행하였다. 관련된 O-혈청타입을 갖는 LPS를 마이크로플레이트 상에 흡착시키기 위해 사용하였다. 2차 면역 반응을 연구하기 위하여, 동일한 그룹의 마우스를 1차 주사 후 1달째에 마우스당 25 mcg의 용량으로 다시 면역접종하였다. 2차 면역접종 후 15일에 혈청 샘플링을 다시 수행하였다. 얻어진 결과는, S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 디-아실화된 유도체가 트리- 및 테트라-아실화된 유도체에 비해 낮은 면역원성을 가지고, 실험실 동물에서 낮은 1차 면역 반응을 유도함을 나타낸다(도 8A, 9A, 11A). 또한, K.뉴모니애의 디-아실화된 유도체는 가장 높은 1차 면역 반응을 유도한다(도 10A). 2-acLPS S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 및 E coli O:55로 면역접종 후 실험실 동물에서 2차 면역 IgG 반응의 수준은 1차 면역 반응과 비교하여 유의미하게 더욱 높았지만, 이는 3-acLPS에 대한 2차 면역 반응과 비교하여 8.0; 8.0 및 7.4배로 더욱 낮았고, 동족 세균으로부터 단리된, 4-acLPS에 대한 2차 면역 반응과 비교하여 12.0; 11.7 및 10.2배로 더욱 낮았다(도 8B, 9B, 11B). 동시에 2-acLPS K.뉴모니애에 대한 2차 면역 IgG-반응은 3-acLPS에 대한 것과 비교하여 단지 2.4배 차이가 났다(도 10B).

3-acLPS S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 및 E. 콜라이 O:55에 대한 1차 반응에서 IgG 항체 생산 수준은 관련된 혈청 타입을 갖는 4-acLPS에 대한 1차 반응과 비교하여 각각 3.0; 1.1 및 3.4배 더욱 낮았다(도 8A, 9A, 11A). 3-acLPS S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 및 E. 콜라이 O:55로 실험실 동물의 면역접종 후 2차 면역 반응은 높지만(항체 역가는 1600, 4000, 1800를 초과하였다), 동시에 이는 관련 혈청 타입을 갖는 4-acLPS에 대한 반응과 비교하여 약간 낮았다(도 8B, 9B, 11B). 4-acLPS S. 플렉스네리 2a, S 엔테리카 sv 티파이 O:901 및 E. 콜라이 O:55는 3-acLPS와 비교하여 실험실 동물에서 3.0; 1.1 및 3.4 배 더욱 높은 1차 면역 반응을 유도하였다(도 8A, 9A, 11A). 4-acLPS로 실험실 동물의 면역화 후 2차 면역 반응 수준은 관련 혈청 타입을 갖는 3-acLPS에 대한 것과 비교하여 1.4; 1.5 및 1.2배 더욱 높았다(도 8B, 9B, 1B). 4-acLPS의 약간 보다 높은 면역원성은 명확하게 이의 지질 A의 높은 아실화도에 의해 야기되고 다른 개질된 S-LPS와 비교하여, 특히 2-acLPS와 비교하여 응집물을 형성시키는 현저한 능력을 갖는다.

내독성 세균의 개개의 개질된 S-LPS의 조합은 이의 지질 A 도메인의 표준(canonical) 구조의 필수 개질에도 불구하고 높은 면역원성 가능성을 나타낸다. 이에 따라, 3-성분 조합 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS)은 성분 질량비 1:1:1의 S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55의 O-항원에 대한 1차 면역 반응을 유도하였으며, 이의 수준은 다소 높고 관련 세균 균주로부터 얻어진 전형적인 Westphal LPS에 대한 반응 수준에 비해 유의미하게 차이가 나지 않는 것이다(도 8A, 9A, 11A). 이에 따라, Westphal 방법에 의해 제조된 저-내독소 조합된 개질된 S-LPS-면역원 및 내독소 및 발열성 LPS의 면역원성 가능성은 대략적으로 동일한 것으로 결정되었는데, 이는 조합이 이의 면역원 성질의 향상에 대한 상승 효과를 제공한 개질된 S-LPS의 상이한 정도의 아실화 회합을 갖는 특별한 높은-면역원성으로 이루어짐을 명시하는 것이다.

이에 따라, S. 플렉스네리 2a, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애 및 E. 콜라이 O:55 세균으로부터 얻어진 (2-acLPS + 3-acLPS + 4-acLPS)의 3-성분 조합은 실험실 동물의 면역접종 후 성분 질량비 1:1:1에서 2차 IgG 면역 반응을 유도하였는데, 이는 2-acLPS에 대한 반응과 비교하여 32.0; 33.6; 8.0 및 32.0배 더욱 높은 것이고, 3-acLPS에 대한 반응과 비교하여 4.0; 4.2; 3.3 및 4.3배 더욱 높은 것이고, 4-acLPS에 대한 반응과 비교하여 2.7; 2.8; 및 3.1배 더욱 높은 것이다(도 8B, 9B, 11B). 동시에, 이러한 조합의 조성에서 개개의 개질된 S-LPS의 투여 용량은 적절한 일성분으로서 투여되는 용량의 단지 33%(w/w)이다. S-LPS의 이러한 3-성분 조합이 임의 성분 질량비, 특히 하기 질량비 (10:45:45); (45:10:45); (45:45:10)에서 면역원성의 증가와 관련한 다소 현저한 상승 효과를 제공한다는 것이 주지되어야 한다.

