CN105342982A - 经鼻给药的流感疫苗免疫制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经鼻给药的流感疫苗免疫制剂及其制备方法，经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，含有如下配比的组分：以HA计，各价灭活流感疫苗50～150mg，免疫增强剂1～50g，渗透压调节剂0～9g，pH调节剂0～30g，水1000mL，所述的免疫增强剂选自烷基糖苷、壳聚糖、低酰基结冷胶或脂质体。本发明的优点在于：研制的流感疫苗经鼻免疫组合物，不需要注射给药，产生的免疫效果与肌肉注射效果相当。

Description

经鼻给药的流感疫苗免疫制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及人用流感疫苗制剂及其制备方法。

背景技术

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒容易变异、传染性强、传播速度快。流感流行给人类带来深重灾难，而且严重影响养禽事业的发展。流感病毒呈多形性，有球状体和丝状体，为单股负链RNA病毒。球形病毒颗粒内，螺旋状的核壳体为病毒内核，由核蛋白(nucleoprotein，NP)和多聚酶蛋白(RNA多聚酶成分：PBl、PB2、PA)组成核衣壳蛋白(ribonucleoprotein，RNP)，与RNA连接。中层为蛋白壳，含有基质蛋白(matrix，M1)和膜蛋白(membraneprotein，M2)。外层来自宿主细胞的双层类脂囊膜，囊膜上有血凝素(hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(neuraminidase，NA)和M2蛋白构成的突起。M2是跨膜离子通道蛋白，一部分在病毒中层，一部分在病毒外层。病毒表面钉状物是棒状三聚体的HA和蘑菇形的四聚体的NA，与黏多糖和糖蛋白具有亲和力，与细胞表面含唾液酸的受体具有更强亲和力。甲型和乙型流感病毒基因组有8个基因片段，分别编码10种蛋白，其中8种是病毒颗粒的组成成分(HA、NA、NP、M1、M2、PBl、PB2和PA)，另两段RNA基因片段编码非结构蛋白一NSl和NS2。这10种蛋白区分为表面蛋白、内部蛋白和非结构蛋白。HA、NA和M2是表面蛋白；内部蛋白包括PBl、PB2、PA、由PBl基因编码的PBl-F2、NP、Ml和NS2；NS1产生于感染细胞，不包装在病毒颗粒内。根据核蛋白和膜蛋白抗原的差异，流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒由于血凝素和神经氨酸酶抗原的不同，又分为不同亚型。血凝素有16个亚型，神经氨酸酶有9个亚型。任何一种HA和任何一种NA都构成一种血清型。

裂解型流感灭活疫苗，是建立在流感全病毒灭活疫苗的基础上，通过选择适当的裂解剂和裂解条件裂解流感病毒，去除病毒核酸和大分子蛋白，保留抗原有效成分HA和NA以及部分M蛋白和NP蛋白，经过不同的生产工艺去除裂解剂和纯化有效抗原成分制备而成。1968年流感裂解疫苗(inactivatedsplitvirusvaccines)开始大规模生产，疫苗除含有表面抗原HA和NA外，还含有病毒核壳体和基质蛋白。免疫原性良好，不良反应轻，因此，裂解疫苗成为目前流感疫苗主流产品。

目前用于免疫人群的疫苗主要是针对甲(A)型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型以及乙(B)型流感病毒的三联灭活疫苗。

流感病毒同许多病原体一样，侵染黏膜表面，首先是上呼吸道黏膜表面。黏膜免疫构成了宿主的第一道防线，是鼻道和下呼吸道免疫反应的主要组成部分。尽管目前使用的注射流感疫苗在大部分健康个体中刺激血清HA-特异性IgG，但仅有小部分接种者HA-特异性IgA抗体出现显著上升。免疫原性和临床效力更佳的改进流感疫苗必须以能激发局部抗体反应和系统抗体反应这两者为目标。

黏膜免疫提供了替代传统免疫的新途径。黏膜免疫可以从病原入侵人体开始发挥作用并且感染不易扩散。此外，黏膜免疫还具有以下优点：免疫方便、可降低成本大面积人群免疫、无需专业人员、避免无菌针头和卫生不足引起交叉感染。

第一个经鼻黏膜免疫的流感疫苗2001年欧洲上市，后因潜在毒性问题撤市。第二个产品是医学免疫(MedImmune)公司的鼻腔喷雾给药流感病毒活疫苗(InfluenzaVirusVaccineLive,商品名：FluMist)，用于2-49岁人群预防流感A型或B型病毒。2003年被美国FDA批准后，成为美国首个用于健康成人的鼻腔喷雾给药流感疫苗。FIuMist与传统的流感疫苗相比有两个特点：一是含弱活流感病毒而不是死病毒，它们能在鼻和咽部生长，但在温度较高的下呼吸道不能生长；二是经鼻腔喷雾免疫而不需注射接种。

