JP2015091793A - 粘膜ワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】安全で、感染症や癌の予防又は治療剤として有用で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることのできる、粘膜ワクチン組成物の提供。
【解決手段】ヒト又は動物の口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、及び、直腸粘膜からなる群より選ばれる少なくとも１種の粘膜に投与される粘膜ワクチン組成物であって、少なくとも一種類の抗原と、免疫賦活化剤として、少なくとも１種のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を含み、上記免疫賦活化剤と上記抗原との質量比（免疫賦活化剤の総質量／抗原の総質量）が、０．００２〜５００であることを特徴とする粘膜ワクチン組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、感染症や癌の予防又は治療剤として有用で口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は直腸粘膜に投与可能な粘膜ワクチン組成物に関する。特に本発明は、特定のリポポリサッカライドをアジュバントとして、抗原とともに粘膜表面に投与することで、安全で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導せしめることが可能な粘膜ワクチン組成物に関する。

ワクチン製剤の剤形としては、現在製品化されているもののほとんどが注射剤である。注射型ワクチンは、血中（全身性）の免疫応答（ＩｇＧ抗体の産生）を誘導するが、粘膜での免疫応答（ＩｇＡ抗体の産生）は誘導せず、感染後による病原体の増殖を防ぐことはできるが、粘膜経路による病原体の感染自体を防御することは困難であるという問題点があった。
そこで、近年、粘膜からのワクチン接種に注目が集まっており、なかでも、インフルエンザウイルスを抗原として用いた粘膜投与（経鼻投与）型ワクチンの開発が脚光を浴びている。

粘膜投与型ワクチンは、全身性免疫（ＩｇＧ抗体の産生）を誘導するだけでなく、粘膜免疫（ＩｇＡ抗体の産生）を誘導することが可能である。このＩｇＡ抗体は、対象となる疾患の病原体のタイプをあまり厳格に区別しないのが特徴であり、年々変わる病原体の流行型が変化しても対応することが可能であり、パンデミック防止に効果的であると考えられている。
また、経鼻投与型ワクチンが脚光を浴びているのは、消化管粘膜への抗原の投与では胃酸の影響やタンパク分解酵素の影響を受けやすく、これらを防ぐことが困難であるのに対し、経鼻粘膜への抗原の投与ではこれらの影響がないことがその理由の１つとして挙げられる。更に、鼻腔粘膜上にはＮＡＬＴと呼ばれる抗原認識組織があり、免疫応答に効果的であることも理由の１つである。
しかしながら、鼻腔粘膜への抗原の投与は、効果は高いが急性脳症等の重篤な副作用の可能性も高く、また老人や乳児等では経鼻投与自体が煩雑で難しく、更に鼻水等の身体的要因により安定した効果が得られない問題点があった。

一方で、抗原を経口投与し、嚥下後、消化管粘膜（小腸）等で全身性免疫及び粘膜免疫を誘導させようとする試みも多数行われている。この際の懸念点は、胃酸による抗原の分解、タンパク分解酵素による抗原の分解をいかに防ぐかということである。これらを解決するために、胃酸を中和する制酸剤を多量に含ませたり、マイクロスフェア等の被膜技術によって抗原を守るような技術が開発されてきた。
しかし、実際に開発が成功したものは、元々胃酸での安定性が高い生弱毒化ポリオウイルスワクチンや生弱毒化ロタウイルスワクチンであった。

口腔粘膜経路で粘膜免疫及び全身性免疫を誘導する例としては、以下の報告が成されている。
特許文献１には、経口（例えば、舌下投与）組成物中に１以上の抗原及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを含む免疫原性組成物が提案され、抗原としてインフルエンザ抗原が、アジュバントとしてＴＬＲ４アゴニストが、それぞれ開示されている。
しかしながら、特許文献１に提案された免疫原性組成物におけるＴＬＲ４アゴニストは、免疫誘導の点で効果が弱く、より強い免疫を誘導でき、かつ、安全なアジュバントが求められていた。

また、特許文献２には、パントエア菌由来リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＬＰＳ）が提案され、従来のＬＰＳよりも安全性が高く、抗原と同時に投与した場合に免疫反応が増強されることが記載されている。
しかしながら、特許文献２には、獲得免疫への使用については明確な言及や例示がなく、また、最適なアジュバント／抗原の比率についての言及もなされていない。更に、特許文献２には、パントエア菌由来ＬＰＳの粘膜ワクチンとしての使用についての明確な言及もされていない。

また、特許文献３には、病原体の不活化抗原、並びに、免疫賦活化剤（アジュバント）として、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）及びザイモザンの組み合わせを含むワクチンが提案され、アジュバントとして、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に由来するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用い、病原体としてインフルエンザウイルスを用いた例が記載されている。
しかしながら、特許文献３に記載のパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に由来するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）使用ワクチンの例は、鼻粘膜に投与するものであり、口腔内粘膜等の特定の粘膜への投与については教示されていない。一般に、投与部位が異なれば効果的なアジュバントが異なることは技術常識である。よって、この特許文献３に記載のパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に由来するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）使用ワクチンの例から、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は直腸粘膜でパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）に由来するリポポリサッカライド（ＬＰＳ）が効果を奏するか否かは不明であった。