S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, K.뉴모니애, E. 콜라이 O:55 세균의 개개의 개질된 S-LPS의 2-성분 조합, 즉 (2-acLPS + 3-acLPS), (2-acLPS + 4-acLPS) 및 (3-acLPS + 4-acLPS)는 또한, 함유하는 성분의 임의 질량비에서 면역원성 향상과 관련하여 상승적 상호작용을 나타낸다. 추가적으로, 살모넬라 또는 시겔라 O-항원에 대한 가장 높은 2차 면역 반응은 성분 질량비 1:1의 (2-acLPS + 3-acLPS), 성분 질량비 3:1의 (3-acLPS + 4-acLPS), 및 성분 질량비 3:1의 (2-acLPS+4-acLPS)의 조합에 의해 유도되었다. 이에 따라, IgG-반응 수준은 S. 플렉스네리 2a의 성분 질량비 3:1의 조합 (3-acLPS + 4-acLPS) 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 성분 질량비 1:1의 조합 (2-acLPS + 3-acLPS) 에 대해 가장 높았다(도 8B, 9B). 3-성분 조합이 2-성분 조합과 비교하여 더욱 현저한 상승 효과를 제공한다는 것이 주지되어야 한다. 이에 따라, 약간 보다 높은 IgG-반응 수준은 성분 질량비 1:1:1의 S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 세균으로부터의 3-성분 조합 및 각각 성분 질량비 1:1, 3:1, 3:1의 (2-acLPS + 3-acLPS), (3-acLPS + 4-acLPS) 및 (2-acLPS+4-acLPS)의 O-항원 조합의 2-성분 저-발열성 동족체의 비교 면역원성 연구에서 3-성분 조합으로 면역접종 후 결정되었다(도 8A, 9A).

이에 따라, 개질된 S-LPS의 조합의 면역원성은 성분드르이 조성, 양 및 질량비에 의해 결정된다. 3-성분 조합은 가장 효과적인 조합인 것으로 여겨질 수 있다. 한편, 개질된 S-LPS의 조합의 면역원성은 또한 장내 세균의 O-항원의 구조(혈청 타입)에 의해 규정된다. 혈청 타입의 수에 대하여, IgG 항체의 큰 증가는 개질된 S-LPS의 2-성분 저-발열성 조합을 사용하여 또한 달성될 수 있다.

실시예 3

내독성 세균의 개질된 S- LPS 및 이들의 조합물을 함유한 백신

A. 콘주게이션되지 않은 백신(약제)의 제조에서 개질된 S-LPS 및 이들의 조합물의 사용

콘주게이션되지 않은 백신의 제조는 실시예 2A, 2B에 따른 S-LPS의 개개의 디-, 트리- 및 테트라-아실화된 유도체 및 조합의 합성, 및 후속하여 pH 안정화제, 보존제, 어주번트, 등장화제 또는 이들의 조합일 수 있는 약제학적으로 허용되는 특수 첨가제 및 활성 물질을 함유한 용액으로 바이알 또는 시린지의 비패혈성 충전을 포함한다. 백신화 용량은 0.010 mg 내지 10 mg 양의 비콘주게이션된 형태의 개질된 S-LPS 또는 비콘주게이션된 형태의 개질된 S-LPS의 조합; 0.150 mg의 소듐 클로라이드, 0.052 mg의 2염기성 소듐 포스페이트, 및 0.017 mg의 일염기성 소듐 포스페이트가 첨가된 0.75 mg 이하의 페놀(보존제); 0.5 ml의 멸균 발열원-부재 주사용 물(PA 42-2620-97, EP IV 2002)을 함유한다.

B. 비콘주게이션된 백신의 발열원성

S. 플렉스네리 2a의 2-acLPS, 3-acLPS, 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS +3-acLPS+4-acLPS)의 조합; S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 2-acLPS, 3-acLPS, 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합의 발열원성을 측정하였고, 이를 상업적 Vi-항원 백신의 발열원성과 비교하였다. 모든 제공된 백신 제조물은 래빗 중량 1kg 당 0.050 mcg의 용량에서 비발열성이었다. 시험 결과는표 4에 제공되어 있다.

표 4

래빗 중량 1kg 당 0.050 mcg의 용량의 S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 세균의 개질된 S-LPS 및 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 비콘주게이션된 백신의 발열원성

C. 비콘주게이션된 백신의 보호 성질

개질된 S-LPS의 조합을 함유한 백신의 보호 성질의 평가를 이질 감염증[Sereny test; Sereny B. A new method for the measurement of protective potency of disentery vaccines. Acta Microbiol., Acad.Sci. Hung., 1962, v.9, pp. 55-60] 및 장티푸스 감염증(활성 마우스보호 시험)의 실험 모델에서 수행하였다.

기니아 피그에서 보호 시겔라 점막 면역력의 형성을 연구하기 위하여, 200 내지 250 g의 체중의 실험실 동물을 동물 당 25 내지 50 mcg의 용량에서 S. 플렉스네리 2a의 3-acLPS 또는 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합물, 또는 질량비 3:1의 (2-acLPS+3-acLPS)의 조합물을 포함하는 백신으로 등 부분에 10일 간격으로 피하주사(s.c.)로 면역접종하였다. 대조군 동물에는 백신 제조물 대신에 염수를 제공하였다. 마지막 면역접종 후 10일째에, 이질 각결막염(Sereny 시험)을 30 mcL의 멸균 염수에서, ID100에 가가운 용량(10⁹세포)에서 그리고 2ID₁₀₀에 가까운 용량(2x10⁹ 세포)에서 S. 플렉스네리 2a의 독성 균주의 현탁액을 안구 결막 세포에 주입함으로써 실험 및 대조군 동물에서 유도하였다. 2x10⁹ 세포의 용량으로 감염된 대조군에서의 모든 동물 및 10⁹ 세포의 용량으로 감염 대조군에서 90%의 동물에서는 이질 각결막염이 발달하였다(표 5).

25 mcg의 용량에서 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 플렉스네리 2a의 조합물을 포함하는 백신으로의 면역화는 10⁹ 세포의 용량에서 감염된 실험 동물의 75%의 안구 보호율을 제공하였으며, 안구 보호율은 2X10⁹ 세포의 용량에서 감염되었을 때 60%이었다. S. 플렉스네리 2a 세균의 질량비 3:1의 (2-acLPS+3-acLPS)의 조합물 또는 3-acLPS를 포함하는 백신으로 기니아 피그를 면역접종하였을 때 실험 이질 감염증으로부터의 안구 보호율은 55 내지 75%로 다양할 수 있다.

