CN109939229A - 一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用 - Google Patents

一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用。该发明包括以鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基葡聚糖为自组装材料，与CpG寡脱氧核苷酸一起自组装形成的纳米佐剂及由该纳米佐剂与病毒抗原形成的纳米疫苗。纳米佐剂提高了CpG寡脱氧核苷酸的生物利用率，避免其在体内降解，并且使B型CpG增加了A型CpG的功能。纳米疫苗不仅可以诱导TH1型的体液免疫反应，同时还能诱导较强的细胞免疫反应。通过小鼠体内攻毒实验证实纳米疫苗具有很好的保护作用，为今后纳米疫苗的应用提供了帮助。

Description

一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方 法与应用
技术领域
本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种自组装形成的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗，具体涉及以鱼精蛋白硫酸盐和羧甲基葡聚糖为自组装材料，与CpG寡脱氧核苷酸一起自组装形成的纳米佐剂及由该纳米佐剂与病毒抗原形成的纳米疫苗的制备方法与应用。
背景技术
病毒疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗。灭活病毒由完整的病毒组成，人为使其致病性丧失或减弱，但仍保持病毒的全部或部分免疫原性，接种后病毒抗原可以刺激机体产生免疫应答，达到保护作用。由于其存在免疫效果差，不能诱导CTL反应，诱导产生的免疫反应持续时间短，需要多次接种等缺点，需要在免疫的同时加入免疫佐剂。应用于灭活疫苗的佐剂一般为铝佐剂。铝佐剂可以增强初次免疫，减少每次免疫抗原的用量以及免疫次数，但是对于嗣后加强免疫效果较小，且可能发生多种不良反应。弗氏佐剂又分弗氏不完全佐剂和完全弗氏佐剂，是目前动物实验中最常见的佐剂，但易在注射局部形成肉芽肿和持久性溃疡，因此不适用于人体使用。所以寻找一种现有佐剂的免疫增强佐剂显得尤为重要。
CPG ODN(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核苷酸)是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN),可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。它能直接激活B细胞和单核细胞(巨噬细胞和树突状细胞),间接激活NK细胞和T细胞等多种免疫效应细胞,增强其功能和细胞因子的分泌,增强抗原的加工提呈,诱导Th1型免疫应答,产生较强的体液免疫和细胞免疫,增强特异性和非特异性免疫反应。CPG ODN是一种很有前景的免疫佐剂，但是由于其容易在体内聚集、降解，所以它的应用受到了一定的限制。
纳米颗粒的生物学特性之一是容易被多种细胞摄取。由于纳米颗粒在维度上与微生物相当，它们能够更好地被抗原递呈细胞吞噬，把抗原更多地带入到细胞中，从而增强蛋白和多肽引起的免疫响应。纳米颗粒还可以增加小分子抗原的尺寸，并对其表面进行修饰。同时，某些类型的纳米颗粒自身对免疫系统就具有刺激作用。因此，纳米颗粒有可能发展成为一类新型的纳米佐剂。将纳米颗粒作为疫苗的佐剂，一方面可以利用其载体性质来提高抗原递呈细胞对抗原的吞噬能力，另一方面，可以利用其对免疫细胞的作用来触发机体的固有免疫响应，并最终诱导有效的特异性免疫响应。
发明内容
本发明提供一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法。该纳米佐剂可以极大增强疫苗免疫效果，包载病毒抗原后可以减少疫苗的使用量，增加细胞因子的分泌，而且制备方法简单易行，适合大规模生产。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种纳米佐剂，所述的纳米佐剂的自组装材料为羧甲基葡聚糖和鱼精蛋白硫酸盐，在自组装过程中加入CpG寡脱氧核苷酸形成纳米佐剂。本发明提供的纳米佐剂，能够高效率地包载CpG寡脱氧核苷酸，解决CpG寡脱氧核苷酸易在体内降解，生物利用率低的问题。
所述羧甲基葡聚糖为水溶性羧甲基修饰的葡聚糖衍生物，是生物相容
性好、生物可降解和代谢的天然高分子材料，其取代度>50％,分子量为20-110KDa。羧甲基葡聚糖具有良好的生物相容性，同时能够避免血浆中负电性蛋白的吸附，增长体内的循环时间。
所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
所述CpG寡脱氧核苷酸为任意人或鼠特异性CpG寡脱氧核苷酸。
所述鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基葡聚糖的质量比为0.4:1～1:1,优选为0.6:1。
