CN103212068A - 鸡传染性支气管炎n-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法 - Google Patents

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鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，它涉及鸡传染性支气管炎纳米活苗的制备方法。本发明是要提供鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，方法为：一、取病毒液并加入到过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，搅拌得到混合溶液A；二、向混合溶液A中滴加过滤除菌后的羧甲基壳聚糖溶液得到混合溶液B；三、将混合溶液B离心然后用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，然后再加入5％蔗糖脱脂乳溶液，再真空冷冻干燥，即完成。本发明应用于兽药领域。

Description

鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法
技术领域
本发明涉及鸡传染性支气管炎纳米活苗的制备方法。
背景技术
传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染的病毒性疾病，以呼吸道症状、产蛋率下降、肾脏病变等为特征。自1988年以来，在我国大部分地区相继流行，发病率100％，死亡率10％～30％。由于集约化养殖对环境的污染和不断出现新的病毒变异毒株，且常常是基因型表现不一和血清型变异交替或同时发生，组织嗜性也不断变化，使IBV的免疫防控难度大，免疫失败的现象时有发生。这两种疫病严重危害养鸡业的发展。及时进行免疫接种是预防鸡传染性支气管炎发生的重要以及主要措施。
目前，对于鸡传染性支气管炎的预防免疫接种，最常用的是传统的灭活苗和弱毒苗。灭活苗起效慢，免疫保护期短，存在灭活不当造成疾病传播，且免疫途径多为肌注，不能引起有效地粘膜免疫，影响免疫效果。弱毒苗的优点在于活病毒感染刺激产生局部免疫，很快起到保护作用，且弱毒苗通常以感染鸡胚尿囊液的冻干制品出售，较便宜，容易使用，适于大群体应用。
另外，粘膜免疫是近年来免疫学领域的前沿方向和研究热点。因粘膜免疫系统覆盖了机体呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等400m2的粘膜表面，集中了一半以上的淋巴组织以及80％以上免疫细胞，因此在机体的免疫系统中占有非常重要的地位，且在粘膜病原体感染的早期预防和减轻后续病损中的作用更为关键。因此诱生高水平粘膜免疫应答，在感染早期和初始部位彻底清除病原体，对于预防感染性疾病的发生具有十分重要的意义，而能否引起有效的粘膜免疫反应也应成为评价疫苗免疫效果的一个重要指标。
与灭活苗的肌肉注射的给药方式相比，弱毒苗的口服或滴鼻的给药途径不仅可激发机体免疫系统在血清中产生抗体，而且能够刺激机体产生粘膜免疫反应；另外，与口服、鼻腔给药相比，注射给药方式也存在着不够方便、组织刺激性、成本高等不足。但是，口服、鼻腔接种弱毒苗，虽然可以引起粘膜系统的免疫反应，但也容易在胃肠道中被粘膜纤毛清除和破坏，与粘膜表面的作用时间较短，导致引起的免疫效果较差。因而，为了更好的达到免疫效果，弱毒苗也需要辅以合适的递送系统。递送系统的应用一方面可以保护抗原免受粘膜系统对抗原结构的破坏，使抗原更好的保有其免疫原性；另一方面，也可改变抗原与粘膜系统受体细胞的作用方式，延长作用时间，增强抗原提呈作用。而这些也是粘膜递送系统的主要作用。目前，能达成这两个主要目的的最成功的例子就是以纳米粒或微球的方式。
用于制备纳米粒或微球的材料有很多种，包括，明胶、PLGA、PMA、壳聚糖及其衍生物等。壳聚糖因其无毒、良好的生物相容性和生物可降解性而被广泛应用，但是由于其弱的溶解性的限制(仅溶于pH小于6.5的溶液中，而在碱性和中性条件下溶解能力极差，也就是说在生理pH下，壳聚糖的溶解效果很差)，使其作为纳米粒递送系统的应用有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的是提供鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法。
本发明鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现：
一、取50～400μl IBV H120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5～2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min，得到混合溶液A；
二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min～1300r/min速度搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.75～1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min～50min，得到混合溶液B；
三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；
四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为106.5EID50/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。
本发明采用壳聚糖的季铵盐衍生物——N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)和N，O-羧甲基壳聚糖(CMC)为载体，以鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗为控型药物，制备鸡传染性支气管炎活苗纳米粒。与传统疫苗相比，其优势在于稳定性强、释药时间长；同时，在保证疫苗作用的前提下，减少了给药剂量，减轻或避免了毒副反应，延长了免疫保护期，避免多次反复给药，且N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在pH为1～14时都具有良好的溶解性，载体材料本身无毒并具有一定的抗菌效果，生物相容性好，可生物降解，可通过体内的水解或酶解反应，最终降解为水和CO2，被机体吸收或排出体外。本试验制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可经滴鼻和口服途径提高机体免疫力，延长疫苗在鸡体内作用时间，减少免疫次数，同时N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)在pH1～14时均有良好的溶解性，本发明制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可用于鸡传染性支气管炎免疫，经滴鼻给药，IBV-N-2-HACC/CMC-NPs(500羽/瓶)，20倍稀释，给药量为每只鸡0.04mL。
同时本发明的制备方法具有以下优点：一、本发明所使用的N-2-HACC和CMC溶液均为过滤除菌后溶液，为后续的病毒检测和实际应用在源头上减少了杂菌污染；二、加入一定量病毒液后用无菌水补足2mL，使得不同体积的病毒加入后不影响整个反应体系，使条件的摸索更精确；三、N-2-HACC溶液与病毒液的混合速度为300r/min，时间为5min，速度不高是防止病毒在包封前产生损伤(如纤突的脱落)，影响免疫原性；时间长是为了使两者混合更均匀，从而使制备的纳米粒的粒径更均一；四、混合完成后即升至搅拌速度，并于1min后匀速缓慢滴加CMC溶液，并给与充分的反应时间20-50min，从而形成更多、更均一的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs；五、用预冷的(4℃)无菌去离子水洗涤沉淀，是为了防止在洗涤过程中部分病毒从纳米粒中释放，并且低温的环境也有益于保持IBV的免疫原性；六、加入5％蔗糖脱脂乳可以更好的保护纳米粒，防止其在真空冷冻干燥的过程中受到损伤。
附图说明
图1是试验1制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的释放曲线图；
图2是试验1制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的透射电镜图；
图3是试验1制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的粒径分布图；
图4是试验1制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的Zeta电位图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现：
一、取50～400μl IBV H120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5～2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min，得到混合溶液A；
二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min～1300r/min速度搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.75～1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min～50min，得到混合溶液B；
三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；
四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为106.5EID50/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。
