CN109998998B - 一种纳米疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种纳米疫苗及其制备方法。本发明提供的纳米疫苗包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；所述包裹层为抗原与佐剂。本发明将阳离子聚合物改性的纳米碳酸钙颗粒作为正电性疫苗载体，去负载负电性抗原及佐剂，能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。

Description

一种纳米疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，特别涉及一种纳米疫苗及其制备方法。
背景技术
肿瘤等疾病严重威胁着人类的健康及发展，传统肿瘤治疗手段包括手术，化疗，放疗，在给患者带来极大病痛的同时，无法做到彻底根治肿瘤。而肿瘤免疫疗法主要通过调动患者自身的免疫系统对抗肿瘤，成为目前有望彻底根治肿瘤的新兴疗法。
目前，免疫疗法在多种肿瘤模型及其它疾病模型中取得了巨大的研究突破，给患者带来了治愈希望。肿瘤疫苗，以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点阻断疗法、CAR-T疗法，在多种肿瘤临床试验中都取得了突破性成果。其中，肿瘤疫苗由于其良好的特异性，预防性及低成本，近些年受到了大量研究者的关注。肿瘤疫苗发挥作用的过程如下，肿瘤抗原被抗原提呈细胞摄取后，被加工成短肽并呈递给初始T细胞，初始T细胞活化产生识别并杀伤肿瘤的效应T细胞，效应T细胞随后血液循环至肿瘤部位，识别并杀伤肿瘤。这是一个理想化的过程，目前疫苗效率低下极大限制了疫苗的作用。[参见Chen DS,Mellman I.Oncology meetsimmunology:the cancer-immunity cycle.Immunity.2013；39:1-10.]。
肿瘤亚单位疫苗存在的主要问题是抗原免疫原性弱，佐剂的加入能够缓解这个问题[参见Guan X,Chen J,Hu Y,Lin L,Sun P,Tian H,et al.Highly enhanced cancerimmunotherapy by combining nanovaccine with hyaluronidase.Biomaterials.2018；171:198-206.]。因而有效的肿瘤疫苗主要包含两部分：抗原和佐剂。但是，由于抗原和佐剂的内吞效率低，其仍然极大限制了疫苗的效率，不能有效地产生抗肿瘤的效应T细胞。因此，如何提高疫苗效率成为目前疫苗领域的研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纳米疫苗及其制备方法。本发明提供的纳米疫苗能够提高抗原和佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。
本发明提供了一种纳米疫苗，包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；
所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；
所述包裹层为抗原与佐剂。
优选的，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、聚赖氨酸和聚赖氨酸衍生物中的一种或几种。
优选的，所述载体颗粒与包裹层的质量比为(10～40)∶1。
优选的，所述载体颗粒中，阳离子聚合物与纳米碳酸钙的质量比为1∶(35～40)。
优选的，所述包裹层中，抗原与佐剂的质量比为(0.5～10)∶1。
优选的，所述抗原为带负电的抗原；
所述带负电的抗原为蛋白抗原或多肽抗原；
所述佐剂为带负电的佐剂；
所述带负电的佐剂包括核酸类佐剂和STING信号通路激动剂中的一种或几种。
优选的，所述纳米碳酸钙的粒度为80～250nm；
所述阳离子聚合物的分子量为≥1800Da。
本发明还提供了一种上述技术方案中所述的纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a)将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到载体颗粒；
b)将所述载体颗粒在水中分散，得到载体悬浮液；
c)将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤和超声分散，得到纳米疫苗分散液；
或将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到纳米疫苗粉剂。
优选的，所述纳米碳酸钙悬浮液的浓度为0.5～1mg/mL；所述阳离子聚合物溶液的浓度为2.5～10mg/mL；
所述步骤a)中静置复合处理的温度为20～30℃，时间为10～30min。
优选的，所述抗原-佐剂混合液的浓度为0.15～0.5mg/mL；
所述步骤c)中静置复合处理的温度为20～30℃，时间为10～30min。