对于经鼻给予灭活流感疫苗而言，因为较活病毒免疫原性低，不易产生免疫应答。相关研究虽然很多，但均没有达到国际通行的有效免疫标准，或者给予次数和抗原量在商业上不可行。迄今为止，灭活流感疫苗的经鼻免疫制剂尚未见临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种经鼻给药的灭活流感疫苗免疫制剂及其制备方法，以满足临床应用的需要。

所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，含有如下配比的组分：

所述的灭活流感疫苗为甲型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型以及乙型流感病毒的单价、二价或三联灭活疫苗，也可以是其他亚型的流感疫苗；

所述的免疫增强剂选自烷基糖苷、壳聚糖、低酰基结冷胶或脂质体；

所述的pH调节剂选自磷酸盐缓冲液(pH＝6～8)、冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4～5)或其他缓冲盐。

所述的渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾、葡萄糖等。

术语“HA”，指的是流感病毒包膜表面柱状抗原，能与人、鸡、豚鼠等多种红细胞受体结合引起红细胞凝集，具有免疫原性。为保护型抗原，其诱导的抗体为血凝抑制抗体，能抑制血凝现象。功能：凝集红细胞，吸附宿主细胞，具抗原性，不稳定性，是划分亚型的依据。在国际病毒学杂志2010年8月第17卷第四期《流感疫苗的现状与未来》中，对其有明确的定义，可以用于计量灭活流感疫苗的用量；

所述的烷基糖苷优选烷基部分由6-20个碳的烷基糖苷，糖苷为麦芽糖苷、蔗糖苷或葡萄糖苷；最优选十二/十四烷基-葡萄糖糖苷；

所述的壳聚糖的脱乙酰度85％以上，分子量为5～100万；

所述的低酰基结冷胶为结冷胶中的一种，所述的结冷胶又称凯可胶，是一种高分子线性多糖，由4个单糖分子组成的基本单元重复聚合而成.其基本单元是由1，3—和1，4—连接的2个葡萄糖残基，1，3—连接的1个葡萄糖醛酸残基，和1，4—连接的1个鼠李糖残基组成。其中葡萄糖醛酸可被钾、钠、钙、镁中和成混合盐。并且天然结冷胶含有O—酰基(甘油酰基和乙酰基)。天然或称高酰基结冷胶可形成高弹性低硬度凝胶。乙酰化结冷胶通过碱处理除去O—酰基后生成低酰基结冷胶，再经过滤可得到纯化低酰基结冷胶，即商品结冷胶，其相对分子质量约为50万。结冷胶在阳离子存在时，在加热后冷却时生成坚硬脆性凝胶。其硬度与结冷胶浓度成正比，并且在较低的二价阳离子浓度时产生最大凝胶硬度。

所述的脂质体由卵磷脂或磷脂衍生物与胆固醇组成，也可含有其他成分如十八胺等，制备方法可参见《羟基喜树碱脂质体的制备与性质研究》、《脂质体作为干扰素-α载体的研究》等文献

本发明的制备方法之一，包括如下步骤：

将烷基糖苷加入所述的磷酸盐缓冲盐溶解，获得烷基糖苷溶液；

将所述的灭活流感疫苗与所述的烷基糖苷溶液混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

本发明的制备方法之二，包括如下步骤：

将壳聚糖加入所述的冰醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

本发明的制备方法之三，包括如下步骤：

将低酰结冷胶加入水溶解，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

本发明的制备方法之四，包括如下步骤：

(1)将处方量卵磷脂或磷脂衍生物、胆固醇，加无水乙醇或氯仿等溶剂，加热、溶解，恒温水浴真空下蒸发溶剂成膜；

(2)将所述的灭活流感疫苗用所述的磷酸盐缓冲液稀释，然后与上述磷脂膜一起充分震荡水化，形成脂质体混悬液，即可获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

本发明还涉及一种经鼻给药的流感疫苗免疫冻干制剂，是采用如下重量百分比的组分制备的：

干基所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂100份

甘露醇、蔗糖、乳糖或其他冻干保护剂50～900份

干基所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂为不含有水的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

制备方法，包括如下步骤：

将所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂与甘露醇、蔗糖、乳糖或其他冻干保护剂混合，然后采用本领域公知的方法，冷冻干燥，即可获得经鼻给药的流感疫苗免疫冻干制剂，临用前复溶。

