CN110025777B - 一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，制备方法为：（1）获得负载有抗原的纳米颗粒，纳米颗粒可以是氧化硅、PLGA、聚苯乙烯球、磁性四氧化三铁等，不同的纳米颗粒，抗原的负载方法不同；（2）将负载抗原的纳米颗粒分散到NaCO3水溶液中，将佐剂溶解到CaCl2水溶液中，将二者混合，离心，洗涤，得到同时包载有抗原和佐剂的微米颗粒疫苗载体。该载体中同时包载有抗原和佐剂，且抗原和佐剂分布于载体的不同位置。本发明制备过程在室温水相下进行，条件温和，保证了抗原和佐剂的活性及载体使用安全性；原料廉价易得，制备工艺简单，抗原负载量高。

Description

一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，属于生物医药及纳微材料制备领域。
背景技术
目前，常见的肿瘤抗原多为蛋白质、多肽和DNA等，在使用过程中安全可靠，但其单独使用时免疫原性较弱，且易被酶降解。通常需要连同佐剂（CpG、R848、PolyI:C）使用或者借助其他手段保护疫苗并刺激免疫应答。商售预防型疫苗常用佐剂为铝佐剂，大量研究结果表明铝佐剂对肿瘤抗原无效。因此，急需开发新型的疫苗载体同时实现佐剂和肿瘤抗原的共负载。
肿瘤疫苗的研究存在的问题是在于难于激发细胞免疫，引发细胞免疫反应首先需要外源性抗原发生溶酶体逃逸至胞质中，并与MHC I作用表达于树突状细胞表面。溶酶体呈酸性，一般认为具有pH响应性的载体具有溶酶体逃逸的能力。因此，我们采用具有pH响应性的碳酸钙微米颗粒包裹负载有抗原的纳米颗粒作为载体，碳酸钙实现溶酶体逃逸的功能，将载有抗原的纳米颗粒和佐剂释放出来，佐剂的作用位点是溶酶体酶，肿瘤抗原作用位点是胞质中的MHC I，载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体使得佐剂和抗原分别作用于不同部位，从而更好发挥各自的功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备纳米颗粒；
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载，获得负载有抗原的纳米颗粒；
（3）将上述步骤（2）所述负载有抗原的纳米颗粒加入Na2CO3水溶液，超声使其分散均匀；将佐剂加入到CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌之后静置，离心，超纯水洗涤，得到载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体，该微米颗粒疫苗载体同时含有抗原和佐剂。
进一步，所述的纳米颗粒为氧化硅、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、聚苯乙烯球或者磁性四氧化三铁中的一种，所述的纳米颗粒的粒径小于500 nm。
进一步，所述的抗原为蛋白质抗原（OVA）、多肽抗原GPC-3、多肽抗原Trp2、多肽抗原M27或多肽抗原M30中的一种或几种的组合。
进一步，所述的佐剂为TLR激动剂，所述的TLR激动剂为CpG、R848、PolyI:C中的一种或多种。
进一步，步骤（3）所述加入的负载有抗原的纳米颗粒的量为0.5-200 mg；所述Na2CO3水溶液的加入量为1-10 mL所述Na2CO3水溶液的浓度为0.1-1.0 M；所述佐剂的加入量为0.25-100 mg，所述CaCl2水溶液的加入量为1-10 mL，所述CaCl2水溶液的浓度为0.1-1.0 M。
进一步，所述的载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的为直径5±0.5μm。
进一步，对于所述的不同的纳米颗粒的抗原负载方式不同。
本发明一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法的有益效果：
本发明载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体直径5±0.5μm，纳米颗粒直径小于500nm。肿瘤抗原共价结合于纳米颗粒表面。由于CaCO3具有pH响应性，在酸性条件下（溶酶体）可以降解，从而发生溶酶体逃逸现象。本发明制备过程在室温水相下进行，条件温和，保证了肿瘤疫苗的活性及载体的使用安全性；原料廉价易得，制备工艺简单易行。
附图说明
图1为实施例1所制得的SiO2纳米颗粒的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例2所制得的SiO2纳米颗粒的透射电子显微镜照片；
图3为实施例2所制得的载有SiO2纳米颗粒的微颗粒疫苗的元素能谱图；
图4为实施例3所制得的载有SiO2纳米颗粒的微颗粒疫苗的扫描电子显微镜照片；
图5为实施例4所制得的载有SiO2纳米颗粒的微颗粒疫苗被DC细胞胞吞情况；
图6为实施例5所制得的载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微颗粒疫苗被小鼠树突状细胞（BMDC）的吞噬情况；
图7为实施例5所制得的载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微颗粒疫苗刺激BMDC分泌细胞因子的水平；
图8为实施例6所制得的载有PLGA纳米颗粒的微颗粒疫苗在小鼠体内的淋巴结迁移情况。
具体实施案例
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明：
实施案例一
（1）制备无机介孔氧化硅纳米颗粒：1.0g CTAB，1.0g正丁醇，30.0g 0.4M尿素，12.0 g环己烷在25 ℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入2.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到无机介孔氧化硅纳米颗粒。
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 643324DEST_PATH_IMAGE001
