CN111388663A - 一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111388663A
CN111388663A CN202010116080.2A CN202010116080A CN111388663A CN 111388663 A CN111388663 A CN 111388663A CN 202010116080 A CN202010116080 A CN 202010116080A CN 111388663 A CN111388663 A CN 111388663A
Authority
CN
China
Prior art keywords
flower
silicon oxide
shaped silicon
antigen
particles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010116080.2A
Other languages
English (en)
Inventor
高静
董莹
姜艳军
王晓莉
张闯年
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hebei University of Technology
Original Assignee
Hebei University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hebei University of Technology filed Critical Hebei University of Technology
Publication of CN111388663A publication Critical patent/CN111388663A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/501—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法，包括如下步骤：步骤1、制备花型氧化硅纳米颗粒；步骤2、所述花型氧化硅纳米颗粒氨基化；步骤3、戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；步骤4、制备载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒；步骤5、加入佐剂溶液使得载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒吸附佐剂，得到同时载有抗原和佐剂的花型氧化硅纳米颗粒。本发明合成具有连同孔道结构的花型氧化硅纳米颗粒，将抗原共价连接于氧化硅孔道表面，同时花型氧化硅吸附上佐剂形成纳米疫苗。

Description

一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药及纳微材料制备领域，尤其是涉及一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法。
背景技术
目前，常见的肿瘤抗原多为蛋白质、多肽和DNA等，在使用过程中安全可靠，但其单独使用时免疫原性较弱，且易被酶降解。通常需要连同佐剂（CpG、R848、PolyI:C）使用或者借助其他手段保护疫苗并刺激免疫应答。商售预防型疫苗常用佐剂为铝佐剂，大量研究结果表明铝佐剂对肿瘤抗原无效。因此，急需开发新型的疫苗载体同时实现佐剂和肿瘤抗原的共负载。
肿瘤疫苗的研究存在的问题是在于难于激发细胞免疫，引发细胞免疫反应首先需要外源性抗原发生溶酶体逃逸至胞质中，并与MHC I作用表达于树突状细胞表面。氧化硅具有制备简便，粒径均一可控，孔径可调，生物安全性好等优点，因而广泛应用于药物递送领域。尽管已有使用氧化硅作为疫苗载体的文献报道，但其氧化硅纳米颗粒不具有连同的孔道结构，且抗原都是通过静电吸附的方式进行负载的。所以抗原负载量低，且容易受外界条件（温度、离子浓度、pH等）的影响而从氧化硅上脱落，进而影响疫苗的稳定性。
发明内容
本发明设计了一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法，其解决的技术问题是现有技术中氧化硅纳米颗粒不具有连同的孔道结构，且抗原都是通过静电吸附的方式进行负载的。所以抗原负载量低，且容易受外界条件（温度、离子浓度、pH等）的影响而从氧化硅上脱落，进而影响疫苗的稳定性。
为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：
一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、制备花型氧化硅纳米颗粒；
步骤2、所述花型氧化硅纳米颗粒氨基化；
步骤3、戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
步骤4、制备载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒；
步骤5、加入佐剂溶液使得载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒吸附佐剂，得到同时载有抗原和佐剂的花型氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述步骤4中将活化后的花型氧化硅纳米颗粒与抗原混合，搅拌之后静置，离心，洗涤，得到载有所述抗原的花型氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述步骤4中添加的抗原为蛋白质抗原（OVA）、多肽抗原GPC-3、多肽抗原Trp2、多肽抗原M27或多肽抗原M30中的一种或几种的组合。
优选地，所述步骤5中添加的佐剂为TLR激动剂。
优选地，所述的TLR激动剂为CpG、R848、PolyI:C中的一种或多种的组合。
优选地，步骤1中将CTAB与正丁醇混合后，依次添加尿素、环己烷和正硅酸乙酯（TEOS），使得混合物上下两相混合均匀，再经过加热、搅拌、离心、洗涤、烘干、煅烧后获得花型氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述步骤2中按顺序加入正己烷，所述步骤1所得花型氧化硅纳米颗粒和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）混合，冷凝回流、洗涤、干燥后得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒。
优选地，所述步骤3中戊二醛溶液与氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒混合，依次经过超声分散、密封、水浴、离心以及洗涤得所述戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒。
一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗，其特征在于：使用上述任何一项制备方法制得。
该花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法具有以下有益效果：
（1）本发明合成具有连同孔道结构的花型氧化硅纳米颗粒，将抗原共价连接于氧化硅孔道表面，同时花型氧化硅吸附上佐剂形成纳米疫苗。
（2）本发明花型氧化硅纳米颗粒疫苗的抗原负载量高，且不易受外界条件（温度、离子浓度、pH等）的影响而从氧化硅上脱落，疫苗稳定性也高。
附图说明
图1为实施例1所制得的花型SiO2纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。
图2为实施例2所制得的花型SiO2纳米颗粒经过不同浓度戊二醛活化后，抗原OVA的负载量变化图。
图3为实施例3所制得的载有SiO2纳米颗粒的透射电子显微镜照片。
图4为实施例4所制得的载有多肽抗原Trp2的花型氧化硅纳米颗粒的电位变化图。
图5为实施例5所制得的同时载有抗原OVA和M27的花型SiO2纳米颗粒的在不同pH缓冲溶液的稳定性。
图6为实施例6所制得的载有抗原OVA和M30的花型SiO2纳米颗粒的细胞毒性。
图7为实施例7所制得的花型SiO2纳米颗粒促进OVA和CpG包吞量结果图。
图8为实施例8所制得的载有OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗刺激BMDC表面共刺激信号分子表达情况。
图9为实施例9所制得的载有OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗刺激BMDC分泌细胞因子的水平。