所述羧甲基葡聚糖与CpG寡脱氧核苷酸的质量比为10:1～80:1，优选为80:3。
本发明中，纳米佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)用去离子水制备羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，羧甲基葡聚糖溶液浓度为0.5-3mg/mL，优选为2mg/mL；
(2)用去离子水制备鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，鱼精蛋白硫酸盐溶液浓度为0.3-1.8mg/mL，优选为1.2mg/mL；
(3)将CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中,CpG寡脱氧核苷酸终浓度为0.2-0.0125mg/mL，优选为0.0375mg/mL；
(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，使用磁力搅拌器持续搅拌5-60min，优选为30min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载CpG寡脱氧核苷酸的纳米佐剂。
本发明还提供一种纳米疫苗，所述的纳米疫苗由上述纳米佐剂包裹病毒抗原而成。
所述病毒抗原包括：EV71灭活病毒、甲肝灭活病毒、脊髓灰质炎灭活病毒、流感灭活病毒、HPV病毒样颗粒、乙肝病毒样颗粒和含有以上病毒抗原的重组蛋白。
所述鱼精蛋白硫酸盐与羧甲基葡聚糖的质量比为0.4:1～1:1,优选为0.6:1。
所述羧甲基葡聚糖与CpG寡脱氧核苷酸的质量比为10:1～80:1，优选为80:3。
所述病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸的质量比为1:2～4:1，优选为2:1。
本发明中，纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)用去离子水制备羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，羧甲基葡聚糖溶液浓度为0.5-3mg/mL，优选为2mg/mL；
(2)用去离子水制备鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，鱼精蛋白硫酸盐溶液浓度为0.3-1.8mg/mL，优选为1.2mg/mL；
(3)将病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中,其中，病毒抗原终浓度为0.4-0.025mg/mL，优选为0.075mg/mL；CpG寡脱氧核苷酸终浓度为0.2-0.0125mg/mL，优选为0.0375mg/mL；
(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，使用磁力搅拌器持续搅拌5-60min，优选为30min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸的纳米疫苗。
本发明所用试剂盒原料均市售可得；对于本发明中没有具体描述的装置、条件(温
度、时间等)、物质、用量、方法等，均可采用本领域已知的或本领域技术人员按照常规技术可确定的。
本发明具有下列优点和效果：采用上述方案，即可获得含有纳米佐剂的纳米
疫苗，其中的纳米佐剂具有细胞毒性小，诱导TH1型免疫应答，提高相应抗体与一型和二型干扰素的分泌水平等优点，极大增强了疫苗的免疫效果。本发明提供的含纳米佐剂的EV71纳米疫苗，与含有CPG佐剂的EV71疫苗相比，大大增强了CPG的生物利用率，具有免疫反应持续性强，免疫效果好，细胞因子分泌增加等优点；与使用不完全弗氏佐剂并含CPG佐剂的疫苗相比，具有对CPG更好的递送效果，增强TH1型免疫反应，延长疫苗释放时间，增强疫苗靶向性，提高疫苗保护效果等优点。
附图说明
图1是实施例1中，EV71纳米疫苗的组成材料及结构示意图。
图2是实施例1中，EV71纳米疫苗的表征，其中A为EV71灭活病毒电镜照片，B为EV71纳米疫苗电镜照片，C为EV71灭活病毒与EV71纳米疫苗的粒径分布，D为EV71纳米疫苗的体外释放曲线。
图3是实施例2中，用实施例1中的EV71纳米疫苗和各组疫苗免疫小鼠后，小鼠体内抗体水平的变化，其中A为EV71特异性抗体滴度变化，B为抗体IgG2a亚型滴度变化，C为抗体IgG1亚型滴度变化，D为IgG2a与IgG1的比值变化。
图4是实施例3中，用实施例1中的EV71纳米疫苗和各组疫苗免疫免疫小鼠后，细胞因子水平的测定，其中A为IFN-α的分泌水平，B为IFN-γ的分泌水平。
图5是实施例4中，实施例2中的得到的各组血清在小鼠体内攻毒实验中对小鼠的存活率的影响结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，本发明包括但不仅限于以下实施例。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例是本发明所公开的纳米佐剂包裹EV71灭活病毒形成EV71纳米疫苗的制备过程。