特表２０１３−５２７２１８号公報 特許第４０４３５３３号 特開２００９−２４２３６７号公報

本発明は、上記現状に鑑み、安全で、感染症や癌の予防又は治療剤として有用で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることのできる、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は、直腸粘膜に投与可能なワクチン組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は、直腸粘膜への投与において、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓａｉａ、Ｂｅｌｎａｐｉａ、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｚａｋｉａ、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｏａｓａｉａ、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される少なくとも１種のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩をアジュバントとして、抗原と共に口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は直腸粘膜に投与するとともに、抗原に対する質量比を特定の範囲とすることで、安全で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ヒト又は動物の口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、及び、直腸粘膜からなる群より選ばれる少なくとも１種の粘膜に投与される粘膜ワクチン組成物であって、少なくとも一種類の抗原と、免疫賦活化剤として、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓａｉａ、Ｂｅｌｎａｐｉａ、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｚａｋｉａ、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｏａｓａｉａ、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される少なくとも１種のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を含み、上記免疫賦活化剤と上記抗原との質量比（免疫賦活化剤の総質量／抗原の総質量）が、０．００２〜５００であることを特徴とする粘膜ワクチン組成物である。

また、本発明の粘膜ワクチン組成物は、液剤、噴霧剤、半固形製剤、又は、固形製剤であり、上記半固形製剤及び固形製剤は、体液及び／又は体温によって溶解することが好ましい。
また、本発明の粘膜ワクチン組成物は、体液及び／又は体温によって溶解する固形製剤であることが好ましい。
また、本願発明の粘膜ワクチン組成物は、液性免疫を誘導するために用いられることが好ましい。
また、本願発明の粘膜ワクチン組成物において、上記抗原が、感染症由来抗原又は癌抗原であることが好ましい。
また、上記半固形製剤は、ゼリー剤、軟膏剤、クリーム剤、経膣剤、坐剤又はシロップ剤であることが好ましい。
また、上記固形製剤は、フィルム製剤、崩壊錠又は即溶錠であることが好ましい。
上記抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原、ヒトパピローマウイルス由来抗原、及び、肺炎球菌由来抗原からなる群より選択される少なくとも１種類であることが好ましい。
また、上記抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原であることが好ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、少なくとも一種類の抗原と免疫賦活化剤とを含有する。
本発明の粘膜ワクチン組成物において、上記免疫賦活化剤と上記抗原との質量比（免疫賦活化剤の総質量／抗原の総質量）が、０．００２〜５００である。０．００２未満であると、充分な強さの免疫が誘導されず、５００を超えると、安全性上の問題が生じる。上記免疫賦活化剤と上記抗原との質量比の好ましい下限は０．０１、好ましい上限は１００である。上記免疫賦活化剤と上記抗原との質量比がこの範囲にあることで、安全性を確保しつつ、充分な強さの免疫が誘導できる。
本明細書にいう「抗原の質量」は、特記する場合を除き、ワクチン中の抗原に含まれる抗原タンパク質の質量のことである。したがって、抗原が、ウイルス等生体由来物質である場合は、その抗原に含まれる全タンパク質の質量を意味する。

本発明で使用する抗原としては、感染症由来抗原又は癌抗原であることが好ましい。
感染症由来抗原では、疾患の予防を目的とし、ワクチン投与によりあらかじめ抗体を形成させておく必要があるため、本発明を利用することが望ましいといえる。本発明の粘膜ワクチン組成物は、液性免疫を活性化させることに適している。
該感染症由来抗原としては、感染性病原体及び感染性病原体由来の抗原であれば特に限定されない。
上記感染性病原体から罹る疾患としては特に限定されず、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、又は、ＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡若しくはワクシニア、又は、伝染性軟属腫などのオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス又はエンテロウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、はしかウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、生殖器疣、尋常性胱贅、又は、足底疣費を引き起こすものなどのヒト乳頭腫（パピローマ）ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス又はデングウイルス）、又は、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶなどのレンチウイルス）などのウイルス感染から罹る疾患などのウイルス疾患、エシェリキア属、エンテロバクター、サルモネラ、ブドウ球菌、赤痢菌、リステリア、アエロバクター、ヘリコバクター、クレブシエラ、プロテウス、シュードモナス、連鎖球菌、クラミジア、マイコプラズマ、肺炎球菌、ナイセリア、クロストリジウム、バシラス、コリネバクテリウム、マイコバクテリウム、カンピロバクター、ビブリオ、セラチア、プロビデンシア、クロモバクテリウム、ブルセラ、エルシニア、ヘモフィルス、又は、ボルデテラなどの細菌感染から罹る疾患などの細菌疾患、クラミジア、カンジダ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎をはじめとするがこれに限定されるものではない真菌疾患、マラリア、ニューモシスティスカリニ肺炎、レーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及び、トリパノソーマ感染等が挙げられる。