具体实施方式
下面结合图1至图9，对本发明做进一步说明：
实施案例一
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：1.0gCTAB和1.0g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入30.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入12.0 g环己烷。然后缓慢滴入2.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 402566DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，100 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 374589DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氨基化了的氧化硅纳米颗粒中加入100 mL2%(v/v)戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次。
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取100 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有25 mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图1为上述实施例1的花型SiO2纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。由图1中可以看出，所制备的SiO2纳米颗粒形貌规则、粒径均一，直径约为300 nm左右。
实施案例二
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：1.0gCTAB和1.0g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入30.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入12.0 g环己烷。然后缓慢滴入2.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 388681DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，100 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 189147DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入100 mL不同体积浓度的戊二醛溶液（1-8%, v/v），超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取100 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有25 mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图2为上述实施例2的花型SiO2纳米颗粒经过不同浓度戊二醛活化后，抗原OVA的负载量变化图。
实施案例三
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：0.5gCTAB和0.5g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入15.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入6.0 g环己烷。然后缓慢滴入1.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 771438DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，50 mg花型氧化硅纳米颗粒，50 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 696669DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入100 mL2%戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取50 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有12.5 mg的多肽抗原GPC-3水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图3为上述实施例3的花型SiO2纳米颗粒的扫描电子显微镜照片。由图3中可以看出，所制备的SiO2纳米颗粒形貌规则、粒径均一，直径约为300 nm左右，孔道呈放射状分布。
实施案例四
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：2.0gCTAB和2.0g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入60.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入24.0 g环己烷。然后缓慢滴入4.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 248873DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入40 mL正己烷，200 mg氧化硅纳米颗粒，200 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 107107DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：200 mg氧化硅纳米颗粒中加入200 mL2%戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取200 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有50 mg的多肽抗原Trp2水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图4为上述实施例4载有多肽抗原Trp2的花型氧化硅纳米颗粒的电位变化图。由图4可看出花型SiO2纳米颗粒成功氨基化、戊二醛活化以及抗原的负载。
实施案例五
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：1.0gCTAB和1.0g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入30.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入12.0 g环己烷。然后缓慢滴入2.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 984933DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，100 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 600723DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入100 mL2% (v/v) 戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取100 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有25 mg的蛋白质抗原OVA水溶液和50 mg的多肽抗原M27水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图5为上述实施例5同时载有抗原OVA和M27的花型SiO2纳米颗粒的在不同pH缓冲溶液的稳定性，由图5中可以看出，花型氧化硅对抗原的负载不受环境pH的影响，即载有抗原的花型SiO2纳米颗粒疫苗具有良好的稳定性。
实施案例六