(a)该制备方法包括以下步骤：
(1)用去离子水制备2mg/mL的羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜；
(2)用去离子水制备1mg/mL的鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜；
(3)将EV71灭活病毒和CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中；
(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，最终鱼精蛋白硫酸盐：羧甲基葡聚糖：EV71灭活病毒：CpG寡脱氧核苷酸的质量比为1.2:2:0.075:0.0375，使用磁力搅拌器持续搅拌30min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载EV71灭活病毒和CpG寡脱氧核苷酸的EV71纳米疫苗。
(b)用Milli-Q超纯水精确制备浓度为0.5mg/mL的纳米疫苗样品溶液。取1mL样品溶液，用激光粒度仪(DLS,英国Malvern,Zetasizer NanoZS)测定纳米粒子水合粒径、多分散指数(Polydispersity，PDI)和表面ζ电位。测定条件：温度25℃，角度90°，激光波长633nm，每次检测前恒温20min，每个样品测试三次，结果取平均值。
(c)用Milli-Q超纯水精确制备浓度为0.05mg/mL的纳米疫苗样品溶液，取10～20μL样品溶液滴加到含有碳支持膜的230目铜网上，恒温干燥；取5μL 1～2％醋酸双氧铀染色5min，滤纸吸干染色液，常温干燥后，用透射电镜(TEM,美国FEI,Tecnai G2 20S-TWIN，200kV)观察样品形态。
(d)体外模拟EV71灭活病毒与CpG从纳米递送系统中的释放过程可测得体外释放曲线。将纳米疫苗分散在2mL的PBS中，将该分散液置于截留分子量为3000Da的透析袋内。将透析袋置于9mL pH＝7.4的硫酸盐缓冲溶液和1mL乙腈的混合溶剂中。整个体系在37℃避光条件下，于摇床上以110rpm的转速孵育。在指定时间内取500μL透析袋外溶液，并补充500μL相应的PBS。用荧光分光光度计分别测试EV71和CpG的浓度，计算各时间点下，纳米疫苗统中EV71和CpG的累积释放速率，画出相应的释放动力学曲线。
EV71纳米疫苗构建示意图见图1，各项检测图谱见图2。其中，图2是实施例1中EV71纳米疫苗的表征，其中A为EV71灭活病毒电镜照片，B为EV71纳米疫苗电镜照片，对比可见，经EV71纳米疫苗与EV71灭活病毒在形态与大小上均有很大差异。C为EV71灭活病毒与EV71纳米疫苗的粒径分布，EV71灭活病毒的平均粒径为30nm，EV71纳米疫苗的平均粒径为230nm。D为EV71纳米疫苗的体外释放曲线，可以看出EV71和CpG在纳米疫苗中具有缓控释放的能力，60h后释放趋于平缓。
实施例2
(a)用实施例1中制备的EV71纳米疫苗(简称ECNP)与纳米自组装载体包裹EV71灭活病毒组(简称ENP)、EV71灭活病毒与CpG寡脱氧核苷酸混合组(简称EC)、EV71灭活病毒与CpG寡脱氧核苷酸用弗氏不完全佐剂混合组(简称ECFA)及PBS溶液组作为阴性对照(简称PBS)分别免疫小鼠，免疫方案如下：
选择BALB/c雌性6-8周龄小鼠作为免疫对象，实验动物分为5组，ECNP组、ENP组、EC佐剂组、EC组、PBS组各8只。
(1)首次免疫(0周)，每针注射体积为100μL。采用皮下方式注射。
(2)加强免疫(2周、4周)，每针注射体积为100μL，浓度为首次免疫的一半。采用皮下方式注射。
(3)通过小鼠眼眶内眦的方式采集实验血清，血清采集的周数为0、2、4、6、
8、10周。
(b)小鼠血清的处理：
(1)血清采集后室温放置2-3h，4℃放置2h，此过程的目的在于使血细胞沉降、血液凝固以便分离血清。
(2)4℃、5 000rpm离心5min，收集血清。
(3)将上一步收集的血清分装至1.5mL无菌离心管中，标明血清样品来源、采血周数、免疫方式及日期，-20℃保存。
(c)小鼠血清抗EV71效价、IgG2a与IgG1分型的检测
(1)以EV71灭活病毒为抗原进行包被，保证每孔蛋白总量为200ng，每孔包被液总体积为100μL。用封口膜封闭板子，4℃包被过夜。
(2)从-20℃冰箱取出血清样品，置于4℃条件下融化。每个血清样品设置复孔2个，每个96孔板中设阴性血清对照复孔4个、空白对照复孔4个。
(3)洗涤：将过夜包被板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μL ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复上一步骤两遍即可。
(4)封闭：每孔中加入200μL的ELISA封闭液(BSA Blocking Buffer)，37℃孵育2h。
(5)洗涤：将已封闭的板中液体吸净并拍干。每孔中加入200μL的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复上一步骤两遍即可。
(6)待测血清、空白样本孵育：将待测血清样本用含10％FBS的PBS缓冲液进行稀释，稀释倍数分别为100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200等。每孔中加入稀释好的待测血清样本100μl。阴性孔中加入阴性血清(PBS组)、空白对照孔中加入等量的稀释液(含10％FBS的PBS)。37℃孵育1h。
(7)洗涤：将板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μL的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复上一步骤两遍即可。
(8)二抗孵育：将酶联二抗用含10％FBS的PBS缓冲液进行稀释，稀释倍数为2 000。每孔中加入稀释好的二抗100μL。37℃孵育1h。
(9)洗涤：将板中的液体吸净并拍干。每孔中加入100μL的ELISA洗涤液，置于摇床1min，吸出孔中的洗涤液并拍干。重复上一步骤两遍即可。
(10)显色：将板中的残余液体吸净并拍干。每孔中加入可溶性单组份TMB底物溶液100μL。37℃条件下静置20min。静置后，每孔中加入ELISA终止液100μL。将96孔酶标板置于酶标仪中，读取OD值。
实验结果如图3，其中A为EV71特异性抗体滴度变化，由此结果可以看出EV71纳米疫苗诱导的抗体水平最高，保护时间最长，表明纳米疫苗有很强的抗体诱导效果，并且优于弗氏佐剂，且有一定的缓释作用。B为抗体IgG2a亚型滴度变化，C为抗体IgG1亚型滴度变化，D为IgG2a与IgG1的比值变化。通过B、C、D的结果可以证明，EV71纳米疫苗诱导小鼠产生了以TH1型为主导的免疫反应，诱导了很高的IgG2a的生成，并且这种效果是与CpG寡脱氧核苷酸的添加相关的，CpG寡脱氧核苷酸的生物利用率越高诱导的TH1型免疫越强。证明EV71纳米疫苗可以很好的保护CpG寡脱氧核苷酸，避免其在药物循环的过程中被降解。
实施例3
(a)取实施例2中，免疫6周后的小鼠血清，用ELISA法测定血清中IFN-α的含量，具体步骤如下：
(1)加样：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔加100μL，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37度室温孵育2小时。
(2)弃去液体，甩干，不用洗涤。
(3)每孔加检测溶液A工作液100μL，酶标板加上覆膜，37度室温孵育1小时。
(4)弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。自动洗板机亦可。
(5)每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。
(6)弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。
(7)每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37度避光显色(反应时间控制在15-25分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。
(8)每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。
(9)在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。
(b)取实施例2中，免疫6周后的小鼠，颈部脱臼处死小鼠，无菌取脾，分离淋巴细胞，计数，将脾淋巴细胞浓度调整至3×106个/ml，100μl/孔种于ELISPOT板，加入刺激肽，1μg/孔，于37℃、5％CO2培养箱中刺激培养40小时后，进行ELISPOT检测。
按照试剂盒说明书要求，稀释捕获抗体，100μl/孔，4℃包被过夜。次日
倾倒包被液，无菌PBS洗涤3遍，再用含10％FBS的1640培养基进行封闭，200μl/孔，室温封闭2小时；弃封闭液，加入脾淋巴细胞，100μl/孔，实验孔加入刺激肽，阴性对照孔中不加刺激物，ConA作为阳性对照，37℃、5％CO2培养箱中刺激培养一段时间；倾倒培养基，以200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴20分钟裂解细胞；用PBST洗板4次，加入检测抗体，100μl/孔，室温避光孵育1小时；PBST洗板4次，加入酶标亲和素，100μl/孔，室温避光孵育1小时；用PBST洗板3次、再用PBS洗板2次，加入底物显色液，100μl/孔，室温下避光显色15～20分钟；去离子水终止色反应，斑点分析仪进行斑点计数。
