WO2012154072A1 - Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция - Google Patents

Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция Download PDF

Info

Publication number
WO2012154072A1
WO2012154072A1 PCT/RU2011/000314 RU2011000314W WO2012154072A1 WO 2012154072 A1 WO2012154072 A1 WO 2012154072A1 RU 2011000314 W RU2011000314 W RU 2011000314W WO 2012154072 A1 WO2012154072 A1 WO 2012154072A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polysaccharide
liquid phase
bacteria
exopolysaccharide
shigella sonnei
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000314
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Петр Геннадьевич АПАРИН
Вячеслав Леонидович ЛЬВОВ
Станислава Ивановна ЕЛКИНА
Марина Эдуардовна ГОЛОВИНА
Владимир Игоревич ШМИГОЛЬ
Original Assignee
Aparin Petr Gennadievich
Lvov Vyacheslav Leonidovich
Elkina Stanislava Ivanovna
Golovina Marina Eduardovna
Shmigol Vladimir Igorevich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aparin Petr Gennadievich, Lvov Vyacheslav Leonidovich, Elkina Stanislava Ivanovna, Golovina Marina Eduardovna, Shmigol Vladimir Igorevich filed Critical Aparin Petr Gennadievich
Priority to US13/877,305 priority Critical patent/US20130203980A1/en
Priority to ES11865292.4T priority patent/ES2686875T3/es
Priority to EA201301213A priority patent/EA030920B1/ru
Priority to PCT/RU2011/000314 priority patent/WO2012154072A1/ru
Priority to EP11865292.4A priority patent/EP2705853B1/en
Priority to KR1020137032139A priority patent/KR101711250B1/ko
Priority to UAA201314232A priority patent/UA111845C2/ru
Publication of WO2012154072A1 publication Critical patent/WO2012154072A1/ru
Priority to US13/855,522 priority patent/US8951538B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0283—Shigella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • E zopolysaccharide of the bacterium Shigella sonnei method for its preparation and vaccine and pharmaceutical composition including it
  • the invention relates to clinical immunology and pharmacology, in particular, to the polysaccharide antigen of the bacterium Shigella sonnei, phase I - O-specific exopolysaccharide, the method of its production, as well as to vaccines and pharmaceutical compositions comprising it.
  • the specificity of immunity to dysenteric infection is determined by the structure of the main protective Shigella antigen - polysaccharide O- antigen.
  • the O-antigenic component of LPS is a polysaccharide consisting of repeating disaccharide units of 0- [4-amino-2 - (] H-acetyl) amino-2,4-dideoxy-P-0-galactopyranosyl] - (1— ”4) -0- [2- (K-acetyl) amino-2-deoxy-a ⁇ -altpiranuronic acid] connected in a polysaccharide chain (1—3) by bonds.
  • This O-polysaccharide component of S. sonnei, phase 1 is covalently attached to the core domain of type E. coli R2, which, in turn, is covalently linked to lipid A, and forms a linear LPS molecule.
  • conjugated protein-polysaccharide vaccines against Sonnet shigellosis show insufficient immunogenicity in
  • the immunogenicity of polysaccharide vaccines depends on the primary structure of the polysaccharide antigen, its molecular weight, and its ability to
  • the technical results provided by the claimed invention are: (a) obtaining a native exopolysaccharide from bacterium S.
  • exopolysaccharide consists of 1 to 100 repeating disaccharide units 0- [4-amino-2- (M-acetyl) amino-2,4-dideoxy-P-0-galactopyranosyl] - (1—>) -0- [2- ( 1CH-acetyl) amino-2-deoxy-a ⁇ - altpiranuronic acid] connected in a polysaccharide chain
  • the exopolysaccharide is prepared using Shigella sonnei bacteria by a process comprising: (a) preparing a culture of bacteria in a liquid phase; (B) separating the liquid phase from the bacterial cells; (c) isolating the polysaccharide from the liquid phase. In doing so, in order to avoid
  • Isolation of the polysaccharide from the liquid phase can be carried out by a method comprising: (i) removing proteins and nucleic acids from the liquid phase; (ii)
  • the exopolysaccharide obtained by the above method may contain not more than 1 wt.% Proteins and 2 wt.% Nucleic acids.
  • the main fraction of the exopolysaccharide is a biopolymer with a molecular weight of more than 80 kDa (Fig. 5B), while the main fraction of the O-polysaccharide has a molecular mass of not more than 26 kDa (Fig. 5A).
  • Exopolysaccharide is immunogenic and causes mucosal protection against Sonnet shigellosis by inducing synthesis
  • the exopolysaccharide is pyrogen-free for the rabbit at a dose of not more than 0.050 ⁇ g / kg in the rabbit pyrogenicity test at
  • providing the vital activity of the cells of the culture can be a nutrient medium of various composition and properties.
  • the separation of the liquid phase from the bacterial cells is preferably carried out while maintaining the nativeness of the bacterial cells.
  • Isolation of the polysaccharide from the liquid phase can be carried out by a method including: (i) removing proteins from the liquid phase and
  • nucleic acids (i) ultrafiltration; and (iii) dialysis of the resulting solution.
  • the claimed vaccine for the prevention and / or treatment of Sonnet shigellosis includes a prophylactically and / or therapeutically effective amount of a polysaccharide of the bacterium Shigella sonnei, phase I, consisting of 1 to 100 repeating disaccharide units of 0- [4-amino-2- (g-acetyl) amino 2,4-Dideoxy-O-galactopyranosyl] - (1—> 4) -0- [2- (g-acetyl) amino-2-deoxy-aL-altpiranuronic acid] connected in the polysaccharide chain (1— c) bonds, and obtained using Shigella sonnei bacteria, but without using lipopolysaccharides as a source of its production.
  • a polysaccharide of the bacterium Shigella sonnei, phase I consisting of 1 to 100 repeating disaccharide units of 0- [4-amino-2- (g-acetyl) amino 2,4-Dide
  • This polysaccharide is an exopolysaccharide, or capsular polysaccharide produced by the bacterium S. sonnei, phase I to the external Wednesday
  • the native exopolysaccharide includes a non-toxic lipid component, which includes non-hydroxylated fatty acids with 16 to 18 carbon atoms in the molecule (Fig. 4).
  • the fatty acid content in it is not less than 0.01 wt.%.
  • the exopolysaccharide obtained by any method using the bacterium S. sonnei does not include structural elements of the LPS core domain ( Figure 4).
  • the exopolysaccharide can be obtained by any method, including genetic engineering, using the genome of the bacterium Shigella sonnei.
  • the exopolysaccharide is prepared using Shigella sonnei bacteria by a process comprising: (a) preparing a culture of bacteria in a liquid phase; (B) separating the liquid phase from the bacterial cells; (c) isolating the polysaccharide from the liquid phase. In doing so, in order to avoid
  • Isolation of the polysaccharide from the liquid phase can be carried out by a method comprising: (i) removing proteins and nucleic acids from the liquid phase; (ii) ultrafiltration; and (iii) dialysis of the resulting solution.
  • the exopolysaccharide obtained by the above method may contain not more than 1 wt.% Proteins and 2 wt.% Nucleic acids.
  • the molecular mass of exopolysaccharide a measured by gel filtration, ranges from 0.4 to 400 kDa.
  • the main fraction of the exopolysaccharide is a biopolymer with a molecular weight of more than 80 kDa (Fig. 5B).
  • the exopolysaccharide is immunogenic and causes mucosal protection against Sonnet shigellosis by inducing the synthesis of specific antibodies against the Shigella sonnei bacterium, phase I in mammals, including humans (Example 1C, Figure 6; Examples 2D, 2F).
  • the maximum immunogenicity is detected by the exopolysaccharide fraction with a molecular weight of 80 to 400 kDa.
  • the immunogenicity of the exopolysaccharide is more than 7 times greater than the immunogenicity of the O-polysaccharide from the bacterial LPS cells (Example 1C, FIG. 6).
  • Exopolysaccharide is
  • the claimed vaccine may include pharmaceutically acceptable additives, which can be used as pH stabilizers, preservatives, adjuvants, isotonic agents, or combinations thereof.
  • the vaccine may include an exopolysaccharide as in
  • the vaccine including the conjugated form of exopolysaccharide, additionally contains a protein carrier, namely diphtheria toxoid or tetanus toxoid, or exoprotein A Pseudomonas aeruginosa, or other proteins.
  • a protein carrier namely diphtheria toxoid or tetanus toxoid, or exoprotein A Pseudomonas aeruginosa, or other proteins.
  • the amount of the polysaccharide of the bacterium Shigella sonnei, phase I consisting of 1 to 100 repeating disaccharide units 0- [4-amino-2- (M-acetyl) amino-2,4-dideoxy-P-0-galactopyranosyl] - (1— ⁇ - ( ⁇ - [ ⁇ - (M-acetone ⁇ amino ⁇ - deoxy-a-L-altpiranuronic acid], connected in the polysaccharide chain (1—> 3) by bonds, and obtained using Shigella sonnei bacteria, but without using lipopolysaccharides as a source of its production.
  • This polysaccharide is an exopolysaccharide, or capsular polysaccharide produced by the bacterium S. sonnei, phase I into the external environment.
  • the native exopolysaccharide includes a non-toxic lipid component represented by non-hydroxylated fatty acids with 16 to 18 carbon atoms in the molecule (Fig. 4). The fatty acid content in it is not less than 0.01 wt.%.
  • the exopolysaccharide obtained by any method using the bacterium S. sonnei does not include structural elements of the LPS core domain (Fig. 4).
  • the exopolysaccharide can be obtained by any method, including genetic engineering, using the genome of the bacterium Shigella sonnei.
  • Isolation of the polysaccharide from the liquid phase can be carried out by a method comprising: (i) removing proteins and nucleic acids from the liquid phase; (ii)
  • the exopolysaccharide obtained by the above method may contain not more than 1 wt.% Proteins and 2 wt.% Nucleic acids.
  • the main fraction of the exopolysaccharide is a biopolymer with a molecular weight of more than 80 kDa (Fig. 5B).
  • Exopolysaccharide is a modulator of the responses of the immune system of mammals, including humans (Example 3B). Exopolysaccharide is pyrogen-free for the rabbit at a dose of not more than 0.050 mcg / kg in the test
  • the claimed pharmaceutical composition may include
  • pharmaceutically acceptable target additives which can be used as preservatives, stabilizers, solvents, or combinations thereof.
  • influenza A virus H1N1 (Example SV, Fig. 9).
  • the exopolysaccharide is prepared using Shigella sonnei bacteria by a process comprising: (a) preparing a culture of bacteria in a liquid phase; (B) separating the liquid phase from the bacterial cells; (c) isolating the polysaccharide from the liquid phase.
  • Isolation of the polysaccharide from the liquid phase can be carried out by a method comprising: (i) removing proteins and nucleic acids from the liquid phase; (ii) ultrafiltration; and (iii) dialysis of the resulting solution.
  • the exopolysaccharide obtained by the above method may contain not more than 1 wt.% Proteins and 2 wt.% Nucleic acids.
  • the main fraction of the exopolysaccharide is a biopolymer with a molecular weight of more than 80 kDa (Fig. 5B).
  • exopolysaccharide is immunogenic and causes mucosal protection against Sonnet shigellosis by inducing the synthesis of specific antibodies against the Shigella sonnei bacterium, phase I in mammals, including humans (Example 1C, Figure 6; Examples 2D, 2F).
  • exopolysaccharide is also a modulator of the responses of the immune system in mammals, including humans (Example 3B).
  • Exopolysaccharide is pyrogen-free for the rabbit at a dose of not more than 0.050 mcg / kg in the rabbit pyrogenicity test with intravenous