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：1.0gCTAB和1.0g正丁醇加入100 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入30.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入12.0 g环己烷。然后缓慢滴入2.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 628721DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入20 mL正己烷，100 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 138200DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入100 mL2% (v/v) 戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取100 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有25 mg的蛋白质抗原OVA水溶液和50 mg的多肽抗原M30水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
图6为上述实施例6载有抗原OVA和M30的花型SiO2纳米颗粒对树突状细胞（DC2.4）和巨噬细胞（RAW246.7）的毒性评价，由图6中可以看出，花型氧化硅纳米颗粒疫苗对主要的抗原提呈细胞无明显毒性。
实施案例七
（1）制备花型氧化硅纳米颗粒：3.0gCTAB和3.0g正丁醇加入250 mL圆底烧瓶中，之后缓慢加入90.0g尿素，并在25 ℃水浴中缓慢搅拌下加入36.0 g环己烷。然后缓慢滴入6.0 g正硅酸乙酯（TEOS），加快转速，使得上下两相混合均匀。25 ℃稳定30 min之后升温至70℃，搅拌20 h。20 h后取出离心，洗涤后烘干。将干燥的载体放入550 ℃的马弗炉中煅烧5 h以去除模板，既得到花型氧化硅纳米颗粒。
（2）花型氧化硅纳米颗粒的氨基化与戊二醛活化：
Figure 921348DEST_PATH_IMAGE001
250 mL圆底烧瓶中按顺序加入40 mL正己烷，50 mg氧化硅纳米颗粒，100 μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），冷凝回流，80 ℃反应12 h，取出材料用乙醇洗三次丙酮洗一次后干燥，得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
Figure 24434DEST_PATH_IMAGE002
戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒：100 mg氧化硅纳米颗粒中加入50 mL2% (v/v) 戊二醛溶液，超声30min，使材料分散均匀。将离心管封口膜封口，置于水浴摇床中，25 ℃中摇2 h后离心，超纯水洗涤三次；
（3）花型氧化硅纳米颗粒负载抗原：称取50 mg戊二醛活化之后的花型氧化硅纳米颗粒，加入含有12.5 mg的蛋白质抗原OVA水溶液，封口膜封口，常温下搅拌2h后离心，超纯水洗涤三次，冷冻干燥并4℃储存备用。
用绿色荧光染料标记OVA，按照实施案例七的方法制备载有标记了OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗，将Cy3标记了的CpG和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒预先混合均匀备用。将树突状细胞DC2.4收集铺入96孔板，105个细胞/孔，孵育过夜后，在孔板中加入一定量游离的荧光标记的OVA和Cy3标记了的CpG，将含有等量OVA的花型SiO2纳米颗粒和Cy3标记了的CpG预先混合后加入孔板的另一些孔中，孵育4小时后，收集细胞，流式检测DC2.4对抗原OVA和佐剂CpG的包吞量，结果如图7所示。由图可以看出，花型氧化硅显著性的提高了抗原提呈细胞对抗原和佐剂的包吞量。
按照实施案例七的方法制备载有OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗，将R848和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒预先混合均匀备用。将从小鼠股骨和胫骨提取出来的BMDC细胞培养至第六天，收集铺入24孔板，106个细胞/孔，贴壁2h后，在孔板中加入一定量游离的OVA和R848，在另一些孔中加入预先混合好的载有OVA的花型SiO2纳米颗粒和R848，孵育一定的时间，收集细胞，流式检测，BMDC的刺激效果如图8所示。从图8可以看出，载有OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗刺激BMDC表面共刺激信号分子表达情况。载有OVA的花型SiO2纳米颗粒能有效的刺激BMDC表面表达共刺激信号分子（CD40, CD80, CD86），说明该疫苗能有效的促进BMDC的成熟。此外，该疫苗颗粒还能提高BMDC表面MHC II、MHC I以及SII的表达，说明该疫苗能够促进抗原的提呈及交叉提呈。
按照实施案例七的方法制备载有OVA的花型SiO2纳米颗粒疫苗，将CpG，R848和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒预先混合均匀备用。将从小鼠股骨和胫骨提取出来的BMDC细胞培养至第六天，收集铺入24孔板，106个细胞/孔，贴壁2h后，在孔板中加入一定量游离的OVA，CpG，R848，在另一些孔中加入预先混合好的CpG，R848和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒，孵育一定的时间，收集细胞培养上清，ELISA法检测细胞分泌因子水平，结果如图9所示。由图9可以看出CpG，R848和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒预先混合组刺激BMDC分泌的Th2相关的细胞因子水平（IL-4和IL-10）相比于别的组并没有增加，而Th1相关的细胞因子水平（IL-6，IL-12，IL-1β和TNF-α）相比于别的组显著增加，说明CpG，R848和载有OVA的花型SiO2纳米颗粒预先混合组能有效的刺激BMDC成熟并促进CD8+和Th1细胞活化。
上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、制备花型氧化硅纳米颗粒；
步骤2、所述花型氧化硅纳米颗粒氨基化；
步骤3、戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒；
步骤4、制备载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒；
步骤5、加入佐剂溶液使得载有抗原的花型氧化硅纳米颗粒吸附佐剂，得到同时载有抗原和佐剂的花型氧化硅纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤4中将活化后的花型氧化硅纳米颗粒与抗原混合，搅拌之后静置，离心，洗涤，得到载有所述抗原的花型氧化硅纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤4中添加的抗原为蛋白质抗原（OVA）、多肽抗原GPC-3、多肽抗原Trp2、多肽抗原M27或多肽抗原M30中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1-3中任何一项所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤5中添加的佐剂为TLR激动剂。
5.根据权利要求4所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述的TLR激动剂为CpG、R848、PolyI:C中的一种或多种的组合。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1中将CTAB与正丁醇混合后，依次添加尿素、环己烷和正硅酸乙酯（TEOS），使得混合物上下两相混合均匀，再经过加热、搅拌、离心、洗涤、烘干、煅烧后获得花型氧化硅纳米颗粒。