本发明可以通过溶液形式滴鼻或鼻腔喷雾进行免疫，也可以适当形式干燥后鼻腔粉末雾化给药。

在上述流感疫苗鼻腔给药组合物中，除了上述提及的配方组合材料外，还可以添加其他免疫增强剂，渗透压调节剂，pH调节剂或者帮助免疫组合物稳定的其他材料，如冻干保护剂等。

本发明的优点在于：研制的流感疫苗经鼻免疫组合物，不需要注射给药，产生的免疫效果与肌肉注射效果相当。

具体实施方式

实施例1

处方：

所述的免疫增强剂为十二/十四烷基-葡萄糖糖苷，pH调节剂为磷酸盐缓冲盐(0.01mM，pH＝7.2)；渗透压调节剂为氯化钠。

制备方法：

将烷基糖苷加入所述的磷酸盐缓冲液溶解，获得烷基糖苷溶液；

将所述的灭活流感疫苗与所述的烷基糖苷溶液混合，并加入其他组分，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂。2～8℃保存。

实施例2

处方：

所述的免疫增强剂为壳聚糖(50万分子量，脱乙酰度90％)；

所述的pH调节剂为冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)

制备方法：

将壳聚糖与冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)溶液混合溶解，然后加入灭活流感疫苗，即可获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

然后加入甘露醇50g，-40℃冷冻干燥，即可获得即可获得经鼻给药的流感疫苗免疫冻干制剂。

实施例3

处方：

以HA计，灭活流感疫苗每种亚型75mg

低酰结冷胶5g

水1000mL

所述的免疫增强剂为低酰结冷胶；

制备方法：

将低酰结冷胶加入水，80～100℃搅拌溶解，放冷，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂。

实施例4

处方：

所述的免疫增强剂为大豆卵磷脂和胆固醇制备的脂质体；

所述的pH调节剂为磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)；

制备方法：

取大豆卵磷脂20g、胆固醇6.66g，加无水乙醇1000ml，50℃水浴加热、溶解，37℃恒温水浴真空蒸发成膜，同时去除乙醇；

将75mgHA含量的灭活流感疫苗用1000ml磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)溶解，恒温常压下与脂质膜混合震荡70min，即得含有流感疫苗的脂质体混悬液。

实施例5

处方：

所述的免疫增强剂为十二烷基-麦芽糖糖苷，pH调节剂为磷酸盐缓冲盐(0.01mM，pH＝7.2)；渗透压调节剂为氯化钾。

制备方法：

将烷基糖苷加入所述的磷酸盐缓冲液溶解，获得烷基糖苷溶液；

将所述的灭活流感疫苗与所述的烷基糖苷溶液混合，并加入其他组分，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂。2～8℃保存。

实施例6

处方：

以HA计，灭活流感疫苗每种亚型50mg

低酰结冷胶50g

水1000mL

所述的免疫增强剂为低酰结冷胶；

制备方法：

将低酰结冷胶加入水，80～100℃搅拌溶解，放冷，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂。

实施例7

BALB/c雌性小鼠乙型流感疫苗免疫试验

取30只6～8周龄的清洁级BALB/c雌性小鼠，随机分6组，每组5只。设对照组，乙醚吸入麻醉后，鼻腔给予20μL磷酸盐缓冲液(Na2HPO41.096g，NaH2PO4·H2O0.316g，NaCl8.5g，溶于1L纯水中)稀释的乙型流感疫苗(HA含量为75μg/ml)；阳性组小鼠后侧大腿内侧肌肉注射0.1ml疫苗注射液(取HA含量为381μg/ml的乙型流感病毒裂解疫苗原液15μl，与366μl上述磷酸盐缓冲液混合,即得HA含量为15μg/ml的注射疫苗)；试验组滴鼻，乙醚吸入麻醉小鼠后，使用10μl移液器将按照实施例1，3～6制备的乙型流感疫苗制剂滴入小鼠鼻腔，实施例1，3～4每鼻孔滴入10μL，实施例5、6每鼻孔分别滴入5μL、15μL，均相当于1.5μgHA/只。保持小鼠仰头姿势约10s。共免疫两次，间隔两周。

初免后一周、二免后1周、2周、3周直至8周，每隔一周小鼠眼眶静脉采血约300μl，置于无菌EP管中，室温下静置1h，5000rpm4℃离心10min，取上清血清，测定乙型流感病毒血凝抑制抗体效价(HI)。