  • the pharmaceutical agent is intended for parenteral, oral, rectal, intravaginal, cutaneous, sublingual and aerosol administration to mammals, including humans.
  • Figure 1 presents the structural formula of the monomer unit
  • Figure 2 presents the C 13 NMR spectrum of the bacterial exopolysaccharide
  • Fig. 3 shows the results of GLC mass spectrometry LPS
  • Figure 4 presents the results of GLC mass spectrometry
  • FIG. 5 shows plots of the molecular weight distribution of an O-specific polysaccharide isolated from the LPS of the Shigella sonnei bacterium, phase I (a) and the exopolysaccharide of the Shigella sonnei bacterium, phase I (b).
  • the ordinate axis represents the values of ultraviolet absorption at a wavelength of 225 nm; the abscissa indicates the time, in minutes.
  • Figure 6 presents diagrams of antibody production (15 days) after primary (a) and secondary (b) immunization of mice with drugs
  • the ordinate indicates serum dilution titer.
  • Figure 7 shows the graphs of the binding of antibodies from monoreceptor rabbit serum to the Shigella sonnei O-antigen, phase 1, with the exopolysaccharide samples of the bacterium Shigella sonnei (series 33 and 35); 0-polysaccharide from LPS cells of the bacterium Shigella sonnei; LPS Salmonella enterica sv
  • the abscissa axis represents the serum dilution titer
  • the ordinate axis represents the optical density of the colored reaction substrate (ortho-phenylenediamine) at a wavelength of 495/650 nm.
  • Figure 9 presents the survival graphs of two groups of mice infected with a dose of LD 100 virulent strain of influenza A HI N1.
  • the first group experienced
  • the best options for carrying out the inventions are:
  • the exopolysaccharide was obtained using the bacteria S. sonnei, phase I.
  • the bacterial culture was obtained in the liquid phase, by deep
  • exopolysaccharide was isolated from the liquid phase by removing proteins and nucleic acids from it, followed by ultrafiltration and dialysis
  • RNAase and DNAase were added in quantities of 100 ⁇ g / ml and 10 ⁇ g / ml, respectively and after 16 hours of stirring at 37 ° C, the reaction mixture was treated with proteinase K (20 ⁇ g / ml) for 2 hours at 55 ° C. The resulting clear solution was ultrafiltered and dialyzed with
  • the exopolysaccharide obtained by the above method contains no more than 1 wt.% Of proteins determined by the Bradford method (Bradford M.M. rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp. 248–254), and not more than 2 wt.% Nucleic acids determined by the Spirin method (Spirin AS Spectrophotometric determination of the total number of nucleic acids. Biochemistry, 1958, v. 23, No. 4, p. 656).
  • NMR spectroscopy was performed on a Bruker spectrometer, model DRX-500, with XWINNMR software and pulse sequences from the manufacturer. The spectra were taken in D 2 o (99: 95%) with acetone as a standard (31, 5 ppm for
  • Packard model 5890 coupled to a NERMAG mass spectrometer model R10-10L.
  • the exopolysaccharide is neither LPS, the essential components of which are core and lipid A, nor an O-specific polysaccharide that includes the “core” oligosaccharide fragment, but is a glycoconjugate of a different composition and structure, but with the same structure of a repeating monomeric unit, which and S.sonnei O-antigen.
  • the molecular weight distribution of S.sonnei exopolysaccharide and O-specific polysaccharide isolated from S.sonnei LPS was studied by HPLC on a TSK 3000 SW column using a UV flow detector (wavelength 225 nm) in a buffer containing 0.02 M NaOAc, 0.2 M NaCl (pH 5.0).
  • S.sonnei series 33 was immunized with an exopolysaccharide preparation and an O-polysaccharide preparation from LPS cells of Shigella sonnei bacteria at a dose of 25 ⁇ g per mouse.
  • mice re-immunized with antigens at a dose of 25 ⁇ g per mouse one month after the initial injection.
  • antigens at a dose of 25 ⁇ g per mouse one month after the initial injection.
  • series 33 On the 15th day of the secondary response after repeated immunization with an exopolysaccharide preparation, series 33, in mice
  • Vaccines including the exopolysaccharide bacteria S. sonnei phase I A. Use of exopolysaccharide for the manufacture of an unconjugated vaccine (pharmaceutical)
  • exopolysaccharide using S.sonnei bacteria phase 1 according to Example 1 (A) and subsequent sterile filling into a vial or syringe of a solution containing the active substance and pharmaceutically
  • the vaccination dose contains:
  • exopolysaccharide in unconjugated form at a concentration of 100 ⁇ g / ml (series 33 and 35), was determined in the inhibition reaction of passive hemagglutination (RTPHA) in comparison with other O-antigens in
  • S.sonnei as well as LPS of bacteria S. sonnei, S. flexneri 2a and Salmonella enterica sv typhimurium obtained by the Westphal method (Westphal O., Jann K. Bacterial lipopoly saccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Methods Carbohydr Chem., 1965, v. 5, p. 83-91).
  • the concentration of inhibition of RPHA vaccines did not exceed 1, 56 ⁇ g / ml (Table 2).
  • Heterologous LPS of bacteria S. flexneri 2a and Salmonella enterica sv typhimurium showed weak serological activity in the reaction with Sonne monoreceptor serum (inhibition concentration> 25 ⁇ g / ml) (Table 2).
  • the ELISA test determined the interaction of in vitro vaccine series
  • the pyrogenicity of a vaccine containing 100 ⁇ g / ml of an unconjugated form of the exopolysaccharide of S.sonnei bacteria was determined in comparison with the pyrogenicity of a commercial Vi antigenic vaccine, O-polysaccharide from LPS cells of S.sonnei bacteria and LPS obtained from extracellular fluid (NJ) and cells of the same strain by the Westphal method according to the method described in example 1 C.
  • the test results are presented in table 3.
  • Intravenous administration of a vaccine including the exopolysaccharide of S.sonnei bacteria at a dose of 0.050 ⁇ g per kg of body weight did not cause a pyrogenic effect in rabbits.
  • LPS preparation from S.sonne bacteria cells of the same strain possessed high pyrogenicity and, thus, was a classic endotoxin.
  • mice were immunized subcutaneously with a vaccine containing 100 ⁇ g / ml of the unconjugated form of exopolysaccharide from S.sonnei bacteria (series 33 and 35) and O-polysaccharide from LPS cells of bacterium S .sonnei, in doses of 25 and 50 micrograms per animal in the back, twice with an interval of 10 days. Control animals were injected with saline instead of the drug.
  • dysentery keratoconjunctivitis (Sereny test) was induced in experimental and control animals by injecting a suspension of cells of the virulent S.sonnei strain into the conjunctiva at a dose close to IDU (10 cells 9 ) and at a dose close to 2ID 10 o (2x10 9 cells), in 30 ⁇ l of sterile saline. All animals
  • the immunogenicity of the vaccine including the unconjugated form of the exopolysaccharide of the bacterium S.sonnei (series 33), for adult volunteers was determined in serological studies using tests enzyme immunoassay (ELISA) and passive hemagglutination reaction (RPHA).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RPHA passive hemagglutination reaction
  • typhoid Vi-antigenic Vianvac at a dose of 25 ⁇ g, was administered once subcutaneously to two groups of subjects, 20 adults
  • lipopolysaccharide-sensitized bacteria S.sonnei rabbit antibodies against IgG, IgM, human IgA conjugated to horseradish peroxidase (Sigma, USA).
  • Optical density was measured on a Bio-Rad iMark ELISA reader with two-wavelength reading (490/630 nm).
  • the RPHA test was carried out according to the manufacturer's instructions using a red blood cell diagnosticum (Microgen, Russia).
  • the immunogenicity of the vaccine was evaluated by the following indicators: 4-fold seroconversion compared to background serum, the level of antigenic response before and after vaccination; in this case, geometric mean antibody titers (CHTA) were determined, and the titer increase rate in the group of vaccinated subjects compared to background serum.
  • CHTA geometric mean antibody titers
  • the exopolysaccharide of the bacterium S.sonnei revealed high rises in antibody titers, mainly IgA class. So, the increase in the titer of IgA antibodies on the 30th and 60th day after immunization was 25.7 x and 30.2 x times; IgG antibodies - 6.1 x and 5.8 x times, respectively. The level of seroconversion of O-specific antibodies of IgA, IgG classes was high and amounted to 96 and 94% for IgA; for IgG - 73 and 72% on the 30th and 60th day after vaccination, respectively.
  • the claimed vaccine including an unconjugated form of exopolysaccharide bacteria
  • Multiplicity of persons from 4 Multiplicity from 4 or more lines by multiples by increments by multiples of the seroconvere titer seroconversion titer
  • the vaccine and the dose of antibodies for rsii antibodies for mi after 60 immunizations are compared 30 days after birth with a titer of days with a vaccination titer, free antibodies before after antibodies up to% of vaccination vaccination vaccination
  • An exopolysaccharide was prepared using S.sonnei bacteria, phase 1 according to Example 1 (A).
  • Obtaining a conjugate of EP with a protein can be carried out by any of the known methods.
  • the approach used in the present study (Taylor DN, Trofa A.S., Sadoff J., Chu C, Brula D., Shiloach J., Cohen D., Ashkenazi S., Lerman Y., Egan W., Schneerson R ., Robbins JB Synthesis, characterization, and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect. and Immunity.
  • the conjugate was purified on a column of Sepharose CL-6B from a small amount of unconjugated starting biopolymers and
  • the vaccine conjugate contained May 40. % protein determined by the Bradford method (Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
  • One vaccination dose of a conjugate vaccine contains: an exopolysaccharide conjugate from 0.010 to 0.200 mg; phenol (preservative), not more than 0.75 mg (Sigma, USP Grade 108-95-2), with the addition of sodium chloride (Sigma, USP Grade 7647-14-5), sodium phosphate disubstituted (Sigma, USP Grade 7782- 85-6) and sodium phosphate monosubstituted (Sigma, 13472-35-0); water
  • mice of the line ( ⁇ 57 ⁇ 1 / 6) FI intraperitoneally
  • a vaccine comprising the unconjugated form of the exopolysaccharide of the bacterium S.sonnei, series 33 and a vaccine comprising the conjugate of the exopolysaccharide of the bacterium S.sonnei, series 33 with the CAT protein carrier, at a dose of 25 ⁇ g of polysaccharide per mouse.
  • the unconjugated vaccine induces a humoral immune response after a single injection, and on the 15th day a 3.4-fold increase in the number of IgG antibodies was determined in the peripheral blood sera of animals.
  • a pharmaceutical composition comprising an exopolysaccharide of S. sonnei bacteria, phase I A.
  • exopolysaccharide for the manufacture of a pharmaceutical composition (pharmaceutical agent)
  • Preparation of a pharmaceutical composition includes the preparation of an exopolysaccharide using S.sonnei bacteria, phase 1 according to Example 1 (A) and subsequent sterile filling into a vial or syringe of a solution containing the active substance and pharmaceutically
  • acceptable target additives which may be used as preservatives, stabilizers, solvents, or combinations thereof.
  • mice of the line CBAXC57B1 / 6
  • FI mice of the line
  • 10 animals each were infected with a dose of LD 100 of the virulent strain of influenza A H1N1, after which the experimental group was treated by daily