氧化硅纳米颗粒的氨基化：250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，100 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥；
Figure 884950DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入100 mL 2%戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
Figure 160073DEST_PATH_IMAGE003
氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取100 mg氨基化之后的氧化硅纳米颗粒，加入含有25mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将200 mg上述负载了抗原的纳米颗粒加入10 mL，1.0 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将100 mg的CpG加入10 mL，1.0 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌120 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗。
图1为上述实施例1的SiO2纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。由图1中可以看出，所制备的SiO2纳米颗粒形貌规则、粒径均一，直径约为300 nm左右。
实施案例二
（1）制备无机介孔氧化硅纳米颗粒：0.5 g CTAB，0.5 g正丁醇，15.0 g，0.4 M尿素，6.0 g环己烷在25 ℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入1.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70 ℃，搅拌15 h。15 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到无机介孔氧化硅纳米颗粒。
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 334703DEST_PATH_IMAGE001
氧化硅纳米颗粒的氨基化：250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，50 mg氧化硅纳米，50 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥；
Figure 669869DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氧化硅纳米颗粒：50 mg氧化硅纳米颗粒中加入50 mL 2%戊二醛溶液，超声30 min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
Figure 398791DEST_PATH_IMAGE003
氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取50 mg氨基化之后的氧化硅纳米颗粒，加入含有12.5 mg的多肽抗原GPC-3水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将50 mg上述负载了抗原的纳米颗粒加入5 mL，0.33 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将2.5 mg的R848加入5 mL，0.33 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌30 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗。图2为上述实施例2 SiO2纳米颗粒的透射电子显微镜照片。由图2中可以看出，所制备的SiO2纳米颗粒形貌规则、粒径均一，直径约为300 nm左右，孔道呈放射状分布。
图3为上述实施例2 载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗的元素能谱图。由图3中可以看出载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗含有C、O、Si及Ca等元素，其中Si和Ca的存在说明载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗的成功制备。
实施案例三
（1）制备无机介孔氧化硅纳米颗粒：2.0 g CTAB，2.0g正丁醇，60 g，0.4M尿素，24.0 g环己烷在25 ℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入4.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70 ℃，搅拌24 h。24 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧10 h以去除模板，既得到无机介孔氧化硅纳米颗粒。
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 477605DEST_PATH_IMAGE001
氧化硅纳米颗粒的氨基化：250 mL圆底烧瓶中按顺序加入40 mL正己烷，200 mg氧化硅纳米，200 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥；
