CN110124024B - 一种新城疫基因vii型dna纳米颗粒疫苗及制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用。本发明以壳聚糖为载体材料，MgSO₄、三聚磷酸钠作为交联剂，通过离子交联法制备出新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。该疫苗表面没有明显的空隙，呈良好规则的圆形，具有良好的分散性，且没有聚集和沉降损伤，平均粒径为240.8±7.4nm，Zeta电位为25.0±1.5mV，纳米颗粒的包封率为92.3±0.56％。可点眼滴鼻免疫诱导黏膜免疫应答，可较好用于鸡新城疫免疫，且成本低，为新型的DNA疫苗研制奠定基础。

Description

一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，特别涉及一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用。

背景技术

新城疫称为伪鸡瘟、亚洲鸡瘟，具有高致病性、高死亡率，是一种由新城疫病毒引起禽类发病、致死的急性、高度接触性的世界范围性传染病，主要以感染鸡与火鸡为主。自1926年在英国新城分离到新城疫病毒以来，经过4次世界范围的大流行后，宿主范围不断扩大，基因VII型，尤其是VIId亚型毒株的流行，给整个养禽业造成了重大的经济损失，并且目前没有一种有效的药物对其进行治疗。目前我国对于新城疫的防治主要采用各种不同毒力的弱毒疫苗或油乳剂灭活苗等传统疫苗进行免疫，但某些弱毒苗保留了部分毒性，对雏鸡有一定的呼吸道病变和致死率，另外也增强了其它病原体的易感性，其次受免疫途径的影响，产生循环抗体低，维持期短；灭活苗虽然能产生高水平的循环抗体，但在抵抗消化道与呼吸道病原感染的黏膜系统中难以发挥较好的作用，而且需要注射器免疫，费时费力，残留一些注射器对环境有害。因此寻求一种廉价、安全、有效且方便的疫苗对新城疫的综合防治有重要的意义。

DNA疫苗是指将能够表达病原主要抗原的真核表达载体，通过一定的途径进入动物体内，利用宿主细胞进行转录和翻译来产生抗原蛋白，刺激机体免疫应答反应，从而起到免疫保护的作用。F蛋白是NDV的主要毒力因子与保护性抗原，单独的F基因构建的DNA疫苗通过普通的肌肉注射难以达到理性的保护效率，因此，对分子佐剂和免疫途径需要进行进一步探讨。在过去的很多年，纳米技术被广泛的用于疫苗的研究中，应运产生了纳米疫苗。其中壳聚糖是一种安全可靠的碱性天然生物活性多糖，其来源丰富、生物相容性好、可降解和分解产物无毒，并且其粒径小，表面积大，与生物膜有较高的黏着性等优点，已成为广泛应用的新型药用辅料之一，作为微球、微囊、纳米粒等药物载体的研究也日益受到重视。国内DNA纳米颗粒疫苗黏膜免疫系统的研究工作开展很少，而新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的研究尚未见有报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。

本发明的再一目的在于提供上述新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法，包含如下步骤：

(1)将pH为4.5～6.5、壳聚糖浓度为0.5～1.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液600～900rpm磁力搅拌5～10min；然后逐滴加入浓度为250～1000ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；再加入pH为4.5～6.5、MgSO₄/浓度为0.5～1.5mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；最后加入pH为4.5～6.5、TPP浓度为0.5～1.5mg/mL的TPP/乙酸溶液，700～1000rpm磁力搅拌30～40min；

(2)搅拌反应后，低温离心，弃上清，收集沉淀；

(3)采用预冷的ddH₂O重悬沉淀，混匀，超声破碎，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

(4)新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗；

步骤(1)中所述的壳聚糖、重组载体pCAGGS-F、MgSO₄、TPP的质量比为5:1:1:2；

步骤(1)中所述的重组载体pCAGGS-F溶液的浓度优选为500ng/μL；

步骤(1)中所述的壳聚糖/乙酸溶液的pH优选为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL；

步骤(1)中所述的壳聚糖/乙酸溶液的制备方法优选为：

将壳聚糖加入到乙酸溶液中，1200rpm磁力搅拌24h；然后4℃、4000g离心5min，取上清液并通过0.45μm过滤器过滤，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的壳聚糖/乙酸母液；进一步稀释，得到pH为4.5～6.5、壳聚糖浓度为0.5～1.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液；

步骤(1)中所述的MgSO₄/乙酸溶液的pH优选为6.0、浓度为1mg/mL；

步骤(1)中所述的MgSO₄/乙酸溶液的制备方法优选为：

将MgSO₄加入到乙酸溶液中，1200rpm磁力搅拌24h；然后4℃、4000g离心5min，取上清液并通过0.45μm过滤器过滤，得到MgSO₄浓度为10mg/mL的MgSO₄/乙酸母液；进一步稀释，得到pH为4.5～6.5、MgSO₄浓度为0.5～1.5mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液；

步骤(1)中所述的TPP/乙酸溶液的pH优选为6.0、TPP浓度为1mg/mL；

步骤(1)中所述的TPP/乙酸溶液的制备方法优选为：

将TPP加入到乙酸溶液中，1200rpm磁力搅拌24h；然后4℃、4000g离心5min，取上清液并通过0.45μm过滤器过滤，得到TPP浓度为10mg/mL的TPP/乙酸母液；进一步稀释，得到pH为4.5～6.5、TPP浓度为0.5～1.5mg/mL的TPP/乙酸溶液；

步骤(2)中所述的低温离心的条件优选为4℃，18000g离心30min；

步骤(2)中所述的超声破碎的时间优选为15min；

步骤(2)中所述的超声破碎的条件优选为温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s；

步骤(3)中所述的ddH₂O为无菌、预冷至0～4℃；

步骤(1)中所述的重组载体pCAGGS-F的制备方法优选为：

(1)根据新城疫病毒F基因，设计扩增引物，然后以新城疫病毒cDNA为模板进行PCR扩增，得到F基因片段；

(2)用限制性内切酶EcoR I和Nhe I将F基因片段、载体pCAGGS进行双酶切后再连接，得到重组载体pCAGGS-F；

所述的扩增引物优选为rGM F-F和rGM F-R，其核苷酸序列为：

rGM F-F：CGGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTCTACC；

rGM F-R：CGGCTAGCTCATGCTCTTGTAGTGGCTCT；

一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗，通过上述制备方法制备得到；

所述的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗在制备新城疫防治产品中的应用；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用的壳聚糖新城疫DNA纳米颗粒递送系统对新城疫DNA疫苗具有一定的保护作用，可提高免疫效果，增强了黏膜免疫反应，通过点眼滴鼻免疫，在保证发挥药物的前提下可以减少了给药剂量、次数。另外壳聚糖、三聚磷酸钠对机体无毒性作用，所以本疫苗为一种具有广阔应用前景的新型DNA疫苗。

(2)本发明制得的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗经过优化在透射电镜下观察，表面没有明显的空隙，呈良好规则的圆形，具有良好的分散性，且没有聚集和沉降损伤，平均粒径为240.8±7.4nm，Zeta电位为25.0±1.5mV，纳米颗粒的包封率为92.3±0.56％。

(3)本发明制得的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗易于保存，稳定性高、毒性小、生物利用度高且无害，成本低、易于生产。在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率，可以在体内保持最佳的药物浓度，实现药物的缓释。

(4)本发明制备工艺简单，成本低，工艺重现性好，样品需要量少，还可以保持DNA疫苗的活性，试验筛选新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法也可以应用于生产应用中，对农业化应用具有一定的意义。本实验将新城疫基因VII型rGM毒株的F基因克隆到真核表达载体pCAGGS中，构建成pCAGGS-F真核表达质粒，以壳聚糖为载体材料，MgSO₄、TPP(三聚磷酸钠)作为交联剂，探讨DNA纳米颗粒制备的条件，以优化后的壳聚糖、MgSO₄、TPP通过离子交联法制备出新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。在攻毒保护试验中，具有良好的的保护效果。该试验初步探讨新城疫新型疫苗的应用，为相关新城疫新制剂的开发提供基础依据。