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Впервые получен и охарактеризован О-специфический полисахаридный антиген - экзополисахарид бактерии Shigella sonnei, фаза I, представляющий собой аутентичное природное соединение - бактериальный капсульный полисахарид, состоящий из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(N-ацетил)амино-2,4-дидезокси-β-D- галактопиранозил]— (1→4)-0-[2-(N-ацетил)амино-2-дезокси-α-L- альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1→3)связями. Экзополисахарид имеет молекулярную массу от 0,4 до 400 kDa, содержит нетоксичный липидный компонент - негидроксилированные жирные кислоты и обнаруживает низкую пирогенность и высокую иммуногенность, вызывая мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии S. sonnei в организме млекопитающих, включая человека. Экзополисахарид высокой степени чистоты получают без использования липополисахаридов в качестве источника его получения, технологичным промышленным способом из жидкой фазы культуры бактерий S. sonnei с высоким выходом. На основе экзополисахарида разработаны эффективные, высокоспецифичные и безопасные вакцины для профилактики и/или лечения шигеллеза Зонне, а также фармацевтические композиции с широким спектром действия, в частности, модулирующим реакции иммунной системы.

Description

Э зополисахарид бактерии Shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
Область техники
Изобретения относятся к клинической иммунологии и фармакологии, в частности, к полисахаридному антигену бактерии Shigella sonnei, фаза I - О-специфическому экзополисахариду, способу его получения, а также к включающим его вакцинам и фармацевтическим композициям.
Предшествующий уровень техники
Уже почти столетие после открытия в Японии бациллы Шига, известной как Shigella dysenteriae, тип 1 , шигеллёзы являются одной из главных проблем здравоохранения практически всех стран мира. Так, ежегодно от дизентерии, вызываемой микроорганизмами рода Shigella, в развивающихся странах погибает несколько сотен тысяч детей до пяти лет.
В развитых странах Северного полушария также периодически возникают мощные вспышки шигеллёза, вызываемые бактерией Shigella sonnei, единственным представителем группы D рода Shigella.
В связи с вышеизложенным ВОЗ рекомендует в качестве приоритета разработку «глобальной» противошигеллёзной вакцины, содержащей протективные компоненты патогенных представителей рода Shigella, в частности, Shigella sonnei, фаза I (Kotloff K.L., Winickoff J.P, Ivanoff В., Clemens J.D., Swerdlow D.L., Sansonetti P.J., Adak G.K., Levine M.M. Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and
implementation of control strategies. Bull.WHO, 1999, v.77, p.651-665).
Создание же моновакцины против шигеллёза Зонне является как
предварительным этапом решения этой проблемы, так и самостоятельной, чрезвычайно актуальной задачей для многих регионов.
Специфичность иммунитета к дизентерийной инфекции детерминирована структурой главного протективного антигена шигелл - полисахаридного О- антигена. Первичная структура О-специфического полисахарида молекулы липополисахарида (LPS) клеточной стенки бактерии S. sonnei, фаза I определена Кеппе с соавт. (Kenne L., Lindberg В., Petersson К.,
Katzenellenbogen Е., Romanowska Е. Structural studies of the O-specific side- chains of the Shigella sonnei phase I lipopoly saccharide. Carbohydrate Res., 1980, 78:119-126).
О-антигенный компонент LPS представляет собой полисахарид, состоящий из повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(]Ч-ацетил)амино- 2,4-дидезокси-Р-0-галактопиранозил]— (1— »4)-0-[2-(К-ацетил)амино-2- дезокси-а^-альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1— кЗ)связями. Этот О-полисахаридный компонент S. sonnei, фаза 1 , ковалентно присоединенный к домену кора E.coli R2 типа, который, в свою очередь, ковалентно связан с липидом А, и образует линейную молекулу LPS.
Выделение О-полисахарида из LPS клеточной стенки не представляет значительных технических трудностей. Так, метод выделения, изначально предложенный Freeman, включает следующие основные стадии - получение культуры бактерий S. sonnei, фаза I в жидкой среде; отделение
культуральной жидкости от бактериальных клеток; экстракцию LPS из бактериальных клеток водным фенолом (Westphal О., Jann К. Bacterial lipopoly saccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem., 1965, v.5, p.83-91); деградацию LPS с последующим выделением из него О-полисахарида (Morrison D.C., Leive L. Fractions of lipopoly saccharide from Escherichia coli 0111:B4 prepared by two extraction procedures. J. Biol. Chem. 250 (1975) 2911-2919).
Известен также способ получения О-специфического антигена Shigella sp. высокой степени чистоты, включающий: получение культуры бактерий в жидкой среде; обработку культуры бактерий гексадеацилтриметиламмоний бромидом с последующей экстракцией LPS из бактериальных клеток; отделение экстракта LPS от бактериальных клеток; деградацию LPS с последующим выделением из него О-полисахарида (KR 20010054032 А). Таким образом, в основе всех известных способов выделения О- специфического антигена из LPS Shigella sp. лежит стадия экстракции, т.е. извлечения LPS из клеточных стенок бактерий, обусловливающая
неизбежную потерю нативности бактериальных клеток. Кроме того, генезис О-специфического антигена из LPS Shigella sp. детерминирует и
структуру выделенных известными способами антигенов. Так, практически все полученные из LPS Shigella sp. О-антигены содержат элементы структуры домена кора. Мягкий гидролиз 1%-ной уксусной кислотой, который используется для удаления липида А из молекулы LPS, приводит к получению полисахаридного дериватива, представляющего собой О- специфический полисахарид, присоединенный к олигосахариду «кора» (Fensom and Meadow, 1970; Morrison and Leive, 1975; Oertelt et al., 2001;
Osborn, 1963).
Предложено использование О-полисахарида из LPS клеточной стенки бактерии S. sonnei, фаза I в составе исключительно конъюгированных вакцин против шигеллёза Зонне, при его ковалентном связывании с
белковыми носителями - белком D Haemophilis influenzae, рекомбинантным экзопротеином A Pseudomonas aeruginosa (гЕРА), рекомбинантным
дифтерийным токсином (rDT), рекомбинантным токсином В С. difficile (rBRU) (US Pat. Appl. 2005/0031646; WO/2010/019890).
Проведены исследования иммуногенных и протективных свойств О- полисахарида из LPS клеточной стенки бактерии Plesiomonas shigelloides 07, идентичного по структуре с О-полисахаридом из LPS бактерии S.
sonnei, фаза I, конъюгированного с белком - экзопротеином A Pseudomonas aeruginosa (гЕРА) или дифтерийным анатоксином CRM9 из мутантного штамма Corynobacterium diphtheriae (Cohen D., Ashkenazi S., Green M.S., Gdalevich M., Robin G., Slepon R., Yavzori M., Orr N., Block C., Ashkenazi I., Shemer J., Taylor D.N., Hale T.L., Sadoff J.C., Pavliakova D., Schneerson R., Robbins R. Double-blind vaccine controlled randomized efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults. Lancet, 1997, v.349, pp.155-159). Обнаружилось, что конъюгат О-полисахарида с гЕРА иммуногенен для экспериментальных животных и человека при
парентеральном введении, вызывая у добровольцев продукцию О- специфических антител и средний уровень защиты от инфекции с
коэффициентом эффективности 74%. Однако чрезвычайно короткая продолжительность контролируемого эпидопыта (2,5 - 7 месяцев) вызывает сомнение в достоверности оценки протективного потенциала вакцины. Недавние испытания иммуногенности О-полисахаридной конъюгированной вакцины против инфекции S. sonnei на основе гЕРА -носителя на детях выявили слабую иммуногенность препарата для детей от 1 до 4-х лет
(коэффициент эффективности составил 27,5%), а также раннее угасание иммунного ответа после иммунизации (Passwell JH, Ashkenzi S, Banet-Levi Y, Ramon-Saraf R, Farzam N, Lerner-Geva L, Even-Nir H, Yerushalmi B, Chu C, Shiloach J, Robbins JB, Schneerson R; Israeli Shigella Study Group. Age-related efficacy of Shigella O-specific polysaccharide conjugates in 1-4-year-old Israeli children. Vaccine. 2010, Mar., 2;28(10), pp.2231- 2235).
Таким образом, конъюгированные белково-полисахаридные вакцины против шигеллеза Зонне обнаруживают недостаточную иммуногенность в
клинических испытаниях как на взрослых, так и на детских контингентах. Следует отметить, что иммуногенные свойства свободного,
неконъюгированного О-полисахарида из LPS бактерии S. sonnei, фаза I, в качестве вакцинного иммуногена не известны. Экспериментальные данные Taylor с соавт. демонстрируют практически полное отсутствие
иммуногенной активности в отношении мышей неконъюгированного О- полисахарида из LPS клеток бактерии Plesiomonas shigelloides, структура которого идентична таковой О-антигена S. sonnei, фаза 1 (Taylor D.N., Trofa A.C., Sadoff J., Chu C, Bryla D., Shiloach J., Cohen D., Ashkenazi S., Lerman Y., Egan W. Synthesis, characterization and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect. Immun., 1993, Sep., 61(9): 3678- 3687).
Исходя из вышеизложенного, актуальность разработки других подходов к созданию О-антигенных вакцин против инфекции S. sonnei очевидна. В качестве альтернативного и наиболее перспективного направления разработки может рассматриваться создание неконъюгированной вакцины на основе О-антигенного экзополисахарида, продуцируемого бактерией S. sonnei, фаза I, во внешнюю среду. Известно, что многие грамположительные и грамотрицательные бактерии продуцируют не только полисахаридные компоненты клеточной стенки, но и внеклеточные экзополисахариды, которые выделяются клеткой во внешнюю среду и выполняют защитную функцию. При этом продуцируемые экзополисахариды могут находиться как свободном состоянии, так и образовывать внеклеточную капсулу или микрокапсулу.
Иногда экзополисахариды, продуцируемые клеткой во внешнюю среду, представляют собой специфические высокоиммуногенные антигены, способные индуцировать синтез протективных антител. Так, целый ряд таких полисахаридных антигенов используется в составе вакцин для профилактики инфекций, вызываемых менингококком групп А и С, возбудителем
брюшного тифа (Lindberg А.А. Polyosides (encapsulated bacteria). С. R.
Acad.Sci. Paris, 1999, v.322, p.925-932).
Иммуногенность полисахаридных вакцин зависит от первичной структуры полисахаридного антигена, его молекулярной массы, способности к
образованию агрегатных структур (The vaccine book. Edited by B.R.Bloom, P.-H. Lambert Academic Press, San Diego 2003, pp. 436). При этом первичная структура бактериального экзополисахарида может быть как идентичной таковой О-полисахарида из LPS клеточной стенки, так и различаться с ней (Goldman R.C.,White D., Orskov F., Orskov I., Rick P.D.,Lewis M.S.,
Bhattacharjee A.K.,Leive L. A sulface polysaccharide of Esherichia coli 0111 contains O-antigen and inhibits agglutination of cells by anti-0 antiserum. J.
Bacteriol., 1982, v.151, p. 1210-1221).
Однако ни первичная структура экзополисахарида бактерии S. sonnei, фаза I, ни его физико-химические, иммунобиологические и протективные свойства, ни способ его выделения, ни, наконец, сам факт его существования в литературе не описаны.
В литературе также не описаны фармацевтические композиции на основе полисахаридов S. sonnei, фаза I , разработка которых может внести
существенный вклад в клиническую фармакологию. Известно лишь
использование фрагментов О-полисахарида из LPS клеток S. sonnei, фаза I, включающих от 1 до 5 дисахаридных звеньев, в качестве пищевой добавки для орального введения, стимулирующей развитие иммунной системы у младенцев от 1 до 6-месячного возраста, детерминированное возрастанием соотношения количества Т-хелперов 1 типа (Th 1 ответ) по отношению Т- хелперам 2 типа (Th 2 ответ) (US Pat. Appl. 2009/0317427 Al).
Раскрытие изобретений
Задачей заявляемых изобретений является получение
высокотехнологичным способом экзополисахарида бактерии S. sonnei, фаза I и разработка на его основе полисахаридных вакцин и фармацевтических композиций.
Техническими результатами, обеспечиваемыми заявляемыми изобретениями, являются: (а) получение нативного экзополисахарида из бактерии S.
sonnei, фаза I, высокой степени чистоты с высоким выходом в
промышленном масштабе; (Ь) повышение специфичности, иммуногенности, протективной активности и безопасности разработанных вакцин; (с) высокая эффективность и широкий спектр действия предложенных
фармацевтических композиций.
Впервые получен новый полисахаридный антиген - экзополисахарид, или капсульный полисахарид, продуцируемый бактерией S. sonnei, фаза I во внешнюю среду. В отличие от О-специфического полисахарида из LPS клеточной стенки бактерии, выделенного искусственно фрагмента
молекулы, экзополисахарид представляет собой аутентичное природное соединение, полученное с использованием бактерий Shigella sonnei, но при этом без использования липополисахаридов в качестве источника его получения. Первичная структура экзополисахарида оказалась идентичной таковой О-полисахарида из LPS клеток бактерии S. sonnei, фаза I, т.е. экзополисахарид состоит из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(М-ацетил)амино-2,4-дидезокси-Р-0- галактопиранозил]— (1— > )-0-[2-(1Ч-ацетил)амино-2-дезокси-а^- альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи
(1— >3)связями (Фиг.1 и Фиг. 2). В отличие от О-полисахарида из LPS клеток бактерии, нативный экзополисахарид включает нетоксичный липидный компонент, в состав которого входят негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле (Фиг.З, Фиг.4). Содержание жирных кислот в нём составляет не менее 0,01 мас.%. Кроме того, полученный любым способом из бактерии S. sonnei экзополисахарид не включает элементов структуры домена кора LPS (Фиг. 4). Экзополисахарид можно получать любым способом, включая генно-инженерный, с использованием генома бактерии Shigella sonnei.
Предпочтительно экзополисахарид получают с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы. При этом, во избежание
разрушения клеточных стенок и попадания LPS в жидкую фазу, отделение её от бактериальных клеток целесообразно осуществлять при сохранении нативности бактериальных клеток. Выделение полисахарида из жидкой фазы может быть осуществлено способом, включающим: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii)
ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
Полученный вышеуказанным способом экзополисахарид может содержать не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот. Молекулярная масса экзополисахарида, измеренная методом гель-фильтрации, составляет от 0,4 до 400 kDa. Основная фракция экзополисахарида представляет собой биополимер с молекулярной массой более 80 kDa (Фиг. 5В), в то время как основная фракция О-полисахарида имеет молекулярную массу не более 26 kDa (Фиг. 5А). Экзополисахарид является иммуногенным и вызывает мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза
специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме млекопитающих, включая человека (Пример 1С, Фиг.6; Примеры 2D, 2F). Как уже отмечалось выше, иммуногенность полисахаридного антигена детерминирована его молекулярной массой, способностью к образованию агрегатных структур, поэтому наибольшую иммуногенность обнаруживает фракция экзополисахарида с молекулярной массой от 80 до 400 kD.
Иммуногенность высокомолекулярной фракции экзополисахарида
превышает более чем в 7 раз иммуногенность О-полисахарида из LPS клеток бактерии (Пример 1С, Фиг.6), что обусловлено, по-видимому, в том числе наличием в его молекуле нетоксичного липидного компонента - негидроксилированных жирных кислот, способствующих образованию надмолекулярных агрегатных структур.
Кроме того, экзополисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах при
внутривенном введении (Пример 1D). По параметру пирогенности вакцинный препарат экзополисахарида соответствует требованиям Комитета экспертов ВОЗ для полисахаридных вакцин (WHO TR - WHO Technical report No.840, 1994).
Заявленный способ получения экзополисахарида бактерии S. sonnei, фаза I, включает: (а) получение культуры бактерий Shigella sonnei в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с)
выделение полисахарида из жидкой фазы. При этом жидкая фаза,
обеспечивающая жизнедеятельность клеток культуры, может представлять собой питательную среду различного состава и свойств. Отделение жидкой фазы от бактериальных клеток предпочтительно осуществляют при сохранении нативности бактериальных клеток.
Таким образом, в заявленном способе получения полисахарида,
исключающим использование LPS в качестве источника его получения, отсутствует стадия извлечения LPS из клеточных стенок бактерий, обусловливающая неизбежную потерю нативности бактериальных клеток. Выделение полисахарида из жидкой фазы может быть осуществлено способом, включающим: (i) удаление из жидкой фазы белков и
нуклеиновых кислот; (и) ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
Заявленная вакцина для профилактики и/или лечения шигеллёза Зонне включает профилактически и/или терапевтически эффективное количество полисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I, состоящего из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(г -ацетил)амино-2,4- дидезокси- -О-галактопиранозил]— (1— >4)-0-[2-(г -ацетил)амино-2-дезокси- a-L-альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1— в)связями, и полученного с использованием бактерий Shigella sonnei , но при этом без использования липополисахаридов в качестве источника его получения.
Данный полисахарид является экзополисахаридом, или капсульным полисахаридом, продуцируемым бактерией S. sonnei, фаза I во внешнюю среду. Нативный экзополисахарид включает нетоксичный липидный компонент, в состав которого входят негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле (Фиг. 4). Содержание жирных кислот в нём составляет не менее 0,01 мас.% . Кроме того, полученный любым способом с использованием бактерии S. sonnei экзополисахарид не включает элементов структуры домена кора LPS (Фиг.4).
Экзополисахарид можно получать любым способом, включая генно- инженерный, с использованием генома бактерии Shigella sonnei.
Предпочтительно экзополисахарид получают с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы. При этом, во избежание
разрушения клеточных стенок и попадания LPS в жидкую фазу, отделение её от бактериальных клеток целесообразно осуществлять при сохранении нативности бактериальных клеток. Выделение полисахарида из жидкой фазы может быть осуществлено способом, включающим: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii) ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
Полученный вышеуказанным способом экзополисахарид может содержать не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот. Молекулярная масса экзополисахарид а, измеренная методом гель- фильтрации, составляет от 0,4 до 400 kDa. Основная фракция экзополисахарида представляет собой биополимер с молекулярной массой более 80 kDa (Фиг. 5В).
Экзополисахарид является иммуногенным и вызывает мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме млекопитающих, включая человека (Пример 1С, Фиг.6; Примеры 2D, 2F). Максимальную иммуногенность обнаруживает фракция экзополисахарида с молекулярной массой от 80 до 400 kDa. Иммуногенность экзополисахарида превышает более чем в 7 раз иммуногенность О-полисахарида из LPS клеток бактерии (Пример 1С, Фиг.6). Экзополисахарид является
апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте
пирогенности на кроликах при внутривенном введении (Пример 1D). Заявленная вакцина может включать фармацевтически приемлемые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты или их комбинации. Кроме того, вакцина может включать экзополисахарид как в
неконъюгированной, так и в конъюгированной форме. При этом вакцина, включающая конъюгированную форму экзополисахарида, дополнительно содержит белковый носитель, а именно дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa, или другие белки.
Заявленная фармацевтическая композиция включает эффективное
количество полисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I, состоящего из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(М-ацетил)амино- 2,4-дидезокси-Р-0-галактопиранозил]— (1— ^-(^-[^-(М-ацетш^амино^- дезокси-а-Ь-альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1— >3)связями, и полученного с использованием бактерий Shigella sonnei, но при этом без использования липополисахаридов в качестве источника его получения.
Данный полисахарид является экзополисахаридом, или капсульным полисахаридом, продуцируемым бактерией S. sonnei, фаза I во внешнюю среду. Нативный экзополисахарид включает нетоксичный липидный компонент, представленный негидроксилированными жирными кислотами с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле (Фиг. 4). Содержание жирных кислот в нём составляет не менее 0,01 мас.%. Кроме того, полученный любым способом с использованием бактерии S. sonnei экзополисахарид не включает элементов структуры домена кора LPS (Фиг. 4). Экзополисахарид можно получать любым способом, включая генно-инженерный, с использованием генома бактерии Shigella sonnei.
Предпочтительно экзополисахарид получают с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы. При этом, во избежание
разрушения клеточных стенок и попадания LPS в жидкую фазу,
отделение её от бактериальных клеток целесообразно осуществлять при сохранении нативности бактериальных клеток. Выделение полисахарида из жидкой фазы может быть осуществлено способом, включающим: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii)
ультрафильтрацию и (ш) диализ полученного раствора.
Полученный вышеуказанным способом экзополисахарид может содержать не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот. Молекулярная масса экзополисахарида, измеренная методом гель- фильтрации, составляет от 0,4 до 400 kDa. Основная фракция экзополисахарида представляет собой биополимер с молекулярной массой более 80 kDa (Фиг. 5В).
Экзополисахарид является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека (Пример ЗВ). Экзополисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте
пирогенности на кроликах при внутривенном введении (Пример 1D).
Заявленная фармацевтическая композиция может включать
фармацевтически приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, растворители или их комбинации.
Заявленная фармацевтическая композиция может обладать широким спектром фармакологической активности и обнаруживает, в частности, эффективное лечебное противовирусное действие при инфекции,
вызываемой вирусом гриппа A H1N1 (Пример ЗВ, Фиг. 9).
Заявлено также применение полисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I, для производства фармацевтического средства. Указанный полисахарид состоит из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(1 - ацетил)амино-2,4-дидезокси-Р-0-галактопиранозил]— (1— >4)-0-[2-(N- ацетил)амино-2-дезокси-а-Ь-альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1— >3 )связями, и получен с использованием бактерий Shigella sonnei, но при этом без использования липополисахаридов в качестве источника его получения.
Данный полисахарид является экзополисахаридом, или капсульным полисахаридом, продуцируемым бактерией S. sonnei, фаза I во внешнюю среду. Нативный экзополисахарид включает нетоксичный липидный компонент, в состав которого входят негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле (Фиг. 4). Содержание жирных кислот в нём составляет не менее 0,01 мас.%. Кроме того, полученный любым способом с использованием бактерии S. sonnei экзополисахарид не включает элементов структуры домена кора LPS (Фиг. 4). Экзополисахарид можно получать любым способом, включая генно-инженерный, с использованием генома бактерии Shigella sonnei.
Предпочтительно экзополисахарид получают с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы. При этом, во избежание разрушения клеточных стенок и попадания LPS в жидкую фазу, отделение её от бактериальных клеток целесообразно осуществлять при сохранении нативности бактериальных клеток. Выделение полисахарида из жидкой фазы может быть осуществлено способом, включающим: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii) ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
Полученный вышеуказанным способом экзополисахарид может содержать не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот. Молекулярная масса экзополисахарида, измеренная методом гель- фильтрации, составляет от 0,4 до 400 kDa. Основная фракция экзополисахарида представляет собой биополимер с молекулярной массой более 80 kDa (Фиг. 5В).
Экзополисахарид является иммуногенным и вызывает мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме млекопитающих, включая человека (Пример 1С, Фиг.6; Примеры 2D, 2F). Кроме того, экзополисахарид является также модулятором реакций иммунной системы у млекопитающих, включая человека (Пример ЗВ).
Экзополисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах при внутривенном
введении (Пример 1D). Фармацевтическое средство предназначено для парентерального, перорального, ректального, интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного введения млекопитающим, включая человека.
Краткое описание чертежей
Изобретения иллюстрируются следующими фигурами.
На Фиг.1 представлена структурная формула мономерного звена
экзополисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I.
На Фиг.2 представлен С 13 ЯМР-спектр экзополисахарида бактерии
Shigella sonnei, фаза I, (серия 33).
На Фиг.З представлены результаты ГЖХ масс-спектрометрии LPS
бактерии Shigella sonnei, фаза I.
На Фиг.4 представлены результаты ГЖХ масс-спектрометрии
экзополисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I; стрелками отмечены сигналы негидроксилированных жирных кислот. На Фиг.5 представлены графики молекулярно-массового распределения О- специфического полисахарида, выделенного из LPS бактерии Shigella sonnei, фаза I (а) и экзополисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I (б). При этом на оси ординат представлены значения ультрафиолетового поглощения, при длине волны 225 нм; на оси абсцисс указано время, в мин.
На Фиг.6 представлены диаграммы продукции антител (15 сутки) после первичной (а) и вторичной (б) иммунизации мышей препаратами
экзополисахарида бактерии S. sonnei, фаза I (серия 33) и О-полисахарида из LPS клеток бактерии S. sonnei, фаза I, в дозе 25 мкг на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.7 представлены графики связывания антител из монорецепторной кроличьей сыворотки к О-антигену Shigella sonnei, фаза 1 , с образцами экзополисахарида бактерии Shigella sonnei (серии 33 и 35); 0-полисахарида из LPS клеток бактерии Shigella sonnei; LPS Salmonella enterica sv