本发明提供了一种纳米疫苗，包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；所述包裹层为抗原与佐剂。本发明将阳离子聚合物改性的纳米碳酸钙颗粒作为正电性疫苗载体，去负载负电性抗原及佐剂，能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。
实验结果表明，采用本发明的纳米疫苗，抗原和佐剂的内吞量均显著增加，纳米疫苗组的抗原和佐剂内吞量分别是游离组的3倍以上和2倍以上，并且抗原和佐剂在细胞中共定位比例明显增多；证明，形成纳米疫苗有利于促进抗原及佐剂的内吞。同时，本发明的纳米疫苗能够促进DC细胞的活化，证明其能够高效激活BMDC细胞，提高疫苗效率。而且，本发明的纳米疫苗能够促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12，证明本发明提供的纳米疫苗能够高效活化树突细胞。同时，通过免疫实验证明，本发明提供的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫系统的功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制得的纳米疫苗的TEM图。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米疫苗，包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；
所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；
所述包裹层为抗原与佐剂。
本发明将阳离子聚合物改性的纳米碳酸钙颗粒作为正电性疫苗载体，去负载负电性抗原及佐剂，能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。
本发明中，所述载体颗粒由阳离子聚合物静电吸附到纳米碳酸钙颗粒表面形成。其中，所述阳离子聚合物优选为聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物、聚赖氨酸和聚赖氨酸衍生物中的一种或几种；采用上述阳离子聚合物能够与纳米碳酸钙颗粒形成界面稳定的特定载体结构，采用该载体负载抗原及佐剂，能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。本发明对所述聚乙烯亚胺衍生物及聚赖氨酸衍生物的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规衍生物即可。
本发明中，所述阳离子聚合物的分子量优选为≥1800Da，更优选为1800～30000Da。若分子量过低，则难以较好的吸附抗原及佐剂，影响疫苗效果。
本发明中，所述纳米碳酸钙颗粒的来源没有特殊限制，为一般市售品或按照本领域技术人员熟知的制备方法制得。本发明中，所述纳米碳酸钙的粒度优选为80～250nm，更优选为80～150nm。
本发明中，所述载体颗粒中，阳离子聚合物与纳米碳酸钙的质量比为1∶(35～40)，最优选为1∶38。
本发明中，得到疫苗载体颗粒后，经过静电作用同时吸附抗原与佐剂，在载体表面形成抗原及佐剂的包裹层。参见图1，图1为本发明实施例1制得的纳米疫苗的TEM图，可以看出，疫苗颗粒为核壳结构，内部为疫苗载体，外部为抗原与佐剂形成的包裹层。
本发明中，所述抗原优选为带负电的抗原。所述抗原优选为蛋白抗原或多肽抗原。本发明对所述抗原的种类没有特殊限制，可通过搭配不同抗原及佐剂，将疫苗用于不同的疾病类型和生物种类。本发明中，所述抗原优选包括市售模型抗原、肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原中的一种或几种。所述市售模型抗原的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规市售模型抗原，包括但不限于卵清蛋白OVA抗原等。所述肿瘤相关抗原的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规肿瘤相关抗原即可，优选包括MAGE-E1抗原和TRP1抗原等中的一种或几种。所述肿瘤特异性抗原的种类没有特殊限制，为本领域技术人员熟知的常规肿瘤相关抗原即可，优选包括Actn4抗原、Ap3d1抗原、Dag1抗原、Eef2抗原和Tubb3抗原等中的一种或几种。
本发明中，所述佐剂优选为带负电的佐剂。所述佐剂优选包括核酸类佐剂和STING信号通路激动剂中的一种或几种。所述核酸类佐剂优选包括寡聚核苷酸CpG。
本发明中，所述抗原与佐剂的质量比优选为(0.5～10)∶1，更优选为(0.5～3)∶1。
本发明中，阳离子聚合物静电吸附到纳米碳酸钙颗粒表面形成带正电的载体颗粒，后经静电作用同时吸附带负电的抗原和佐剂，在载体颗粒表面形成包裹层。本发明中，所述载体颗粒与包裹层的质量比优选为(10～40)∶1，更优选为(10～20)∶1。
