CN108421035A - 一种基于壳聚糖的纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供了一种基于壳聚糖的纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用。该纳米颗粒通过快速纳米络合的方法制备，其可实现对抗原和疫苗佐剂的高效共包裹。该纳米疫苗以蛋白抗原，CpG作为疫苗佐剂；在老年和年轻机体疾病模型中，该疫苗均可诱导强烈的抗原特异性的体液和细胞免疫应答，并形成记忆性免疫应答，展现出优良的癌症预防效果。所述纳米疫苗易于制备、成份可控、可大批量连续生产。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种基于壳聚糖的纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
癌症已经成为严重威胁人类健康的疾病，在癌症预防和治疗领域，疫苗已经展现出来极大的希望。随着免疫学的不断深入研究、日益成熟的基因工程技术以及合成技术的飞速发展，人类已研制出多种DNA重组疫苗、短肽疫苗等新型疫苗。这些新兴的疫苗虽然有很多优点，例如易于合成、提纯、抗原特异性强，但其较弱的免疫原性却成为其致命的缺点，导致其不能诱发强有力的免疫反应，限制了其在临床上的使用。在实际应用中，其往往需用免疫佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的特异性应答；但这些疫苗佐剂存在毒副作用大，体内易降解等缺点。由于癌症的年轻化趋势以及老年群体对癌症的易感性，提高年轻机体和老年机体的免疫应答尤为重要。然而，目前的疫苗尚不能诱导有效的免疫应答来对抗癌症，尤其是在老年机体中。
生物材料已经被用来提高其安全性和效率，如乳液、水凝胶和微粒，但这些材料均容易引起机体发生T细胞的免疫耐受和耗竭。然而，纳米颗粒作为抗原和疫苗佐剂的载体可靶向输送疫苗至特定组织，如淋巴结；延缓抗原和佐剂的降解；降低佐剂的毒副作用。壳聚糖是带正电的天然多糖，自然界含量丰富，生物相容性良好，价格便宜。基于壳聚糖的纳米颗粒制备可在水相中通过正负电交联的方式完成，并实现对生物制剂的高效包载以及高效地保留生物制剂的生物活性。因此，我们利用快速纳米络合技术制备基于壳聚糖的纳米疫苗。
发明内容
本发明为了克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种负载蛋白抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒。
本发明的第二个目的是提供一种负载抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒的制备方法。
本发明的第三个目的是提供所述负载蛋白抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒的应用。
一种负载蛋白抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒，为利用带正电荷的平均分子量90 K的壳聚糖，与带负电的三聚磷酸钠交联包裹抗原和疫苗佐剂形成纳米颗粒。
本发明纳米颗粒中的壳聚糖在pH = 5.3条件下具有良好的水溶性，可与不同质量比的三聚磷酸钠交联形成纳米颗粒；而CpG作为疫苗佐剂可诱导机体产生Th1型免疫应答，其在抗癌方面发挥关键作用；（鸡卵清白蛋白）OVA作为一种模式蛋白。
优选地，所述壳聚糖的平均分子量为50 kDa～90 kDa（优选为90 kDa），其可与三聚磷酸钠交联形成稳定的纳米颗粒。
优选地，所述纳米疫苗的粒径为50～200 nm（优选为60 nm）。
优选地，所述纳米疫苗的PDI为0.1～0.2。
优选地，所述纳米疫苗的电位为-5 mV～-30 mV。
优选地，所述纳米疫苗的载药量为10%-30%。
优选地，所述纳米疫苗还包含药学上可接受的赋形剂。
优选地，所述纳米疫苗为冻干制剂。
本发明负载抗原和疫苗佐剂具有靶向淋巴结的功能，提高了疫苗在淋巴结内的富集，提高了疫苗被抗原呈递细胞的摄取，提高了年轻和老年机体的抗原特异性的体液和细胞免疫应答，以及记忆性免疫应答，在癌症预防的应用中展现出了良好的效果。
因此，本发明还请求保护所述纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤纳米疫苗制剂，包含上述任一所述的负载抗原和佐剂的纳米颗粒。