附图说明

图1是本发明制得的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的透射电子显微镜图。

图2是本发明制得的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的纳米粒度分析图。

图3是实施例1中菌液PCR鉴定结果图；其中，M：DL2000 DNA Marker；泳道1～9：质粒pCAGGS-F疑似菌液PCR产物；泳道10：阴性对照。

图4是优化过程不同因素影响包封率的结果。

图5是攻毒保护试验存活率结果分析图。

图6是免疫后各组间IgG抗体水平平均值结果分析图。

图7是免疫后各组内IgG抗体水平组内分布结果分析图。

图8是免疫鸡IgA抗体的测定结果分析图；其中，A：泪液IgA测定；B：气管液IgA测定；C：胆汁IgA测定；D：血清IgA测定。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1重组载体pCAGGS-F的制备

以新城疫病毒rGM株(Sun M,Xiang B,Li Y,et al.Generation and evaluationof a genetically attenuated Newcastle disease virus rGM-VIIm as a genotype-matched vaccine[J].Virus Genes,2017,53(1):35-43.)尿囊液提取RNA，反转为cDNA，再以cDNA为模板按以下条件进行PCR扩增，得到rGM F基因片段：Premix Ex Taq 25μL，cDNA模板2.5μL，上游引物F0.5μL，下游引物R0.5μL，ddH₂O 21.5μL，总体积50μL；PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃1min、56℃1min、72℃1min40s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃∞。其中，rGM F基因片段的扩增引物为rGM F-F和rGM F-R，其核苷酸序列为：

rGM F-F：5’-CGGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTCTACC-3’；

rGM F-R：5’-CGGCTAGCTCATGCTCTTGTAGTGGCTCT-3’；

PCR产物经过胶回收、纯化后，用限制性内切酶EcoR I和Nhe I将F基因片段和pCAGGS载体分别进行双酶切，然后连接，连接体系如下：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，pCAGGS Vector 1μL，PCR Product(F片段)7μL，T4 DNA Ligase 1μL；上述组分充分混匀后，4℃连接过夜(16h)；连接完成后转化，具体步骤如下：

(1)10μL连接产物加入到100μL融化的感受态细胞中(DH5α菌株)，轻轻吹打混匀，冰上静置30min；

(2)混合物于42℃水浴热激70s，迅速移至冰上放置5min；

(3)加入400μL无抗性的LB至EP管中，在37℃，220r/min振荡培养45min；

(4)用玻璃棒将100μL菌液均匀涂在含100μg/mL Amp⁺抗性的LB平板上，待菌液被LB平板吸收后(约8min)，将LB平板倒放置于37℃生化培养箱中培养过夜。转化16h后，在每个LB平板中挑取单菌落接种于600μL含100μg/mL Amp⁺抗性的LB液体培养基中，37℃，220r/min的摇床中振荡培养6h后，用菌液PCR法筛选阳性克隆，使用Tiangen公司的Golden EasyPCR System试剂盒。PCR反应体系如下：2×Reaction Mix 10.2μL；上游引物rGM F-F(20μM)0.2μL；下游引物rGM F-R(20μM)0.2μL；菌液1.0μL；ddH₂O 8.4μL。反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min40s，运行30个循环；72℃终延伸10min，4℃∞。根据鉴定结果(图3)，挑选阳性菌液接种于含100μg/mL Amp⁺抗性的LB液体培养基中，37℃，220r/min的摇床中振荡培养16h后，用于质粒大提。质粒大提是按照E.Z.N.A D6926-BEndo-Free Plasmid Maxi Kit I(OMEGA)制备，送样检测，得到重组载体pCAGGS-F。

rGM F基因片段的核苷酸序列如下所示：

GTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTGTTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTCTACCAGGATCCCAGCACCTCTAATGCTGATCACTCGGATTATGCTGATATTGAGCTGTATCCGTCTGACAAGCTCTCTTGACGGCAGGCCCCTTGCAGCTGCAGGAATTGTAGTAACAGGAGATAAGGCAGTCAATGTATACACCTCGTCTCAGACAGGGTCAATCATAGTCAAGTTGCTCCCGAATATGCCCAGAGATAAGGAGGCATGTGCAAAAGCCCCATTAGAGGCATATAACAGAACACTGACTACTCTGCTCACTCCTCTTGGCGACTCCATCCGCAAGATCCAAGGGTCTGTGTCCATGTCTGGAGGAAGGAGACAAAAACGCTTTATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGCTCTTGGGGTTGCAACAGCGGCCCAGATAACAGCAGCTGCGGCCCTAATACAAGCCAAACAGAATGCCGCCAACATCCTCCGGCTTAAGGAGAGCATTGCCGCAACCAATGAAGCTGTGCATGAAGTCACCGACGGATTATCACAACTATCAGTGGCAGTTGGGAAGATGCAGCAGTTTGTCAATGACCAGTTTAATAATACGGCGCGAGAATTGGACTGTATAAAAATCACACAACAGGTCGGTGTAGAACTCAACCTATACCTAACTGAATTGACTACAGTATTCGGGCCACAGATCACCTCCCCTGCATTAACTCAGCTGACCATCCAGGCACTTTATAATTTAGCTGGTGGCAATATGGATTACTTATTAACTAAGTTAGGTATAGGAAACAATCAACTCAGCTCATTAATTGGTAGCGGCCTGATCACTGGTTATCCTATACTGTATGACTCACATACTCAACTCTTGGGCATACAAGTAAACCTGCCCTCAGTCGGGAACTTAAATAATATGCGTGCCACCTATTTGGAGACCTTATCTGTAAGTACAACCAAAGGATATGCCTCAGCACTTGTCCCGAAAGTAGTGACACAAGTCGGTTCTGTGATAGAAGAGCTTGACACCTCATACTGTATAGAGTCCGATCTGGATTTATATTGTACTAGAATAGTGACATTCCCCATGTCCCCAGGTATTTATTCCTGTTTGAGCGGCAACACATCAGCTTGCATGTATTCAAAGACTGAAGGTGCACTCACTGCGCCATATATGGCCCTTAAAGGCTCAGTTATTGCCAATTGTAAGATAACAACATGTAGATGTACAGACCCTCCTGGTATCATATCGCAAAATTATGGAGAAGCTGTATCCCTGATAGATAGACATTCATGCAATGTCTTATCATTAGACGGAATAACTCTGAGGCTCAATGGGGAATTTGATGCAACTTATCAAAAGAACATCTCAATATTAGATTCTCAAGTCATCGTGACAGGCAATCTTGATATATCAACTGAACTTGGAAACGTCAACAATTCAATCAGCAATGCCTTGGATAGGTTGGCAGAAAGCAACAGCAAGCTAGAAAAAGTCGATGTCAGACTAACTAGCACATCTGCTCTCATTACCTATATTGTTCTAACTGTCATTTCTCTAATTTTCGGTGCACTTAGTCTGGTTTTAGCGTGTTACCTGATGTACAAACAGAAGGCACAACAAAAGACCTTGCTATGGCTTGGGAATAATACCCTCGATCAGATGAGAGCCACTACAAGAGCATGAGCTAGCAGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTAAAACATCAGAATGAGTATTTGGTTTAGAGTTTGGCAACATATGCCATATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTGGCTATAAAGAGGTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTTTTATATTTTGTTTTGTGTTATTTTTTTCTTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGCCAGATTTTTCCTCCTCTCCTGACTACTCCCAGTCATAGCTGTCCCTCTTCTCTTATGAAGATCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCGGATCCGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCCGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTG

实施例2

(1)称取0.5g壳聚糖粉末加入到装有50mL体积分数为1％乙酸溶液的锥形瓶中，1200rpm磁力搅拌搅拌24h；然后将溶液置于4℃、4000g离心5min，取上清液并通过0.45μm过滤器过滤，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的壳聚糖/乙酸母液，进一步稀释，得到pH为6.0、壳聚糖浓度分别为0.5、1、1.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液；同样方法得到pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液和pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液；

(2)将5mL pH为6.0、壳聚糖浓度分别为0.5、1、1.5的壳聚糖/乙酸溶液加入至锥形瓶中，600rpm磁力搅拌5min；往瓶中逐滴加入2mL浓度为500ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液；600rpm继续磁力搅拌3min；再加入1mL pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，900rpm磁力搅拌搅拌5min；最后加入2mL pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液，1000rpm磁力搅拌40min；

(3)搅拌反应后，将反应液分装2mL EP管中，4℃、18000g离心30min，弃上清，收集沉淀；

(4)在步骤(3)制得的沉淀中加入高压灭菌后预冷至4℃的ddH₂O，吹打震荡混匀，超声破碎15min(温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s)，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

(5)新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗，其中，壳聚糖浓度对纳米颗粒的影响见图4A。

实施例3

方法同实施例2，其中，步骤(2)中壳聚糖/乙酸溶液pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL，MgSO₄/乙酸溶液pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL，TPP/乙酸溶液pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL，重组载体pCAGGS-F溶液浓度分别为250、500、1000ng/μL。

重组载体pCAGGS-F溶液浓度对纳米颗粒的影响见图4B。

实施例4

方法同实施例2，其中，步骤(2)中壳聚糖/乙酸溶液pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL，MgSO₄/乙酸溶液pH为6.0、MgSO₄浓度分别为0.5、1、1.5mg/mL，TPP/乙酸溶液pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL，重组载体pCAGGS-F溶液浓度为500ng/μL。

MgSO₄溶液浓度对纳米颗粒的影响见图4C。

实施例5

方法同实施例2，其中，步骤(2)中壳聚糖/乙酸溶液pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL，MgSO₄/乙酸溶液pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL，TPP/乙酸溶液pH为6.0、TPP浓度分别为0.5、1、1.5mg/mL，重组载体pCAGGS-F溶液浓度为500ng/μL。

TPP溶液浓度对纳米颗粒的影响见图4D。

实施例6

(1)称取0.5g壳聚糖粉末加入到装有50mL体积分数为1％乙酸溶液的锥形瓶中，1200rpm磁力搅拌搅拌24h；然后将溶液置于4℃、4000g离心5min，取上清液并通过0.45μm过滤器过滤，得到壳聚糖浓度为10mg/mL的壳聚糖/乙酸母液，进一步稀释，得到pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液；同样方法得到pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液和pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液；

(2)将5mL pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液加入至锥形瓶中，600rpm磁力搅拌5min；往瓶中逐滴加入2mL浓度为500ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液；600rpm继续磁力搅拌3min；再加入1mL pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，900rpm磁力搅拌搅拌5min；最后加入2mL pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液，1000rpm磁力搅拌40min；

(3)搅拌反应后，将反应液分装2mL EP管中，4℃、18000g离心30min，弃上清，收集沉淀；

(4)在步骤(3)制得的沉淀中加入高压灭菌后预冷至4℃的ddH₂O，吹打震荡混匀，超声破碎15min(温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s)，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

(5)新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗，该纳米颗粒表面没有明显的空隙，呈良好规则的圆形(图1)，具有良好的分散性，且没有聚集和沉降损伤，平均粒径为240.8±7.4nm(图2)，Zeta电位为25.0±1.5mV，纳米颗粒的包封率为92.3±0.56％。

实施例7

(1)同实施例6；

(2)将5mL pH为4.5、壳聚糖浓度为1.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液加入至锥形瓶中，900rpm磁力搅拌10min；往瓶中逐滴加入2mL浓度为750ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液；900pm继续磁力搅拌5min；再加入1mL pH为4.5、MgSO₄浓度为1.5mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，600rpm磁力搅拌搅拌3min；最后加入2mL pH为4.5、TPP浓度为1.5mg/mL的TPP/乙酸溶液，700rpm磁力搅拌30min；

(3)同实施例6；

(4)在步骤(3)制得的沉淀中加入高压灭菌后预冷至0℃的ddH₂O，吹打震荡混匀，超声破碎15min(温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s)，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

(5)新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。

实施例8

(1)同实施例6；

(2)将5mL pH为6.5、壳聚糖浓度为0.5mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液加入至锥形瓶中，800rpm磁力搅拌8min；往瓶中逐滴加入2mL浓度为250ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液；800rpm继续磁力搅拌4min；再加入1mL pH为6.5、MgSO₄浓度为0.5mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，800rpm磁力搅拌搅拌4min；最后加入2mL pH为6.5、TPP浓度为0.5mg/mL的TPP/乙酸溶液，900rpm磁力搅拌35min；

(3)同实施例6；

(4)在步骤(3)制得的沉淀中加入高压灭菌后预冷至2℃的ddH₂O，吹打震荡混匀，超声破碎15min(温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s)，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

(5)新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗。

对比实施例

(1)参照实施例6，得到pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液、pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液和pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液；

(2)将5mL pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液加入至锥形瓶中，600rpm磁力搅拌5min；再加入1mL pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，900rpm磁力搅拌搅拌5min；最后加入2mL pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液，1000rpm磁力搅拌40min；

(3)搅拌反应后，将反应液分装2mL EP管中，4℃、18000g离心30min，弃上清，收集沉淀；

(4)在步骤(3)制得的沉淀中加入高压灭菌后预冷至4℃的ddH₂O，吹打震荡混匀，超声破碎15min(温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0s)，得到壳聚糖-TPP纳米粒溶液；

(5)壳聚糖-TPP纳米粒溶液冻干处理，最后冻干处理，得到壳聚糖-TPP纳米粒。

效果实施例

(1)间接免疫荧光(IFA)试验检测新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的体外表达

实验分组：第一组为质粒pCAGGS-F(2μg)转染组；第二组为新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗组(实施例6制得，含2μg重组载体pCAGGS-F)；第三组为壳聚糖-TPP纳米粒组(无质粒)，作为阴性对照；第四组为空白对照组。转染前16h，将DF-1细胞(市购)铺在具有适当密度的6孔板中生长，在39℃，5％CO ₂培养箱中培养。当细胞长到80％左右用于做转染试验。弃去培养基，细胞用(无抗生素和血清)DMEM洗涤两次。按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行：1)将100μL Opti-MEM与6μL Lipofectamine 2000轻轻吹打混匀；2)分别将100μLOpti-MEM与4μL浓度为500ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液(含重组载体pCAGGS-F 2μg)、实施例6制得的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗(含重组载体pCAGGS-F 2μg)以及对比实施例制得的壳聚糖-TPP纳米粒轻轻吹打混匀；3)各室温孵育5min；最后两管溶液混匀室温孵育5min，制备成DNA预混液，加至细胞中，再补DMEM至1mL。同时设空白细胞作空白对照组。将细胞板置于CO₂浓度为5％的39℃培养箱中培养，6h后换液，48h后分析转染细胞。

先把细胞板(6孔板)的营养液弃去，将500μL PBS加入到细胞板中，置于摇床(80r/min)摇5min，弃液，重复3次；然后将200μL 4％(体积分数)的多聚甲醛加入到细胞板中，室温固定15min，弃液；继续加入500μL PBST，置于摇床(80r/min)摇5min，弃液，重复3次；加入200μL 0.1％(体积分数)的曲拉通，通透20min，弃液；继续加入500μL PBST，置于摇床(80r/min)摇5min，弃液，重复3次；加入500μL 5％(体积分数)脱脂奶粉封闭1h，然后加入500μLPBST，置于摇床(80r/min)摇5min，弃液，重复3次；用PBS将兔抗鸡新城疫F蛋白多克隆抗体(敖艳华,陈晓春,廖明,et al.新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达[J].中国兽医科学,2008,38(5).)血清稀释到1:100，滴加在6孔板中，每孔500μL，37℃作用1h。加入500μLPBST，置于摇床(80r/min)摇5min，弃液，重复3次；取FITC标记的羊抗兔荧光抗体(购自Bioss公司)用PBS 1:5000稀释，每孔500μL，37℃作用30min，之后用PBS洗涤3次，于荧光显微镜下观察。

试验结果可以看出质粒pCAGGS-F(第一组)和新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗(第二组)均检测到荧光，表明了检测到目的蛋白的表达，而壳聚糖-TPP纳米粒(第三组)以及空白对照组(第四组)均没有检测到荧光。

(2)为确定新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的免疫原性和疫苗保护效果，取50只2周龄SPF鸡(广东省新兴大华农禽蛋有限公司提供)，共分为5组，每组10只。试验组I：对照组，每只后腿肌肉多点注射200μL PBS溶液；试验组II：每只点眼滴鼻免疫200μL壳聚糖-TPP纳米粒溶液(壳聚糖、TPP含量与试验组IV相同)；试验组III：每只后腿肌肉多点注射200μL重组载体pCAGGS-F溶液(含重组载体pCAGGS-F100μg)；试验组IV：每只于后腿多点肌肉注射200μL，含新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗(含重组载体pCAGGS-F100μg)；试验组V：每只点眼滴鼻免疫200μL，新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗(含重组载体pCAGGS-F100μg)；一免后每周采集血清，检测中和抗体水平；二免后两周用10³EID₅₀的F基因同源病毒(rGM)对所有鸡以点眼滴鼻方式攻毒，攻毒后14d内每天观察试验鸡的发病情况，统计死亡鸡只和记录发病鸡的情况；攻毒后第3、5、7和9d分别采集试验组和对照组每只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，置于-20℃冰箱中保存，用9～11d SPF鸡胚测定病毒效价，检测排毒情况。

实验分组情况：

结果表明：第V组在一免后一周IgG抗体仍然处于一个较低水平，二免后两周抗体达到较高水平，与其他免疫组、阴性对照组有差异(图6和图7)。

攻毒保护试验中，试验组I、II的鸡在攻毒后第7d已经全部死亡，试验组III只有40％的保护率，而试验组IV保护率为70％，试验组V为保护率100％(图5)，表明了该疫苗点眼滴鼻能给免疫动物提供较好的保护。

(3)间接ELISA法测定新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗免疫鸡的血清、泪液、胆汁、气管液IgA

步骤(2)中一免后每周采集血清、泪液、胆汁、气管液，先将血清稀释100倍，然后按以下步骤进行：1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条(96孔板)，剩余板条用自封袋密封放回4℃；2)设置阴、阳性对照孔和样品孔，阴、阳性对照孔中加入阴性对照，阳性对照各50μL；(3)待测样品孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；4)随后阴、阳性对照孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗原(鸡新城疫病毒IgA抗体(NDV-IgA)酶联免疫吸附测定试剂盒，购自江莱公司)100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或者恒温箱温育60min；5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静止1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长下测定OD₄₅₀值。绘制IgA标准梯度标准曲线，计算各样本浓度。同样方法检测泪液、胆汁、气管液IgA。

结果表明：免疫后I组跟II组每周IgA抗体含量差距不大，但第III、IV、V组在免疫后14d，IgA的含量上升得较快与I、II组有显著性差异。期间第V组在免疫后的7～28d，IgA的含量都逐步上升，且在28d达到了一个小高峰(图8)。

结合图6、7、8，SPF鸡体内免疫实验结果表明，新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗点眼滴鼻免疫比裸质粒肌肉注射免疫更好地产生高水平的IgG、IgA，说明纳米颗粒黏膜免疫系统不仅在黏膜局部产生免疫应答还引起全身性的体液免疫和细胞免疫，同时还提高了抗体滴度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗及制备及应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6378

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> rGM F基因片段的核苷酸序列

<400> 1

gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc 420

atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca 480

gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg 540

gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt 600

tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc 660

gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc 720

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 780

gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 840

ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg 900

tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 960

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc 1020

ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg 1080

tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc 1140

cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc 1200

gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg 1260

ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct 1320

gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1380

gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc 1440

tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt 1500

cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg 1560

acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1620

gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1680

acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcgccacc atgggcttca 1740

aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg ctgatattga 1800

gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca ggaattgtag 1860

taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca atcatagtca 1920

agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca ttagaggcat 1980

ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc aagatccaag 2040

ggtctgtgtc catgtctgga ggaaggagac aaaaacgctt tataggtgct gttattggca 2100

gtgtagctct tggggttgca acagcggccc agataacagc agctgcggcc ctaatacaag 2160

ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc ttaaggagag cattgccgca accaatgaag 2220

ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg aagatgcagc 2280

agtttgtcaa tgaccagttt aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata aaaatcacac 2340

aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta ttcgggccac 2400

agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat ttagctggtg 2460

gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc agctcattaa 2520

ttggtagcgg cctgatcact ggttatccta tactgtatga ctcacatact caactcttgg 2580

gcatacaagt aaacctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc acctatttgg 2640

agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg aaagtagtga 2700

cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag tccgatctgg 2760

atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttat tcctgtttga 2820

gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg tgcactcact gcgccatata 2880

tggcccttaa aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgtaga tgtacagacc 2940

ctcctggtat catatcgcaa aattatggag aagctgtatc cctgatagat agacattcat 3000

gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcaa tggggaattt gatgcaactt 3060

atcaaaagaa catctcaata ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat cttgatatat 3120

caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg ttggcagaaa 3180

gcaacagcaa gctagaaaaa gtcgatgtca gactaactag cacatctgct ctcattacct 3240

atattgttct aactgtcatt tctctaattt tcggtgcact tagtctggtt ttagcgtgtt 3300

acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg aataataccc 3360

tcgatcagat gagagccact acaagagcat gagctagcag atctttttcc ctctgccaaa 3420

aattatgggg acatcatgaa gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt 3480

attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg 3540

agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag tatttggttt agagtttggc aacatatgcc 3600

atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc 3660

ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa agccttgact tgaggttaga ttttttttat 3720

attttgtttt gtgttatttt tttctttaac atccctaaaa ttttccttac atgttttact 3780

agccagattt ttcctcctct cctgactact cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg 3840

aagatccctc gacctgcagc ccaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt 3900

gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag 3960

cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 4020

tccagtcggg aaacctgtcg tgccagcgga tccgcatctc aattagtcag caaccatagt 4080

cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 4140

ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 4200

attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctaacttg 4260

tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 4320

gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 4380

gtctggatcc gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 4440

ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 4500

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 4560

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 4620

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 4680

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 4740

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 4800

cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 4860

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 4920

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 4980

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 5040

ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 5100

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 5160

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5220

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5280

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 5340

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5400

tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5460

ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5520

taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 5580

gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 5640

gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 5700

ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 5760

aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 5820

gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 5880

cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 5940

actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 6000

caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 6060

gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 6120

ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6180

caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 6240

tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6300

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6360

cccgaaaagt gccacctg 6378

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物rGM F-F

<400> 2

cggaattcgc caccatgggc ttcaaacctt ctacc 35

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物rGM F-R

<400> 3

cggctagctc atgctcttgt agtggctct 29

Claims (5)

1.一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将pH为6.0、壳聚糖浓度为1mg/mL的壳聚糖/乙酸溶液600～900rpm磁力搅拌5～10min；然后逐滴加入浓度为500ng/μL的重组载体pCAGGS-F溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；再加入pH为6.0、MgSO₄浓度为1mg/mL的MgSO₄/乙酸溶液，600～900rpm磁力搅拌3～5min；最后加入pH为6.0、TPP浓度为1mg/mL的TPP/乙酸溶液，700～1000rpm磁力搅拌30～40min；

（2）搅拌反应后，4℃离心，弃上清，收集沉淀；

（3）采用预冷的ddH₂O重悬沉淀，混匀，超声破碎，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液；

（4）新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗溶液冻干处理，得到新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗；

步骤（1）中所述的壳聚糖、重组载体pCAGGS-F、MgSO₄、TPP的质量比为5:1:1:2；

步骤（1）中所述的重组载体pCAGGS-F的制备方法为：

1）根据新城疫病毒F基因，设计扩增引物，然后以新城疫病毒rGM株cDNA为模板进行PCR扩增，得到F基因片段；所述的扩增引物为rGM F-F和rGM F-R，其核苷酸序列为：

rGM F-F：CGGAATTCGCCACCATGGGCTTCAAACCTTCTACC；

rGM F-R：CGGCTAGCTCATGCTCTTGTAGTGGCTCT；

2）用限制性内切酶EcoR I和Nhe I将F基因片段、载体pCAGGS进行双酶切后再连接，得到重组载体pCAGGS-F。

2.根据权利要求1所述的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的离心的条件为18000g离心30min。

3.根据权利要求1所述的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的超声破碎的条件为温度26℃，200W，超声3.0s，间隙5.0 s。

4.一种新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗，其特征在于通过权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到。

5.权利要求4所述的新城疫基因VII型DNA纳米颗粒疫苗在制备新城疫防治产品中的应用。

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