typhimurium; LPS Shigella flexneri 2a в ELISA тесте. При этом на оси абсцисс представлены значения титра разведения сыворотки, а на оси ординат - значения оптической плотности цветного субстрата реакции (орто-фенилендиамина) при длине волны 495/650 нм.
На Фиг.8 представлены диаграммы продукции антител (15 сутки) после первичной (а) и вторичной (б) иммунизации мышей вакциной, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S. sonnei, фаза I, и вакциной, включающей коньюгированный с CAT экзополисахарид бактерии S.sonnei, фаза I (серия 33), в дозе 25 мкг полисахарида на мышь. На оси ординат указаны значения титра разведения сыворотки.
На Фиг.9 представлены графики выживаемости двух групп мышей, инфицированных дозой LD 100 вирулентного штамма гриппа A HI N1. При этом первая группа (опыт) получала ежедневные инъекции фармкомпозиции, в дозе 100 мкг экзополисахарида на мышь, вторая же группа (контроль) - инъекции физиологического раствора соответственно. Лучшие варианты осуществления изобретений
Пример 1
Получение и характеристика экзополисахарида бактерии Shigella sonnei, фаза I
А. Получение экзополисахарида
Экзополисахарид получали с использованием бактерии S. sonnei, фаза I. Культуру бактерий получали в жидкой фазе, путём глубинного
культивирования S. sonnei в питательной среде. Отделение жидкой фазы от бактериальных клеток осуществляли с помощью проточной центрифуги (Westphalia) с охлаждением, при соблюдении режимов, обеспечивающих мягкое осаждение клеток с сохранением их нативности.
Экзополисахарид выделяли из жидкой фазы путём удаления из неё белков и нуклеиновых кислот, последующей ультрафильтрации и диализа
полученного раствора. С этой целью жидкую фазу концентрировали и подвергали диализу с использованием установки для ультрафильтрации (Владисарт; предел прохождения мембраны 50 kDa). Диализат
лиофилизировали, вновь растворяли в 0,05 М трис-буфере, рН = 7,2, содержащем 0,01% СаС12 и MgCl2, добавляли RNA-азу и DNA-азу в количествах 100 мкг/мл и 10 мкг/мл соответственно и через 16 часов перемешивания при 37°С реакционную смесь обрабатывали протеиназой К (20 мкг/мл) в течение 2-х часов при температуре 55°С. Полученный прозрачный раствор подвергали ультрафильтрации и диализу с
использованием установки для ультрафильтрации (Владисарт; предел прохождения мембраны 50 kDa). При необходимости полученный раствор лиофилизировали и получали очищенный экзополисахарид с выходом 60- 80%. Полученный вышеуказанным способом экзополисахарид содержит не более 1 мас.% белков, определяемых методом Бредфорда (Bradford М.М. А rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp. 248- 254), и не более 2 мас.% нуклеиновых кислот, определяемых методом Спирина (Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, 1958, т. 23, N2 4, с. 656).
В. Структура, состав и физико-химические свойства экзополисахарида Структуру экзополисахарида S. sonnei, фаза I изучали с помощью
С ЯМР-спектроскопии. ЯМР-спектроскопия выполнена на спектрометре Bruker, модель DRX-500, с программным обеспечением XWINNMR и импульсными последовательностями от производителя. Съемка спектров проводилась в D2o (99 : 95 %) с ацетоном в качестве стандарта (31 ,5 ррт для
С 13 ). Масс-спектроскопия высокого разрешения с ионизацией
электрораспылением и регистрацией ионов с помощью ион-циклотронного резонанса выполнена на спектрометре Bruker Daltonics, модель Apex II, с магнитом 7 Тесла.
Сравнительный анализ С13 ЯМР-спектра экзополисахарида (Фиг. 2) показал
1
его полную идентичность известным С ЯМР-спектрам О-специфического полисахарида, выделенного из LPS S.sonnei, фаза 1, что однозначно указывает на тождество строения мономерных звеньев обоих биополимеров (Фиг. 1).
Исследования липидного компонента экзополисахарида проводили на основании анализа жирных кислот с помощью газо-жидкостной
хроматографии и ГЖХ/масс-спектрометрии на хроматографе Hewlett
Packard, модель 5890, соединенном с масс-спектрометром NERMAG, модель R10-10L.
Проведено сравнительное исследование жирнокислотного состава и строения экзополисахарида и LPS S.sonnei, фаза I. Экзополисахарид и LPS были подвергнуты метан олизу действием 2М НС1/СН3ОН при 85°С в течение 16 часов. В метанолизате LPS были обнаружены лауриновая (12:0), миристиновая (14:0) и β-гидроксимиристиновая (30Н14:0) кислоты (Фиг. 3), тогда как метанолизат экзополисахарида содержал в качестве основных продуктов метиловые эфиры высших жирных кислот 16:0, 18: 1 и 18:0 (Фиг. 4).
Результаты ГЖХ/масс-спектрометрии позволили заключить, что
экзополисахарид содержит нетоксичный липидный компонент, содержащий негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле, характерные для диглицеридов, в количестве не менее 0,01 мас.% . В экзополисахариде, в отличие от LPS, не обнаружены
компоненты олигосахарида кора (гептоза, Kdo) и липида А
(гидроксилированнные жирные кислоты; жирные кислоты с более короткой, чем у пальмитиновой кислоты, цепью) (Фиг. 4). При мягкой кислотной деградации экзополисахарида не происходит отщепления липидной части. Мягкий гидролиз LPS 1%-ной уксусной кислотой приводит к удалению липида А из молекулы LPS. При этом оставшийся полисахаридный
компонент представляет собой О-специфический полисахарид,
присоединенный к олигосахариду «кора» (Fensom and Meadow, 1970;
Morrison and Leive, 1975; Oertelt et al., 2001; Osborn, 1963).
Таким образом, экзополисахарид не является ни LPS, необходимыми компонентами которого служат кор и липид А, ни О-специфическим полисахаридом, включающим олигосахаридный фрагмент «кора», а представляет собой гликоконьюгат иного состава и структуры, но с тем же строением повторяющегося мономерного звена, что и О-антиген S.sonnei. Исследование молекулярно - массового распределения экзополисахарида S.sonnei и О-специфического полисахарида, выделенного из LPS S.sonnei, проведено с помощью ВЭЖХ на колонке TSK 3000 SW с помощью проточного УФ-детектора (длина волны 225 нм) в буфере, содержащем 0,02 М NaOAc, 0,2 М NaCl (рН 5,0). Сравнительный анализ хроматограмм О- специфического полисахарида и экзополисахарида показал, что основная фракция О-полисахарида имеет молекулярную массу ~26 kDa (Фиг. 5А), тогда как экзополисахарид представляет собой биополимер с молекулярной массой более 80 kDa (Фиг. 5В).
C. Иммуногенность экзополисахарид а
Две группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI внутрибрюшинно
иммунизировали препаратом экзополисахарида бактерии S.sonnei, серия 33, и препаратом О-полисахарида из LPS клеток бактерии Shigella sonnei, в дозе 25 мкг на мышь. Препарат экзополисахарида индуцировал
гуморальный иммунный ответ после однократного введения и на 15 сутки в сыворотках периферической крови животных определяли 3,4-кратное увеличение количества IgG антител; препарат же О-полисахарида из LPS клеток бактерии индуцировал слабый первичный иммунный ответ - 1,9- кратное увеличение количества IgG антител на 15 сутки соответственно (Фиг. 6А).
Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей
иммунизировали антигенами повторно в дозе 25 мкг на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки вторичного ответа после повторной иммунизации препаратом экзополисахарида, серия 33, у мышей
зарегистрировано 25 -кратное увеличение количества IgG анти-0 антител, т.е. наблюдался анамнестический вторичный иммунный ответ. После повторной иммунизации мышей препаратом О-полисахарида из LPS клеток бактерии зарегистрирован слабый 3,4-кратный подъем количества IgG анти-0 антител (Фиг. 6В). Таким образом, экзополисахарид бактерии обладает существенно более высокой иммуногенностью, индуцируя синтез О-специфических IgG антител, уровень которых в 7 раз превышает таковой, индуцируемый О-полисахаридом из LPS клеток бактерии.
D. Пирогенность экзополисахарида
Пирогенность препаратов экзополисахарида бактерии S.sonnei (серия 33 и 35) и О-полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei определяли в сравнении с пирогенностью образцов LPS, полученных из клеток того же штамма по методу Westphal (Westphal О., Jann К. Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem., 1965, v.5, pp.83-91), и коммерческой Vi-антигенной вакциной. Тест проводился на кроликах породы Шиншилла массой 2,80-3,05 кг в соответствии с требованиями Технического регламента ВОЗ для Vi- полисахаридной вакцины (WHO Technical report No.840, 1994). После введения препарата трижды измеряли ректальную температуру кроликов с интервалом в 1 час. Апирогенным считали препарат, для которого суммарное
о
повышение температуры не превышало 1 , 15 С.
Таблица 1. Пирогенность препаратов полисахаридов и LPS бактерии
S.sonnei и комме ческой Vi- антигенной вакцины
Figure imgf000022_0001
Внутривенное введение препарата экзополисахарида бактерии S.sonnei и препарата О-полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei в дозе 0,050 мкг на кг массы тела не вызывало пирогенного эффекта у кроликов. Препарат LPS, полученный из клеток того же штамма, являясь классическим эндотоксином, обнаружил высокую пирогенность.
Пример 2
Вакцины, включающие экзополисахарид бактерии S. sonnei, фаза I A. Применение экзополисахарида для производства неконъюгированной вакцины (фармацевтического средства)
Приготовление неконъюгированной вакцины включает получение
экзополисахарида с использованием бактерии S.sonnei, фаза 1 согласно Примеру 1 (А) и последующий стерильный розлив в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную субстанцию и фармацевтически
приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты или их комбинации. Прививочная доза вакцины содержит:
неконъюгированную форму экзополисахарида, в количестве от 0,010 мг до 0,100 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг (Sigma, USP Grade 108-95-2), с добавлением натрия хлорида (Sigma,USP Grade 7647-14-5), натрия фосфата двузамещенного (Sigma, USP Grade 7782-85-6) и натрия фосфата
однозамещенного (Sigma, USP Grade 13472-35-0); воду апирогенную
стерильную для инъекций, 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).
B. Серологическая активность неконъюгированной вакцины
Серологическую активность и иммуноспецифичность вакцины,
включающей экзополисахарид в неконъюгированной форме, в концентрации 100 мкг/мл (серии 33 и 35), определяли в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) в сравнении с другими О-антигенами в
концентрации 100 мкг/мл - О-полисахаридом из LPS клеток бактерии
S.sonnei, а также LPS бактерий S. sonnei , S.flexneri 2а и Salmonella enterica sv typhimurium, полученных методом Westphal (Westphal О., Jann К. Bacterial lipopoly saccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem., 1965, v.5, p.83-91).
Использовали коммерческий диагностикум эритроцитарный Зонне
(Микроген, Россия) и монорецепторные кроличьи сыворотки к О-антигену S. sonnei.
Концентрация торможения РПГА вакцинами, включающими экзополисахарид (серия 33 и 35), О-полисахарид из LPS, а также препарат LPS бактерии S.sonnei, не превышала 1 ,56 мкг/мл (Табл. 2).
Гетерологичные LPS бактерий S.flexneri 2а и Salmonella enterica sv typhimurium обладали слабой серологической активностью в реакции с монорецепторной сывороткой Зонне (концентрации торможения >25 мкг/мл) (Табл. 2).
Таблица 2 . Торможение РПГА неконъюгированной вакциной, включающей экзополисахарид бактерии S.sonnei, и препаратами О-полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei и LPS бактерий S. sonnei , S.flexneri 2а,
Figure imgf000024_0001
В тесте ELISA определяли взаимодействие in vitro серий вакцин,
включающих неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei в концентрации 100 мкг/мл (серия 33-1 и 35-1), и другие О- антигены в концентрации 100 мкг/мл - О-полисахарид из LPS клеток бактерии S.sonnei, препараты LPS бактерий S.flexneri 2а и Salmonella enterica sv typhimurium, с антителами монорецепторной кроличьей
сыворотки к О-антигену S. sonnei. При адсорбции на твердой фазе вакцины, включающие экзополисахарид бактерии S.sonnei и О-полисахарид из LPS клеток бактерии S.sonnei, также эффективно взаимодействовали с сывороткой к О-антигену S. sonnei (Фиг.7).
С. Пирогенность неконъюгированной вакцины
Пирогенность вакцины, содержащей 100 мкг/мл неконъюгированной формы экзополисахарида бактерии S.sonnei (серия 33 и 35), определяли в сравнении с пирогенностью коммерческой Vi-антигенной вакцины, О-полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei и LPS, полученных из надклеточной жидкости (НЖ) и клеток того же штамма методом Westphal по методике, описанной в примере 1 С. Результаты теста представлены в таблице 3.
Таблица 3. Пирогенность вакцины, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei , коммерческой Vi- антигенной вакцины, препаратов О-полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei и
Figure imgf000025_0001
Внутривенное введение вакцины, включающей экзополисахарид бактерии S.sonnei, в дозе 0,050 мкг на кг массы тела не вызывало пирогенного эффекта у кроликов. Препарат LPS из клеток бактерии S.sonne того же штамма обладал высокой пирогенностью и, таким образом, представлял собою классический эндотоксин.
D. Протективные свойства неконъюгированной вакцины