本発明において、上記感染症由来抗原は、インフルエンザウイルス由来抗原、ヒトパピローマウイルス由来抗原、及び、肺炎球菌由来抗原からなる群より選択される少なくとも１種類であることが好ましく、なかでも、インフルエンザウイルス由来抗原であることが好ましい。
ここで、上記インフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属する直径約１００ｎｍの粒子サイズを有するＲＮＡエンベロープウイルスであり、内部タンパクの抗原性に基づいて、Ａ、Ｂ及びＣ型に分けられる。上記インフルエンザウイルスは、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープに取り囲まれた内部ヌクレオキャプシド又は核タンパク質と会合したリボ核酸（ＲＮＡ）のコアと、外部糖タンパク質からなる。上記ウイルスエンベロープの内層は、主としてマトリックスタンパク質で構成され、外層は大部分が宿主由来脂質物質で構成される。また、上記インフルエンザウイルスのＲＮＡは、分節構造をとる。なお、世界中で大流行するインフルエンザは、Ａ型インフルエンザウイルスによるものであり、このＡ型インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２種類のエンベロープ糖タンパク質を有し、抗原性の違いによってＨＡでは１６種、ＮＡでは９種の亜型に区別されている。
本発明においては、上記感染症由来抗原としては、Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス由来抗原が好適に用いられる。なお、上述したＡ型及びＢ型インフルエンザウイルスの亜型としては特に限定されず、これまで単離された亜型であっても将来単離される亜型であってもよい。

本発明において、インフルエンザウイルス由来抗原としては、上記インフルエンザウイルスを構成する種々の成分の少なくとも一部であれば特に限定されるものではなく、精製ウイルス粒子を脂質エンベロープが可溶化されるように有機溶媒／界面活性剤若しくは他の試薬で分解されたサブビリオン、又は、ＨＡ及びＮＡを始めとするウイルスサブユニットでもよく、ウイルス全粒子でもよい。免疫原性の観点から、ＨＡ又はウイルス全粒子が好ましい。上記ウイルス全粒子は、ホルマリン等により不活化されたものがより好ましい。
上記インフルエンザウイルス抗原の調製方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物又はインフルエンザの患者から単離されたウイルス株をニワトリ卵等に感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製する方法が挙げられる。また、遺伝子工学的に培養細胞中で調製したウイルス由来の抗原を用いてもよい。

本発明の粘膜ワクチン組成物において、上記抗原は有効量含有されていればよいが、例えば、本発明の粘膜ワクチン組成物中、１回投与量当たり０．０１〜１００００μｇの範囲で含有されていることが好ましい。０．０１μｇ未満であると、感染症や癌の予防又は治療剤としての機能が不充分となることがあり、１００００μｇを超えると、安全性に関して問題となることがある。上記抗原含有量のより好ましい下限は０．１μｇ、より好ましい上限は５０００μｇである。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、免疫賦活化剤を含有する。
上記免疫賦活化剤としては、トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストが挙げられ、本発明では、該トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストとして、特定のリポポリサッカライド又はその誘導体若しくは塩が用いられる。
なお、本明細書にいう「リポポリサッカライド」は、リポポリサッカライドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体であることができる。本明細書にいう塩とは、任意の有機酸または無機酸であってよいが、好ましくは薬学的に許容される塩である。

ここで、リポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、以下、ＬＰＳと記載することがある）について説明する。
上記ＬＰＳは、大腸菌、サルモネラ菌、百日咳菌等のグラム陰性細菌細胞壁のペプチドグリカンを囲む外膜に存在している脂質及び糖からなる複合化合物であり、Ｏ抗原及びエンドトキシンの活性成分として知られている［ジェー・エム・ギューセン及びアール・ハッケンベック（Ｊ．Ｍ．Ｇｈｕｙｓｅｎ ａｎｄ Ｒ．Ｈａｋｅｎｂｅｃｋ）編、「ニュー・コンプリヘンシブ・バイオケミストリー（Ｎｅｗ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第２７巻、バクテリアル・セル・ウオール（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ）、第１８ページ、エルセヴィア（Ｅｌｓｅｖｅａ）、１９９４年］。
上記ＬＰＳの基本構造は、特異な脂質を有するリピドＡ、それに共有結合したＲコアと呼ばれるオリゴ糖、さらにＯ特異多糖の３成分よりなっている（「日経バイオテクノロジー最新用語辞典」、第４３１ページ、日経マグロウヒル社、１９８５年）。

上記Ｏ特異多糖の構造は、構成成分の中で最も多様であり、菌種に特異的であって、いわゆるＯ抗原としての活性を示す。一般に数種の単糖からなるオリゴ糖の繰返し構造を特徴とするが、同一単糖からなるもの、または繰返し構造でないものも知られている。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、上記免疫賦活化剤として、特定のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を含む。これらは、多くの食品、漢方薬に含まれ、生体への安全性が担保されており、これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。