이에 따라,, 현저한 점막 이질방지 면역력은 S. 플렉스네리 2a의 질량비 3:1의 (2-acLPS+3-acLPS)의 조합 또는 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합물 또는 3-acLPS를 함유한 백신으로 동물의 s.c. 면역접종 후에 확인되었다.

표 5

S. 플렉스네리 2a 세균의 개질된 S-LPS 및 개질된 S-LP의 조합물을 함유한 백신으로 전신 면역력의 결과로서 기니아 피그에서의 보호 점막 면역력

보호 장티푸스 면역력을 연구하기 위하여, (CBAXC57B1/6)FI 마우스의 시험 그룹을 3-acLPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901을 포함하는 용량 구배의 백신으로 그리고 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 포함한 백신으로 복막내로 면역접종하였다. 대조군 동물에는 염수가 제공되었다. 12 내지 14일 후에, 두 동물 그룹 모두를 Joo 프로토콜(Joo I., Pusztai Z., Juhasz V.P. Mouseprotective ability of the international reference preparations of typoid vaccine. Z. Immun. Forsch. exp. Ther., 1968, v.135, pp.365-72)에 따라 5%(w/w) 무신 타입 III(Sigma, USA)을 함유한 멸균 염수 중 80 LD50의 용량에서 S. 엔테리카 sv 티파이 Ty2 No. 4446의 독성 장티푸스 균주의 1000 세포(m.c.)로 i.p. 감염시켰다. 두 그룹 모두에서의 동물 생존율을 3 내지 5일 동안 나타났다.

표 6

S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 세균의 개질된 S-LPS 또는 개질된 S-LPS의 조합을 포함하는 백신, 및 장티푸스 백신 Typhim Vi의 보호 성질의 비교 특징분석

표 6에 기술된 바와 같이, 활성 마우스 보호의 시험은 청구된 백신에 대한 필수적인 보호 효능을 나타내었다. 이에 따라, 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 포함하는 백신은 마우스에서의 시험에서 백신 제조물 TYPHIM-Vi와 유사한 보호 효능을 가지고, 장티푸스 백신에 대한 보호 활성의 정량적 표준화의 요건을 충족시킨다.

D. 비콘주게이션된 백신의 쇼크-방지 활성

내독성 쇼크로부터의 동물 보호를 내독성 쇼크 유도하기 72시간 전에 0.5 mL 0.9%-소듐 클로라이드 용액에서 마우스 당 50, 100 및 200 mcg의 용량(각각 2.5; 5 및 10 mg/kg과 동일함)에서 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 손네이의 조합물을 포함하는 백신, 및 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) E. coli O:55의 조합물을 포함하는 백신으로 시험 그룹의 (CVAX C57B1/6)FI 마우스의 예방적 i.p. 면역접종에 의해 수행하였다. 내독쇼 쇼크를 대략 4 LD₁₀₀인 마우스당 2 mg(100 mg/kg)의 용량에서 E. 콜라이 O:55 (Sigma-Aldrich, USA)의 표준 내독소의 i.p. 투여에 의해 유도하였다. 대조군에 동일한 방식에 의해 0.5 mL 염수를 i.p. 투여하였다. 동물 생존율을 내독소의 주사 후에 3일 동안 평가하였다(표 7).

표 7

4 LD₁₀₀의 LPS E. 콜라이 O:55의 i.p. 주사에 의한 내독성 쇼크의 유도에서, S. 손네이 및 에세리키아 콜라이 O:55의 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 백신에 의해 면역접종된, (CBA×C57B1/6)FI 마우스의 생존율

이에 따라, 표 7로부터 청구된 백신의 감소된 내독성에도 불구하고, 각각 80% 및 40 내지 60%, 상당한 (4 LD₁₀₀) 내독소 로드와 관련된 실험 동물의 생존율, 및 결과적으로, 내독성 쇼크의 병인성 메카니즘의 교정를 제공하는 100 및 200 mcg/마우스의 용량에서 효과적인 예방적 제조물이다. 동시에, 개질된 S-LPS S. 손네이의 조합을 포함하는 백신은 유사한 E. 콜라이 O:55 백신에 비해 더욱 현저한 쇼크 방지 활성을 갖는다.

패혈성 쇼크로부터의 동물 보호를 패혈성 쇼크의 시뮬레이션 이전에 30일 간격으로 마우스 당 10 및 50 mcg의 용량(각각 0.5 및 2.5 mg/kg과 동일함)에서 2회 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 손네이의 조합을 포함하는 백신, 및 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) E. coli O:55의 조합을 포함한 백신으로 (CBAX C57B1/6)FI 마우스의 시험 그룹의 예방적 i.p. 면역화에 의해 수행하였다. 패혈성 쇼크 시뮬레이션을 2차 면역화 후 18일 후에 수행하였다. 대조군은 무흠 수술후 동물로 이루어졌다(표 8).

패혈성 쇼크(실험적 복막염) 시뮬레이션을 맹장 결찰 및 천공 절차에 의해 수행하였다(CLP-모델). 시험 및 대조 마우스 그룹을 일반적인 마취제에 의해 마취하였고, 복막을 개방하고, 맹장 및 충수를 제거하였다. 맹장을 충수에 인접한 영역에서 묶고 22G 니들에 의해 2회 천공하였다. 맹장의 내용물을 위 내용물의 복막강의 오염을 위한 형성된 천공을 통해 밀어내고, 이후에 기관을 복부로 역으로 뒤집고 복막강을 바느질하였다.

표 8

1차 면역화 후 8일에 CLP-절차 동안, S. 손네이 및 E. 콜라이 O:55의 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 백신에 의해 면역화된 마웃에서의 패혈성 쇼크 교정

표 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 10 mcg/마우스의 용량에서 청구된 백신으로 동물의 면역화는 실험적 복막염 발달의 억제를 제공하는데 더욱 효과적이고(대조군과 비교하여 30 및 18시간 동안), 패혈증 하에서 생존율을 증가시키는(대조군과 비교하여 36 및 24시간 동안) 것으로 여겨졌다.