Для изучения формирования протективного мукозального иммунитета у морских свинок, опытных животных весом 200-250 г иммунизировали подкожно вакциной, включающей 100 мкг/мл неконъюгированной формы экзополисахарида бактерии S.sonnei (серия 33 и 35), и препаратом О- полисахарида из LPS клеток бактерии S.sonnei, в дозах 25 и 50 мкг на животное в область спины двукратно с интервалом в 10 дней. Контрольным животным вместо препарата вводили физиологический раствор. Через 10 дней после последней иммунизации у опытных и контрольных животных вызывали дизентерийный кератоконъюнктивит (тест Sereny), вводя в конъюнктиву глаза суспензию клеток вирулентного штамма S.sonnei в дозе, близкой к ИДюо (Ю9 клеток), и в дозе, близкой к 2ИД10о (2x109 клеток), в 30 мкл стерильного физиологического раствора. У всех животных
контрольной группы, инфицированных дозой 2x109 клеток, и у 90% животных контрольной группы, инфицированных дозой 109 клеток, развился дизентерийный кератоконъюнктивит (Табл.4 ). Иммунизация вакциной, включающей экзополисахарид (серии 33 и 35), в дозе 25 мкг обеспечивала защиту глаз от 70 до 90% опытных животных при
заражении дозой 109 клеток; при заражении дозой 2x109 уровень защиты глаз животных варьировал от 50 до 70% соответственно. Иммунизация той же вакциной в дозе 50 мкг обеспечивала защиту глаз от 55 до 85% опытных животных при заражении дозой 109 клеток; при заражении дозой 2х109 уровень защиты глаз животных варьировал от 50 до 70%
соответственно. Таким образом, при подкожной иммунизации животных вакциной на основе неконъюгированной формы экзополисахарида бактерии S. sonnei (серия 33 и 35), у них регистрировался выраженный местный противодизентерийный иммунитет, в то время как иммунизация препаратом О-полисахарида из LPS клеток бактерии S. sonnei не выявила противодизентерийного эффекта препарата.
Таблица 4. Протективный мукозальный иммунитет к дизентерийной инфекции S.sonnei у морских свинок после системной иммунизации их вакциной, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида
Figure imgf000027_0001
Е. Безопасность неконъюгированной вакцины
Вакцину, включающую неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei (серия 33), в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, и препарат сравнения - вакцину брюшнотифозную Vi-антигенную «Вианвак», в дозе 25 мкг, вводили однократно подкожно двум группам по 20 взрослых добровольцев в верхнюю треть плеча. В течение первых трех суток после иммунизации определяли температурные реакции на введение препаратов, общие
побочные и местные реакции. Вакцина, включающая экзополисахарид бактерии S.sonnei (серия 33), введенная в дозе 50 мкг, показала высокую безопасность для взрослых добровольцев. Температурные реакции в диапазоне 37,1 - 37,5°С были выявлены лишь у 5% добровольцев, более высокие температурные и общие побочные реакции отсутствовали; местная реакция (болезненность в месте инъекции) была зафиксирована только у одного добровольца (Таблица 5).
Таблица 5. Безопасность вакцины, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei, при иммунизации взрослых
Figure imgf000028_0001
F. Иммуногенность неконъюгированной вакцины
Иммуногенность вакцины, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei (серия 33), для взрослых добровольцев определяли в серологических исследованиях, используя тесты иммуноферментного анализа (ELISA) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Вакцину, включающую экзополисахарид бактерии S.sonnei (серия 33), в дозе 50 мкг антигена, содержащегося в 0,5 мл фенол-фосфатного буфера в качестве растворителя, и препарат сравнения - вакцину
брюшнотифозную Vi-антигенную «Вианвак», в дозе 25 мкг, вводили однократно подкожно двум группам испытуемых, по 20 взрослых
добровольцев, в верхнюю треть плеча. Сыворотки крови для исследований брали у испытуемых до вакцинации и через 30 и 60 дней после вакцинации соответственно.
Для проведения ELISA анализа использовали планшеты,
сенсибилизированные липополисахаридом бактерии S.sonnei, кроличьи антитела против IgG, IgM, IgA человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma,USA). Оптическую плотность измеряли на ELISA-ридере фирмы Bio-Rad iMark при двуволновом считывании (490/630 нм).
Тест РПГА проводили согласно инструкции производителя, используя эритроцитарный коммерческий диагностикум (Микроген, Россия).
Иммуногенность вакцины оценивали по следующим показателям: 4-х кратным сероконверсиям по сравнению с фоновой сывороткой, уровню антигенного ответа до и после вакцинации; при этом определяли средние геометрические титры антител (СГТА), кратность нарастания титров в группе привитых испытуемых по сравнению с фоновой сывороткой.
Нарастание титров анти-0 антител наблюдали у всех добровольцев, привитых вакциной, включающей экзополисахарид бактерии S.sonnei (серия 33). При этом кратность нарастания титров агглютинирующих антител до и после вакцинации была высокой и составила 40,7х и 42,5х раза на 30-й и 60- й день после вакцинации соответственно. У вакцинированных испытуемых зарегистрированы высокие уровни сероконверсий антител к О-антигену S.sonnei, составляющие > 90%. У испытуемых, иммунизированных вакциной «Вианвак», подъемов специфических антител и 4-х кратных сероконверсий отмечено не было (Табл. 6).
Изучение у испытуемых кратности нарастания и сероконверсии IgA, IgG, IgM классов антител к О-антигену S.sonnei в ELISA-тесте по сравнению с фоновым уровнем при иммунизации их вакциной, включающей
экзополисахарид бактерии S.sonnei (серия 33), выявило высокие подъемы титров антител, преимущественно IgA класса. Так, кратность нарастания титра IgA антител составила на 30-й и 60-й день после иммунизации 25,7 х и 30,2 х раза; IgG антител - 6,1х и 5,8х раза соответственно. Уровень сероконверсии О-специфических антител IgA, IgG классов был высоким и составил для IgA - 96 и 94%; для IgG - 73 и 72% на 30-й и 60-й день после вакцинации соответственно. Таким образом, заявленная вакцина, включающая неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии
S.sonnei, при однократной подкожной иммунизации взрослых добровольцев индуцирует системный адаптивный иммунный ответ с доминированием антител IgA класса.
Таблица 6. Индукция вакциной, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei, системного иммунного ответа при подкожной иммунизации взрослых добровольцев.
Число Число лиц
Ко- Кратность лиц с 4-х Кратность с 4-х и более ли- нарастания кратными нарастания кратными чес- титра сероконве титра сероконверсия
Вакцина и доза тво антител по рсиями антител по ми через 60 иммунизации доб- сравнению через 30 сравнению дней после ро- с титром дней с титром вакцинации, воль- антител до после антител до в % цев вакцинации вакцинац вакцинации
ии, в %
РПГА- агглютинирующие антитела
Вакцина, включающая
экзополисахарид
20 40,7 90% 42,5 95% бактерии S.sonnei
(серия 33), 50 мкг Vi-антигенная вакцина Не
«Вианвак» 20 1,14 обнару- 1,16 Не обнаружено (серия 193), 25 мкг жено
ELISA - IgA
Вакцина, включающая
экзополисахарид
20 25,7 95% 30,2 95% бактерии S. sonnei
(серия 33), 50 мкг
Vi-антигенная вакцина Не
«Вианвак» 20 0,82 обнару- 0,99 Не обнаружено (серия 193), 25 мкг жено
ELISA - IgG
Вакцина, включающая
экзополисахарид
20 6Д 75% 5,8 70% бактерии S.sonnei
(серия 33), 50 мкг
Vi-антигенная вакцина Не
«Вианвак» 20 1,06 обнару- 1,09 Не обнаружено (серия 193), 25 мкг жено
ELISA - IgM
Вакцина, включающая
экзополисахарид
20 2,51 50% 2,73 50% бактерии S.sonnei
(серия 33), 50 мкг
Vi-антигенная вакцина Не
«Вианвак» 20 1,10 обнару- 1,14 Не обнаружено (серия 193), 25 мкг жено
G. Применение экзополисахарида для производства конъюгированной вакцины (фармацевтического средства).
Экзополисахарид получали с использованием бактерии S.sonnei , фаза1 согласно Примеру 1 (А).
Получение конъюгата ЭП с белком может быть проведено по любому из известных методов. В рамках настоящего исследования был использован подход (Taylor D.N., Trofa А.С., Sadoff J., Chu С, Brula D., Shiloach J., Cohen D., Ashkenazi S., Lerman Y., Egan W., Schneerson R., Robbins J.B. Synthesis, characterization, and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O- specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids. Infect. and Immunity. 1993, pp.3678-3687), основанный на модификации ЭП адипиндигидразидом (АГ) в присутствии 1 -этил-3-(3- диметиламинопропил)карбодиимида (КДИ) с последующим
взаимодействием образующегося амидированного ЭП со свободной
гидразидной группой с белковым носителем - столбнячным анатоксином (СА).
Модификацию ЭП с АГ в присутствии КДИ проводили в воде в течение 2- 16 часов, поддерживая значение рН 4,8-5,2 прибавлением конц. НС1 с помощью рН-стата. Модифицированный ЭП выделяли на колонке с
Сефадексом G-50 в воде. Контроль степени амидирования осуществлялся с помощью 13С- МР-спектроскопии. Конъюгацию модифицированного ЭП с СА проводили в 0,2М растворе хлористого натрия в присутствии КДИ в течение 4-18 часов, поддерживая значение рН 5,6 с помощью рН-стата.
Конъюгат очищали на колонке с Сефарозой CL-6B от незначительного количества неконъюгированных исходных биополимеров и
низкомолекулярных примесей, используюя в качестве элюента 0,2М раствор хлористого натрия. Фракции, содержащие конъюгат ЭП с белком и
элюирующиеся вблизи холостого объема колонки, объединяли и
прибавляли к ним фенол до концентрации 0,05-0,15%.
для последующего стерильного розлива в ампулы с добавлением
фармацевтически приемлемых целевых добавок, в качестве которых использовались стабилизаторы рН или консерванты, или адъюванты, или изотонизирующие агенты или их комбинации.
Вакцинный конъюгат содержал 40 мае. % белка, определенного методом Бредфорд (Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 1976, v. 72, pp.248-254).
Одна прививочная доза конъюгированной вакцины содержит: коньюгат экзополисахарида от 0,010 до 0,200 мг; фенол (консервант), не более 0,75 мг (Sigma, USP Grade 108-95-2), с добавлением натрия хлорида (Sigma,USP Grade 7647-14-5), натрия фосфата двузамещенного (Sigma, USP Grade 7782- 85-6) и натрия фосфата однозамещенного (Sigma, 13472-35-0); воду
апирогенную, стерильную для инъекций 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002). Н. Иммуногенность конъюгированной вакцины
Две группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI внутрибрюшинно
иммунизировали вакциной, включающей неконъюгированную форму экзополисахарида бактерии S.sonnei, серия 33 и вакциной, включающей конъюгат экзополисахарида бактерии S.sonnei, серия 33 с белковым носителем CAT, в дозе 25 мкг полисахарида на мышь. Неконъюгированная вакцина индуцирует гуморальный иммунный ответ после однократного введения и на 15 сутки в сыворотках периферической крови животных определяли 3,4-кратное увеличение количества IgG антител.
Конъюгированная вакцина также индуцирует гуморальный иммунный ответ после однократного введения и на 15 сутки в сыворотках периферической крови животных определяли 3,7-кратное увеличение количества IgG
антител (Фиг.8А).
Для изучения вторичного иммунного ответа те же группы мышей
иммунизировали вакцинами повторно в дозе 25 мкг полисахарида на мышь через месяц после первичного введения. На 15 сутки вторичного ответа после повторной иммунизации конъюгированной вакциной
зарегистрировано 27-кратное увеличение количества IgG анти-О антител, а после повторной иммунизации неконъюгированной вакциной - 23,6- кратное увеличение количества IgG анти-0 антител соответственно. При этом уровни О-специфических антител существенно превышали показатели первичного иммунного ответа у иммунизированных мышей (Фиг.8В).
Пример 3
Фармацевтическая композиция, включающая экзополисахарид бактерии S. sonnei, фаза I A. Применение экзополисахарида для производства фармацевтической композиции (фармацевтического средства)
Приготовление фармацевтической композиции включает получение экзополисахарида с использованием бактерии S.sonnei, фаза1 согласно Примеру 1 (А) и последующий стерильный розлив в ампулы или шприцы раствора, содержащего активную субстанцию и фармацевтически
приемлемые целевые добавки, в качестве которых могут быть использованы консерванты, стабилизаторы, растворители или их комбинации.
Лечебная доза фармацевтической композиции содержит: экзополисахарид, от 0,010 до 5,000 мг, с добавлением натрия хлорида (Sigma,USP Grade 7647- 14-5), натрия фосфата двузамещенного (Sigma, USP Grade 7782-85-6) и натрия фосфата однозамещенного (Sigma, USP Grade 13472-35-0), воду апирогенную стерильную для инъекций 0,5 мл (ФС 42-2620-97, ЕР IV 2002).
B. Противовирусное действие фармацевтической композиции
Две группы мышей линии (СВАХС57В1/6) FI, по 10 животных каждая, инфицировали дозой LD 100 вирулентного штамма гриппа A H1N1, после чего осуществляли лечение опытной группы путём ежедневного
внутрибрюшинного введения животным фармацевтической композиции, в дозе 100 мкг экзополисахарида на животное; контрольной же группе животных аналогично вводили физиологический раствор. Выживаемость животных определяли в течение двух недель после инфицирования. В контрольной группе выживаемость составила 0 %, в опытной - 20% (Фиг. 9). При этом средние показатели продолжительности жизни опытной группы мышей статистически достоверно (р > 0,001) были выше
контрольной. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявленная фармацевтическая композиция обладает модулирующим реакции иммунной системы действием.

Claims

Формула изобретения
1. Полисахарид бактерии Shigella sonnei, фаза I , состоящий из 1 - 100 повторяющихся дисахаридных звеньев 0-[4-амино-2-(1Ч-ацетил)амино-2,4- дидезокси- -О-галактопиранозил]— (1— >4)-0-[2-(М-ацетил)амино-2-дезокси- a-L-альтрпирануроновой кислоты], соединенных в полисахаридной цепи (1— »3)связями, полученный с использованием бактерий Shigella sonnei, но при этом без использования липополисахаридов в качестве источника его получения.
2. Полисахарид по п.1 , полученный с использованием бактерий
Shigella sonnei, способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы.
3. Полисахарид по п.2, полученный с использованием бактерий
Shigella sonnei способом, в котором отделение жидкой фазы от
бактериальных клеток осуществляют при сохранении нативности бактериальных клеток.
4. Полисахарид по п.2, полученный с использованием бактерий
Shigella sonnei способом, в котором выделение полисахарида из жидкой фазы включает: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii) ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
5. Полисахарид по п.1 , представляющий собой экзополисахарид, продуцируемый бактериями Shigella sonnei, фаза I, во внешнюю среду.
6. Полисахарид по п.5, представляющий собой бактериальный
капсульный полисахарид.
7. Полисахарид по п.1 или п.5, или п.6, включающий нетоксичный липидный компонент.
8. Полисахарид по п.7, в котором в состав нетоксичного липидного компонента входят негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле.
9. Полисахарид по п.8, в котором содержание негидроксилированных жирных кислот составляет не менее 0,01 мас.% .
10. Полисахарид по любому из пп. 1 - 9, молекулярная масса которого, измеренная методом гель-фильтрации, составляет от 0,4 до 400 kDa.
1 1. Полисахарид по любому из пп. 1 - 10, содержащий не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот.
12. Полисахарид по любому из пп. 1 - 11, вызывающий мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме
млекопитающих, включая человека.
13. Полисахарид по любому из пп. 1 - 12, апирогенный для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах.
14. Способ получения полисахарида по п.1, включающий: (а) получение культуры бактерий Shigella sonnei в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы.
15. Способ по п.14, в котором отделение жидкой фазы от
бактериальных клеток осуществляют при сохранении нативности
бактериальных клеток.
16. Способ по п.14, в котором выделение полисахарида из жидкой фазы включает: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот;
(ii) ультрафильтрацию и (iii) диализ полученного раствора.
17. Вакцина, включающая эффективное количество полисахарида по п.1.
18. Вакцина по п.17, в которой полисахарид получен с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы.
19. Вакцина по п.18, в которой полисахарид получен с
использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим отделение жидкой фазы от бактериальных клеток при сохранении нативности бактериальных клеток.
20. Вакцина по п.18, в которой полисахарид получен с использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим следующие стадии его выделения из жидкой фазы: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (и) ультрафильтрацию и (ш) диализ полученного раствора.
21. Вакцина по п.17, в которой полисахарид представляет собой экзополисахарид, продуцируемый бактериями Shigella sonnei, фаза I, во внешнюю среду.
22. Вакцина по п.21, в которой полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид.
23. Вакцина по любому из пп. 17 - 22, в которой полисахарид включает нетоксичный липидный компонент.
24. Вакцина по п.23, в которой нетоксичным липидным компонентом полисахарида являются негидроксилированные жирные кислоты с 16- тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле.
25. Вакцина по п.24, в которой содержание негидроксилированных жирных кислот в полисахариде составляет не менее 0,01 мас.% .
26. Вакцина по любому из пп. 17 - 25, в которой полисахарид имеет молекулярную массу, измеренную методом гель-фильтрации, от 0,4 до 400 kDa.
27. Вакцина по любому из пп. 17 - 26, в которой полисахарид содержит не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот.
28. Вакцина по любому из пп. 17 - 27, в которой полисахарид вызывает мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме млекопитающих, включая человека.
29. Вакцина по любому из пп. 17 - 28, в которой полисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах.
30. Вакцина по любому из пп.17 - 29, включающая фармацевтически приемлемые добавки.
31. Вакцина по п.30, в которой фармацевтически приемлемые добавки выбраны из группы, включающей стабилизаторы рН, консерванты, адъюванты, изотонизирующие агенты или их комбинации.
32. Вакцина по любому из пп.17 - 31 , в которой полисахарид содержится в неконъюгированной форме.
33. Вакцина по п.ЗО, включающая в качестве фармацевтически приемлемой добавки белковый носитель.
34. Вакцина по п.33, в которой белковый носитель выбран из группы, включающей дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин,
экзопротеин A Pseudomonas aeruginosa.
35. Вакцина по п.33 или п.34, в которой полисахарид содержится в конъюгированной форме.
36. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное
количество полисахарида по п.1.
37. Фармацевтическая композиция по п.36, в которой полисахарид получен с использованием бактерий Shigella sonnei способом,
включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы.
38. Фармацевтическая композиция по п.37, в которой полисахарид получен с использованием бактерий Shigella sonnei способом,
включающим отделение жидкой фазы от бактериальных клеток при сохранении нативности бактериальных клеток.
39. Фармацевтическая композиция по п.37, в которой полисахарид получен с использованием бактерий Shigella sonnei способом,
включающим следующие стадии его выделения из жидкой фазы:
(i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот;
(ii) ультрафильтрацию и (Hi) диализ полученного раствора.
40. Фармацевтическая композиция по п.36, в которой полисахарид представляет собой экзополисахарид, продуцируемый бактериями Shigella sonnei, фаза I, во внешнюю среду.
41. Фармацевтическая композиция по п.40, в которой полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид.
42. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 41, в которой полисахарид включает нетоксичный липидный компонент.
43. Фармацевтическая композиция по п.42, в которой нетоксичным липидным компонентом полисахарида являются негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле.
44. Фармацевтическая композиция по п.43, в которой содержание негидроксилированных жирных кислот в полисахариде составляет не менее 0,01 мас.% .
45. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 44, в которой полисахарид имеет молекулярную массу, измеренную методом гель- фильтрации, от 0,4 до 400 kDa.
46. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 45, в которой полисахарид содержит не более 1 мас.% белков и 2 мас.%
нуклеиновых кислот.
47. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 46, в которой полисахарид является модулятором реакций иммунной системы
млекопитающих, включая человека.
48. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 47, в которой полисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах.
49. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 36 - 48,
включающая фармацевтически приемлемые целевые добавки.
50. Фармацевтическая композиция по п.49, в которой целевые добавки выбраны из группы, включающей консерванты, стабилизаторы,
растворители или их комбинации.
51. Применение полисахарида по п. 1 для производства
фармацевтического средства.
52. Применение по п. 51, в котором полисахарид получен с
использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим: (а) получение культуры бактерий в жидкой фазе; (Ь) отделение жидкой фазы от бактериальных клеток; (с) выделение полисахарида из жидкой фазы.
53. Применение по п. 52, в котором полисахарид получен с
использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим отделение жидкой фазы от бактериальных клеток при сохранении нативности бактериальных клеток.
54. Применение по п. 52, в котором полисахарид получен с
использованием бактерий Shigella sonnei способом, включающим следующие стадии его выделения из жидкой фазы: (i) удаление из жидкой фазы белков и нуклеиновых кислот; (ii) ультрафильтрацию и ( ) диализ полученного раствора.
55. Применение по п. 51 , в котором полисахарид представляет собой экзополисахарид, продуцируемый бактериями Shigella sonnei, фаза I, во внешнюю среду.
56. Применение по п. 55, в котором полисахарид представляет собой бактериальный капсульный полисахарид.
57. Применение по любому из ππ. 51 - 56, в котором полисахарид включает нетоксичный липидный компонент.
58. Применение по п. 57, в котором нетоксичным липидным
компонентом полисахарида являются негидроксилированные жирные кислоты с 16-тью - 18-тью углеродными атомами в молекуле.
59. Применение по п. 58, в котором содержание негидроксилированных жирных кислот в полисахариде составляет не менее 0,01 мас.% .
60. Применение по любому из пп. 51 - 59, в котором полисахарид имеет молекулярную массу, измеренную методом гель-фильтрации, от 0,4 до 400 kDa.
61. Применение по любому из пп. 51 - 60, в котором полисахарид содержит не более 1 мас.% белков и 2 мас.% нуклеиновых кислот.
62. Применение по любому из пп. 51 - 61, в котором полисахарид вызывает мукозальную защиту от шигеллеза Зонне путём индукции синтеза специфических антител против бактерии Shigella sonnei, фаза I в организме млекопитающих, включая человека.
63. Применение по любому из пп. 51 - 61 , в котором полисахарид является модулятором реакций иммунной системы млекопитающих, включая человека.
64. Применение по любому из пп. 51 - 63, в котором полисахарид является апирогенным для кролика в дозе не более 0,050 мкг/кг в тесте пирогенности на кроликах.
65. Применение по п.51 , в котором фармацевтическое средство предназначено для парентерального, перорального, ректального,
интравагинального, накожного, сублингвального и аэрозольного
введения млекопитающим, включая человека.
PCT/RU2011/000314 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция WO2012154072A1 (ru)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/877,305 US20130203980A1 (en) 2011-05-06 2011-05-06 Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
ES11865292.4T ES2686875T3 (es) 2011-05-06 2011-05-06 Exopolisacárido de la bacteria Shigella sonnei, método para producirlo, vacuna y composición farmacéutica que lo contienen
EA201301213A EA030920B1 (ru) 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
PCT/RU2011/000314 WO2012154072A1 (ru) 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
EP11865292.4A EP2705853B1 (en) 2011-05-06 2011-05-06 Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
KR1020137032139A KR101711250B1 (ko) 2011-05-06 2011-05-06 시겔라 소네이 박테리아의 세포외 다당류, 이를 제조하는 방법, 이를 함유한 백신 및 약제 조성물
UAA201314232A UA111845C2 (ru) 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
US13/855,522 US8951538B2 (en) 2011-05-06 2013-04-02 Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2011/000314 WO2012154072A1 (ru) 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/877,305 A-371-Of-International US20130203980A1 (en) 2011-05-06 2011-05-06 Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
US13/855,522 Continuation-In-Part US8951538B2 (en) 2011-05-06 2013-04-02 Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012154072A1 true WO2012154072A1 (ru) 2012-11-15

Family

ID=47139391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000314 WO2012154072A1 (ru) 2011-05-06 2011-05-06 Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20130203980A1 (ru)
EP (1) EP2705853B1 (ru)
KR (1) KR101711250B1 (ru)
EA (1) EA030920B1 (ru)
ES (1) ES2686875T3 (ru)
UA (1) UA111845C2 (ru)
WO (1) WO2012154072A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014196887A1 (ru) * 2013-06-04 2014-12-11 Aparin Petr Gennadievich Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
RU2614123C1 (ru) * 2015-10-01 2017-03-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Способ получения комплексного шигеллезного препарата

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11052142B2 (en) 2013-06-04 2021-07-06 Petr G. Aparin Modified endotoxic bacteria lipopolysaccharide (variants), combination of modified lipopolysaccharides (variants) and, containing same, a vaccine (variants) and a pharmaceutical composition (variants)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111012C1 (ru) * 1997-04-15 1998-05-20 Вячеслав Леонидович Львов Вакцинный препарат для профилактики брюшного тифа
KR20010054032A (ko) 1999-12-03 2001-07-02 김을제 세균성 이질균의 오스피시픽항원의 분리 정제
US20050031646A1 (en) 1999-03-19 2005-02-10 Smithkline Beecham Biological, S.A. Vaccine
US20090317427A1 (en) 2006-02-06 2009-12-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Corporate Sponsored Research And Licensing Zwitterionic Polysaccharides for Promotion of Immune System Maturation and Health
WO2010019890A2 (en) 2008-08-15 2010-02-18 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Vaccine for shigella

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5700787A (en) * 1994-09-02 1997-12-23 Brigham & Women's Hospital, Inc. Capsular polysaccharide immunomodulator
KR20000017905A (ko) * 1999-12-20 2000-04-06 강수홍 두부 및 비지장 제조방법
RU2260053C2 (ru) * 2002-06-26 2005-09-10 Апарин Петр Геннадьевич Способ выделения биологически активной фракции (баф), содержащей s-липополисахариды (s-лпс) из грамотрицательных бактерий, баф для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых грамотрицательными бактериями, производящими эндотоксичные s-лпс, фармацевтическая композиция, способы индукции протективного иммунитета и улучшения состояния пациента при состояниях, требующих повышения иммунного статуса
KR20050021357A (ko) * 2002-06-26 2005-03-07 페트르 젠나디에비치 아파린 내독소 리포폴리사카라이드를 생산하는 세균으로 부터얻어지는 임상적으로 허용가능한 천연에스-리포폴리사카라이드를 포함하는 생물학적으로 활성인프랙션을 분리하는 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2111012C1 (ru) * 1997-04-15 1998-05-20 Вячеслав Леонидович Львов Вакцинный препарат для профилактики брюшного тифа
US20050031646A1 (en) 1999-03-19 2005-02-10 Smithkline Beecham Biological, S.A. Vaccine
KR20010054032A (ko) 1999-12-03 2001-07-02 김을제 세균성 이질균의 오스피시픽항원의 분리 정제
US20090317427A1 (en) 2006-02-06 2009-12-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Corporate Sponsored Research And Licensing Zwitterionic Polysaccharides for Promotion of Immune System Maturation and Health
WO2010019890A2 (en) 2008-08-15 2010-02-18 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services Vaccine for shigella

Non-Patent Citations (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The vaccine book", 2003, ACADEMIC PRESS, pages: 436
ANIKO TOTH ET AL.: "Synthesis of the Repeating Unit of the O-specific Polysaccharide of Shigella sonnei and Quantitation of its Serologic Activity.", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 10, no. 1, 2000, pages 19 - 21, XP009150688 *
BRADFORD M.M.: "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", ANAL.BIOCHEM., vol. 72, 1976, pages 248 - 254, XP025650297, DOI: doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3
BRADFORD M.M.: "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", ANALBIOCHEM., vol. 72, 1976, pages 248 - 254, XP025650297, DOI: doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3
COHEN D.; ASHKENAZI S.; GREEN M.S.; GDALEVICH M.; ROBIN G.; SLEPON R.; YAVZORI M.; ORR N.; BLOCK C.; ASHKENAZI I.: "Double-blind vaccine controlled randomized efficacy trial of an investigational Shigella sonnei conjugate vaccine in young adults", LANCET, vol. 349, 1997, pages 155 - 159, XP002144782, DOI: doi:10.1016/S0140-6736(96)06255-1
GOLDMAN R.C.; WHITE D.; ORSKOV F.; ORSKOV I.; RICK P.D.; LEWIS M.S.; BHATTACHARJEE A.K.; LEIVE L.: "A surface polysaccharide of Esherichia coli 0111 contains 0-antigen and inhibits agglutination of cells by anti-O antiserum", J. BACTERIOL., vol. 151, 1982, pages 1210 - 1221
JOHN B. ROBBINS ET AL.: "Synthesis, characterization, and immunogenicity in mice of Shigella sonnei O-specific oligosaccharide-core-protein conjugates.", PROC NATL ACAD SCI, 27 January 2009 (2009-01-27), pages 1 - 5, XP009128568, Retrieved from the Internet <URL:http://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0900891106> [retrieved on 20111228] *
KENNE L.; LINDBERG B.; PETERSSON K.; KATZENELLENBOGEN E.; ROMANOWSKA E.: "Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide", CARBOHYDRATE RES., vol. 78, 1980, pages 119 - 126, XP027201502
KOTLOFF K.L.; WINICKOFF J.P; IVANOFF B.; CLEMENS J.D.; SWERDLOW D.L.; SANSONETTI P.J.; ADAK G.K.; LEVINE M.M.: "Global burden of Shigella infections: implications for vaccine development and implementation of control strategies", BULL.WHO, vol. 77, 1999, pages 651 - 665
LENNART KENNE ET AL.: "Structural studies of the o-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide.", CARBOHYDRATE RESEARCH, vol. 78, no. 1, 1980, pages 119 - 126, XP027201502 *
LINDBERG A.A.: "Polyosides (encapsulated bacteria", C. R. ACAD.SCI. PARIS, vol. 322, 1999, pages 925 - 932, XP004270330, DOI: doi:10.1016/S0764-4469(00)87188-7
MORRISON D.C.; LEIVE L.: "Fractions of lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111:B4 prepared by two extraction procedures", J. BIOL. CHEM., vol. 250, 1975, pages 2911 - 2919, XP002371333
PASSWELL JH; ASHKENZI S; BANET-LEVI Y; RAMON-SARAF R; FARZAM N; LERNER-GEVA L; EVEN-NIR H; YERUSHALMI B; CHU C; SHILOACH J: "Israeli Shigella Study Group. Age-related efficacy of Shigella O-specific polysaccharide conjugates in 1-4-year-old Israeli children", VACCINE, vol. 28, no. 10, 2 March 2010 (2010-03-02), pages 2231 - 2235
SHMIGOL V.I.: "Nekotorye fiziko-khimicheskie i immunobiologicheskie svoistva lipopolisakharidov Salmonella enterica sv typhi a shigellae.", AVTOREV., DIS. KAND. BIOL. NAUK, 2004, pages 109, XP008171978, Retrieved from the Internet <URL:http://www.dissercat.corn/content/nekotorye-fiziko-khimicheskie-i-immunobiologicheskie-svoistva-lipopolisakharodov-salmonella> [retrieved on 20111219] *
SPIRIN A.S: "Spectrophotometric determination of the total amount of nucleic acids", BIOCHEMISTRY, vol. 23, no. 4, 1958, pages 656
TAYLOR D.N.; TROFA A.C.; SADOFF J.; CHU C.; BRULA D.; SHILOACH J.; COHEN D.; ASHKENAZI S.; LERMAN Y.; EGAN W.: "Synthesis, characterization, and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids", INFECT. AND IMMUNITY, 1993, pages 3678 - 3687
TAYLOR D.N.; TROFA A.C.; SADOFF J.; CHU C.; BRYLA D.; SHILOACH J.; COHEN D.; ASHKENAZI S.; LERMAN Y.; EGAN W.: "Synthesis, characterization and clinical evaluation of conjugate vaccines composed of the O-specific polysaccharides of Shigella dysenteriae type 1, Shigella flexneri type 2a, and Shigella sonnei (Plesiomonas shigelloides) bound to bacterial toxoids", INFECT. IMMUN., vol. 61, no. 9, September 1993 (1993-09-01), pages 3678 - 3687
WESTPHAL 0.; JANN K.: "Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure", METHODS CARBOHYDR.CHEM., vol. 5, 1965, pages 83 - 91
WESTPHAL O.; JANN K.: "Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure", METHODS CARBOHYDR. CHEM., vol. 5, 1965, pages 83 - 91
WHO TECHNICAL REPORT NO. 840, 1994
WHO TR, WHO TECHNICAL REPORT NO.840, 1994

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014196887A1 (ru) * 2013-06-04 2014-12-11 Aparin Petr Gennadievich Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
KR20160029060A (ko) * 2013-06-04 2016-03-14 페트르 젠나디에비치 아파린 개질된 내독성 세균 지질다당류(변형체), 개질된 지질다당류들(변형체들)의 조합물, 및 이를 함유한 백신(변형체) 및 약제 조성물(변형체)
EA031879B1 (ru) * 2013-06-04 2019-03-29 Пётр Геннадиевич Апарин Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
KR102125600B1 (ko) 2013-06-04 2020-06-23 페트르 젠나디에비치 아파린 개질된 내독성 세균 지질다당류(변형체), 개질된 지질다당류들(변형체들)의 조합물, 및 이를 함유한 백신(변형체) 및 약제 조성물(변형체)
RU2614123C1 (ru) * 2015-10-01 2017-03-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России Способ получения комплексного шигеллезного препарата

Also Published As

Publication number Publication date
US20130203980A1 (en) 2013-08-08
UA111845C2 (ru) 2016-06-24
KR20140030233A (ko) 2014-03-11
EA201301213A1 (ru) 2014-04-30
KR101711250B1 (ko) 2017-03-02
EA030920B1 (ru) 2018-10-31
EP2705853B1 (en) 2018-07-18
ES2686875T3 (es) 2018-10-22
EP2705853A1 (en) 2014-03-12
EP2705853A4 (en) 2014-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2621359T3 (es) Polisacáridos modificados para vacunas conjugadas
CZ42993A3 (en) Vaccine
KR101266552B1 (ko) 그룹 ｙ 수막염균에 대한 백신 및 그의 수막염균성 조합
CA2836251C (en) Protein matrix vaccine compositions including polycations
US20120231086A1 (en) Protein matrix vaccines of improved immunogenicity
US20070031447A1 (en) Method of isolating biologically active fraction containing clinically acceptable native S-lipopolysaccharides obtained from bacteria producing endotoxic lipopolysaccharides
Zhu et al. Recent advances in lipopolysaccharide-based glycoconjugate vaccines
WO2008013735A2 (en) Methods for conjugation of oligosaccharides or polysaccharides to protein carriers through oxime linkages via 3-deoxy-d-manno-octulsonic acid
Rocha et al. A Porphyromonas gingivalis capsule-conjugate vaccine protects from experimental oral bone loss
WO2012154072A1 (ru) Экзополисахарид бактерии shigella sonnei, способ его получения и включающие его вакцина и фармацевтическая композиция
RU2563354C2 (ru) Адъювант на основе низкомолекулярного пептидогликана клеточной стенки бактерий
WO2014196887A1 (ru) Модифицированный липополисахарид эндотоксичных бактерий (варианты), комбинация модифицированных липополисахаридов (варианты) и включающие их вакцина (варианты) и фармацевтическая композиция (варианты)
US8951538B2 (en) Exopolysaccharide of Shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and phamaceutical composition containing same
WO2007059115A1 (en) Anti-sepsis conjugate vaccine
RU2818894C1 (ru) Свободные от примеси с-полисахарида капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae с остатком 2,5-ангидроманнозы на восстанавливающем конце
Korcová et al. Immunomodulative properties of conjugates composed of detoxified lipopolysaccharide and capsular polysaccharide of Vibrio cholerae O135 bound to BSA-protein carrier
CN113663065B (zh) 一种肌醇甘露寡糖缀合物、制备方法及作为抗结核糖疫苗的应用
RU2407792C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ IgAl-ПРОТЕАЗЫ ИЗ КУЛЬТУРЫ NEISSERIA MENINGITIDIS СЕРОГРУППЫ А И ИММУНОГЕННЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕЕ ОСНОВЕ
TW201406389A (zh) 多醣體與大腸桿菌熱不穩定腸毒素之共軛物，其用途及製法
KR20050021357A (ko) 내독소 리포폴리사카라이드를 생산하는 세균으로 부터얻어지는 임상적으로 허용가능한 천연에스-리포폴리사카라이드를 포함하는 생물학적으로 활성인프랙션을 분리하는 방법
KR20050008257A (ko) 장티푸스 협막 다당체와 일본 뇌염 바이러스의 혼합 백신제조 및 면역성
Abu-baker et al. SYNTHESIS, CHARACTERIZATION, AND IMMUNOLOGICAL PROPERTIES OF LPS-BASED CONJUGATE VACCINE COMPOSED OF O-POLYSACCHARIDE AND RECOMBINANT EXOPROTEIN A FROM Pseudomonas aeruginosa.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11865292

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13877305

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201301213

Country of ref document: EA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137032139

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: A201314232

Country of ref document: UA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011865292

Country of ref document: EP