本发明提供了一种纳米疫苗，包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；所述包裹层为抗原与佐剂。本发明将阳离子聚合物改性的纳米碳酸钙颗粒作为正电性疫苗载体，去负载负电性抗原及佐剂，能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应。实验结果表明，本发明提供的纳米疫苗，能够明显提高抗原及佐剂的内吞量，达到游离抗原和佐剂内吞量的3倍以上和2倍以上；采用该纳米疫苗三次免疫小鼠后，相比游离抗原佐剂组，能够明显激活体内免疫反应。本发明提供的纳米疫苗，可通过搭配不同抗原及佐剂，将疫苗用于不同的疾病类型和生物种类。
本发明还提供一种上述技术方案中所述的纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
a)将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到载体颗粒；
b)将所述载体颗粒在水中分散，得到载体悬浮液；
c)将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤和超声分散，得到纳米疫苗分散液；
或将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到纳米疫苗粉剂。
其中，纳米碳酸钙、阳离子聚合物、抗原、佐剂的种类、含量、粒度及来源等特征均与上述技术方案中所述一致，在此不再赘述。
按照本发明，先将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到载体颗粒。
本发明中，所述纳米碳酸钙悬浮液为纳米碳酸钙分散于水中形成的悬浮液。所述水优选为超纯水和/或二次蒸馏水。所述分散优选为超声分散；所述超声分散的功率优选为600～900W；所述超声分散的时间优选为3～10min。所述纳米碳酸钙悬浮液的浓度优选为0.5～1mg/mL，最优选为1mg/mL，若浓度过高，则分散性变差，影响后续混合的均匀性及疫苗性能的发挥。
本发明中，所述阳离子聚合物溶液为阳离子聚合物的水溶液。所述水优选为超纯水和/或二次蒸馏水。所述阳离子聚合物溶液的浓度优选为2.5～10mg/mL，最优选为5mg/mL，若浓度过高，则复合时会导致沉淀，影响纳米疫苗的制备。
本发明中，在将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混合时，阳离子聚合物与纳米碳酸钙的投料质量比优选为≥5，更优选为(5～10)∶1。配制时，所述混合优选为等体积混合。
本发明中，将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混合的方式没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的常规混合方式将二者混匀即可，如可通过涡旋处理、搅拌等方式将二者混合。本发明中，所述混合处理的转速优选为500～3000rpm；处理的时间优选为15～60s。
本发明中，将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混合均匀后，进行静置复合处理，在静置处理过程中，阳离子聚合物静电吸附于纳米碳酸钙颗粒表面，形成均匀的改性纳米颗粒。本发明中，所述静置复合处理的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述静置复合处理的时间优选为10～30min。
本发明中，在上述静置复合处理后，进行离心洗涤。所述离心洗涤的操作没有特殊限制，按照本领域技术人员熟知的常规操作和借助常规离心洗涤设备进行处理即可。本发明中，所述离心洗涤的转速优选为6000～10000r/min，处理时长优选为3～20min。所述离心洗涤优选洗涤两次。在离心洗涤后，得到载体颗粒，为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒。
按照本发明，在得到载体颗粒后，将所述载体颗粒在水中分散，得到载体悬浮液。
本发明中，所述水优选为超纯水和/或二次蒸馏水。所述分散优选为超声分散。所述超声分散的功率优选为500～900W；所述超声分散的时间优选为3～10min。所述载体悬浮液的浓度优选为0.5～2mg/mL。
按照本发明，在得到载体悬浮液后，将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤和超声分散，得到纳米疫苗分散液；或将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到纳米疫苗粉剂。
本发明中，所述抗原-佐剂混合液的浓度优选为0.15～0.5mg/mL。所述抗原-佐剂混合液中，抗原与佐剂的质量比优选为2～10∶1。