实验结果如图4所示，其中A为IFN-α的分泌结果，从图中可以看出，EV71纳米疫苗大幅增加了IFN-α的分泌，而IFN-α是一种与抗病毒感染密切相关的细胞因子。理论上将，A型(D型)CpG具有诱导IFN-α分泌的作用，而B型(K型)CpG并不具备此种功能。经过实验的验证，我们证明了本发明中的EV71纳米疫苗在不缺少B型CpG功能的同时，增加了A型CpG的功能。B为IFN-γ的分泌结果，从图中可看出EV71纳米疫苗显著地增强了IFN-γ的分泌，IFN-γ的分泌与诱导细胞免疫的水平密切相关，证明本发明中的EV71纳米疫苗不仅诱导很强的体液免疫反应，同时还诱导了细胞免疫反应。
实施例4
取实施例2中，小鼠免疫8周后的血清做小鼠体内攻毒实验，具体步骤如下
实验动物选择新生BALB/c乳鼠。
(1)1日龄的新生BALB/c乳鼠每窝约为5只，两窝为一组，每组大约9-10只。
(2)实验中病毒选用EV71病毒A亚型BrCr-TR株，病毒扩增后过0.45μm滤膜，测定病毒的滴度TCID50。
(3)将各血清样品与10LD50的EV71病毒BrCr-TR株混匀，4℃孵育过夜。
(4)次日清晨，腹腔注射病毒血清混合液于新生1日龄乳鼠。后续每日进行一次观察，共14天，统计小鼠存活率。
(5)实验观察过程中由于新生乳鼠以母乳为营养源，切记乳鼠与母鼠不可分离饲养。
实验结果如图5，从结果中可知，EV71纳米疫苗具有最好的保护效果，在实验终止时并未有一只小鼠死亡，存活率达到了100％，并且生长状态良好，保护效果优于其他实验组，甚至优于市面上上市的弗氏不完全佐剂，说明EV71纳米疫苗是一种很有前景的抗EV71疫苗。

Claims (10)

1.一种自组装的纳米佐剂，其特征在于，该佐剂包括纳米自组装材料和负载在该纳米材料中的CpG寡脱氧核苷酸。
2.根据权利要求1所述的纳米佐剂，其特征在于，所述的纳米自组装材料为羧甲基葡聚糖和鱼精蛋白硫酸盐，鱼精蛋白硫酸盐：羧甲基葡聚糖的质量比为0.4:1～1:1。
3.根据权利要求2所述的纳米自组装材料，其特征在于，所述的羧甲基葡聚糖取代度>50％,分子量为20-110KDa；所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
4.根据权利要求1所述的纳米佐剂，其特征在于，所述的CpG寡脱氧核苷酸为任意人或鼠特异性CpG寡脱氧核苷酸，所述羧甲基葡聚糖与CpG寡脱氧核苷酸的质量比为10:1～160:1。
5.如权利要求1所述的纳米佐剂，其特征在于经过下列方法制备：
(1)用去离子水制备羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，羧甲基葡聚糖溶液浓度为0.5-3mg/mL；
(2)用去离子水制备鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，鱼精蛋白硫酸盐溶液浓度为0.3-1.8mg/mL；
(3)将CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中,CpG寡脱氧核苷酸终浓度为0.2-0.0125mg/mL；
(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，使用磁力搅拌器持续搅拌5-60min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载CpG寡脱氧核苷酸的纳米佐剂。
6.一种纳米疫苗，所述的纳米疫苗包含有如权利要求1所述纳米佐剂包裹病毒抗原。
7.如权利要求6所述的纳米疫苗，所述病毒抗原包括：灭活病毒或重组蛋白。
8.根据权利要求6所述的纳米疫苗，其特征在于，病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸的质量比为1:2～4:1。
9.制备如权利要求6所述的纳米疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用去离子水制备羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，羧甲基葡聚糖溶液浓度为0.5-3mg/mL；
(2)用去离子水制备鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，鱼精蛋白硫酸盐溶液浓度为0.3-1.8mg/mL；
(3)将病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中,其中，病毒抗原终浓度为0.4-0.025mg/m；CpG寡脱氧核苷酸终浓度为0.2-0.0125mg/mL；
(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，使用磁力搅拌器持续搅拌5-60min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸的纳米疫苗。
10.权利要求1-8中任一项中所述的一种自组装的纳米佐剂或纳米疫苗的用途，其特征在于,用于预防性及治疗性疫苗领域的应用。
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