上記免疫賦活化剤に用いられるリポポリサッカライドの由来細菌としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ（Ｐａｎｔｏｅａ菌近種／パン、肉類、牛乳、常在細菌の一種）、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ（Ｐａｎｔｏｅａ菌近種／食品全般（土壌菌））、Ｒａｈｎｅｌｌａ（Ｐａｎｔｏｅａ菌近種／常在細菌の一種）、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ａｓａｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｂｅｌｎａｐｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｋｏｚａｋｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｎｅｏａｓａｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｓｔｅｌｌａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ（酢酸菌類／発酵食品製造）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス菌類／牛肉、卵、肉類、魚介類、野菜）、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ（アクロモバクター菌類／魚介類、肉類）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バシラス菌類／米、野菜）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ（メタン産生菌類／動物の腸に寄生するメタン産生菌）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ（メタン産生菌類／動物の腸に寄生するメタン産生菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム菌類／肉類、牛乳、野菜、缶詰）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ（放射菌類／肉類、魚介類）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（バクロイデス菌類／食品の腐敗菌）、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒが挙げられる。これらは、多くの食品に含まれるものであるか、食品の製造工程で用いられるものであるため、生体への安全性が担保されている。
なかでも、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓａｉａ、Ｂｅｌｎａｐｉａ、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｚａｋｉａ、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｏａｓａｉａ、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される少なくとも１種が好ましい。
より好ましくは、上記グラム陰性細菌としては、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される少なくとも１種である。特にＰａｎｔｏｅａ由来リポポリサッカライドは、現在健康食品として用いられており、特に経口的に投与する際により有効であるといえる。これらの菌由来の抽出物又はその改変体をそのまま用いることも可能である。

また、上記グラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を用いる場合には、一般的には生体への安全性を加味する必要があり、これらを解毒化するための改変体として用いることもできる。

また、上記トール様受容体４（ＴＬＲ４）アゴニストとしては、上記特定のリポポリサッカライドの誘導体、例えば、多糖部分を除去したリピドＡ又はモノホスホリルリピッドＡ、３−脱−アシル化ＭＰＬ等が挙げられ、若しくは塩であってもよい。
上記リポポリサッカライドの多糖部分を除去したリピドＡとしては、上記特定のグラム陰性細菌由来の単離物であればよく、あるいはこれらのグラム陰性細菌由来の単離物と同じ構造になるように合成した物を用いてもよい。
また、上記リピドＡの改変体としては、脱リン酸化を行ったモノホスホリルリピッド（ＭＰＬ）又は塩も好適に用いられる。なお、本明細書にいうモノホスホリルリピッドは、モノホスホリルリピッドそれ自体のほか、その性質を有する限りその誘導体であることができる。特に既に医療用途で免疫賦活化剤として実績がある３−脱−アシル化物モノホスホリルリピッド（３Ｄ−ＭＰＬ）、又は、米国特許出願公開第２０１０／０３１０６０２号明細書で提案されている脱アシル化されていない合成Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｌｉｐｉｄが生体への安全性の観点から好ましい。
また、上記モノホスホリルリピッドとしては、安全性及び使用前例のあるサルモネラ菌由来のものも好適に用いられる。

本発明では、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）由来ＬＰＳがさらに好ましく用いられる。なかでも、パントエア・アグロメランス由来ＬＰＳは、タンパク質マーカーを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で測定した分子量が、５０００±３０００、好ましくは、５０００±２０００であるパントエア・アグロメランス由来ＬＰＳが好ましい。ここにいう分子量は、タンパク質マーカーを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による染色帯の位置により測定され、詳細は後述する。
本発明でも好ましく用いられるパントエア・アグロメランス由来ＬＰＳは、Ｏ−抗原部分がラムノースとグルコースとの繰返し構造であることを特徴とするリポポリサッカライドである。

上記パントエア・アグロメランス由来ＬＰＳは、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）を、常法により培養し、培地から菌体を集め、集めた菌体から公知の方法により精製して製造できる。

なお、上記パントエア・アグロメランス由来ＬＰＳの分子量は、以下の方法で測定できる。
すなわち、配合物として用意したパントエア・アグロメランス由来ＬＰＳ、あるいはワクチン組成物から適当な方法で抽出精製したパントエア・アグロメランス由来ＬＰＳについて、以下の方法で分子量を測定できる。パントエア・アグロメランス由来ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液を調製し、その溶液と、Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２ＭＥ＋（ＷＡＫＯ社製）を等量混合し、５分間沸騰水浴中に浸し、その後直ちに氷水中に浸して急冷する。
ランニングバッファー（アトー社製）をスラブゲル電気泳動槽（マリソル社製）に満たし、２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動槽に固定し、サンプル溝に１０μＬずつ検体を入れ、電圧を１００Ｖにて少なくとも１時間、色素がゲルより溶出するまで泳動を継続する。泳動終了後に、銀染色キット１６１−０４４３（バイオラッド社製）により室温で銀染色を行い、挙動を確認する。

また、本発明の粘膜ワクチン組成物は、上述した免疫賦活化剤として、特定のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を含有するものであれば、これらと他の従来公知の免疫賦活化剤を組み合わせて用いてもよい。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、上述した抗原及び免疫賦活化剤に、必要に応じて他の成分（例えば、リン酸緩衝溶液等）を加え、公知の方法で攪拌混合することで、及び必要に応じて公知の方法で、さらに加熱、冷却、又は非加熱乾燥することで調製することができる。
また、本発明の粘膜ワクチン組成物を用いて、液剤、半固形剤、固形製剤、噴霧剤を調製することが可能であり、上述した材料以外に、所望により、賦形剤、結合剤、香料、矯味剤、甘味剤、着色剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、界面活性剤等を適宜使用してもよい。
これらの材料としては特に限定されず、従来公知のものが使用できる。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、液剤、噴霧剤、半固形製剤、又は、固形製剤であることが好ましい。後述のように、本発明の粘膜ワクチン組成物が液剤、噴霧剤、半固形剤又は固形剤であることで、ヒト又は動物の粘膜表面に好適に投与することができる。
また、本発明の粘膜ワクチン組成物は、ヒト又は動物の粘膜表面に投与されるものであるので、上記半固形製剤及び固形製剤は、体液及び／又は体温によって溶解するものであることが好ましい。

更に、本発明の粘膜ワクチン組成物は、抗原の安定性確保の観点から保存時に水分含量が少ないことが好ましいので、保存時には乾燥状態であり、粘膜表面投与後に体液及び／又は体温によって溶解する固形製剤であるものが好ましい。ここにいう「水分含量が少ない」とは、本発明の粘膜ワクチン組成物の全重量中、含水率が好ましくは２０重量％以下、より好ましくは１０重量％以下であることを意味する。また、ここにいう「含水率」は、第十六改正日本薬局方 一般試験法 乾燥減量法 第一法に従い求める。すなわち、本発明の粘膜ワクチン組成物の試験片を１０５℃３時間の条件で加熱したときの、重量の減少割合により求める。このような固形製剤の特性とするためには、本発明の粘膜ワクチン組成物の材料として、体液及び／又は体温によって溶解する材料を選択することが好ましい。このような材料として、例えば、免疫賦活化剤としては、水溶性の高いパントエア・アグロメランス由来ＬＰＳを選択することが好ましく、賦形剤としては、体液及び／又は体温によって溶解する物性のポリマーを選択することが好ましい。このような固形製剤とすることで、特別のデバイスの必要性なく、口腔内や膣、直腸等の粘膜に簡単に投与することができる。

ここで、上記固形製剤には、錠剤、コーティング錠、散剤、顆粒剤、紬粒剤、崩壊錠、貼付剤、ゼリー剤、フィルム剤が含まれ、粘膜表面に投与する固形状のものであれば特に限定されない。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、ヒト又は動物（哺乳類、鳥類等）の口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、及び、直腸粘膜からなる群より選ばれる少なくとも１種の粘膜へ投与されるものであり、好ましくは口腔内粘膜へ投与されるものである。口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は、直腸粘膜は、一般的には、免疫を活性化することは難しいと考えられていたが、本発明の粘膜ワクチン組成物は、少なくとも一種類の抗原とともに、上述した特定の免疫賦活化剤を併用するため、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は直腸粘膜への投与であっても、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。
また、投与経路として口腔粘膜、膣粘膜、直腸粘膜を選択することで、消化管粘膜へ抗原を投与する場合のように胃酸の影響やタンパク分解酵素の影響を受けることがなく、また、経鼻粘膜へ抗原を投与する場合のように急性脳症等の重篤な副作用の可能性がなく、老人や乳児等でも投与が容易で更に鼻水等の身体的要因による安定した効果が妨げられることもない。

また、本発明の粘膜ワクチン組成物の投与方法としては、前述した通りである。また、その投与量としては、動物種、対象の年齢、性別、体重等を考慮して決められるが、例えば、抗原としてＨＡを用いた場合、通常０．１μｇ〜５０μｇを１回又は２回以上投与することができる。好ましくは複数回の投与であり、この場合、１〜４週間の間隔をあけて投与することが好ましい。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、少なくとも一種類の抗原とともに、上述した特定の免疫賦活化剤を併用するため、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は直腸粘膜への投与により、安全で、効果的に液性免疫、例えば、全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導させることができる。

実施例１〜１０、比較例１〜５のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ（Ｂ型）特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例１〜１０、比較例１〜５のマウス血清中インフルエンザＨＡ（Ｂ型）特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例１１〜２０、比較例６〜９のマウス鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例１１〜２０、比較例６〜９のマウス血清中インフルエンザＨＡ（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例２１〜２４、比較例１０〜１２のマウス鼻腔洗浄液中肺炎球菌特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例２１〜２４、比較例１０〜１２のマウス血清中肺炎球菌特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例２５〜２８、比較例１３〜１５のマウス鼻腔洗浄液中ＨＰＶ１６特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例２５〜２８、比較例１３〜１５のマウス血清中ＨＰＶ１６特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス鼻腔洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス唾液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス肺胞洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス膣洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス糞便抽出液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７１〜７３、比較例３０のマウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス鼻腔洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス唾液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス肺胞洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス膣洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス糞便抽出液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７４〜７６、比較例３１のマウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例７７〜７９、比較例３２のマウス膣洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７７〜７９、比較例３２のマウス糞便抽出液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例７７〜７９、比較例３２のマウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。 実施例８０〜８２、比較例３３のマウス膣洗浄液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例８０〜８２、比較例３３のマウス糞便抽出液中ＯＶＡ特異的ＩｇＡ力価の結果を示すグラフである。 実施例８０〜８２、比較例３３のマウス血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＧ力価の結果を示すグラフである。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

以下の各投与群は１０匹分として調製した。
また、マウスに対するワクチン抗原の適正な投与量として、インフルエンザワクチンの場合、１．０μｇ、０．１μｇの２つのパターンでの検討を行った。１．０μｇを超える投与量では、アジュバント非存在下でも抗体産生が見られる可能性があり、一方、０．１μｇ未満の投与量では、ワクチン抗原量が少なすぎてアジュバント存在下でも抗体産生が見られない可能性がある。

（実施例１〜１０、比較例１〜５）
インフルエンザワクチン抗原含有溶液（Ｂ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０、阪大微生物病研究会製）（４４５μｇ／ｍＬ）と、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（自然免疫応用技研社製）溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）とを、表１の各群の投与量となるように調製し、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて３００μＬのワクチン組成物を調製した。例えば実施例１ではインフルエンザワクチン抗原含有溶液を２２．５μＬ加え、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド溶液を２０μＬ加えたのちにリン酸緩衝液を加えて総量３００μＬとした。その他の実施例、比較例も適宜希釈し投与量に相当する含量となるように調製し、比較例５ではワクチン抗原やアジュバントを加えずに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）のみをマウスに投与した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中インフルエンザＨＡ（Ｂ型）特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ（Ｂ型）特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。
ここで、アジュバント量１０００μｇの投与（比較例１）は、一回目の投与２４時間後にマウスの毛並の悪化、体重減少が見られ、安楽死処分したため、後の抗体価の測定は行っていない。アジュバントは、免疫を賦活させる物質であり、添加量が多いほど免疫が得られやすいことは明白であるが、過剰量を投与することは安全上の問題があり、マウスにおける１０００μｇの投与は比較例１以降行っていない。
なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例１１〜２０、比較例６〜９）
インフルエンザワクチン抗原含有溶液をＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０からＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１、阪大微生物病研究会製）（８０１μｇ／ｍＬ）に変更した以外は基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表２に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例１１ではインフルエンザワクチン抗原含有溶液を１２．５μＬとＰａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド溶液を２０μＬ加えたのちにリン酸緩衝液を加えて総量３００μＬとした。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中インフルエンザＨＡ（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中インフルエンザＨＡ（Ｈ１Ｎ１）特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例２１〜２４、比較例１０〜１２）
ワクチン抗原をインフルエンザから肺炎球菌莢膜ポリサッカライド含有溶液（Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ ＮＰ、ＭＳＤ株式会社製）（１１５０μｇ／ｍＬ）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表３に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例２１では肺炎球菌莢膜ポリサッカライド含有溶液を８．７μＬとＰａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド溶液を２μＬ加えたのちにリン酸緩衝液を加えて総量３００μＬとした。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中肺炎球菌特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中肺炎球菌特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例２５〜２８、比較例１３〜１５）
ワクチン抗原をインフルエンザからＨＰＶ１６組み換えタンパク質含有溶液（ＨＰＶ１６、ＰＲＯＳＰＥＣ社製）（８２０μｇ／ｍＬ）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表４に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例２５ではＨＰＶ１６組み換えタンパク質含有溶液を１２．２μＬとＰａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド溶液を２μＬ加えたのちにリン酸緩衝液を加えて総量３００μＬとした。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中ＨＰＶ１６組み換えタンパク質特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中ＨＰＶ１６組み換えタンパク質特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例２９〜３１、比較例１６）
弱毒生ロタウイルス含有溶液（ロタテック内用液、ＭＳＤ社製）２００μＬと、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液を実施例２９では５０μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）、実施例３０では５μＬ、実施例３１では０．５μＬ、比較例１６ではグルコピラノシルリピッド（ＭＰＬＡｓ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製）溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を５μＬ添加し、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて３００μＬのワクチン組成物を調製した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与する。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物３０μＬを投与する。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び鼻腔洗浄液を採取し、血清中抗原特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中抗原特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行う。

（実施例３２〜７０、比較例１７〜２９）
実施例３２〜３４、比較例１７では不活化ポリオウイルス含有溶液（イモバックスポリオ皮下注、サノフィ社製）、実施例３５〜３７、比較例１８では不活化Ａ型肝炎ウイルス含有溶液（エイムゲン、化学及血清療法研究所社製）、実施例３８〜４０、比較例１９では不活化日本脳炎ウイルス含有溶液（エンセバック皮下注用、化学及血清療法研究所社製）、実施例４１〜４３、比較例２０では弱毒生ムンプスウイルス含有溶液（おたふくかぜ生ワクチン、北里第一三共ワクチン社製）、実施例４４〜４６、比較例２１では弱毒生麻疹ウイルス含有溶液（はしか生ワクチン、北里第一三共ワクチン社製）、実施例４７〜４９、比較例２２では弱毒生風疹ウイルス含有溶液（乾燥弱毒生風しんワクチン、北里第一三共ワクチン社製）、実施例５０〜５２、比較例２３では破傷風トキソイド結合インフルエンザ菌ｂ型多糖含有溶液（アクトヒブ、サノフィ社製）、実施例５３〜５５、比較例２４では組換えＨＢｓ抗原タンパク質含有溶液（ビームゲン、化学及血清療法研究所社製）、実施例５６〜５８、比較例２５では弱毒生黄熱ウイルス含有溶液（黄熱ワクチン、サノフィ社製）、実施例５９〜６１、比較例２６では破傷風トキソイド含有溶液（破傷風トキソイド、デンカ生研社製）、実施例６２〜６４、比較例２７では弱毒生水痘ウイルス含有溶液（乾燥弱毒生水痘ワクチン、阪大微生物病研究会社製）を用い、実施例６５〜６７、比較例２８では生ＢＣＧ含有溶液（乾燥ＢＣＧワクチン、日本ビーシージー製造社製）を用い、実施例６８〜７０、比較例２９では不活化狂犬病ウイルス含有溶液（組織培養不活化狂犬病ワクチン、化学及血清療法研究所社製）を用いた。
表５及び実施例２９〜３１、比較例１６と同様にワクチン組成物を調製した。また、実施例２９〜３１、比較例１６と同様の手法で免疫実験を行う。

（実施例７１〜７３、比較例３０）
ワクチン抗原をインフルエンザからＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）（シグマアルドリッチジャパン）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表６に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例７１ではＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）１００μＬ（１０００μｇ／ｍＬ）と、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液５μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）とに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて３００μＬの粘膜ワクチン組成物を調製した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの舌下に調製したワクチン組成物を３０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスに同様に舌下に投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び粘膜サンプルを採取し、血清中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中、唾液中、肺胞洗浄液中、膣洗浄液中、糞便抽出物中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例７４〜７６、比較例３１）
ワクチン抗原をインフルエンザからＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）（シグマアルドリッチジャパン）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表７に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例７４ではＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）１００μＬ（１０００μｇ／ｍＬ）と、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液５μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）とに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて５００μＬの粘膜ワクチン組成物を調製した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、液体用噴霧器（ペンセンチュリー社製）を用い、それぞれのマウスの気管支に調製したワクチン組成物を５０μＬ噴霧投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスに同様に肺に投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び粘膜サンプルを採取し、血清中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＧ力価及び鼻腔洗浄液中、唾液中、肺胞洗浄液中、膣洗浄液中、糞便抽出物中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例７７〜７９、比較例３２）
ワクチン抗原をインフルエンザからＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）（シグマアルドリッチジャパン）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表８に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例７７ではＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）１００μＬ（１０００μｇ／ｍＬ）と、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液５μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）とに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて２００μＬの粘膜ワクチン組成物を調製した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、それぞれのマウスの膣に調製したワクチン組成物をピペットを用いて２０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスに同様に膣に投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び粘膜サンプルを採取し、血清中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＧ力価及び膣洗浄液中、糞便抽出物中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（実施例８０〜８２、比較例３３）
ワクチン抗原をインフルエンザからＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）（シグマアルドリッチジャパン）に変更した以外は、基本的に実施例１〜１０、比較例１〜５に準ずる操作で表９に相当するワクチン組成物を調製した。例えば、実施例８０ではＯｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ）１００μＬ（１０００μｇ／ｍＬ）と、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ由来リポポリサッカライド（ナカライテスク社製）溶液５μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）とに、リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加えて５００μＬの粘膜ワクチン組成物を調製した。
マウス（メス８週齢ＢＡＬＢ／Ｃマウス、日本エスエルシー社）６匹に麻酔後、１ｍＬシリンジ及びマウス用ゾンデ（フチガミ器械）を用い、それぞれのマウスの直腸に調製したワクチン組成物を５０μＬ投与した。当該投与から１週間後、再度マウスに麻酔をかけ、それぞれのマウスに同様に直腸に投与した。２度目の投与から更に１週間後に、マウスの血清及び粘膜サンプルを採取し、血清中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＧ力価及び膣洗浄液中、糞便抽出物中Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ特異的ＩｇＡ力価の測定をＥＬＩＳＡ法により測定を行った。なお、詳細な測定方法は後述する。

（マウス免疫実験）
８週齢、メス、ＢＡＬＢ／ｃマウスについて２回、一週間間隔にて投与を行った。最終投与より一週間後、マウス血液及び鼻腔洗浄液を採取した。血液は４℃下３０００Ｇで１０分間遠心し、上清２０μＬにリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）３００μＬを加えて血清サンプルとした。各種粘膜サンプルの採取方法は以下の通り。鼻腔洗浄液は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの気道下部に切れ込みを入れ、２００μＬのリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を流し込み鼻腔に出てきたサンプルを回収し、鼻腔洗浄液サンプルとした。唾液はマウスの腹腔に１２μｇ／ｍＬの塩化カルバミルコリンを５００μＬ投与し、唾液産生を促進させたのち、唾液を２０μＬ採取した。肺胞洗浄液は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの気道下部に切れ込みを入れ、５００μＬのリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を肺に流し込み、出てきたリン酸緩衝液を回収し、肺胞洗浄液サンプルとした。膣洗浄液は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの膣に１５０μＬのリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を流し込み、１０回ピペッティングしたものを膣洗浄液サンプルとした。糞便抽出液は、回収した糞便１０ｍｇあたり１００μＬのリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）を加え、１０分間ボルテックスを行った。その後４℃下３０００Ｇで１０分間遠心し、上清液を糞便抽出液サンプルとした。
マウス血清中の免疫抗原特異的ＩｇＧ力価を測定することにより、全身性免疫応答を評価した。また、マウス粘膜サンプル中の免疫抗原特異的ＩｇＡ力価を測定することにより、粘膜免疫応答を評価した。それぞれの評価法に関しては次に示す。
また、それぞれの評価結果を図１〜２６に示した。

（マウス血清中抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに炭酸緩衝液にて希釈した各抗原（例えばＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（Ｂ）特異的ＩｇＧ抗体価を測定する時にはＢ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／２０１０（Ｂ）インフルエンザＨＡ抗原溶液）（２．５μｇ／ｍＬ）を１００μＬずつ添加し、一晩放置した。
予め準備したＴｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（以下洗浄液）で３回ウェルを洗浄し、ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）を精製水で４ｇ／４００ｍＬに希釈したブロッキング溶液を２００μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄した。
ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ、ＤＳファーマバイオメディカル社製）をリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で０．４ｇ／１００ｍＬに希釈した溶液（以下試薬希釈液）を用いて、前述の血清サンプルを１／２倍ずつ１５回段階希釈し、その溶液をそれぞれ５０μＬずつ添加し、２時間室温で放置した。
その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄し、試薬希釈液でＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００００倍に希釈したものを、１００μＬずつ添加し、１時間室温で放置した。
その後、洗浄液で３回ウェルを洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ ＴＭＢキット、ナカライテスク社製）を１００μＬずつ加えた。ここに１Ｍ硫酸溶液を１００μＬずつ加え、当該９６ウェルプレートをマイクロプレートリーダー（１６８−１１１３５ＣＡＭ、バイオラッド社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。段階希釈時の吸光度を基に、その吸光度が０．１を切らない最大の希釈倍率をマウス血清中ＩｇＧ力価とし、その値をＬｏｇ２の値で求めた。

（マウス粘膜サンプル中抗原特異的ＩｇＡ力価測定方法（ＥＬＩＳＡ法））
基本的には抗原特異的ＩｇＧ力価測定方法と同様であるが、測定サンプルは粘膜サンプルであり、またＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体の代わりにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＡ抗体（Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ α ＨＲＰ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を用いた。それ以外の操作はすべて同様である。

図１〜２６に示したように、実施例では、抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡが高レベルで産生していた。これに対し、比較例では、抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのいずれも産生量が低かった。また図９〜２６に見られる通り、粘膜に抗原とリポポリサッカライドを投与することで、その粘膜面のみならず遠隔の粘膜面にも免疫が誘導されることが確認された（例えば舌下に抗原とリポポリサッカライドを投与すると腸管や膣面に抗原特異的ＩｇＡの産生が確認された）。すなわちリポポリサッカライド又はその塩はあらゆる粘膜面に対して有効な免疫賦活化剤として働き、かつ全身に抗原特異的ＩｇＡを十分に誘導できることが見いだされた。
これらの結果から、抗原に対して所定の範囲で含有させた免疫賦活化剤としての特定のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩が、粘膜表面での粘膜免疫誘導に有効であることが見出された。

本発明の粘膜ワクチン組成物は、少なくとも一種類の抗原とともに、上述した特定の免疫賦活化剤を所定の含有量の範囲で併用するため、口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、又は、直腸粘膜への投与であっても、安全で、効果的に全身性免疫応答及び粘膜免疫応答を誘導することができる。

Claims (5)

1. ヒト又は動物の口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽頭粘膜、気道粘膜、気管支粘膜、肺粘膜、胃粘膜、腸管粘膜、及び、直腸粘膜からなる群より選ばれる少なくとも１種の粘膜に投与される粘膜ワクチン組成物であって、
   少なくとも一種類の抗原と、免疫賦活化剤として、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ、Ｒａｈｎｅｌｌａ、Ａｃｉｄｉｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｃｉｄｉｓｐｈａｅｒａ、Ａｃｉｄｏｃｅｌｌａ、Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ、Ａｓａｉａ、Ｂｅｌｎａｐｉａ、Ｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｏｚａｋｉａ、Ｌｅａｈｉｂａｃｔｅｒ、Ｍｕｒｉｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｏａｓａｉａ、Ｏｌｅｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｒａｕｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ、Ｒｏｓｅｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｕｂｒｉｔｅｐｉｄａ、Ｓａｃｃｈａｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎｉａ、Ｔｅｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｚａｖａｒｚｉｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群より選択される少なくとも１種のグラム陰性細菌由来のリポポリサッカライド又はその塩を含み、
   前記免疫賦活化剤と前記抗原との質量比（免疫賦活化剤の総質量／抗原の総質量）が、０．００２〜５００である
   ことを特徴とする粘膜ワクチン組成物。
2. 液剤、噴霧剤、半固形製剤、又は、固形製剤であり、
   前記半固形製剤及び固形製剤は、体液及び／又は体温によって溶解する請求項１記載の粘膜ワクチン組成物。
3. 体液及び／又は体温によって溶解する固形製剤である請求項２記載の粘膜ワクチン組成物。
4. 液性免疫を誘導するために用いられる請求項１、２又は３記載の粘膜ワクチン組成物。
5. 抗原が、感染症由来抗原又は癌抗原である請求項１、２、３又は４記載の粘膜ワクチン組成物。

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