E. 비콘주게이션된 백신의 안전성

성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 플렉스네리 2a의 조합을 포함하는 이질 백신, 및 성분 질량비 1:1:1의 조합 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 엔테리카 sv 티파이 O:901을 포함하는 백신을, 25 mcg의 용량에서 빅를 위한 생성물, 즉 장티푸스 Vi-항원 백신 "Vianvac", 및 용매로서 0.5 mL 페놀-포스페이트 완충 용액 중 50 mcg 항원의 용량으로, 20명의 성인 지원자의 세 그룹에 어깨의 상단 1/3에 피하로 1회 주사하였다. 지원자의 약물 주사에 대한 온도 반응, 일반적은 부작용 및 국부 반응을 면역화 후 첫 3일 동안 연구하였다. S. 플렉스네리 2a의 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 백신은 성인 지원자에 대해 높은 안정성 프로파일을 나타내었다. 37.1 내지 37.5℃ 범위에서의 온도 반응이 단지 지원자의 5%에서 확인되었으며, 보다 높은 온도 반응 및 일반적인 부작용이 존재하지 않았으며, 국소 반응(주사 부위의 통증)은 단지 한명의 지원자에서 검출되었다(표 9). 37.1 내지 37.5℃ 범위에서의 온도 반응은 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 포함하는 백신 또는 장티푸스 Vi-항원 백신 "Vianvac"로 면역접종된 지원자의 단지 10%에서 확인되었다(표 9).

표 9

성인 지원자의 면역화 후, 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신 안정성

인간에 비경구로(피하로) 투여하였을 때 청구된 백신의 안전성을 평가하기 위하여 전염증성 사이토카인의 생산을 연구하였다. 용매로서 0.5 mL 페놀-포스페이트 완충 용액에 함유된 50 mcg의 항원의 용량에서 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 포함한 백신을 어깨의 상부 1/3의 외부 표면에서 지원자에게 피하로 1회 주사하였다.

면역화 후 지원자는 5일 동안 의사의 관리하에 있었다. 관리 첫째날에, 지원자는 약물 제조물의 주사 후 2, 4, 6 및 24시간에 의학적 실험을 받았다. 사이토카인 상태를 연구하기 위하여, 청구된 백신의 주사 전에(0시간) 및 투여 후 2, 4, 및 6 시간에 지원자의 정맥으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 문헌 데이타에 따라, TNF-α, IL-1β, IL-6은 3종류의 전염증성 사이토카인, 즉 패혈증의 기본 매개체들을 배열시켰다[Casey L.C., Balk R.A., Bone R.C. Plasma cytokine and endotoxine levels correlate with survival in patients with the sepsis syndrome. Ann. Intern. Med., 1993; 119: 771-78.]. 0.06 내지 0.2 ng/kg의 용량의 Westphal LPS E. 콜라이의 i.v. 투여는 순환하는 TNF-α 및 IL-6의 수준의 2 내지 100배 증가를 제공하며[Taudorf S., Krabbe K.S., Berg R.M.G., Pedersen B.K., Moller K. human models of low-grade inflammation: bolus versus continuous infusion of endotoxin. Clin. Vaccine Immunol., 2007; 14(3): 250-55], 50 mcg (0.8 내지 1 mcg/kg와 동일함)의 용량의 S. 플렉스네리 2a의 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 백신 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 개질된 S-LPS의 조합을 함유한 장피푸스 백신으로 지원자에 면역화시킨 실험에서, 전염증성 사이토카인 농도는 낮았고, 백신 주사 전 지원자로부터 채취된 혈청에서의 농도와는 유의미하게 상이하지 않았다(표 10). 동시에, TNF-α 농도는 2시간에 약간 증가하였으며, IL-6은 청구된 백신의 투여 후 4시간에 약간 증가하였으며, IL-1β 농도는 실제적으로 변하지 않고 기저 수준에서 머물러 있었다.

표 10

개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a의 조합을 함유한 조합의 이질 백신 및 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 장티푸스 백신으로 면역화 후 지원자의 혈청 중의 전염증성 사이토카인의 프로파일

F. 콘주게이트화되지 않은 백신의 면역원성

지원자의 면역 반응을 용매로서 0.5 mL 페놀-포스페이트 완충 용액 중에 함유하는 50 mcg의 항원의 용량의 개질된 S-LPS 및 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a의 조합을 포함하는 백신, 및 또한 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신으로 20명의 성인 지원자의 시험 그룹의 어깨의 상단 1/3에 단일 경피 면역화 후 조사하였다. 2차 면역화를 1차 면역화 후 30일 후에 동일한 방식으로 수행하였다. 연구를 위한 혈청을 백신화 이전 및 1차 및 2차 백신화 후에 30일 후에 각각 지원자로부터 채취하였다.

주요 클래스의 특정 항-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 항체를 HRP와 콘주게이션된 동족형-특이적 항-IgA, 항-IgG 및 항-IgM 항체를 사용하여 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 백신 면역원성은 백그라운드 혈청 수준과 비교하여 면역 혈청에서 LPS-특이적 항체의 4배 이상의 증가, 즉 혈철전환에 의해 평가하였다.

표 11

개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신의 면역원성(1차 백신화)

표 12

개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신의 면역원성(2차 백신화)

높은 수준의 특이적 IgA-항체가 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신으로의 지원자의 1차 및 2차 면역화 후 검출 빈도 또는 최종 역가 중 어느 하나에 의해 관찰되는 것으로 확인되었다(표 11, 표 12).

개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a의 조합을 함유한 백신으로 면역화 후 IgA 항-LPS 항체 역가의 4배 이상의 검출 빈도는 1차 및 2차 면역화 후에 80%이었으며, 70% 경우에서 IgG 항체의 4배 Tg 혈청변환의 최대 검출 빈도는 2차 면역화 후에 검출되었다.