7.根据权利要求1-6中任何一项所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤2中按顺序加入正己烷，所述步骤1所得花型氧化硅纳米颗粒和3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）混合，冷凝回流、洗涤、干燥后得到氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒。
8.根据权利要求1-7中任何一项所述的花型氧化硅纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤3中戊二醛溶液与氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒混合，依次经过超声分散、密封、水浴、离心以及洗涤得所述戊二醛活化氨基化了的花型氧化硅纳米颗粒。
9.一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗，其特征在于：使用权利要求1-8中任何一项制备方法制得。
CN202010116080.2A 2020-01-07 2020-02-25 一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法 Pending CN111388663A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010015711 2020-01-07
CN2020100157111 2020-01-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111388663A true CN111388663A (zh) 2020-07-10

Family

ID=71415105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010116080.2A Pending CN111388663A (zh) 2020-01-07 2020-02-25 一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111388663A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042597A (zh) * 2022-11-17 2023-05-02 河北工业大学 固定化酶的制备方法、固定化酶及其应用和碳酸甘油酯的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004053056A2 (en) * 2002-09-24 2004-06-24 University Of Kentucky Research Foundation Nanoparticle-based vaccine delivery system containing adjuvant
AU2013239497A1 (en) * 2012-03-26 2014-11-06 The University Court Of The University Of Edinburgh Adjuvant
CN109998998A (zh) * 2019-04-19 2019-07-12 中国科学院长春应用化学研究所 一种纳米疫苗及其制备方法
CN110025777A (zh) * 2019-04-30 2019-07-19 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004053056A2 (en) * 2002-09-24 2004-06-24 University Of Kentucky Research Foundation Nanoparticle-based vaccine delivery system containing adjuvant
AU2013239497A1 (en) * 2012-03-26 2014-11-06 The University Court Of The University Of Edinburgh Adjuvant
CN109998998A (zh) * 2019-04-19 2019-07-12 中国科学院长春应用化学研究所 一种纳米疫苗及其制备方法
CN110025777A (zh) * 2019-04-30 2019-07-19 中国医学科学院生物医学工程研究所 一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王红芳等: "DDAB/PLA纳米颗粒佐剂浓度对免疫效果的影响", 《现代预防医学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116042597A (zh) * 2022-11-17 2023-05-02 河北工业大学 固定化酶的制备方法、固定化酶及其应用和碳酸甘油酯的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110025777B (zh) 一种载有纳米颗粒的微米颗粒疫苗载体的制备方法
CN104027324B (zh) 一种可溶性微针疫苗贴片及其制备方法
CN110585426B (zh) 一种应用于肝癌免疫治疗的抗原和佐剂共递送纳米疫苗
CN109939229B (zh) 一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用
CN109998998B (zh) 一种纳米疫苗及其制备方法
CN108434122B (zh) 聚电解质杂化中空二氧化硅纳米颗粒及其制备方法与应用
Wu et al. Uniform-sized particles in biomedical field prepared by membrane emulsification technique
CN113274492B (zh) 一种基于羟基氧化铝纳米羧基改性的复合疫苗佐剂的制备方法
CN112107547A (zh) 一种具有光热响应性的水凝胶微球及其制备方法和应用
CN111388663A (zh) 一种花型氧化硅纳米颗粒疫苗及其制备方法
CN112592894B (zh) 一种光热驱动药物释放水凝胶微球的制备方法及应用
CN112516297A (zh) 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用
CN110613844A (zh) 一种迷你联合佐剂纳米颗粒及其制备方法和应用
CN112089834B (zh) 基于氧化石墨烯的茯苓多糖纳米佐剂及佐剂/抗原共递送疫苗的制备与应用
CN108578689B (zh) 利用物理方法激活特异性免疫的微米刺球及其制备方法
CN105861560A (zh) 低毒介孔二氧化硅基因纳米载体的制备方法及其应用
Wang et al. Synthesis of a crystalline zeolitic imidazole framework-8 nano-coating on single environment-sensitive viral particles for enhanced immune responses
CN107149683B (zh) 一种铃铛结构的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用
Viswanathan et al. In ovo delivery of Newcastle disease virus conjugated hybrid calcium phosphate nanoparticle and to study the cytokine profile induction
CN110623938B (zh) 一种mpc修饰的树状大分子包裹纳米金颗粒及其制备和应用
CN112592895B (zh) 一种激活性抗体修饰光子晶体水凝胶杂化载药微球的制备方法及应用
CN112807289B (zh) 基于纳米颗粒的活细胞表面改造方法及其使用的纳米颗粒
CN112717126A (zh) 一种聚谷氨酸载体佐剂的制备方法
CN104689325B (zh) 一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用
CN112089833A (zh) 一种普适性的CpG ODN纳米颗粒佐剂及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200710

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication