CN105555308A - 粘膜疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于,提供安全,作为感染症、癌的预防或治疗剂有用,可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答,且能够对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药的疫苗组合物。本发明为一种粘膜疫苗组合物,其特征在于,其为对选自由人或动物的口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜和直肠粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药的粘膜疫苗组合物,其含有至少一种抗原和作为免疫刺激剂的源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐,所述革兰氏阴性细菌选自由沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属(Rahnella)、嗜热酸菌属(Acidicaldus)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、酸球形菌属(Acidisphaera)、酸胞菌属(Acidocella)、酸单胞菌属(Acidomonas)、亚细亚菌属(Asaia)、别尔纳普氏菌属(Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌属(Leahibacter)、鼠球菌属(Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属(Oleomonas)、副脆弱球菌属(Paracraurococcus)、红球状菌属(Rhodopila)、玫瑰球菌属(Roseococcus)、如比特皮达(Rubritepida)、糖杆菌属(Saccharibacter)、星状菌属(Stella)、斯瓦米纳坦氏菌属(Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、甲烷袋状菌属(Methanoculleus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属(Pantoea)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的组中的至少一种,上述免疫刺激剂与上述抗原的质量比(免疫刺激剂的总质量/抗原的总质量)为0.002~500。

Description

粘膜疫苗组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及作为感染症、癌的预防或治疗剂有用,且能够对口腔内粘膜、眼粘膜、 耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠 粘膜给药的粘膜疫苗组合物。特别是本发明涉及通过将特定的脂多糖作为佐剂、与抗原一 起对粘膜表面给药,能够安全且有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答的粘膜疫苗组 合物。

背景技术

[0002] 作为疫苗制剂的剂型,现在产品化的制剂大部分为注射剂。注射型疫苗存在如下 问题:诱导血中(全身性)的免疫应答(IgG抗体的产生)而不会诱导粘膜中的免疫应答(IgA 抗体的产生),虽然可以防止由于感染后所导致的病原体的增殖,但是难以防御由于粘膜途 径所导致的病原体的感染自身。

[0003] 因此,近年由粘膜的疫苗接种受到关注,其中,使用流感病毒作为抗原的粘膜给药 (经鼻给药)型疫苗的开发显露头角。

[0004] 粘膜给药型疫苗不仅能够诱导全身性免疫(IgG抗体的产生),而且还能够诱导粘 膜免疫(IgA抗体的产生)。该IgA抗体的特征在于,不怎么严格区别成为对象的疾病的病原 体的类型,即使每年改变的病原体的流行型变化也能够应对,认为对于防止流行病而言是 有效的。

[0005] 另外,经鼻给药型疫苗显露头角的理由之一,可列举出对消化道粘膜给予抗原时, 容易受到胃酸的影响、蛋白分解酶的影响却难以防止这些影响,与此相对,经鼻对粘膜给予 抗原时,没有这些影响。进而,在鼻腔粘膜上存在被称为NALT的抗原识别组织对于免疫应答 而言是有效的也是理由之一。

[0006] 但是,对鼻腔粘膜的抗原的给药,虽然效果高但是急性脑病等严重副作用的可能 性也高,另外对于老人、婴儿等而言,经鼻给药自身繁杂且困难,进而存在由于鼻涕等身体 上主要原因而得不到稳定的效果的问题。

[0007] 另一方面,也进行了很多想要将抗原经口给药,咽下后,在消化道粘膜(小肠)等诱 导全身性免疫和粘膜免疫的尝试。此时担心的是,如何防止由于胃酸所导致的抗原的分解、 由于蛋白分解酶所导致的抗原的分解。为了解决这些问题,含有大量的中和胃酸的抗酸剂、 或者通过微球等覆膜技术防护抗原的技术得到开发。

[0008] 但是,实际上开发成功的是,本来在胃酸中的稳定性高的存活弱毒化脊髓灰质炎 病毒疫苗、存活弱毒化轮状病毒疫苗。

[0009] 作为在口腔粘膜途径诱导粘膜免疫和全身性免疫的例子,提出了以下的报告。 [0010]专利文献1中提出了在经口(例如舌下给药)组合物中含有一种以上的抗原和Toll 样受体(TLR)激动剂的免疫原性组合物,作为抗原,公开了流感抗原,作为佐剂,公开了 TLR4 激动剂。

[0011]但是,专利文献1中提出的免疫原性组合物中的TLR4激动剂在免疫诱导方面效果 弱,谋求可以诱导更强的免疫并且安全的佐剂。

[0012]另外,专利文献2中提出了源自泛菌属菌的脂多糖(lipopolysaccharide、LPS),记 载了与以往的LPS相比安全性高,与抗原同时给药的情况下免疫响应得到增强。

[0013] 但是,专利文献2中,对于对获得性免疫的使用没有明确的提及、例示,另外,对于 最合适的佐剂/抗原的比率也没有提及。进而,专利文献2中,对于源自泛菌属菌的LPS的作 为粘膜疫苗的使用也没有明确提及。

[0014] 另外,专利文献3中提出了含有病原体的灭活抗原、以及作为免疫刺激剂(佐剂)的 Poly(I:C)与酵母聚糖的组合的疫苗,记载了使用源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的 脂多糖(LPS)作为佐剂,使用流感病毒作为病原体的例子。

[0015]但是,专利文献3中记载的使用源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖 (LPS)的疫苗的例子是对鼻粘膜给药,没有示范对口腔内粘膜等特定的粘膜的给药。通常若 给药部位不同则有效的佐剂不同是技术常识。由此由该专利文献3中记载的使用源自成团 泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖(LPS)的疫苗的例子,在口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘 膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘 膜,源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖(LPS)是否发挥效果还不明确。

[0016]现有技术文献 [0017]专利文献

[0018] 专利文献1:日本特表2013-527218号公报 [0019] 专利文献2:日本专利第4043533号公报 [0020] 专利文献3:日本特开2009-242367号公报

发明内容

[0021] 发明要解决的问题

[0022] 本发明鉴于上述现状,其目的在于,提供安全,作为感染症、癌的预防或治疗剂有 用,可以有效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答,且能够对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘 膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜 给药的疫苗组合物。

[0023] 用于解决问题的方案

[0024]本发明人等为了解决上述问题而进行深入研究,结果发现,在对口腔内粘膜、眼粘 膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或 直肠粘膜的给药中,将源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐作为佐剂,与抗原一起对口腔 内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、 肠道粘膜或直肠粘膜给药,并且使得与抗原的质量比处于特定范围内,由此可以安全且有 效地诱导全身性免疫应答和粘膜免疫应答,从而完成了本发明,所述革兰氏阴性细菌选自 由沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属(RahneIla)、嗜热酸菌属 (Acidical dus)、嗜酸菌属(Acidiphili um)、酸球形菌属(Acidisphaera )、酸胞菌属 (Acidocella)、酸单胞菌属(Acidomona s )、亚细亚菌属(Asaia)、别尔纳普氏菌属 (Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌 属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozak ia)、利亚杆菌属(Leahi bacter)、鼠球菌属 (Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属(Oleomonas)、副脆弱球菌属 (Paracraurococcus)、红球状菌属(Rhodopila)、玫瑰球菌属(Roseococcus)、如比特皮达 (Rubritepida)、糖杆菌属(Saccharibac ter)、星状菌属(St el la)、斯瓦米纳坦氏菌属 (Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus )、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽抱杆菌属(Bacillus)、甲焼袋状菌属 (Methanoculleus)、甲焼八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属 (Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属(Pantoea)、醋酸杆菌属 (Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas )、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属 (Enterobacter)组成的组中的至少一种D

[0025] 即,本发明为一种粘膜疫苗组合物,其特征在于,其为对选自由人或动物的口腔内 粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠 道粘膜和直肠粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药的粘膜疫苗组合物,其含有至少一种抗 原和作为免疫刺激剂的源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐,所述革兰氏阴性细菌选自由 沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属(RahneIla)、嗜热酸菌属 (Ac idi caldus)、嗜酸菌属(Acidiphi I ium)、酸球形菌属(Ac idi sphaera)、酸胞菌属 (Acidocella)、酸单胞菌属(Acidomona s )、亚细亚菌属(Asaia)、别尔纳普氏菌属 (Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌 属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌属(Leahibacter)、鼠球菌属 (Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属(Oleomonas)、副脆弱球菌属 (Paracraurococcus)、红球状菌属(Rhodopila)、玫瑰球菌属(Roseococcus)、如比特皮达 (Rubritepida)、糖杆菌属(Saccharibac ter)、星状菌属(St el la)、斯瓦米纳坦氏菌属 (Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)、假单胞菌 属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽抱杆菌属(Bacillus)、甲焼袋状菌属 (Methanoculleus)、甲焼八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属(Clostridium)、微球菌属 (Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属(Pantoea)、醋酸杆菌属 (Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas )、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属 (Enterobacter)组成的组中的至少一种,上述免疫刺激剂与上述抗原的质量比(免疫刺激 剂的总质量/抗原的总质量)为0.002~500。

[0026] 另外,本发明的粘膜疫苗组合物优选为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体制 剂,上述半固体制剂和固体制剂通过体液和/或体温溶解。

[0027] 另外,本发明的粘膜疫苗组合物优选为通过体液和/或体温溶解的固体制剂。

[0028] 另外,本申请发明的粘膜疫苗组合物优选用于诱导体液免疫。

[0029] 另外,本申请发明的粘膜疫苗组合物中,上述抗原优选为源自感染症的抗原或癌 抗原。

[0030] 另外,上述半固体制剂优选为凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、经阴道剂、栓剂或糖浆剂。

[0031] 另外,上述固体制剂优选为薄膜制剂、崩解片或速溶片。

[0032] 上述抗原优选为选自由源自流感病毒的抗原、源自人类乳头瘤病毒的抗原和源自 肺炎球菌的抗原组成的组中的至少一种。

[0033] 另外,上述抗原优选为源自流感病毒的抗原。

[0034] 以下对本发明进行详细说明。

[0035] 本发明的粘膜疫苗组合物含有至少一种抗原和免疫刺激剂。

[0036] 本发明的粘膜疫苗组合物中,上述免疫刺激剂与上述抗原的质量比(免疫刺激剂 的总质量/抗原的总质量)为0.002~500。若不足0.002则不能诱导充分强度的免疫,若超过 500则产生安全性上的问题。上述免疫刺激剂与上述抗原的质量比的优选的下限为0.01,优 选的上限为100。通过上述免疫刺激剂与上述抗原的质量比处于该范围内,可以确保安全性 的同时诱导充分强度的免疫。

[0037] 本说明书中所称的"抗原的质量",除了特别记载的情况之外,指的是疫苗中的抗 原中含有的抗原蛋白质的质量。因此,抗原为源自病毒等生物体的物质的情况下,指的是该 抗原中含有的全部蛋白质的质量。

[0038]作为本发明中使用的抗原,优选为源自感染症的抗原或癌抗原。

[0039] 对于源自感染症的抗原而言,为了预防疾病,需要通过疫苗给药来预先形成抗体, 因此优选利用本发明。本发明的粘膜疫苗组合物适于使得体液免疫活化。

[0040] 作为该源自感染症的抗原,若为感染性病原体和源自感染性病原体的抗原则没有 特别限定。

[0041 ]作为由上述感染性病原体患染的疾病,没有特别限定,可列举出例如由腺病毒、疱 疹病毒(例如批¥-1、批¥-11、01^或¥2¥)、痘病毒(例如天花病毒或痘苗病毒、或者传染性软 疣等正痘病毒)、小核糖核酸病毒(例如鼻病毒或肠道病毒)、正黏病毒(例如流感病毒)、副 黏病毒(例如副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒 (例如SARS)、乳多空病毒(例如引起生殖器疣、寻常性膀胱疣或足底疣的乳多空病毒等人类 乳头瘤(papilloma)病毒)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、黄病毒(例如丙型肝炎病毒 或登革病毒)、或反转录病毒(例如HIV等慢病毒)等病毒感染患染的疾病等病毒疾病;由埃 希氏菌属、肠杆菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌、志贺氏菌、李斯特菌属、气杆菌属、螺杆菌属、 克雷伯氏杆菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、链球菌、衣原体属、支原体属、肺炎球菌、奈瑟氏 菌属、梭菌属、杆菌属、棒状杆菌属、分支杆菌属、弯曲杆菌属、弧菌属、沙雷氏菌属、普罗维 登斯菌属、色素杆菌属、布氏杆菌属、耶尔森氏菌属、嗜血杆菌属、或博代氏杆菌属等细菌感 染患染的疾病等细菌疾病;以衣原体(Chlamydia)症、念珠菌症、曲霉病、组织胞浆菌病、隐 球菌脑膜炎为代表但是不限于此的真菌疾病;疟疾;卡氏肺囊虫肺炎;利什曼病;隐孢子虫 病;弓形体病和锥虫病等。