本实施方式中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，来自名称为“N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法(申请号：201110333845.9，申请日：2011年10月28日)”的专利，所述N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：
一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90～120℃下回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mLNaOH的异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5～8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处理的壳聚糖；二、将2～3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100～150mL体积浓度为1～3％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500～1000r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1～2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8～9并有白色沉淀析出，浸泡8h后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15～20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；三、在N2保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75～85℃，每隔2h逐滴加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8～14h后将烧瓶冷却至室温，加入150～300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h，完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15％～40％，异丁醇的量为每克壳聚糖加入10～30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加入量为2～27g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶25mL。
本具体实施方式采用壳聚糖的季铵盐衍生物——N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)和N，O-羧甲基壳聚糖(CMC)为载体，以鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗为控型药物，制备传染性支气管炎纳米活苗。与传统疫苗相比，其优势在于稳定性强、释药时间长；同时，在保证疫苗作用的前提下，减少了给药剂量，减轻或避免了毒副反应，延长了免疫保护期，避免多次反复给药，且N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖在pH为1～14时都具有良好的溶解性，载体材料本身无毒并具有一定的抗菌效果，生物相容性好，可生物降解，可通过体内的水解或酶解反应，最终降解为水和CO2，被机体吸收或排出体外。本试验制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可经滴鼻和口服途径提高机体免疫力，延长疫苗在鸡体内作用时间，减少免疫次数，同时N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(N-2-HACC)在pH1～14时均有良好的溶解性，本实施方式制备的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗可用于鸡传染性支气管炎免疫，经滴鼻给药，IBV-N-2-HACC/CMC-NPs(500羽/瓶)，20倍稀释，给药量为每只鸡0.04mL。
同时本具体实施方式的制备方法具有以下优点：一、本具体实施方式所使用的N-2-HACC和CMC溶液均为过滤除菌后溶液，为后续的病毒检测和实际应用在源头上减少了杂菌污染；二、加入一定量病毒液后用无菌水补足2mL，使得不同体积的病毒加入后不影响整个反应体系，使条件的摸索更精确；三、N-2-HACC溶液与病毒液的混合速度为300r/min，时间为5min，速度不高是防止病毒在包封前产生损伤(如纤突的脱落)，影响免疫原性；时间长是为了使两者混合更均匀，从而使制备的纳米粒的粒径更均一；四、混合完成后即升至搅拌速度，并于1min后匀速缓慢滴加CMC溶液，并给与充分的反应时间20-50min，从而形成更多、更均一的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs；五、用预冷的(4℃)无菌去离子水洗涤沉淀，是为了防止在洗涤过程中部分病毒从纳米粒中释放，并且低温的环境也有益于保持IBV的免疫原性；六、加入5％蔗糖脱脂乳可以更好的保护纳米粒，防止其在真空冷冻干燥的过程中受到损伤。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一和步骤二所述的过滤除菌的方法为：在无菌操作台中通过0.22μm的细菌滤器进行过滤。其他步骤和参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中所述的取200μl病毒液并加入无菌去离子水补足2mL，然后加入到5mL浓度为1.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中。其他步骤和参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中所述的将混合溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.8mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液。其他步骤和参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中所述的N，O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：
一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1-12h后加入60mL浓度为10-40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；
二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，然后均匀分成五份，再依次在搅拌状态下加入到碱化壳聚糖中，每份间隔10min加入，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成。其他步骤和参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中所述的搅拌时间是40min。他步骤和参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤二中所述的过滤除菌后的羧甲基壳聚糖的滴加速度为0.007mL/s。其他步骤和参数与具体实施方式一至六之一相同。
通过以下试验验证本发明的有益效果：
试验1、本试验鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，是通过以下步骤进行：
一、取200μlIBV H120系病毒液并加入无菌去离子水补足2mL，然后加入到5mL浓度为1mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以磁力搅拌器300r/min搅拌5min，得到混合溶液A；
二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.8mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌40min，得到混合溶液B；
三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；
四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，然后再加入5％蔗糖脱脂乳溶液，再真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗(IBV-N-2-HACC/CMC-NPs)，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为106.5EID50/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与5％蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。本试验的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖采用具体实施方式一的方法制备，本实验的N，O-羧甲基壳聚糖采用具体实施方式五的方法制备
本试验制备所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的释放曲线图如图1所示，可见在96h内IBV-N-2-HACC/CMC-NPs病毒累积释放量迅速提高，之后释放逐渐平稳；
本试验制备所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的透射电镜图如图2所示，可见纳米粒粒径均匀、大小适宜、形状圆整规则、分散性良好等优点；
本试验制备的IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的粒径分布图如图3所示，可见粒径分布均匀，尺寸适中，平均粒径为122.4nm；
本试验制备所得IBV-N-2-HACC/CMC-NPs的Zeta电位图如图4所示，可见Zeta电位为正值，且电位值较大为+53.2mV，制备的纳米粒体系稳定，有利于与细胞的接触、结合。

Claims (7)

1.鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法，其特征在于鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法按以下的实验步骤实现：
一、取50～400μl IBV H120系病毒液加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为0.5～2.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中，然后在室温、无菌条件下以搅拌速度为300r/min的条件下搅拌5min，得到混合溶液A；
二、将混合溶液A在室温、无菌条件下以900r/min～1300r/min速度搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.75～1.75mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液；然后在搅拌速度不变的条件下磁力搅拌20min～50min，得到混合溶液B；
三、将混合溶液B于4℃、12000r/min离心20min，去上清，并用温度为4℃的无菌去离子水洗涤沉淀3遍，收集固相物；
四、将固相物加入到4℃的无菌去离子水中，再加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液，真空冷冻干燥24h，得到鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，即完成鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗的制备方法；其中步骤一中IBV H120系病毒液为经过浓缩纯化后的鸡传染性支气管炎H120系病毒液，病毒含量为106.5EID50/0.1mL；步骤四中4℃的无菌去离子水与质量浓度为5％的蔗糖脱脂乳溶液的体积比为1∶1。
2.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤一和步骤二所述的过滤除菌的方法为：在无菌操作台中通过0.22μm的细菌滤器进行过滤。
3.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤一中所述的取200μl病毒液并加入无菌去离子水补足至2mL，然后加入到5mL浓度为1.0mg/mL的过滤除菌后的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中。
4.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的将混合溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min搅拌1min后，然后滴加2mL浓度为0.8mg/mL的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖溶液。
5.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的N，O-羧甲基壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：
一、将5g粉末状壳聚糖置于250mL三口烧瓶中，加入40mL异丙醇并搅拌，浸泡1-12h后加入60mL浓度为10-40mol/L的NaOH溶液，搅匀后浸泡2～24h，得碱化壳聚糖；
二、将20g氯乙酸水浴加热溶于10mL的异丙醇中，然后均匀分成五份，再依次在搅拌状态下加入到碱化壳聚糖中，每份间隔10min加入，然后在40～80℃下反应2～8h，制得羧甲基壳聚糖混合物，然后加入20mL蒸馏水，用体积浓度为1％的盐酸调pH至7.0，再用布氏漏斗抽滤，滤液中加入4倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，然后依次用体积浓度为95％的乙醇和无水乙醇洗涤，再置于30～60℃下真空干燥6～24h，得精制品，即完成N，O-羧甲基壳聚糖的合成。
6.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的磁力搅拌时间是40min。
7.根据权利要求1所述的鸡传染性支气管炎N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米活苗，其特征在于步骤二中所述的过滤除菌后的N，O-羧甲基壳聚糖的滴加速度为0.007mL/s。
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