Figure 382107DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氧化硅纳米颗粒：200 mg氧化硅纳米颗粒中加入200 mL 2%戊二醛溶液，超声30 min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
Figure 153754DEST_PATH_IMAGE003
氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取200 mg氨基化之后的氧化硅纳米颗粒，加入含有50 mg的多肽抗原Trp2水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2 h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将0.5 mg上述负载了抗原的纳米颗粒加入1 mL，0.1 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将0.25 mg的PolyI:C加入1 mL，0.1 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌10 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗。
图4为上述实施例3载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的扫描电子显微镜照片。由图4中可以看出SiO2纳米颗粒成功被碳酸钙微米颗粒负载。
实施案例四
（1）制备无机介孔氧化硅纳米颗粒：2.0 g CTAB，2.0g正丁醇，60 g，0.4M尿素，24.0 g环己烷在25 ℃水浴中缓慢搅拌。然后缓慢滴入4.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70 ℃，搅拌24 h。24 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧10 h以去除模板，既得到无机介孔氧化硅纳米颗粒。
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 104393DEST_PATH_IMAGE001
氧化硅纳米颗粒的氨基化：250 mL圆底烧瓶中按顺序加入40 mL正己烷，200 mg氧化硅纳米，200 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥；
Figure 518056DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氧化硅纳米颗粒：200 mg氧化硅纳米颗粒中加入200 mL 2%戊二醛溶液，超声30 min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
Figure 870540DEST_PATH_IMAGE003
氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取200 mg氨基化之后的氧化硅纳米颗粒，加入含有50 mg的蛋白质抗原OVA水溶液和50 mg的多肽抗原M27水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2 h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将0.5 mg上述负载了抗原的纳米颗粒加入1 mL，0.1 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将0.25 mg的CpG和0.25 mg的R848加入1 mL，0.1 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌10 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗。
图5为上述实施例4载有SiO2纳米颗粒的微米颗粒疫苗被DC细胞胞吞情况，该疫苗同时含有两种抗原OVA和M27，同时含有两种TLR佐剂CpG和R848，由图5中可以看出，该疫苗能够显著提高DC细胞对抗原和佐剂的胞吞量。
实施案例五
（1）制备无机磁性Fe3O4纳米颗粒：将10.8 g的6H2O·FeCl3和3.98g的4H2O·FeCl2溶解于100 ml去离子水中，并倒入250 ml的三颈烧瓶中，一头放置滴液漏斗，一头通氮气保护，中间头机械搅拌，室温通氮气下搅拌30 min。随后，将1.25 mol/L的NaOH水溶液逐滴加入至上述溶液至其溶液pH值为12.0。继续搅拌30 min后，在80 ℃下持续搅拌2 h，之后搅拌下冷却至室温。用磁铁分离并去离子水洗3次，用磁铁分离出磁性Fe3O4纳米颗粒并用去离子水洗涤至中性，即得到磁性Fe3O4纳米颗粒。
（2）将磁性Fe3O4纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 813089DEST_PATH_IMAGE001
磁性Fe3O4纳米颗粒的表面修饰：将多巴胺溶解于50 mM，pH8.5的Tris-HCl水溶液中，多巴胺的浓度为2 mg/mL；将100 mg磁性Fe3O4纳米颗粒分散于此多巴胺溶液中，常温下搅拌4 h，之后离心水洗得到多巴胺表面修饰的磁性Fe3O4纳米颗粒；
Figure 657548DEST_PATH_IMAGE002
磁性Fe3O4纳米颗粒负载抗原：将上述修饰后的磁性Fe3O4纳米颗粒重悬于10 mL的水溶液中，随后加入含有50 mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2 h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将50 mg上述负载了抗原的磁性Fe3O4纳米颗粒加入10 mL，0.33 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将2.5 mg的CpG加入10 mL，0.33 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌30 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗。