本发明采用FNC技术在多入口涡流混合器中来制备负载胰岛素纳米颗粒，所述多入口涡流混合器包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体；第一部件设置有多个通道（优选为4个，分别为通道1，通道2，通道3，通道4），第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道；第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通；第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通；第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通；具有高通量，可控性强的特点，制得的纳米颗粒分布均匀且粒径较小，批次间差异小；上述技术及装置记载在本发明人前期申请号为PCT/US2017/014080的专利中。
一种制备负基于壳聚糖的抗癌纳米疫苗的方法，包括如下步骤：
S1. 将壳聚糖溶液通过通道1，抗原溶液通过通道2，疫苗佐剂溶液通过通道3，三聚磷酸钠溶液通过通道4到达涡流混合区域中混合，得到负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗；四个通道液体匀速流动，流速为2 mL/min～50 mL/min；（优选为5 mL/min～50 mL/min，更优选为20 mL/min）；
S2. 通过改变壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比，从7:1到2:1（优选为5:1），从而改变纳米疫苗的尺寸；
优选地，所述的壳聚糖溶液的pH为2.0～6.0（优选5.3）；具体为将壳聚糖溶解于pH = 2的HCl溶液中，后用NaOH溶液将pH值调至5.3。
优选地，所述纳米疫苗的最终pH为5.0～8.0（优选6.5），用NaOH溶液将pH值调至6.5。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述纳米颗粒具有较高包封率和/或载药量且具有靶向淋巴结的功能，提高了生物制剂的安全性，提高了疫苗在淋巴结内的富集以及抗原提呈细胞的摄取，提高了年轻和老年机体的抗原特异性的体液和细胞免疫应答，以及记忆性面应答，在癌症预防的应用中展现出了良好的效果。
附图说明
图1为纳米颗粒疫苗NP (OVA)、NP (OVA CpG)的粒径分布和透射电镜图。
图2为OVA、Alum-OVA、CpG-OVA、纳米疫苗 NP (OVA)、NP (OVA CpG)引发免疫反应的抗体滴度。
图3为纳米疫苗CpG-OVA、NP (OVA CpG)靶向淋巴结的荧光强度;
图4为淋巴结内树突状细胞摄取纳米疫苗CpG-OVA、NP (OVA CpG)的百分比。
图5为OVA、Alum-OVA、CpG-OVA、纳米疫苗NP (OVA)、NP (OVA CpG)在年轻小鼠肿瘤预防效果。
图6为OVA、Alum-OVA、CpG-OVA、纳米疫苗NP (OVA)、NP (OVA CpG)在老年小鼠肿瘤预防效果。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。
以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。
以下实施例中所涉及制剂来源如下：
培养基，RMPI 1640，购自赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific），无菌；
胎牛血清，购自赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific），无菌；
三聚磷酸钠（以下用TPP表示），购自西格马奥德里奇公司（Sigma-Aldrich），纯度99%；壳聚糖购自Novamatrix公司；
无内毒素的鸡卵清蛋白（以下简称OVA蛋白）和疫苗佐剂CpG购自InvivoGen公司，纯度99%；
铝佐剂购自赛默飞世尔科技（ThermoFisher Scientific），纯度99%；
癌细胞EG7购自上海歌凡生物，并按以下步骤培养：
1) 把水浴锅提前升温至37℃，将培养基（RPMI 1640）、胎牛血清等放入水浴锅预热，并且同时打开超净台紫外灯照射半小时；
2) 从液氮罐中取出冻存的癌细胞EG7，迅速放置在37℃的水浴锅中使细胞解冻，之后迅速转移到超净台里进行如下操作：把含细胞的溶液用移液器小心地转移到含有培养基的离心管中，离心5分钟，去上清，用含有10%胎牛血清的培养基重悬，转移到含有10%胎牛血清的培养基的培养皿中，然后放入37℃培养箱中培养；
3) 第二天观察细胞状态，待细胞状态良好后，传一代以后进行下面的实验；
4) 收集细胞培养液，吸入到离心管中，1000 rpm转速下离心4 min，之后弃掉溶液，加入新鲜的培养基用枪吹打均匀，用细胞计数板计数为1×107个每毫升。
其余试剂均为市售分析纯试剂。
所述OVA蛋白溶液为自制，将OVA蛋白溶于无热源的超纯水纯水（pH=7.0）得到5mg/mL的OVA蛋白溶液；所述CpG溶液为自制，将CpG蛋白溶于无热源的超纯水纯水（pH=7.0）得到1 mg/mL的CpG溶液。
实施例1 利用FNC技术制备纳米颗粒
FNC技术为一种水相中通过静电相互作用制备载药纳米颗粒的技术（记载在本发明人前期申请号为PCT/US2017/014080的专利中），制备过程主要在多入口涡流混合器中进行，具有高通量，可控性强的特点，制得的纳米颗粒分布均匀且粒径较小，批次间差异小。由于整个过程中无有机溶剂的参与，特别适合于蛋白、核酸等生物大分子的制剂化。所述多入口涡流混合器包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体；第一部件设置有多个通道（优选为4个，分别为通道1，通道2，通道3，通道4），第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道；第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通；第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通；第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通。
1、负载抗原的纳米疫苗的制备
将壳聚糖溶液通过通道1，抗原溶液通过通道2，水溶液通过通道3，三聚磷酸钠溶液通过通道4到达涡流混合区域中混合，得到负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗；四个通道液体匀速流动，流速为2 mL/min～50 mL/min；（优选为5 mL/min～50 mL/min，更优选为20 mL/min）；四个通道流速一致，调节通道流速，2 mL/min，5 mL/min，10 mL/min，20 mL/min，30mL/min，40 mL/min，50 mL/min，使四种溶液通过四个通道到达涡流混合区进行混合，得到负载抗原的纳米疫苗（NP (OVA)）。
2、负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗的制备
将壳聚糖溶液通过通道1，抗原溶液通过通道2，疫苗佐剂溶液通过通道3，三聚磷酸钠溶液通过通道4到达涡流混合区域中混合，得到负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗；四个通道液体匀速流动，流速为2 mL/min～50 mL/min；（优选为5 mL/min～50 mL/min，更优选为20mL/min）；四个通道流速一致，调节通道流速，2 mL/min，5 mL/min，10 mL/min，20 mL/min，30 mL/min，40 mL/min，50 mL/min，使四种溶液通过四个通道到达涡流混合区进行混合，得到负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗（NP (OVA CpG)）。
实施例2 粒径、电位和形态表征
利用马尔文粒径仪测量颗粒的粒径、多分散性指数以及表面电位。利用透射电镜表征颗粒的形态。如图1所示。
实施例3 靶向淋巴结以及淋巴结内树突细胞的摄取
取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0小时，制备实施例2、对比制备例3中制得的疫苗分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
24小时后，通过活体成像评估疫苗在淋巴结内富集的情况。如图2所示。
24小时后，通过流式细胞术评估淋巴结内树突细胞对疫苗摄取的情况。如图3所示。
NP (OVA CpG)在淋巴结内的募集最强，且更多的被树突细胞摄取。
实施例4 免疫学评价
免疫实施例1
（1）小鼠第一次免疫
取6-8周的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2、对比制备例3中制得的疫苗分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
（2）小鼠第二次免疫
在第14天的时间点，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2、对比制备例3中制得的疫苗分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
（3）抗体滴度的测量
在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用Elisa的方法进行相应抗体滴度的测量。结果如图4所示。NP (OVA CpG)诱导机体产生了更强的抗体滴度。
（4）小鼠肿瘤抑制实验
在第49天用癌细胞接种小鼠右侧肋部，接种量2×106个细胞每只老鼠，随着肿瘤生长，在小鼠背部出现肉眼可见的肿瘤，定期测试肿瘤大小，以此评价肿瘤抑制效果。测试方法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长（最长径）和宽（垂直于最长径方向的宽度），肿瘤体积按照公式【长×宽×（长+宽）/2】计算。结果如图5所示。NP (OVA CpG)具有更好的肿瘤抑制效果。
免疫实施例2
（1）小鼠第一次免疫
取18 -24个月的小鼠，以第一次注射时间记为0天，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2、对比制备例3中制得的疫苗分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
（2）小鼠第二次免疫
在第14天的时间点，取制备实施例1、制备实施例2、对比制备例1、对比制备例2、对比制备例3中制得的疫苗分别以每只老鼠100微升的剂量在小鼠腹股沟处进行皮下注射。
（3）抗体滴度的测量
在第21天的时候取小鼠血清，使用BioTek酶标仪，用Elisa的方法进行相应抗体滴度的测量。结果显示，NP (OVA CpG)相比于CpG-OVA，诱导机体产生了更多的抗体。
（4）小鼠肿瘤抑制实验
在第49天用癌细胞接种小鼠右侧肋部，接种量2×106个细胞每只老鼠，随着肿瘤生长，在小鼠背部出现肉眼可见的肿瘤，定期测试肿瘤大小，以此评价肿瘤抑制效果。测试方法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长（最长径）和宽（垂直于最长径方向的宽度），肿瘤体积按照公式【长×宽×（长+宽）/2】计算。结果如图6所示。NP (OVA CpG) 相比于CpG-OVA更快的消除了肿瘤。
对比制备例1
取5 mg/mL的OVA蛋白溶液20微升，用无热源的超纯水溶液（pH=7.0）定容至1000微升，得到不含佐剂的蛋白疫苗OVA（最终OVA蛋白浓度为0.1 mg/mL）。
对比制备例2
（1）取40 mg/mL 的铝佐剂62.5微升，用无热源的超纯水溶液（pH=7.0）定容至500微升，得到铝佐剂分散液。
（2）取5 mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（1）中制得的铝佐剂分散液，用无热源的超纯水溶液（pH=7.0）定容于1000微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的蛋白疫苗Alum-OVA（最终铝佐剂的浓度为2.5 mg/mL, OVA蛋白浓度为0.1 mg/mL）。
对比制备例3
（1）取1 mg/mL 的CpG 40微升，用无热源的超纯水溶液（pH=7.0）定容至500微升，得到CpG溶液。
（2）取5 mg/mL的OVA蛋白溶液20微升加入到（1）中制得的CpG溶液，用无热源的超纯水溶液（pH=7.0）定容于1000微升，进行物理混合，得到的混合物为含铝佐剂的蛋白疫苗CpG-OVA（最终铝佐剂的浓度为0.04 mg/mL, OVA蛋白浓度为0.1 mg/mL）。
Claims (7)
1.一种负载蛋白抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒，其特征在于，利用带正电荷的平均分子量90 K的壳聚糖，与带负电的三聚磷酸钠交联包裹抗原和疫苗佐剂形成纳米颗粒。
2. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述壳聚糖的平均分子量为50 kDa～90 kDa。
3. 根据权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为50～200 nm。
4.权利要求1～3任一项所述的纳米颗粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.一种抗肿瘤纳米疫苗制剂，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的负载抗原和佐剂的纳米颗粒。
6.一种负载抗原和疫苗佐剂的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将壳聚糖溶液通过通道1，抗原溶液通过通道2，疫苗佐剂溶液通过通道3，三聚磷酸钠溶液通过通道4到达涡流混合区域中混合，得到负载抗原和疫苗佐剂的纳米疫苗；四个通道液体匀速流动，流速为2 mL/min～50 mL/min；
S2.通过改变壳聚糖和三聚磷酸钠的质量比，从7:1到2:1，从而改变纳米疫苗的尺寸。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其特征在于，所述壳聚糖的浓度为0.2～3mg/mL，抗原溶液浓度为0.5～3mg/mL，疫苗佐剂的浓度为0.05～0.3mg/mL。
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