在将载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混和时，载体的质量与抗原-佐剂总质量之比优选为(4～10)∶1。所述混合优选为等体积混合。本发明对所述混合的方式没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的常规混合方式将二者混匀即可，如可通过涡旋处理、搅拌等方式将二者混合。本发明中，所述混合处理的转速优选为500～3000rpm；处理的时间优选为15～60s。
本发明中，在将载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀后，进行静置复合处理，在静置处理过程中，抗原与佐剂静电吸附于载体颗粒表面，形成核壳结构，内部为载体颗粒，外部包裹上抗原及佐剂。本发明中，所述静置复合处理的温度优选为20～30℃，更优选为25℃。所述静置复合处理的时间优选为10～30min。
本发明中，在上述静置复合处理后，进行离心洗涤。本发明中，所述离心洗涤的转速优选为6000～10000r/min，处理时长优选为3～10min。所述离心洗涤优选洗涤两次。在离心洗涤后，得到纳米疫苗颗粒粉剂，包括载体和负载于载体表面的抗原-佐剂包裹层。在得到上述纳米疫苗颗粒粉剂后，可以粉剂形式保存备用，待使用时再形成分散液；也可将所得纳米疫苗颗粒继续分散处理，形成分散液进行保存备用。所述分散所用分散剂优选为超纯水和/或二次蒸馏水。所述分散优选超声分散。所述超声分散的功率优选为500～900W；所述超声分散的时间优选为1～10min。所述分散液的浓度优选为0.1～1mg/mL。
本发明提供了一种纳米疫苗的制备方法，先将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到载体颗粒；再将所述载体颗粒在水中分散，得到载体悬浮液；然后将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤和超声分散，得到纳米疫苗分散液；或将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到纳米疫苗粉剂。本发明提供的制备方法简单易行，条件温和，便于规模化生产。
本发明中，在形成纳米疫苗后，进行实验测试，如下：
(1)BMDC细胞的提取和培养
C57BL/6雄性小鼠(6-8周)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨和胫骨，并用剪刀和镊子将骨头周围的肌肉组织去除干净；之后，将干净的骨头移至装有酒精(浓度75％)的无菌培养皿中浸泡3～5min，进行彻底消毒；后转移骨头至装有无菌PBS的培养皿中洗涤两次；用剪刀剪去骨头两端，后用注射器抽取无菌PBS，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓至50mL离心管中，直至骨头完全变白；悬浮液用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织，1500r/min、10min离心收集骨髓细胞，将细胞用含有10％胎牛血清的1640培养基进行重悬培养，外加细胞因子GM-CSF和IL-4进行刺激。所述培养条件优选为在体积分数为5％的二氧化碳的培养箱中连续培养，培养温度优选37℃。后续培养七天内对细胞进行半量换液，换液时间优选为2天一次，更优选为一天一次。
(2)纳米疫苗的内吞
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于6孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。后加入荧光标记材料(样品分别为：OVA-FITC+CpG，OVA+CpG-FITC，载体/OVA-FITC/CpG，载体/OVA/CpG-FITC；其中，FITC为荧光标记物)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养4h，然后采用流式细胞仪检测抗原和佐剂的内吞。
结果显示，采用本发明提供的纳米疫苗后，抗原和佐剂的内吞量均显著增加，纳米疫苗组的抗原和佐剂内吞量分别是游离组的3倍以上和2倍以上，并且抗原和佐剂在细胞中共定位比例明显增多。证明，形成纳米疫苗，有利于促进抗原及佐剂的内吞和树突细胞的活化。
(3)BMDC体外成熟实验
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，疫苗载体，纳米疫苗)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养24h，然后流式技术检测BMDC细胞表面成熟分子表达，细胞表面B7分子(CD86，CD80)的上调是BMDC细胞成熟的标志。
实验结果表明，相比PBS和游离OVA组，纳米疫苗组和载体组能够有效上调BMDC细胞上CD86和CD80分子的表达，说明本发明提供的纳米疫苗不仅能够增强抗原佐剂的内吞，而且可以作为一种新型佐剂激活树突细胞。其中，纳米疫苗组能进一步提高CD86和CD80的表达，即CpG的加入能进一步促进DC细胞的活化，说明本发明提供的纳米疫苗能够高效激活BMDC细胞，大大提高疫苗的效率。
(4)BMDC细胞因子分泌
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。之后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，疫苗载体，纳米疫苗)，加入材料体积控制在总体积10％以内，保证最终各样品中总体积保持恒定，继续培养24h。后取细胞悬浮液离心，取上清用于ELISA实验细胞因子检测。
实验结果表明，因子分泌的结果与成熟实验结果一致。相比PBS组，纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12，说明本发明提供的纳米疫苗能够高效活化树突细胞。
(5)体内免疫细胞检测
采用20g左右的C57BL/6小鼠，将本发明中制备的纳米疫苗通过皮下注射到小鼠体内，每七天一次，连续注射三次。三次注射后再过七天，将小鼠脱臼处死，分别提取腹股沟淋巴结和脾脏置于PBS缓冲液中，剥去其周围的结缔组织，后将脾脏或淋巴结置于100或者200目不锈钢网上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获取细胞悬液。吸取部分细胞悬液分别进行细胞分子标记，经过4℃孵育30min后，离心洗涤，流式细胞仪检测。
体内实验结果表明，相对于PBS组，小鼠三次免疫纳米疫苗后，其脾脏和淋巴结中CD8+T细胞和CD4+T细胞的含量明显增加，说明本发明提供的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫系统的功能。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
1.1疫苗的制备
将纳米碳酸钙超声分散于超纯水中，纳米碳酸钙浓度为1mg/mL，超声时间为5min，形成纳米碳酸钙悬浮液。将聚乙烯亚胺(25000Da，PEI25K)溶于超纯水中，浓度为5mg/mL，形成聚乙烯亚胺溶液。将聚乙烯亚胺溶液加入纳米碳酸钙悬浮液中，等体积混合，涡旋处理15s后，室温下静置15min；然后离心洗涤，离心转速为6000r/min，处理10min，洗涤两次，得到载体颗粒。
将载体分散于超纯水中，浓度为1mg/mL。之后，加入等体积的抗原-佐剂混合液，抗原为市售模型抗原(卵清蛋白OVA抗原)，佐剂为寡聚核苷酸CpG，载体：抗原：佐剂的质量比为1:0.2:0.1。涡旋15s后，室温下静置15min。然后离心洗涤，离心转速为6000r/min，处理5min，洗涤两次，得到纳米疫苗。
1.2表征
(1)对上述制备过程中采用的原料及得到的产物进行电位粒径测试，结果参见表1。
表1实施例1的电位粒径测试结果
Figure BDA0002033901920000101
Figure BDA0002033901920000111
由以上测试结果可知，制备过程中电位正反交替，且逐级吸附后粒径增大，证明原料经层层吸附，成功制得纳米疫苗。
(2)对所得纳米疫苗进行透射电镜测试，结果如图1所示，图1为本发明实施例1制得的纳米疫苗的TEM图。可以看出，所得纳米疫苗颗粒为核壳结构，其内部为载体颗粒，外部包裹上了抗原及佐剂。
1.3效果实验
(1)纳米疫苗的内吞
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞；按照每孔1×106细胞的密度接种于6孔培养板，置于37℃含体积分数5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。之后分别加入荧光标记材料(样品分别为：OVA-FITC+CpG，OVA+CpG-FITC，PEI/CaCO3/OVA-FITC/CpG，PEI/CaCO3/OVA/CpG-FITC)，所加入荧光材料的体积控制在总体积的10％以内，继续培养4h，然后采用流式细胞仪检测抗原和佐剂的内吞。
结果表明，采用纳米疫苗后，抗原和佐剂的内吞量均显著增加，纳米疫苗组(即NVs组)的抗原和佐剂内吞量分别是游离组的3.3倍和2.2倍，并且抗原和佐剂在细胞中共定位比例明显增多。证明，形成纳米疫苗有利于促进抗原及佐剂的内吞和树突细胞的活化。
(2)纳米疫苗活化BMDC细胞
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。之后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，PEI/CaCO3，纳米疫苗)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养24h；然后采用流式技术检测BMDC细胞表面成熟分子表达，细胞表面B7分子(CD86，CD80)的上调是BMDC细胞成熟的标志。
实验结果表明，相比PBS和游离OVA组，纳米疫苗组和PEI/CaCO3组能够有效上调BMDC细胞上CD86和CD80分子的表达，说明实施例1制备的纳米疫苗不仅能够增强抗原佐剂的内吞，而且可以作为一种新型佐剂激活树突细胞。其中，纳米疫苗组能进一步提高CD86和CD80的表达，即CpG的加入能进一步促进DC细胞的活化，说明实施例1制备的纳米疫苗能够高效激活BMDC细胞，大大提高疫苗的效率。BMDC细胞的活化结果参见表2。
表2实施例1中BMDC细胞的活化结果
DC成熟百分比
PBS 34.4
LPS 51.6
OVA 32.4
OVA/CpG 33.6
PEI/CaCO<sub>3</sub> 42.1
NVs 45.5
(3)纳米疫苗促进BMDC分泌免疫活化细胞因子
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。之后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，PEI/CaCO3，纳米疫苗)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养24h，离心收集培养上清检测细胞因子含量。
测试结果参见表3，可以看出，因子分泌的结果与成熟实验结果一致。相比PBS组，纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12，说明实施例1制备的纳米疫苗能够高效活化树突细胞。
表3实施例1中因子分泌结果
Figure BDA0002033901920000121
Figure BDA0002033901920000131
(4)纳米疫苗激活体内免疫系统
采用20g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每5只一组，后对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别为：PBS，OVA+CpG，PEI/CaCO3，纳米疫苗)，之后每七天免疫一次，共计三次。第三次免疫七天后，将小鼠脱臼处死，分别提取腹股沟淋巴结和脾脏置于PBS缓冲液中，剥去其周围的结缔组织，后将脾脏或淋巴结置于100或者200目不锈钢网上，用注射器针芯分别轻轻研压脾脏淋巴结，获取细胞悬液。吸取部分细胞悬液分别进行细胞分子标记，经过4℃孵育30min后，离心洗涤，流式细胞仪检测。
体内实验结果表明，相对于PBS组，小鼠三次免疫纳米疫苗后，其脾脏和淋巴结中CD8+T细胞和CD4+T细胞的含量明显增加，说明实施例1制备的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫系统的功能。
实施例2
1.1疫苗的制备
将纳米碳酸钙超声分散于超纯水中，纳米碳酸钙浓度为1mg/mL，超声时间为5min，形成纳米碳酸钙悬浮液。将聚赖氨酸(15000Da)溶于超纯水中，浓度为5mg/mL，形成聚赖氨酸溶液。将聚赖氨酸溶液加入纳米碳酸钙悬浮液中，等体积混合，涡旋处理15s后，室温下静置15min；然后离心洗涤，离心转速为6000r/min，处理10min，洗涤两次，得到载体颗粒。
将载体分散于超纯水中，浓度为1mg/mL。之后，加入等体积的抗原-佐剂混合液，抗原为市售模型抗原(卵清蛋白OVA抗原)，佐剂为寡聚核苷酸CpG，载体：抗原：佐剂的质量比为1:0.2:0.1。涡旋15s后，室温下静置15min。然后离心洗涤，离心转速为6000r/min，处理5min，洗涤两次，得到纳米疫苗。
1.2表征
(1)对上述制备过程中采用的原料及得到的产物进行电位粒径测试，结果参见表4。
表4实施例2的电位粒径测试结果
Figure BDA0002033901920000132
Figure BDA0002033901920000141
由以上测试结果可知，制备过程中电位正反交替，且逐级吸附后粒径增大，证明原料经层层吸附，成功制得纳米疫苗。
(2)对所得纳米疫苗进行透射电镜测试，结果与图1相似，所得纳米疫苗颗粒为核壳结构，其内部为载体颗粒，外部包裹上了抗原及佐剂。
1.3效果实验
(1)纳米疫苗活化BMDC细胞
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中培养过夜。之后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，PLL/CaCO3，纳米疫苗)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养24h；然后采用流式技术检测BMDC细胞表面成熟分子表达，细胞表面B7分子(CD86，CD80)的上调是BMDC细胞成熟的标志。
实验结果表明，相比PBS和游离OVA组，纳米疫苗组和PLL/CaCO3组能够有效上调BMDC细胞上CD86和CD80分子的表达，说明实施例2制备的纳米疫苗不仅能够增强抗原佐剂的内吞，而且可以作为一种新型佐剂激活树突细胞。其中，纳米疫苗组能进一步提高CD86和CD80的表达，即CpG的加入能进一步促进DC细胞的活化，说明实施例2制备的纳米疫苗能够高效激活BMDC细胞，大大提高疫苗的效率。BMDC细胞的活化结果参见表5。
表5实施例2中BMDC细胞的活化结果
Figure BDA0002033901920000142
Figure BDA0002033901920000151
(2)纳米疫苗促进BMDC分泌免疫活化细胞因子
BMDC培养七天后，用培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于50mL离心管，1000r/min、5min离心收集细胞，按照每孔1×106细胞的密度接种于24孔培养板，置于37℃含体积分数为5％二氧化碳的孵箱中继续培养过夜。之后加入不同组分材料(分别为：PBS，LPS，OVA，PLL/CaCO3，纳米疫苗)，所加入材料体积控制在总体积10％以内，继续培养24h，离心收集培养上清检测细胞因子含量。
测试结果显示，因子分泌的结果与成熟实验结果一致。相比PBS组，纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-12，说明实施例2制备的纳米疫苗能够高效活化树突细胞。
(3)纳米疫苗激活体内免疫系统
采用20g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每5只一组，后对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别为：PBS，OVA+CpG，PLL/CaCO3，纳米疫苗)，之后每七天免疫一次，共计三次。第三次免疫七天后，将小鼠脱臼处死，分别提取腹股沟淋巴结和脾脏置于PBS缓冲液中，剥去其周围的结缔组织，后将脾脏或淋巴结置于100或者200目不锈钢网上，用注射器针芯分别轻轻研压脾脏淋巴结，获取细胞悬液。吸取部分细胞悬液分别进行细胞分子标记，经过4℃孵育30min后，离心洗涤，流式细胞仪检测。
体内实验结果表明，相对于PBS组，小鼠三次免疫纳米疫苗后，其脾脏和淋巴结中CD8+T细胞和CD4+T细胞的含量明显增加，说明实施例2制备的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫系统的功能。
由实施例1～2的测试结果可知，本发明提供的纳米疫苗能够有效提高抗原及佐剂的内吞效率，同时能够高效活化树突细胞，激活体内免疫反应，在疫苗领域具有光明的应用前景。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，包括最佳方式，并且也使得本领域的任何技术人员都能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统，和实施任何结合的方法。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。本发明专利保护的范围通过权利要求来限定，并可包括本领域技术人员能够想到的其他实施例。如果这些其他实施例具有近似于权利要求文字表述的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的文字表述无实质差异的等同结构要素，那么这些其他实施例也应包含在权利要求的范围内。

Claims (5)

1.一种纳米疫苗，其特征在于，包括带正电的载体颗粒和负载于所述载体颗粒表面的带负电的包裹层；
所述载体颗粒为表面吸附有阳离子聚合物的纳米碳酸钙颗粒；
所述包裹层为抗原与佐剂；
所述阳离子聚合物为聚赖氨酸；
所述载体颗粒中，阳离子聚合物与纳米碳酸钙的质量比为1∶（35~40）；
所述纳米碳酸钙的粒度为80~250nm；
所述阳离子聚合物的分子量为≥1800Da；
所述载体颗粒与包裹层的质量比为（10~40）∶1；
所述抗原为带负电的抗原；
所述带负电的抗原为蛋白抗原或多肽抗原；
所述佐剂为带负电的佐剂；
所述带负电的佐剂包括核酸类佐剂和STING信号通路激动剂中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述包裹层中，抗原与佐剂的质量比为（0.5~10）∶1。
3.一种权利要求1~2中任一项所述的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）将纳米碳酸钙悬浮液与阳离子聚合物溶液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到载体颗粒；
b）将所述载体颗粒在水中分散，得到载体悬浮液；
c）将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤和超声分散，得到纳米疫苗分散液；
或将所述载体悬浮液与抗原-佐剂混合液混匀和静置复合处理后，离心洗涤，得到纳米疫苗粉剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纳米碳酸钙悬浮液的浓度为0.5~1mg/mL；所述阳离子聚合物溶液的浓度为2.5~10mg/mL；
所述步骤a）中静置复合处理的温度为20~30℃，时间为10~30min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述抗原-佐剂混合液的浓度为0.15~0.5mg/mL；
所述步骤c）中静置复合处理的温度为20~30℃，时间为10~30min。
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