개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신으로의 1차 및 2차 면역화 후 IgA 항-LPS 항체의 4배 이상의 역가 상승은 각각 지원ㅈ의 70% 및 75%에서 확인되었으며, 백신화된 지원자에서 IgG 항체의 4배 이상의 혈청전환의 최대 검출 빈도는 1차 면역화 후 80%이었다.

3-acLPS S. 플렉스네리 2a를 함유한 백신으로의 1차 및 2차 면역화 후에 특이적 IgA 항체의 4배 이상의 역가 상승은 각각 지원자의 40% 및 40%에서 확인되었다. IgG 항체의 4배 이상의 혈청전환의 빈도는 3-acLPS S. 플렉스네리 2a로의 1차 및 2차 면역화 후에 각각 백신화 지원자 중 40% 및 40%이었다.

개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a 및 3-acLPS S. 플렉스네리 2a의 조합물 모두를 포함하는 백신으로 면역화된 지원자 중 LPS-특이적 IgM-항체의 수준 증가는 무시할 정도이고, 2차 면역화 후 각각 10% 및 15%의 4배 이상의 혈청전환을 일으켰다.

개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 백신으로 면역화된 지원자 중 IgM-항체의 혈청전환의 빈도 증가는 유의미하고, 1차 면역화 후 55%이었고 2차 면역화 후 60%이었다. 2차 면역 반응은 LPS S. 플렉스네리 2a에 대한 IgA 및 IgG 항체의 증가로서, 2-acLPS S. 플렉스네리 2a를 포함하는 백신에 의해 면역화된 지원자에서 나타났다.

이에 따라, 시험 결과는 개질된 S-LPS S. 플렉스네리 2a의 조합을 함유한 이질 백신 및 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합을 함유한 장티푸스 백신의 인간에 대한 높은 면역원성을 입증하였다. 특정 항체는 점막 면역력에 대해 가장 중요한 IgA- 및 IgG-항체의 클래스에 의해 제시되었다.

G. 콘주게이션된 백신(약제)의 제조에서 면역자극 담체로서 개질된 S-LPS의 조합물의 사용

성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합물을 실시예 2A 및 실시예 2B에 따라 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 세균으로부터 수득하였다. 개질된 S-LPS에서 활성 작용기를 형성시키기 위하여, 얻어진 조합을 일부 퍼요오데이트 산화로 처리하고 이후에 형성된 알데하이드 기를 카복실기로 산화시켰다. 이후에, 일부 산화된 개질된 S-LPS를 임의 공지된 방법에 의해 백신 항원과 콘주게이션시켰다. 이러한 연구는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드(EDC)를 사용하는 다당류 항원, 즉 캡슐 Vi-항원 또는 단백질 항원-파상풍 톡소이드(TT)와의 콘주게이션 방법을 사용하였다.

Vi-항원 또는 TT와 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 일부 산화된 조합의 콘주게이션을 pH-stat에 의해 pH 값 5.6으로 유지시키면서 4 내지 18시간 동안 EDC의 존재 하에 0.2M 소듐 클로라이드 용액 중에서 수행하였다. 콘주게이트를 용리액으로서 0.2M 소듐 클로라이드 용액을 사용하여 Sepharose CL-6B 상에서 콘주게이션되지 않은 초기 바이오폴리머 및 저분자 불순물로부터 정제하였다. 콘주게이트를 함유하고 컬럼 공간 부피 부근에 용리되는 분획들을 약제학적으로 적합한 특별한 첨가제로 멸균 바이알의 후속 충전을 위해 합하였으며, 이러한 것으로서 pH 안정화제 또는 보존제, 또는 어주번트, 또는 등장화제 또는 이들의 조합이 사용되었다. Vi-항원과 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합의 백신 콘주게이트는 ELISA 방법에 의해 결정된 50% (w/w) 혈청학적 활성 Vi-항원을 함유하였다. 그러나, TT와 동일한 조합의 백신 콘주게이트는 브래드포드 방법[Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp.248-54]에 의해 측정한 경우, 40%(w/w) 단백질 질량을 함유하였다.

1회의 백신화 용량의 콘주게이션된 백신은 0.010 내지 0.200 mg의 개질된 S-LPS의 조합의 콘주게이트; 4.150 mg의 소듐 클로라이드, 0.052 mg의 이염기 소듐 포스페이트, 및 0.017 mg의 일염기 소듐 포스페이트가 첨가된 0.75 mg 이하의 페놀(보존제); 0.5 mL의 멸균 발열원-부재 주사용 물(PA 42-2620-97, EP IV 2002)을 함유한다.

H. 콘주게이션된 백신의 면역원성

면역자극 담체, 즉 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합과 다당류 Vi-항원 및 단백질의 콘주게이트에 대하여 마우스 면역 반응을 연구하였다.

(CBAXC57B1/6) F1 마우스의 그룹을 마우스당 25 mcg의 다당류의 용량에서 상술된 Vi-항원 콘주게이트 및 순수한 Vi-항원에 의해 i.p. 면역화하였다. 콘주게이트는 인간 면역 반응을 유도하였고, 이의 주사 후 15일에, ELISA 방법에 의해 순수한 Vi-항원의 반응과 비교하여 동물 말초 혈청에서 IgG 항체의 5.8배 증가가 검출되었다(도 12A).

2차 면역 반응을 연구하기 위하여, 동일한 마우스 그룹을 1차 투여하고 1달 후에 마우스 당 25 mcg의 다당류 용량의 명시된 백신으로 다시 면역화하였다. 콘주게이트로 재면역화 후 15일째에, IgG 항 Vi-항체 양의 8.2배 증가를 나타내었다(도 12B).

면역자극 담체, 즉 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901와 단백질 TT의 콘주게이트 및 순수한 TT를 또한 마우스 당 20 mcg의 단백질의 용량으로 (CBAXC57B1/6)FI 마우스의 그룹에 i.p.로 투여하였다. 콘주게이트는 단일 주사 후에 인간 면역 반응을 유도하였고 15일째에, 순수한 TT의 반응과 비교하여 동물 말초 혈청에서 IgG 항체 양의 3배 증가가 측정되었다(도 12A).