表1.BALB/c小鼠乙型流感疫苗免疫产生的HI滴度情况

其中in代表鼻腔滴入，im代表肌肉注射。*较肌注P>0.05

流感疫苗抗原中的血凝素(HA)能与人或动物(鸡、豚鼠)的红细胞发生凝集，称为血凝现象。如果血清中产生相应的抗体，则会抑制血凝，称为血凝抑制试验。通过测定免疫后血清的血凝抑制滴度，可以反映机体对流感病毒的保护水平，是临床检测疫苗免疫效果的关键指标。

上述乙型流感疫苗血凝抑制抗体效价(HI)检测结果表明，实施例1、3、4、5，6经鼻免疫后较无佐剂组经鼻免疫大大提高了抗体滴度，均能在二免后6周、8周达到与肌注免疫相当(P>0.05)，具有较好的免疫效果。

实施例8

BALB/c雌性小鼠H1N1流感疫苗免疫试验

取30只6～8周龄的清洁级BALB/c雌性小鼠，随机分6组，每组5只。设对照组，鼻腔给予20μL磷酸盐缓冲液稀释的H1N1流感疫苗(HA含量为75μg/ml)；阳性组小鼠后侧大腿内侧肌肉注射0.1ml疫苗注射液(取HA含量为381μg/ml的H1N1流感病毒裂解疫苗原液15μl，与366μl上述磷酸盐缓冲液混合,即得HA含量为15μg/ml的注射疫苗)；试验组滴鼻，乙醚吸入麻醉小鼠后，使用10μl移液器将按照实施例1～2，4～6制备的H1N1流感疫苗制剂滴入小鼠鼻腔，实施例1～2，4每鼻孔滴入10μL，实施例5、6每鼻孔分别滴入5μL、15μL，均相当于1.5μgHA/只。保持小鼠仰头姿势约10s。共免疫两次，间隔两周。

初免后一周、二免后1周、2周、3周直至8周，每隔一周小鼠眼眶静脉采血约300μl，置于无菌EP管中，室温下静置1h，5000rpm4℃离心10min，取上清血清，测定H1N1流感病毒血凝抑制抗体效价(HI)。

表2.BALB/c小鼠H1N1流感疫苗免疫产生的HI滴度情况

其中in代表鼻腔滴入，im代表肌肉注射。*较肌注P>0.05

上述H1N1的血凝抑制抗体效价(HI)检测结果表明，实施例1、2、4、5，6经鼻免疫后较无佐剂组经鼻免疫大大提高了抗体滴度，均能在二免后6周达到与肌注免疫相当的抗体滴度(P>0.05)，具有较高的保护效率。

Claims (9)

1.经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，含有如下配比的组分：

所述的免疫增强剂选自烷基糖苷、壳聚糖、低酰基结冷胶或脂质体。

2.根据权利要求1所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的pH调节剂选自磷酸盐缓冲液(pH＝6～8)、冰醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4～5)或其他缓冲盐。

3.根据权利要求1所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的渗透压调节剂选自氯化钠、氯化钾或葡萄糖。

4.根据权利要求1所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的烷基糖苷为烷基部分由6-20个碳的烷基糖苷，糖苷为麦芽糖苷、蔗糖苷或葡萄糖苷。

5.根据权利要求4所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的烷基糖苷为十二/十四烷基-葡萄糖糖苷。

6.根据权利要求1所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的壳聚糖的脱乙酰度85％以上，分子量为5～100万。

7.根据权利要求1～6任一项所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂，其特征在于，所述的灭活流感疫苗为甲型流感病毒H1N1亚型、H3N2亚型以及乙型流感病毒的单价、二价或三联灭活疫苗，或是其他亚型的流感疫苗。

8.根据权利要求1～7任一项所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将烷基糖苷加入所述的磷酸盐缓冲盐溶解，获得烷基糖苷溶液；

将所述的灭活流感疫苗与所述的烷基糖苷溶液混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

制备方法之二，包括如下步骤：

将壳聚糖加入所述的冰醋酸-醋酸钠缓冲液溶解，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

制备方法之三，包括如下步骤：

将低酰结冷胶加入水溶解，然后与所述的灭活流感疫苗混合，获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂；

制备方法之四，包括如下步骤：

(1)将处方量卵磷脂或磷脂衍生物、胆固醇，加无水乙醇或氯仿等溶剂，加热、溶解，恒温水浴真空下蒸发溶剂成膜；

(2)将所述的灭活流感疫苗用所述的磷酸盐缓冲液稀释，然后与上述磷脂膜一起充分震荡水化，形成脂质体混悬液，即可获得所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂。

9.一种经鼻给药的流感疫苗免疫冻干制剂，其特征在于，是采用如下重量百分比的组分制备的：

干基所述的经鼻给药的流感疫苗免疫制剂100份

甘露醇、蔗糖、乳糖或其他冻干保护剂50～900份。