[0042]本发明中,上述源自感染症的抗原优选为选自由源自流感病毒的抗原、源自人类 乳头瘤病毒的抗原和源自肺炎球菌的抗原组成的组中的至少一种,其中,优选为源自流感 病毒的抗原。

[0043]在此,上述流感病毒指的是属于正黏病毒科的具有直径约IOOnm的粒子尺寸的RNA 包膜病毒,基于内部蛋白的抗原性,分为A、B和C型。上述流感病毒包含与被具有脂双层结构 的病毒包膜包围的内部核壳体或核蛋白结合的核糖核酸(RNA)的核、和外部糖蛋白。上述病 毒包膜的内层主要由基质蛋白构成,外层大部分由源自宿主的脂质物质构成。另外,上述流 感病毒的RNA采用分成多部分的结构。需要说明的是,全世界大流行的流感为由于A型流感 病毒所导致的,该A型流感病毒具有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种包膜糖蛋白,根据 抗原性的不同,对于HA而言分为16种亚型、对于NA而言分为9种亚型。

[0044] 本发明中,作为上述源自感染症的抗原,合适地使用源自A型和B型流感病毒的抗 原。需要说明的是,作为上述的A型和B型流感病毒的亚型,没有特别限定,可以为迄今已分 离的亚型或将来可分离的亚型。

[0045] 本发明中,作为源自流感病毒的抗原,若为构成上述流感病毒的各种成分的至少 一部分则没有特别限定,可以为使得脂质包膜可溶化来用有机溶剂/表面活性剂或其它试 剂将纯化病毒粒子分解而成的亚病毒粒子、或者以HA和NA为代表的病毒亚单位,也可以为 病毒全粒子。从免疫原性的观点考虑,优选为HA或病毒全粒子。上述病毒全粒子更优选被福 尔马林等灭活。

[0046] 对上述流感病毒抗原的制造方法没有特别限定,可以没有限定地使用公知的方 法。可列举出例如使得由流感感染动物或流感的患者分离的病毒株感染鸡蛋等,利用常规 方法培养,由纯化了的病毒原液制造抗原的方法。另外,也可以使用源自在基因工程学上在 培养细胞中制造的病毒的抗原。

[0047] 本发明的粘膜疫苗组合物中,上述抗原若含有有效量即可,但是例如本发明的粘 膜疫苗组合物中,优选以每1次给药量0.01~1000 Oyg的范围含有。若不足0.Olyg则作为感 染症、癌的预防或治疗剂的功能有可能不充分,若超过1000 Oyg则在安全性方面有可能成为 问题。上述抗原含量的更优选的下限为O.lyg、更优选的上限为5000yg。

[0048] 本发明的粘膜疫苗组合物含有免疫刺激剂。

[0049]作为上述免疫刺激剂,可列举出Toll样受体4(TLR4)激动剂,本发明中,作为该 Tol 1样受体4(TLR4)激动剂,使用特定的脂多糖、其衍生物或盐。

[0050]需要说明的是,本说明书中所称的"脂多糖",除了脂多糖其自身之外,只要具有其 性质则还可以为其衍生物。本说明书中所称的盐,可以为任意的有机酸或无机酸,但是优选 为药学上可允许的盐。

[0051 ] 在此对脂多糖(1丨口(^〇1}^3(^1^1^(16、以下有时记载为1^5)进行说明。

[0052]上述LPS,为存在于包围埃希氏杆菌、沙门氏杆菌、百日咳杆菌等革兰氏阴性细菌 细胞壁的肽聚糖的外膜的由脂质和糖形成的复合化合物,作为〇抗原和内毒素的活性成分 而已知[J.M.Ghuysen and R.Hakenbeck编、"New Comprehensive Biochemistry"、第27卷、 "Bacterial Cell Wall"、第18页、Elsevea、1994年]。

[0053]上述LPS的基本结构包含具有特异的脂质的脂质(lipid)A、与其共价键合的被称 为R核心的低聚糖、以及0特异多糖这三种成分("Nikkei Biotechnology Saishin Yougo Jiten(日経,彳才于夕y 口'2-最新用語辞典)"、第431页、Nikkei McGraw-Hill, Inc., 1985年)。

[0054] 上述0特异多糖的结构在构成成分之中最多种多样,为菌种特异性,表现出作为所 谓〇抗原的活性。通常特征在于,包含数种单糖的低聚糖的重复结构,但是也已知包含相同 单糖的低聚糖的重复结构、或者并非重复结构。

[0055] 本发明的粘膜疫苗组合物含有源自特定的革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐作为 上述免疫刺激剂。它们包含于很多食品、中药中,对生物体的安全性得到担保,也可以直接 使用源自这些菌的提取物或其修饰物。

[0056] 作为上述免疫刺激剂中使用的脂多糖的来源细菌,可列举出沙雷氏菌属 (Serratia)(泛菌属(Pantoea)菌近种/面包、肉类、牛奶、原生细菌(indigenous bacteria) 的一种)、勒克菌属(Leclercia)(泛菌属(Pantoea)菌近种/全部食品(土壤细菌))、拉恩菌 属(Rahnella)(泛菌属(Pantoea)菌近种/原生细菌的一种)、嗜热酸菌属(Acidicaldus)(醋 酸菌类/发酵食品制造)、嗜酸菌属(Acidiphilium)(醋酸菌类/发酵食品制造)、酸球形菌属 (Acidisphaera)(醋酸菌类/发酵食品制造)、酸胞菌属(Acidocella)(醋酸菌类/发酵食品 制造)、酸单胞菌属(Acidomonas)(醋酸菌类/发酵食品制造)、亚细亚菌属(Asaia)(醋酸菌 类/发酵食品制造)、别尔纳普氏菌种(Belnapia)(醋酸菌类/发酵食品制造)、脆弱球菌属 (Craurococcus)(醋酸菌类/发酵食品制造)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)(醋酸菌 类/发酵食品制造)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)(醋酸菌类/发酵食品制造)、柯扎克氏菌 属(Kozakia)(醋酸菌类/发酵食品制造)、利亚杆菌属(Leahibacter)(醋酸菌类/发酵食品 制造)、鼠球菌属(Muricoccus)(醋酸菌类/发酵食品制造)、新亚细亚菌数(Neoasaia)(醋酸 菌类/发酵食品制造)、嗜油单胞菌属(Oleomonas)(醋酸菌类/发酵食品制造)、副脆弱球菌 属(Paracraurococcus)(醋酸菌类/发酵食品制造)、红球状菌属(Rhodopila)(醋酸菌类/发 酵食品制造)、玫瑰球菌属(Roseococcus)(醋酸菌类/发酵食品制造)、如比特皮达 (Rubritepida)(醋酸菌类/发酵食品制造)、糖杆菌属(Saccharibacter)(醋酸菌类/发酵食 品制造)、星状菌属(Ste Ila)(醋酸菌类/发酵食品制造)、斯瓦米纳坦氏菌属 (Swaminathania)(醋酸菌类/发酵食品制造)、替考球菌属(Teichococcus)(醋酸菌类/发酵 食品制造)、扎瓦尔金氏菌属(Zavarzinia)(醋酸菌类/发酵食品制造)、假单胞菌属 (Pseudomonas)(假单胞菌类/牛肉、蛋、肉类、鳞介类、蔬菜)、无色杆菌属(Achromobacter) (无色杆菌类/鳞介类、肉类)、芽孢杆菌属(Baci I Ius)(芽孢杆菌类/米、蔬菜)、甲烷袋状菌 属(Methanocul Ieus)(产甲烷菌类/寄生于动物的肠的产甲烷菌)、甲烷八叠球菌属 (Methanosarcina)(产甲烧菌类/寄生于动物的肠中的产甲烧菌)、梭菌属(Clostridium) (梭菌类/肉类、牛奶、蔬菜、罐头)、微球菌属(Micrococcus)(放线菌类/肉类、鳞介类)、黄杆 菌属(Flavobacter ium)(拟杆菌类/食品的腐败菌)、泛菌属(Pantoea )、醋酸杆菌属 (Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属 (Enterobacter)。它们包含于很多食品或者在食品的制造工序中使用,因此对生物体的安 全性得到担保。

[0057] 其中,优选为选自由沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属 (Rahnella)、嗜热酸菌属(Acidicaldus)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、酸球形菌属 (Acidisphaera)、酸胞菌属(AcidoceIla)、酸单胞菌属(Acidomonas )、亚细亚菌属(Asaia)、 别尔纳普氏菌属(Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属 (Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌 属(Leahibacter )、鼠球菌属(Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属 (Oleomonas)、副脆弱球菌属(Paracraurococcus)、红球状菌属(Rhodopila)、玫瑰球菌属 (Roseococcus)、如比特皮达(Rubritepida)、糖杆菌属(Saccharibacter)、星状菌属 (Stella)、斯瓦米纳坦氏菌属(Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏 菌属(Zavarzinia)、泛菌属(Pantoea )、醋酸杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属 (Zymomonas )、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的组中的至少一 种。

[0058] 作为上述革兰氏阴性细菌,更优选为选自由泛菌属(Pantoea)、醋酸杆菌属 (Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆菌属 (Enterobacter)组成的组中的至少一种。特别是源自泛菌属(Pantoea)的脂多糖现在作为 健康食品使用,可以说特别是在经口给药时更有效。也可以直接使用源自这些菌的提取物 或其修饰物。

[0059] 另外,使用源自上述革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐的情况下,通常需要考虑到 对生物体的安全性,也可以以用于对它们解毒化的修饰物形式使用。

[0060] 另外,作为上述Toll样受体4(TLR4)激动剂,可列举出上述特定的脂多糖的衍生物 例如去除了多糖部分的脂质A或单磷酰脂A、3-脱-酰基化MPL等,或者也可以为盐。

[0061] 作为上述脂多糖的去除了多糖部分的脂质A,可以为源自上述特定的革兰氏阴性 细菌的分离物,或者也可以使用以形成与源自这些革兰氏阴性细菌的分离物相同的结构的 方式合成而成的物质。

[0062] 另外,作为上述脂质A的修饰物,也优选使用进行了脱磷酸化的单磷酰脂(MPL)或 盐。需要说明的是,本说明书中所称的单磷酰脂,除了单磷酰脂其自身之外,只要具有其性 质则也可以为其衍生物。特别是已经在医疗用途中作为免疫刺激剂存在实际效果的3-脱-酰基化物单磷酰脂(3D-MPL)、或美国专利申请公开第2010/0310602号说明书中提出的没有 脱酰基化的合成啦喃葡萄糖基脂(Glucopyranosyl lipid),从对生物体的安全性的观点考 虑优选。

[0063] 另外,作为上述单磷酰脂,也合适地使用具有安全性和使用先例的源自沙门氏菌 属菌的单磷酰脂。

[0064] 本发明中,进一步优选使用源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的LPS。其中,源 自成团泛菌的LPS优选为使用蛋白标志物利用SDS-PAGE法测得的分子量为5000 ± 3000、优 选5000 ± 2000的源自成团泛菌的LPS。在此所称的分子量通过利用使用了蛋白标志物的 SDS-PAGE法得到的染色带的位置来测定,详细如后文所述。

[0065] 本发明中优选使用的源自成团泛菌的LPS为特征在于0-抗原部分为鼠李糖和葡萄 糖的重复结构的脂多糖。

[0066] 上述源自成团泛菌的LPS可以通过利用常规方法培养成团泛菌(Pantoea agglomerans),由培养基收集菌体,由所收集的菌体利用公知方法纯化来制造。

[0067] 需要说明的是,上述源自成团泛菌的LPS的分子量可以通过以下的方法测定。

[0068] 即,对于作为配合物准备的源自成团泛菌的LPS、或者由疫苗组合物用适当的方法 进行提取纯化而得到的源自成团泛菌的LPS,可以用以下的方法测定分子量。将源自成团泛 菌的LPS溶解于蒸馏水,制造 lmg/mL浓度的溶液,将该溶液和样品缓冲溶液(Sample buffer solution)2ME+(Wako Pure Chemical Industries ,Ltd.制)等量混合,浸渍于沸水浴中5分 钟,然后立即浸渍于冰水中进行骤冷。

[0069]将电泳缓冲液(ΑΤΤ0⑶RP.制)充满于板式凝胶电泳槽(Marisol Corp.制),将 20%聚丙烯酰胺凝胶固定于电泳槽,向样品槽各加入IOyL检样,以IOOV电压连续进行电泳 至少1小时直至色素由凝胶溶出为止。电泳结束后,利用银染色试剂盒161-0443(Bi〇-Rad Laboratories,Inc ·制)在室温下进行银染色,确认行为。

[0070]另外,本发明的粘膜疫苗组合物,若含有源自特定的革兰氏阴性细菌的脂多糖或 其盐作为上述免疫刺激剂,则可以将它们和其它的以往公知的免疫刺激剂组合来使用。

[0071] 本发明的粘膜疫苗组合物可以如下制造:对上述的抗原和免疫刺激剂根据需要加 入其它成分(例如磷酸盐缓冲溶液等),用公知的方法进行搅拌混合,以及根据需要用公知 的方法进而进行加热、冷却或非加热干燥,由此制造本发明的粘膜疫苗组合物。

[0072] 另外,能够使用本发明的粘膜疫苗组合物来制造液体制剂、半固体制剂、固体制 剂、喷雾剂,除了上述材料以外,也可以根据需要适当使用赋形剂、粘合剂、香料、矫味剂、甜 味剂、着色剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、表面活性剂等。

[0073] 作为这些材料,没有特别限定,可以使用以往公知的材料。

[0074] 本发明的粘膜疫苗组合物优选为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体制剂。如后 文所述,通过本发明的粘膜疫苗组合物为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体制剂,可以 合适地对人或动物的粘膜表面给药。

[0075] 另外,本发明的粘膜疫苗组合物由于对人或动物的粘膜表面给药,因此上述半固 体制剂和固体制剂优选通过体液和/或体温溶解。

[0076] 进而,本发明的粘膜疫苗组合物,从抗原的稳定性确保的观点考虑,优选在保存时 水分含量少,因此优选为保存时为干燥状态、在粘膜表面给药后通过体液和/或体温溶解的 固体制剂。在此所称的"水分含量少"指的是在本发明的粘膜疫苗组合物的总重量中、含水 率优选20重量%以下、更优选10重量%以下。另外,在此所称的"含水率"根据第十六次修改 日本药典一般试验法干燥失重法第一法来求出。即,通过将本发明的粘膜疫苗组合物的试 验片在105°C、3小时的条件下进行加热时的重量的减少比率求出。为了得到这种固体制剂 的特性,作为本发明的粘膜疫苗组合物的材料,优选选择通过体液和/或体温溶解的材料。 作为这种材料,例如作为免疫刺激剂,优选选择水溶性高的源自成团泛菌的LPS,作为赋形 剂,优选选择通过体液和/或体温溶解的物性的聚合物。通过形成这种固体制剂,无需特别 的设备,就可以简单地对口腔内、阴道、直肠等的粘膜给药。

[0077]在此,上述固体制剂包括片剂、包衣片、散剂、颗粒剂、微粒剂、崩解片、贴剂、凝胶 剂、薄膜剂,若为对粘膜表面给药的固体状的固体制剂则没有特别限定。

[0078] 本发明的粘膜疫苗组合物,对选自由人或动物(哺乳类、鸟类等)的口腔内粘膜、眼 粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜 和直肠粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药,优选对口腔内粘膜给药。认为口腔内粘膜、目艮 粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜、 或直肠粘膜通常难以活化免疫,但是本发明的粘膜疫苗组合物由于与至少一种抗原一起组 合使用上述的特定的免疫刺激剂,即使对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘 膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药,也可以有效地诱 导全身性免疫应答和粘膜免疫应答。

[0079] 另外,作为给药途径,通过选择口腔粘膜、阴道粘膜、直肠粘膜,由此不会如对消化 道粘膜给予抗原的情况那样受到胃酸影响、蛋白分解酶的影响,另外不会如经鼻对粘膜给 予抗原的情况那样存在急性脑病等严重副作用的可能性,即使是老人、婴儿等也容易给药, 进而不会由于鼻涕等身体上主要原因而阻碍稳定的效果。

[0080] 另外,作为本发明的粘膜疫苗组合物的给药方法,如前文所述。另外,作为其给药 量,考虑到动物种类、对象的年龄、性别、体重等来确定,例如使用HA作为抗原的情况下,通 常可以以1次或2次以上给予0. Uig~50yg。优选多次给药,此时,优选间隔1~4周给药。

[0081] 发明的效果

[0082] 本发明的粘膜疫苗组合物,由于与至少一种抗原一起组合使用上述特定的免疫刺 激剂,通过对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘 膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药,可以安全且有效地诱导体液免疫、例如全身 性免疫应答和粘膜免疫应答。

附图说明

[0083]图1为表示实施例1~10、比较例1~5的小鼠鼻腔洗涤液中流感HA (B型)特异性I gA 效价的结果的图表。

[0084]图2为表示实施例1~10、比较例1~5的小鼠血清中流感HA (B型)特异性I gG效价的 结果的图表。

[0085]图3为表示实施例11~20、比较例6~9的小鼠鼻腔洗涤液中流感HA(HlNl)特异性 IgA效价的结果的图表。

[0086]图4为表示实施例11~20、比较例6~9的小鼠血清中流感HA(H1N1)特异性IgG效价 的结果的图表。

[0087]图5为表示实施例21~24、比较例10~12的小鼠鼻腔洗涤液中肺炎球菌特异性IgA 效价的结果的图表。

[0088]图6为表示实施例21~24、比较例10~12的小鼠血清中肺炎球菌特异性IgG效价的 结果的图表。

[0089]图7为表示实施例25~28、比较例13~15的小鼠鼻腔洗涤液中HPV16特异性IgA效 价的结果的图表。

[0090] 图8为表示实施例25~28、比较例13~15的小鼠血清中HPV16特异性IgG效价的结 果的图表。

[0091] 图9为表示实施例71~73、比较例30的小鼠鼻腔洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0092]图10为表示实施例71~73、比较例30的小鼠唾液中OVA特异性IgA效价的结果的图 表。

[0093]图11为表示实施例71~73、比较例30的小鼠肺胞洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0094]图12为表示实施例71~73、比较例30的小鼠阴道洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0095]图13为表示实施例71~73、比较例30的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0096]图14为表示实施例71~73、比较例30的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图 表。

[0097]图15为表示实施例74~76、比较例31的小鼠鼻腔洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0098]图16为表示实施例74~76、比较例31的小鼠唾液中OVA特异性IgA效价的结果的图 表。

[0099]图17为表示实施例74~76、比较例31的小鼠肺胞洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0100]图18为表示实施例74~76、比较例31的小鼠阴道洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0101] 图19为表示实施例74~76、比较例31的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0102] 图20为表示实施例74~76、比较例31的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图 表。

[0103] 图21为表示实施例77~79、比较例32的小鼠阴道洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0104] 图22为表示实施例77~79、比较例32的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0105] 图23为表示实施例77~79、比较例32的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图 表。

[0106] 图24为表示实施例80~82、比较例33的小鼠阴道洗涤液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0107] 图25为表示实施例80~82、比较例33的小鼠粪便提取液中OVA特异性IgA效价的结 果的图表。

[0108] 图26为表示实施例80~82、比较例33的小鼠血清中OVA特异性IgG效价的结果的图 表。

具体实施方式

[0109] 通过以下的实施例对本发明进行具体说明,但是本发明不被这些实施例所限定。

[0110] 以下的各给药组以10只份制造。 Com]另外,作为对于小鼠的疫苗抗原的适当的给药量,流感疫苗的情况下,以l.Oyg、 〇. Uig这两种模式进行了研究。对于超过I.Oyg的给药量而言,即使不存在佐剂下,也有可能 发现抗体产生,另一方面,对于不足〇. Iyg的给药量而言,疫苗抗原量过少,即使存在佐剂下 也有可能没有发现抗体产生。

[0112] (实施例1~10、比较例1~5)

[0113] 以成为表1的各组的给药量制造含流感疫苗抗原的溶液(B/Wisconsin/1/2010、阪 大微生物病研究会制)(445yg/mL)、和源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖(自 然免疫应用技研社制)溶液(50mg/mL),加入磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)制造 300此的疫苗组合物。例如实施例1中,加入含流感疫苗抗原的溶液22.5yL,加入源自成团泛 菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖溶液20yL后,加入磷酸盐缓冲液使得总量为300yL。其 它的实施例、比较例也适当稀释,以形成相当于给药量的含量的方式制造,比较例5中,不加 入疫苗抗原、佐剂而对小鼠仅给予磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)。

[0114] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc ·) 6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和鼻腔洗涤 液,对于血清中流感HA( B型)特异性I gG效价和鼻腔洗涤液中流感HA( B型)特异性I gA效价的 测定,通过ELI SA法进行测定。

[0115]在此,对于佐剂量1000 yg的给药(比较例1)而言,在第一次给药起24小时后发现小 鼠的毛色变差、体重减少,进行安乐死处置,因此没有进行此后的抗体效价的测定。佐剂为 激活免疫的物质,可知添加量越多则越容易得到免疫,但是过量给药存在安全上的问题,小 鼠中的1000 yg的给药在比较例1以后没有进行。

[0116]需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0117][表 1]

Figure CN105555308AD00131

[0119] (实施例11~20、比较例6~9)

[0120] 将含流感疫苗抗原的溶液由B/Wisconsin/1/2010变更为A/California/07/2009 (H1N1、阪大微生物病研究会制)(801yg/mL),除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较 例1~5的操作制造相当于表2的疫苗组合物。例如实施例11中,加入含流感疫苗抗原的溶液 12·5yL和源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖溶液20yL后,加入磷酸盐缓冲液 使得总量为300yL。

[0121] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc.) 6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和鼻腔洗涤 液,对于血清中流感HA(HlNl)特异性IgG效价和鼻腔洗涤液中流感HA(HlNl)特异性IgA效价 的测定,通过ELISA法进行测定。需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0122] [表 2]

[0123]

Figure CN105555308AD00141

[0124] (实施例21~24、比较例10~12)

[0125] 将疫苗抗原由流感变更为含肺炎球菌荚膜多糖的溶液(Pneumovax NP、MSD K.K.) (1150yg/mL),除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表3 的疫苗组合物。例如实施例21中,加入含肺炎球菌荚膜多糖的溶液8.7yL和源自成团泛菌 (Pantoea agglomerans)的脂多糖溶液2yL后,加入磷酸盐缓冲液使得总量为300yL。

[0126] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和鼻腔洗涤 液,对于血清中肺炎球菌特异性IgG效价和鼻腔洗涤液中肺炎球菌特异性IgA效价的测定, 通过ELISA法进行测定。需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0127] [表 3]

Figure CN105555308AD00142

[0129](实施例25~28、比较例13~15)

[0130] 将疫苗抗原由流感变更为含HPV16重组蛋白的溶液(HPV16、PR0SPEC公司制)(820μ g/mL),除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表4的疫苗 组合物。例如实施例25中,加入含HPV16重组蛋白的溶液12.2yL和源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖溶液2yL后,加入磷酸盐缓冲液使得总量为300yL。

[0131] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc ·) 6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和鼻腔洗涤 液,对于血清中HPV16重组蛋白特异性IgG效价和鼻腔洗涤液中HPV16重组蛋白特异性IgA效 价的测定,通过ELISA法进行测定。需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0132] [表 4]

Figure CN105555308AD00151

[0134] (实施例29~31、比较例16)

[0135] 添加含弱毒存活轮状病毒的溶液(RotaTeq内用液、MSD公司制)200yL,以及在实施 例29中添加源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE, INC.制)溶 液50yL(2mg/mL)、在实施例30中添加源自成团泛菌(Pantoea aggIomerans)的脂多糖 (NACALAI TESQUE,INC.制)溶液5yL、在实施例31中添加源自成团泛菌(Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC·制)溶液0 · 5yL,在比较例16中添加吡喃葡萄 糖基脂(Glucopyranosyl lipid)(MPLAs、InvivoGen公司制)溶液(2mg/mL)5yL,加入磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),制造300yL的疫苗组合物。

[0136] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和鼻腔洗涤 液,对于血清中抗原特异性IgG效价和鼻腔洗涤液中抗原特异性IgA效价的测定,通过ELISA 法进行测定。

[0137] (实施例32~70、比较例17~29)

[0138] 实施例32~34、比较例17中使用含灭活脊髓灰质炎病毒的溶液(MOVAX POLIO皮 下注射、Sanof i K.K.制),实施例35~37、比较例18中使用含灭活甲型肝炎病毒的溶液 (Aimmugen、化学及血清疗法研究所社制),实施例38~40、比较例19中使用含灭活日本脑炎 病毒的溶液(ENCEVAC皮下注射用、化学及血清疗法研究所社制),实施例41~43、比较例20 中使用含弱毒存活流行性腮腺炎病毒的溶液(流行性腮腺炎存活疫苗、Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co.,Ltd.制),实施例44~46、比较例21中使用含弱毒存活麻疹病毒的溶 液(麻疼存活疫苗、Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co. ,Ltd.制),实施例47~49、比较 例22中使用含弱毒存活风疹病毒的溶液(干燥弱毒存活风疹疫苗、Kitasato Daiichi Sankyo Vaccine Co.,Ltd.制),实施例50~52、比较例23中使用含破伤风类毒素结合b型流 感嗜血杆菌多糖的溶液以(^!118、3 &11〇行1(.1(.制),实施例53~55、比较例24中使用含重组 HBs抗原蛋白质的溶液(Bimmugen、化学及血清疗法研究所社制),实施例56~58、比较例25 中使用含弱毒存活黄热病病毒的溶液(黄热病疫苗、Sanofi K.K.制),实施例59~61、比较 例26中使用含破伤风类毒素的溶液(破伤风类毒素 、DENKA SEIKEN CO.,LTD.制),实施例62 ~64、比较例27中使用含弱毒存活水痘带状疱疹病毒的溶液(干燥弱毒存活水痘疫苗、阪大 微生物病研究会社制),实施例65~67、比较例28中使用含存活BCG的溶液(干燥BCG疫苗、 Japan BCG Laboratory制),实施例68~70、比较例29中使用含灭活狂犬病病毒的溶液(组 织培养灭活狂犬病疫苗、化学及血清疗法研究所社制)。

[0139] 与表5和实施例29~31、比较例16同样地制造疫苗组合物。另外,用与实施例29~ 31、比较例16相同的手法进行免疫实验。

[0140][表 5]

Figure CN105555308AD00161

[0142](实施例71~73、比较例30)

[0143] 将疫苗抗原由流感变更为卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) (Sigma-Aldrich Japan), 除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表6的疫苗组合物。 例如实施例71中,向卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) 100yL( 1000yg/mL)和源自成团泛菌 (Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC ·制)溶液5yL( 2mg/mL)加入磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),制造300yL的粘膜疫苗组合物。

[0144] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,对各小鼠的舌 下给予所制造的疫苗组合物30yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠同样 地进行舌下给药。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和粘膜样品,对于血清中卵 清蛋白(Ovalbumin)特异性IgG效价以及鼻腔洗涤液中、唾液中、肺胞洗涤液中、阴道洗涤液 中、粪便提取物中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性IgA效价的测定,通过ELISA法进行测定。需 要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0145] [表 6]

Figure CN105555308AD00171

[0147](实施例74~76、比较例31)

[0148] 将疫苗抗原由流感变更为卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) (Sigma-Aldrich Japan), 除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表7的疫苗组合物。 例如实施例74中,向卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) 100yL( 1000yg/mL)和源自成团泛菌 (Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC ·制)溶液5yL( 2mg/mL)加入磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),制造500yL的粘膜疫苗组合物。

[0149] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,使用液体用喷 雾器(Penn-Century,Inc.),对各小鼠的支气管喷雾给予所制造的疫苗组合物50yL。由该给 药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠同样地对肺给药。由第二次给药起进而1周后, 采集小鼠的血清和粘膜样品,对于血清中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性IgG效价以及鼻腔洗 涤液中、唾液中、肺胞洗涤液中、阴道洗涤液中、粪便提取物中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性 IgA效价的测定,通过ELISA法进行测定。需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0150] [表 7]

Figure CN105555308AD00172

[0152] (实施例77~79、比较例32)

[0153] 将疫苗抗原由流感变更为卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) (Sigma-Aldrich Japan), 除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表8的疫苗组合物。 例如实施例77中,向卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) IOOyL(1000yg/mL)和源自成团泛菌 (Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC ·制)溶液5yL( 2mg/mL)加入磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),制造200yL的粘膜疫苗组合物。

[0154] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,对各小鼠的阴 道使用移液管给予所制造的疫苗组合物20yL。由该给药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对 各小鼠同样地对阴道给药。由第二次给药起进而1周后,采集小鼠的血清和粘膜样品,对于 血清中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性IgG效价以及阴道洗涤液中、粪便提取物中卵清蛋白 (Ovalbumin)特异性IgA效价的测定,通过ELISA法进行测定。需要说明的是,详细的测定方 法如后文所述。

[0155][表 8]

Figure CN105555308AD00181

[0157] (实施例8〇~%、比较例幻)

[0158] 将疫苗抗原由流感变更为卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) (Sigma-Aldrich Japan), 除此之外,基本上通过基于实施例1~10、比较例1~5的操作制造相当于表9的疫苗组合物。 例如实施例80中,向卵清蛋白(Ovalbumin) (OVA) IOOyL(1000yg/mL)和源自成团泛菌 (Pantoea agglomerans)的脂多糖(NACALAI TESQUE,INC ·制)溶液5yL( 2mg/mL)加入磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),制造500yL的粘膜疫苗组合物。

[0159] 对小鼠(雌性8周龄BALB/C小鼠 、Japan SLC,Inc. )6只进行麻醉后,使用ImL注射器 和小鼠用探头(Fuchigami Kikai),对各小鼠的直肠给予所制造的疫苗组合物50yL。由该给 药起1周后,再次对小鼠施加麻醉,对各小鼠同样地对直肠给药。由第二次给药起进而1周 后,采集小鼠的血清和粘膜样品,对于血清中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性IgG效价以及阴 道洗涤液中、粪便提取物中卵清蛋白(Ovalbumin)特异性IgA效价的测定,通过ELISA法进行 测定。需要说明的是,详细的测定方法如后文所述。

[0160] [表 9]

Figure CN105555308AD00182

[0162] (小鼠免疫实验)

[0163] 对于8周龄、雌性、BALB/C小鼠以2次、一周间隔进行给药。由最终给药起一周后采 集小鼠血液和鼻腔洗涤液。对于血液在4°C下以3000G进行10分钟离心,向上清液20yL加入 磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制)300yL,制成血清样品,各种粘膜样品的采集方法 如下所述。对于鼻腔洗涤液而言,在BALB/C小鼠的气道下部形成切口,流入200yL的磷酸盐 缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),回收在鼻腔出来的样品,制成鼻腔洗涤液样品。对于唾 液而言,对小鼠的腹腔给予12yg/mL的氯化氨甲酰胆碱500yL,促进唾液产生后,收集唾液20 yL。对于肺泡洗涤液而言,在BALB/C小鼠的气道下部形成切口,将500yL的磷酸盐缓冲液 (NACALAI TESQUE,INC.制)流入肺,回收出来的磷酸盐缓冲液,制成肺泡洗涤液样品。对于 阴道洗涤液而言,向BALB/C小鼠的阴道流入150yL的磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC. 制),将10次移液物作为阴道洗涤液样品。对于粪便提取液而言,向所回收的粪便每IOmg加 入IOOyL的磷酸盐缓冲液(NACALAI TESQUE,INC.制),进行10分钟涡流。然后4°C下以3000G 进行10分钟离心,将上清液作为粪便提取液样品。

[0164] 通过测定小鼠血清中的免疫抗原特异性IgG效价,评价全身性免疫应答。另外,通 过测定小鼠粘膜样品中的免疫抗原特异性IgA效价,评价粘膜免疫应答。各评价方法如下所 述。

[0165] 另外,各评价结果如图1~26所示。

[0166] (小鼠血清中抗原特异性IgG效价测定方法(ELISA法))

[0167] 向ELI SA用96孔板添加利用碳酸盐缓冲液稀释而成的各抗原(例如测定B/ Wisconsin/1/2010(B)特异性 IgG 抗体效价时 B/Wisconsin/1/2010(B)流感 HA 抗原溶液(2.5 yg/mL)各 100yL,放置一夜。

[0168] 利用预先准备的含TWeen20的PBS(以下洗涤液)将孔洗涤三次,添加用纯化水将封 闭剂(Block Ace、DS Pharma Biomedical Co. ,Ltd.制)稀释至4g/400mL而成的封闭溶液各 200yL,室温下放置2小时。然后用洗涤液洗涤孔3次。

[0169] 使用将封闭剂(Block Ace、DS Pharma Biomedical Co · ,Ltd ·制)用磷酸盐缓冲液 (NACALAI TESQUE,INC.制)稀释至0.4g/1OOmL而成的溶液(以下试剂稀释液),将前述的血 清样品进行15次每1/2倍的系列稀释,分别添加该溶液各50yL,室温下放置2小时。

[0170] 然后,用洗涤液洗涤孔3次,添加用试剂稀释液将HRP标记抗小鼠 IgG抗体(Goat-anti-mouse IgG Fe HRP、BETHYL公司制)稀释至10000倍而成的稀释物各100yL,室温下放 置1小时。

[0171] 然后用洗涤液洗涤孔3次,加入TMB溶液(ELISA POD TMB试剂盒、NACALAI TESQUE, INC.制)各100yL。向其中加入IM硫酸溶液各IOOyU对于该96孔板,利用酶标仪(168-11135CAM、Bi〇-Rad Laboratories,Inc.制)测定450nm的吸光度。基于系列稀释时的吸光 度,将该吸光度不突破0.1的最大的稀释倍率作为小鼠血清中IgG效价,其值用Log2的值求 出。

[0172] (小鼠粘膜样品中抗原特异性IgA效价测定方法(ELISAfe))

[0173] 基本上与抗原特异性IgG效价测定方法相同,但是测定样品为粘膜样品,另外使用 HRP标记抗小鼠 IgA抗体(Goat-anti-mouse IgA aHRP、BETHYL公司制)来替代HRP标记抗小 鼠 IgG抗体。除此以外的操作都同样。

[0174] 如图1~26所示,实施例中,抗原特异性IgG和IgA以高水平产生。与此相对,比较例 中,抗原特异性IgG和IgA的产生量都低。另外,如图9~26看到那样确认了,通过对粘膜给予 抗原和脂多糖,不仅在该粘膜面而且在远隔的粘膜面也诱导免疫(例如若对舌下给予抗原 和脂多糖则在肠道、阴道面确认了抗原特异性IgA的产生)。即发现,脂多糖或其盐对于所有 粘膜面作为有效的免疫刺激剂发挥作用,并且可以在全身充分诱导抗原特异性IgA。

[0175] 由这些结果发现,相对于抗原以规定范围含有的作为免疫刺激剂的源自特定的革 兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐,对于粘膜表面中的粘膜免疫诱导而言是有效的。

[0176] 产业上的可利用性

[0177] 本发明的粘膜疫苗组合物,由于与至少一种抗原一起以规定的含量范围组合使用 上述特定的免疫刺激剂,即使对口腔内粘膜、眼粘膜、耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸 道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜或直肠粘膜给药,也可以安全且有效地诱导 全身性免疫应答和粘膜免疫应答。

Claims (5)

1. 一种粘膜疫苗组合物,其特征在于,其为对选自由人或动物的口腔内粘膜、眼粘膜、 耳粘膜、生殖器粘膜、咽喉粘膜、呼吸道粘膜、支气管粘膜、肺粘膜、胃粘膜、肠道粘膜和直肠 粘膜组成的组中的至少一种粘膜给药的粘膜疫苗组合物, 其含有至少一种抗原和作为免疫刺激剂的源自革兰氏阴性细菌的脂多糖或其盐,所述 革兰氏阴性细菌选自由沙雷氏菌属(Serratia)、勒克菌属(Leclercia)、拉恩菌属 (Rahne 1 la)、嗜热酸菌属(Acidicaldus)、嗜酸菌属(Acidiphilium)、酸球形菌属 (八(^(118口1^6從)、酸胞菌属(八(^(1〇06113)、酸单胞菌属(八(^(1〇11101^8)、亚细亚菌属(八831&)、 别尔纳普氏菌属(Belnapia)、脆弱球菌属(Craurococcus)、葡糖醋杆菌属 (Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、柯扎克氏菌属(Kozakia)、利亚杆菌 属(Leahibacter)、鼠球菌属(Muricoccus)、新亚细亚菌数(Neoasaia)、嗜油单胞菌属 (016〇111〇1^8)、副脆弱球菌属(?3^(^3111'〇(3〇(3(3118)、红球状菌属(1?11〇(1(^;!_13)、玫瑰球菌属 (尺〇80〇(3〇(3(3118)、如比特皮达(1?11131';^6卩1(1&)、糖杆菌属(3&(3(311&1';^&(^61')、星状菌属 (Stella)、斯瓦米纳坦氏菌属(Swaminathania)、替考球菌属(Teichococcus)、扎瓦尔金氏 菌属(Zavarzinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、芽抱杆菌属 (Bacillus)、甲焼袋状菌属(Methanoculleus)、甲焼八叠球菌属(Methanosarcina)、梭菌属 (Clostridium)、微球菌属(Micrococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、泛菌属(Pantoea)、 醋酸杆菌属(Acetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)和肠杆 菌属(Enterobacter)组成的组中的至少一种, 所述免疫刺激剂与所述抗原的质量比即免疫刺激剂的总质量/抗原的总质量为0.002 ~500〇
2. 根据权利要求1所述的粘膜疫苗组合物,其为液体制剂、喷雾剂、半固体制剂或固体 制剂,所述半固体制剂和固体制剂通过体液和/或体温溶解。
3. 根据权利要求2所述的粘膜疫苗组合物,其为通过体液和/或体温溶解的固体制剂。
4. 根据权利要求1、2或3所述的粘膜疫苗组合物,其用于诱导体液免疫。
5. 根据权利要求1、2、3或4所述的粘膜疫苗组合物,其中,抗原为源自感染症的抗原或 癌抗原。
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