2차 면역 반응을 연구하기 위하여 동일한 마우스 그룹을 1차 투여 후 1달 후에 마우스당 20 mcg의 단백질의 용량으로 명시된 백신으로 재면역화하였다. 콘주게이트로의 재-면역화 후 15일째에, IgG 항-TT 항체 양의 6.4배 상승이 나타났다(도 12B).

면역자극 담체, 즉 TT와 콘주게이트에 의해 유도된 개질된 S-LPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901의 조합에 대한 O-특이적 항체 수준이 또한 상승된다는 것이 주지되어야 한다. 1차 반응에서, 3.2 배, 및 2차 반응에서 1.5배 증가하였다(도 12A 및 12B). 이에 따라, 면역 반응의 추가적인 상승은 단백질 담체를 갖는 S-LPS 콘주게이트를 투여할 때 단백질 항원 및 담체 둘 모두에 대해 관찰되었다.

I. 다가 이질-장티푸스-에세리키아 콜라이 백신

시겔라 플레스네리 또는 손네이 시겔로시스, 장티파스 열 및 장관 출혈성 E- 콜라이드 O:55 감염증에 대한 다가 백신 물질을 제조하기 위하여, 실시예 2A 및 2B에 따라 동일한 질량 분율의 혈청타입 S. 플렉스네리 2a, S. 손네이, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 및 E. 콜라이 O:55의 성분비 1:1:1의 조합 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS) 물질을 발열원-부재 물에 용해시켰다. 최종 백신 제조물을 실시예 3A에 따라 제조하였다.

다가 이질-장티푸스-에세리키아 콜라이 백신의 면역원성을 (CBAXC57B1/6)FI 마우스에서 시험에 의해 측정하였으며, 이는 마우스 당 100 mcg의 용량의 다가 백신에 의해 i.p, 면역화되었다. 다가 백신의 성분, 즉 비 1:1:1 S. 플렉스네리 2a 또는 S. 손네이 또는 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 또는 E. 콜라이 O:55의 조합 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)을 또한 마우스 당 25 mcg의 용량으로 상이한 마우스 그룹에 별도로 주사하였다. 15일째에, 동물 혈청 샘플을 채취하였다. 2차 면역 반응을 연구하기 위하여, 동일한 마우스 그룹을 1차 주사 후 1달에 마우스당 100 또는 25 mcg의 용량으로 명시된 약물 제조에 의해 다시 면역화하였다. 2차 면역화 후 15일째에, 동물 혈청 샘플을 채취하였다. 다가 백신은 1차 및 2차 면역화 후에 면역 반응을 유도하였다. 동시에, 다가 백신은 이의 개개 성분들 모두, 즉 장티푸스 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, 이질 S. 플렉스네리 2a 및 이질 S. 손네이 및 에세리키아 콜라이 O:55에 대한 IgG 항체 역가를 25 mcg의 용량의 상응하는 성분의 별도의 투여 후 반응 수준과 유사한 수준를 초과하였다(도 13A, B).

이에 따라, 다가 이질-장티푸스-에세리키아 콜라이 백신은 세 가지의 상이한 내독성 세균의 패밀리와 관련된 4개의 세균 균주로부터 단리된 개질된 S-LPS 항원에 대한 마우스에서의 면역 반응을 동시에 유도한다.

실시예 4

개질된 S- LPS 및 이의 조합을 함유한 약제 조성물

A. 약제 조성물(약제)의 제조에서 개질된 S-LPS 및 이의 조합의 사용

약제 조성물의 제조는 실시예 2A 및 실시예 2B에 따른 개질된 S-LPS 및 이의 조합의 합성, 및 후속하여 활성 물질, 및 적합한 특별한 첨가제를 함유한 용액으로 바이알 또는 시린지의 패혈성 충전을 포함하며, 이의 첨가제로서 pH 안정화제, 보존제, 어주번트, 등장제(isotonizing agent) 또는 이들의 조합을 포함한다. 치료학적 용량의 약제 조성물은 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합, 0.010 내지 50.000 mg의 S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 살모넬라; 4.150 mg의 소듐 클로라이드 및 0.017 mg의 일염기성 소듐 포스페이트가 첨가된 0.75 mg 이하의 페놀(보존제); 0.5 mL의 멸균 발열원-부재 주사용 물(PA 42-2620-97, EP IV 2002)을 함유한다.

B. 약제 조성물의 항바이러스 작용

S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 살모넬라로부터 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합을 함유한 약제 조성물의 활성 작용을 백색 마우스에서 연구하였다. 체중이 18 내지 20 g인 수컷 마우스의 시험 그룹 및 대조군(그룹 당 10마리의 동물)을 LD100 용량의 독성 인플루엔자 A H1N1 바이러스로 감염시키고, 이후에, 시험 그룹에서의 동물을 동물당 100 mcg의 용량의 성분 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합, S. 엔테리카 sv 티파이 O:901로 이루어진 약물 제조물의 i.p. 일일 투여에 의해 처리하였다. 마우스의 대조군에는 유사한 방식으로 염수 용액을 제공하였다. 동물 생존율을 감염 후 2주 동안 결정하였다. 마우스 생존율은 대조군에서 0%이었고 시험 그룹에서 40%이었다(도 14). 동시에, 시험 그룹의 평균 기대 수명은 대조군에 비해 통계학적으로 유효하게 보다 높았다(p>0.001). 이에 따라, 얻어진 실험 데이타는, 청구된 약제 조성물이 면역계 반응을 조절하는 효과를 가짐을 입증한다.

C. 약제 조성물의 면역관용성 효과

(CBA×C57B1/6)FI 마우스의 시험 그룹을 LD100인 2 mg/마우스의 용량(100 mg/kg와 동일함)의 표준 내독소-LPS E. 콜라이 O:55 (Sigma-Aldrich, USA)의 주사하기 72 시간 전에 0.5 mL의 0.9% 소듐 클로라이드(염수 용액) 중 각각 50, 100 및 200 mcg/마우스의 용량(2.5; 5 및 10 mg/kg과 동일함)의 2-acLPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901 또는 3-acLPS S. 엔테리카 sv 티파이 O:901, 또는 질량비 1:1:1의 (2-acLPS+3-acLPS+4-acLPS)의 조합을 함유한 약제 조성물로 i.p. 면역화하였다. 마우스의 대조군에 동일한 방식에 의해 0.5 mL의 염수를 i.p. 주사하였다.

TNF-α 양을 제조업체의 표준 프로토콜에 따라 ELISA 방법에 의해 시험-시스템 Quantikine Mouse TNF-α/ TNFSF1A (R&D Systems, USA)으로 마우스 혈청에서 측정하였다. 혈액을 내독성 쇼크 유도 후 90분 후에 동물로부터 채취하였다. 시험 결과는 표 13에 나타내었다.

표 13

내독성 쇼크 유도 전 72시간에 수행된 청구된 약제 조성물의 예비-투여 후 마우스에서의 TNF-α 생산

청구된 약제 조성물로 마우스의 예비-투여는 500 pg/mL 미만의 수준으로의 대식세포에 의해 생체내 TNF-α 생산의 감소를 제공하였으며, 대조군에서 동일한 수준은 900 pg/mL 보다 높았다(표 13). 청구된 약제 조성물로 면역화 하에서 TNF-α 생산의 용량-의존적 억제는 이들의 면역관용성 효과를 입증하고, 이는 전염증성 사이토카인의 과생산과 관련된 다양한 병리학적 상태의 교정을 위해 사용될 수 있다.

Claims

하나 이상의 반복 단위로 이루어진 O-특이적 다당류, 코어 올리고당 및 두 개의 아실 잔기를 함유한 전부 O-탈아실화된 지질 A를 포함한, 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS).
제1항에 있어서, 살모넬라(Salmonella), 에세리키아(Escherichia), 시겔라(Shigella), 보르데텔라(Bordetella), 헤모필루스(Haemophilus), 나이세리아(Neisseria), 캄필로박터(Campylobacter), 비브리오(Vibrio), 클렙시엘라(Klebsiella), 클라미디아(Chlamydya), 코리노박테리움(Corynobacterium) 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인, 개질된 지질다당류.
제1항 또는 제2항에 있어서, 85% 이상의 순도를 갖는, 개질된 지질다당류.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는, 개질된 지질다당류.
제1항 또는 제2항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는, 개질된 지질다당류.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인, 개질된 지질다당류.
제1항 또는 제2항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗(rabbit)에 대해 비발열성인, 개질된 지질다당류.
하나 이상의 반복 단위를 포함하는 O-특정 다당류, 코어 올리고당 및 3개의 아실 잔기를 함유한 일부 O-탈아실화된 지질 A를 포함하는, 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS).
제8항에 있어서, 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인, 개질된 지질다당류.
제8항 또는 제9항에 있어서, 80% 이상의 순도를 갖는, 개질된 지질다당류.
제8항 또는 제9항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는, 개질된 지질다당류.
재8항 또는 제9항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는, 개질된 지질다당류.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인, 개질된 지질다당류.
제8항 또는 제9항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인, 개질된 지질다당류.
하나 이상의 반복 단위를 포함하는 O-특이적 다당류, 코어 올리고당 및 4개의 아실 잔기를 함유한 일부 O-탈아실화된 지질 A를 포함하는, 내독성 세균의 개질된 지질다당류(S-LPS).
제15항에 있어서, 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인, 개질된 지질다당류.
제15항 또는 제16항에 있어서, 80% 이상의 순도를 갖는, 개질된 지질다당류.
제15항 또는 제16항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는, 개질된 지질다당류.
제15항 또는 제16항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는, 개질된 지질다당류.
제15항 또는 제16항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인, 개질된 지질다당류.
제15항 또는 제16항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인, 개질된 지질다당류.
제1항의 개질된 지질다당류 및 제8항의 개질된 지질다당류를 포함하는, 개질된 지질다당류들의 조합물(combination).
제22항에 있어서, 개질된 지질다당류들을 임의 비로 포함하는 조합물.
제22항 또는 제23항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 조합물.
제24항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는 조합물.
제24항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는 조합물.
제24항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 조합물.
제24항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 조합물.
제1항의 개질된 지질다당류 및 제15항의 개질된 지질다당류를 포함하는, 개질된 지질다당류들의 조합물.
제29항에 있어서, 개질된 지질다당류들을 임의 비로 포함하는 조합물.
제29항 또는 제30항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 조합물.
제31항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는 조합물.
제31항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는 조합물.
제31항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 조합물.
제31항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 조합물.
제8항의 개질된 지질다당류 및 제15항의 개질된 지질다당류를 포함하는, 개질된 지질다당류들의 조합물.
제36항에 있어서, 개질된 지질다당류들을 임의 비로 포함하는 조합물.
제36항 또는 제37항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 조합물.
제38항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는 조합물.
제38항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는 조합물.
제38항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 조합물.
제38항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 조합물.
제1항의 개질된 지질다당류, 제8항의 개질된 지질다당류, 및 제15항의 개질된 지질다당류를 포함하는, 개질된 지질다당류들의 조합물.
제43항에 있어서, 개질된 지질다당류들을 임의 비로 포함하는 조합물.
제43항 또는 제44항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 조합물.
제45항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는 조합물.
제45항에 있어서, 패혈성 및/또는 내독성 쇼크에 대한 쇼크-방지 활성을 갖는 조합물.
제45항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 조합물.
제45항에 있어서, 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 조합물.
유효량의 제1항 또는 제8항 또는 제15항의 개질된 지질다당류를 포함하는 백신(vaccine).
제50항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 백신.
제50항 또는 제51항에 있어서, 개질된 지질다당류가 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 백신.
제50항 또는 제51항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 백신.
제53항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제가 pH 안정화제, 보존제, 어주번트(adjuvant), 등장화제(isotonizing agent) 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 백신.
제50항, 제51항 또는 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 비-콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함하는 백신.
제53항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제로서 운반 단백질(carrier protein)을 포함하는 백신.
제56항에 있어서, 운반 단백질이 디프테리아성 아나톡신(diphtherial anatoxin), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) 및 슈도모나스 에루지노사 외부단백질 A(Pseudomonas aeruginosa exoprotein A)을 포함하는 군으로부터 선택되는 백신.
제56항 또는 제57항에 있어서, 콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함하는 백신.