用绿色荧光染料标记OVA，按照实施方案四的方法制备载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗。将从小鼠股骨和胫骨提取出来的BMDC细胞培养至第六天，收集铺入24孔板，106个细胞/孔，贴壁2h后，在不同孔中加入一定量游离的OVA和含有等量OVA的载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗，孵育一定的时间，收集细胞，流式检测，BMDC的刺激效果如图6所示。从图6可以看出，载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗刺激BMDC表面共刺激信号分子表达情况。载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗能有效的刺激BMDC表面表达共刺激信号分子（CD40, CD80, CD86），说明该疫苗能有效的促进BMDC的成熟。此外，该疫苗颗粒还能提高BMDC表面MHC II、MHC I以及SII的表达，说明该疫苗能够促进抗原的提呈及交叉提呈。
用近红外染料Cy7标记OVA，按照实施方案五的方法制备载有PLGA纳米颗粒的微米颗粒疫苗，该疫苗负载有Cy7标记的蛋白质抗原OVA。在小鼠尾根部注射一定量游离的OVA和含有等量OVA的载有PLGA纳米颗粒的微米颗粒疫，间隔一定时间用小动物活体成像观察小鼠淋巴结处Cy7的荧光信号，从而判断抗原的淋巴结迁移情况，结果如图7所示。图7为载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗刺激BMDC分泌细胞因子水平。由图7中可以看出载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗刺激BMDC分泌的Th2相关的细胞因子水平（IL-4和IL-10）相比于别的组并没有增加，而Th1相关的细胞因子水平（IL-6，IL-12，IL-1β和TNF-α）相比于别的组显著增加，说明载有磁性Fe3O4纳米颗粒的微米颗粒疫苗能有效的刺激BMDC成熟并促进CD8+和Th1细胞活化。
实施案例六
（1）制备PLGA纳米颗粒：将30 mg的PLGA溶解于1 mL的二氯甲烷中，之后加入100uL的去离子水，超声1 min后得到PLGA初乳；将初乳加入到4 mL， 2%的PVA中超声4 min，之后将颗粒混悬液敞口震荡过夜，使二氯甲烷彻底挥发，12000r/20min离心水洗两次，即得到PLGA纳米颗粒。
（2）将PLGA纳米颗粒对抗原进行负载：
Figure 78165DEST_PATH_IMAGE001
PLGA纳米颗粒的表面修饰：将多巴胺溶解于50 mM，pH8.5的Tris-HCl水溶液中，多巴胺的浓度为2 mg/mL；将100 mg的PLGA纳米颗粒分散于此多巴胺溶液中，常温下搅拌4 h，之后离心水洗得到多巴胺表面修饰的PLGA纳米颗粒；
Figure 550734DEST_PATH_IMAGE002
PLGA纳米颗粒负载抗原：将上述修饰后的PLGA纳米颗粒重悬于10 mL的水溶液中，随后加入含有25 mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2 h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
（3）将50 mg上述负载了抗原的PLGA纳米颗粒加入10 mL，0.33 M的Na2CO3水溶液中，超声使其分散均匀；将2.5 mg的CpG加入10 mL，0.33 M的CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌30 s之后静置离心，超纯水洗涤，得到具备溶酶体逃逸特质的载有PLGA纳米颗粒的微米颗粒疫苗。
图8为上述实施例6载有PLGA纳米颗粒的微米颗粒疫苗（OVA@NM）在小鼠体内的淋巴结迁移情况。由图中可以看出，6h的时候抗原的荧光信号已经迁移到了淋巴结处，第9天的时候游离抗原组的荧光已经消失了，而OVA@PLGA和OVA@NM组的荧光依然存在，说明载有纳米颗粒的微米颗粒载体能迁移至淋巴结处并能很好的保护抗原不被体内酶降解。
上面结合具体实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）制备纳米颗粒；
（2）将纳米颗粒对抗原进行负载，获得负载有抗原的纳米颗粒；
（3）将上述步骤（2）所述负载有抗原的纳米颗粒加入Na2CO3水溶液，超声使其分散均匀；将佐剂加入到CaCl2水溶液中使其充分溶解；将上述两种溶液等体积混合，搅拌之后静置，离心，超纯水洗涤，得到载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体，该微米颗粒疫苗载体同时含有抗原和佐剂；
所述的纳米颗粒为氧化硅、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纳米颗粒、磁性四氧化三铁中的一种，所述的纳米颗粒的粒径小于500 nm；
所述的抗原为蛋白质抗原OVA、多肽抗原GPC-3、多肽抗原Trp2、多肽抗原M27或多肽抗原M30中的一种或几种的组合；
所述的佐剂为TLR激动剂，所述的TLR激动剂为CpG、R848、PolyI:C中的一种或多种；
步骤（3）所述加入的负载有抗原的纳米颗粒的量为0.5-200 mg；所述Na2CO3水溶液的加入量为1-10 mL；所述Na2CO3水溶液的浓度为0.1-1.0 M；所述佐剂的加入量为0.25-100mg，所述CaCl2水溶液的加入量为1-10 mL，所述CaCl2水溶液的浓度为0.1-1.0 M；
所述的载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的直径为5±0.5μm；
对于不同的纳米颗粒的抗原负载方式不同。
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