제50항 또는 제51항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대한 보호를 생성시키는 백신.
제50항 또는 제51항에 있어서, 패혈성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정(correction)을 제공하는 백신.
제50항 또는 제51항에 있어서, 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 백신.
유효량의 제22항 또는 제29항 또는 제36항 또는 제43항의 개질된 지질다당류들의 조합물을 포함하는 백신.
제62항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 백신.
제62항 또는 제63항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 백신.
제62항 또는 제63항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 백신.
제65항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제가 pH 안정화제, 보존제, 어주번트, 등장화제 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 백신.
제62항, 제63항 또는 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 비-콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함하는 백신.
제65항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제로서 운반 단백질을 포함하는 백신.
제68항에 있어서, 운반 단백질이 디프테리아성 아나톡신, 파상풍 톡소이드 및 슈도모나스 에루지노사 외부단백질 A를 포함하는 군으로부터 선택되는 백신.
제68항 또는 제69항에 있어서, 콘주게이션된 형태의 개질된 지질다당류를 포함하는 백신.
제62항 또는 제63항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 세균에 대해 보호를 생성시키는 백신.
제62항 또는 제63항에 있어서, 패혈성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 백신.
제62항 또는 제63항에 있어서, 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 백신.
유효량의 제1항 또는 제8항 또는 제15항의 개질된 지질다당류를 포함하는 약제 조성물.
제74항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 약제 조성물.
제74항 또는 제75항에 있어서, 개질된 지질다당류가 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 약제 조성물.
제74항 또는 제75항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약제 조성물.
제77항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제가 보존제, 안정화제, 용매 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 약제 조성물.
제74항 또는 제75항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 약제 조성물.
유효량의 제22항, 또는 제29항, 또는 제36항, 또는 제43항의 개질된 지질다당류들의 조합물을 포함하는 약제 조성물.
제80항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 약제 조성물.
제80항 또는 제81항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 래빗 발열원성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 약제 조성물.
제80항 또는 제81항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 약제 조성물.
제83항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 첨가제가 보존제, 안정화제, 용매 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 약제 조성물.
제80항 또는 제81항에 있어서, 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 약제 조성물.
약제의 제조에서 제1항 또는 제8항 또는 제15항의 개질된 지질다당류의 용도.
제86항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 용도.
제86항 또는 제87항에 있어서, 개질된 지질다당류가 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 용도.
제86항 또는 제87항에 있어서, 개질된 지질다당류가 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 세균에 대한 보호를 생성시키는 용도.
제86항 또는 제87항에 있어서, 개질된 지질다당류가 패혈성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 용도.
제86항 또는 제87항에 있어서, 개질된 지질다당류가 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 용도.
제86항 또는 제87항에 있어서, 개질된 지질다당류가 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 용도.
제86항에 있어서, 약제가 인간을 포함하는 포유동물에 비경구, 경구, 직장, 질내, 경피, 설하 및 에어로졸 투여를 위해 의도되는 용도.
약제의 제조에서 제22항 또는 제29항 또는 제36항 또는 제43항의 개질된 지질다당류들의 조합물의 용도.
제94항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 용도.
제94항 또는 제95항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 용도.
제94항 또는 제95항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 인간을 포함하는 포유동물에서 특이적 항균성 IgG, IgA, IgM 항체의 합성을 유도함으로써 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 세균에 대한 보호를 생성시키는 용도.
제94항 또는 제95항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 패혈성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 용도.
제94항 또는 제95항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 내독성 쇼크의 과정의 예방 및/또는 교정을 제공하는 용도.
제94항 또는 제95항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 인간을 포함하는 포유동물에서 면역계 반응 조절제인 용도.
제94항에 있어서, 약제가 인간을 포함하는 포유동물에 비경구, 경구, 직장, 질내, 경피, 설하 및 에어로졸 투여를 위해 의도되는 용도.
백신의 제조에서 면역자극 담체(immunostimulating carrier)로서 제1항 또는 제8항 또는 제15항의 개질된 지질다당류의 용도.
제102항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 용도.
제102항 또는 제103항에 있어서, 개질된 지질다당류가 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 용도.
제102항 또는 제103항에 있어서, 개질된 지질다당류가 방어 항원(protective antigen) 또는 합텐(hapten)과 콘주게이션된 용도.
제105항에 있어서, 방어 항원이 합성의, 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제105항에 있어서, 합텐이 합성의, 단백질 및 다당류 합텐을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제102항에 있어서, 백신이 세균성 감염 예방을 위한 백신 및 바이러스성 감염 예방을 위한 백신을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
백신의 제조에서 면역자극 담체로서 제22항 또는 제29항 또는 제36항 또는 제43항의 개질된 지질다당류들의 조합물의 용도.
제109항에 있어서, 개질된 지질다당류가 살모넬라, 에세리키아, 시겔라, 보르데텔라, 헤모필루스, 나이세리아, 캄필로박터, 비브리오, 클렙시엘라, 클라미디아, 코리노박테리움 및 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된 내독성 세균의 지질다당류인 용도.
제109항 또는 제110항에 있어서, 개질된 지질다당류들의 조합물이 래빗 발열성 시험에서 100 mcg/kg 이하의 용량에서 래빗에 대해 비발열성인 용도.
제109항 또는 제110항에 있어서, 개질된 지질다당류가 방어 항원 또는 합텐과 콘주게이션된 용도.
제112항에 있어서, 방어 항원이 합성의, 단백질 및 다당류 항원을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제112항에 있어서, 합텐이 합성의, 단백질 및 다당류 합텐을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
제109항에 있어서, 백신이 세균성 감염 예방을 위한 백신 및 바이러스성 감염 예방을 위한 백신을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.