CN106177974B

CN106177974B - 一种载抗原聚合物脂质纳米球的制备及作为疫苗佐剂的应用

Info

Publication number: CN106177974B
Application number: CN201510222026.5A
Authority: CN
Inventors: 王连艳; 杨婷媛; 徐婧
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2035-05-05
Also published as: CN106177974A

Abstract

本发明涉及一种聚合物脂质纳米粒子、制备方法及其作为疫苗佐剂系统的应用。所述聚合物纳米粒子是由高分子聚合物组成的实心球，其表面镶嵌阳离子脂质荷正电，所述纳米粒子表面可以吸附蛋白抗原、多肽抗原、病毒抗原等活性药物；所述聚合物纳米粒子的平均粒径在300nm以下，分散系数即多分散指数PDI(Polydispersity)值小于0.2，Zeta电位平均值为大于20mV。本发明的聚合物纳米粒子是尺寸均一、抗原携载率高、抗原活性保持好，以纳米粒子携载抗原并作为疫苗佐剂时，可以增加抗原提呈细胞(APCs)对抗原的摄取量，提高抗原提呈细胞的活化水平，增强后续免疫应答水平。

Description

一种载抗原聚合物脂质纳米球的制备及作为疫苗佐剂的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种载蛋白抗原、多肽抗原、灭活病毒抗原等活性药物的聚合物纳米粒子及其制备方法和作为抗原递送与佐剂系统的应用。

背景技术

近年来，基于纳米技术的药物输送方法引起了科学界和企业界的极大关注和兴趣，纳米粒子已成为一种新型的具有巨大应用前景的药物或基因递送载体，有众多证据表明，纳米粒子可把药物定向地输送到器官、组织或细胞，这将为恶性肿瘤、心脑血管疾病，神经系统疾病的治疗提供新的解决方案。某些纳米粒子可通过毛细管渗透穿越生理屏障，使药物在体内特定部位累积，改变药物在体内的分布，降低药物的毒副作用，同时提高药物的治疗效率。另外，在免疫研究中发现，纳米粒子可作为抗原递送与佐剂系统，显著增强机体对抗原的特异性免疫应答水平，并能够改变抗原的提呈途径，大大增强细胞免疫应答水平。

目前国内外已开发了多种基于合成聚合物和天然组分材料的微粒缓控释系统，包括：水包油型乳剂、脂质体、微球和纳米粒等，尤其在免疫学方面的研究，将微粒缓控释系统用于免疫佐剂的研究中仍然面临的挑战。

纳米粒子的制备方法有很多，通常采用自乳化溶剂挥发法制备，自乳化溶剂挥发法以丙酮或甲醇为“水相”，以水不溶性低沸点有机溶剂如二氯甲烷或氯仿为“油相”，在乳化剂存在条件下，由于大量“水相”的迅速扩散，将“油相”分散成微细液滴，待蒸发溶剂后形成固体纳米粒。该方法不需乳匀或超声，是一种自发过程。

通过对自乳化溶剂挥发法进行改良，即先对油相和水相的改良，在本发明中采用毒性较低的乙醇和丙酮的混合液为油相，水相为去离子水，将高分子聚合物材料溶于油相中，并在油相中加入适当比例的阳离子脂质材料，然后将油相缓慢加入到水相中，匀速搅拌下将油相蒸发，制备得到纳米粒子。采用这种方法制备得到的纳米粒子粒径均一，且分散性良好，表面荷正电，将其与蛋白质、多肽、灭活病毒抗原等生物活性物质混合，可通过静电相互作用将活性物质携载到纳米粒子上。采用这种携载方式，条件温和、过程简单，活性物质活性能够得到较好保持，携载率也较高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种尺寸均一、高吸附性、高活性的载活性抗原的纳米递送与佐剂系统，并将其用作新型疫苗制剂。

一方面，本发明提供一种载活性抗原物质的聚合物纳米粒子，所述聚合物纳米粒子是由高分子聚合物聚合形成的内核，阳离子脂质穿插在内核中，阳离子脂质头部暴露于纳米粒子表面，使其荷正电；所述聚合物纳米粒子表面可通过静电作用吸附携载蛋白、多肽、病毒抗原的活性物质；所述聚合物纳米粒子的平均粒径在90-200nm之间，多分散指数(PDI)小于0.2，Zeta电位平均值为大于20mV。

本发明提供的载活性药物的聚合物纳米粒子，其表面带有正电荷，其他纳米粒子相比，可以吸附表面带负电的蛋白质、多肽及疫苗。

本发明提供的载活性药物的聚合物纳米粒子，其平均粒径在90-300nm之间，在免疫途径中当载药微球的粒径处于纳米级，可以增加抗原提呈细胞APCs的摄取量，使抗原更好的被加工提呈。

本发明提供的载活性药物的聚合物脂质球，其尺寸均一、可控，是可载蛋白质、多肽或疫苗等多种生物活性药物的可降解的聚合物纳米粒子，该纳米粒子具有较小的粒径，且其表面带有正电荷，其粒度分散系数(PDI)小于0.2。

上述PDI的定义为：多分散系数，代表粒子均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，溶液中的粒子分布越均匀。相反地，该数值越大，溶液中的粒子分布越宽泛。一般认为PDI小于0.2的乳液具有单分散性。

本发明中，所述聚合物脂质球的平均粒径在90-300nm之间，例如列举粒径优选90-200nm。

本发明中，所述聚合物纳米粒子中可吸附不同浓度的蛋白质、多肽或灭活病毒抗原等活性物质，也可吸附不同种类的蛋白质、多肽或灭活病毒抗原等活性物质。也就是说，所述活性物质只要表面带有负电即可被聚合物纳米粒子吸附携载。

作为本发明的优选方案，所述聚合物纳米粒子在制备过程中采用可降解聚合物材料和阳离子脂质。其中，阳离子脂质镶嵌在纳米粒子表面，具有改变纳米粒子表面电荷的功能，同时也具有稳定纳米粒子体系的功能。所述可降解聚合物，选自聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-b-聚乙二醇共聚物、聚乙醇酸、聚内酯、聚酸酐、聚三亚甲基碳酸酯、聚对二氧环己酮或它们的共聚物。

本发明的方法与现有技术相比，具有如下特点：

(1)本发明提供的载蛋白质、多肽、灭活病毒抗原等活性物质的可降解聚合物纳米粒子，平均粒径在90-300nm之间，纳米粒子携载抗原后，可以增加抗原提呈细胞(APCs)对抗原的摄取量，提升抗原提呈细胞活化水平，并提高T细胞活化相关细胞因子分泌水平。

(2)本发明提供的载蛋白质、多肽、灭活病毒等活性物质可降解的聚合物纳米粒子，其尺寸均一，分散系数(PDI)小于0.2，实验批次间可重复性好，确保了纳米粒子抗原递送与佐剂系统体内外免疫学效应的可重复性提供保障。

(3)本发明提供的纳米粒子表面荷正电，可以通过吸附携载带负电的蛋白、多肽或灭活病毒抗原，能够有效保持抗原活性，同时还可以携载分子佐剂如CpG等，可以得到仿病原体颗粒，提供高效免疫应答，并且安全性良好。

(4)本发明提供的改良的快速制备尺寸均一的可降解的聚合物纳米粒子的方法，可通过控制制备过程中的油相组成比例和阳离子脂质用量等来控制纳米粒子的粒径大小和均一性。

(5)本发明不需要在水中额外添加稳定剂和乳化剂，即可制备得到稳定的聚合物纳米粒子悬浊液，洗涤程序更容易，且免去了后期测定残留等复杂过程，在提高安全性的同时有利于降低成本。

(6)本发明的方法制备条件耗能低、温和；制备参数可控性强、重现性好；制备出的纳米粒子粒径均一、可控，利于大规模工业化生产。

总之，本发明的有益效果体现在：作为蛋白质、多肽、灭活病毒抗原等活性物质，该载体可以作为抗原递送与佐剂系统，通过吸附将抗原等活性物质通过吸附携载在纳米粒子表面，增加抗原提呈细胞(APCs)对抗原的摄取，提升抗原提呈细胞活化水平，并提高T细胞活化相关细胞因子的分泌水平。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是改良自乳化溶剂挥发法制备表面带有正电的可降解的聚合物纳米粒子的流程示意图；

图2是改良自乳化溶剂挥发所制备的纳米粒子示意图，该纳米粒子为实心球体，且表面荷有正电；

图3是实施例1中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图4是比较例1中制备得到的微球的扫描电镜照片；

图5是实施例2中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图6是实施例3中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图7是实施例4中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图8是实施例5中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图9是实施例6中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图10是实施例7中制备得到的纳米粒子的扫描电镜图；

图11是实施例18中小鼠血清中IgG水平结果；

具体实施方案

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。

实施例1

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子(制备流程示意图如图1所示，所制备的纳米粒子示意图如图2所示)，将100mgPLA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为117nm，粒径分布系数PDI为0.138，表面Zeta电位为30.1mV。扫描电镜照片如图3所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例1

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PLA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的PLA和双十二烷基二甲基溴化铵，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，聚乳酸和双十二烷基二甲基溴化铵的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有聚乳酸和双十二烷基二甲基溴化铵的油相倒入60mL PVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PLA微球。所制备的纳微球的扫描电镜照片如图4所示，所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例2

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和20mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为10mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为134.4nm，粒径分布系数PDI为0.189，表面Zeta电位为35.7mV。扫描电镜照片如图5所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例3

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和50mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为177.7nm，粒径分布系数PDI为0.209，表面Zeta电位为35.5mV。扫描电镜照片如图6所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例4

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为2∶3；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为139.7nm，粒径分布系数PDI为0.139，表面Zeta电位为32.9mV。扫描电镜照片如图7所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例5

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为3∶2；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为121.4nm，粒径分布系数PDI为0.139，表面Zeta电位为34.9mV。扫描电镜照片如图8所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例6

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为5mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为145.9nm，粒径分布系数PDI为0.158，表面Zeta电位为35.5mV。扫描电镜照片如图9所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例7

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为20mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为225.9nm，粒径分布系数PDI为0.156，表面Zeta电位为29.8mV。扫描电镜照片如图10所示，结果表明所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例8

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg[1-(2，3-二油酰基)]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为159.7nm，粒径分布系数PDI为0.199，表面Zeta电位为27.9mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例9

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mgPLA和30mg DC-胆固醇(DC-Chol)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌 12小时，最后离心，洗涤，冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为185.6nm，粒径分布系数PDI为0.179，表面Zeta电位为28.9mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例2

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DC-Chol/PLA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的聚乳酸(PLA)和DC-胆固醇(DC-Chol)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PLA和DC-Chol的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PLA和DC-Chol的油相倒入60mLPVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DC-Chol/PLA微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例10

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg PLGA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNanoZS90)测量，在水中的平均粒径为178.6nm，粒径分布系数PDI为0.138，表面Zeta电位为26.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例11

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg PLGA和30mg[1-(2，3-二油酰基)]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为297nm，粒径分布系数PDI为0.128，表面Zeta电位为29.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例3

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DOTAP/PLGA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和[1-(2，3-二油酰基)]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PLGA和DOTAP的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PLGA和DOTAP的油相倒入60mLPVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DOTAP/PLGA微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例12

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg PLGA和30mg DC-胆固醇(DC-Chol)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为237nm，粒径分布系数PDI为0.145，表面Zeta电位为26.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

实施例13

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg PELA和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为181.9nm，粒径分布系数PDI为0.178，表面Zeta电位为29.4mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例4

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PELA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的乳酸-乙二醇共聚物(PELA)和双十八烷基溴化铵(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PELA和DDAB的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PELA和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PELA微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例14

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg聚乙醇酸(PGA)和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为199.2nm，粒径分布系数PDI为0.198，表面Zeta电位为27.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例5

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PGA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的聚乙醇酸(PGA)和双十八烷基溴化铵(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PGA和DDAB的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PGA和DDAB的油相倒入60mLPVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PGA微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例15

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg聚内酯和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNanoZS90)测量，在水中的平均粒径为199.8nm，粒径分布系数PDI为0.134，表面Zeta电位为34.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例6

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PCL微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的聚己内酯(PCL)和双十八烷基溴化铵(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PCL和DDAB的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PCL和DDAB的油相倒入60mLPVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PCL微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例16

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg聚酸酐(PAA)和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNanoZS90)测量，在水中的平均粒径为231.7nm，粒径分布系数PDI为0.188，表面Zeta电位为35.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例7

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PAA微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的聚酸酐(PAA)和双十八烷基溴化铵(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PAA和DDAB的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PAA和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PAA微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例17

采用改良自乳化溶剂挥发法制备纳米粒子，将100mg聚三亚甲基碳酸酯(PCS)和30mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)共同溶于乙醇和丙酮混合的油相当中，油相的体积为15mL，其中V_乙醇∶V_丙酮为1∶1；然后将去离子水作为水相，水相的体积为90mL；之后将混合均匀的油相缓慢加入到水相当中，以400rpm的转速进行机械搅拌，搅拌12小时，最后离心、洗涤、冷冻干燥，得到的聚合物纳米粒子。其平均粒径和粒径分布采用英国马尔文纳米粒度仪(ZetasizerNano ZS90)测量，在水中的平均粒径为197.8nm，粒径分布系数PDI为0.144，表面Zeta电位为31.1mV，所制备的聚合物纳米粒子的粒径均一。

比较例8

采用膜乳化技术结合溶剂挥发法制备粒径为1.0μm的DDAB/PCS微球。配制1％的水相PVA溶液作为水相(W)。称取一定量的聚三亚甲基碳酸酯(PCS)和双十八烷基溴化铵(DDAB)，溶解于二氯甲烷中作为油相(O)，PCS和DDAB 的质量比按10∶1，二者在二氯甲烷中的浓度为5％，室温充分溶解10-20min。将10mL溶有PCS和DDAB的油相倒入60mL PVA水相中，搅拌制备预乳液(O/W)，将预乳液转至快速膜乳化器的储料罐中，选用2.9μm的膜，在0.8Mpa氮气压力下过膜3次，制备均一O/W型乳液，随后将乳液置于通风橱中搅拌过夜，固化微球。固化的微球采用超纯水离心洗涤3-5次，即制得粒径在1μm左右的均一阳离子DDAB/PCS微球。所制备的纳微球呈圆整球形，且分散性良好，粒径均一。

实施例18

采用实施例1的DDAB/PLA纳米球和比较例1的DDAB/PLA微球对猪圆环灭活病毒PCV2进行吸附携载，抗原吸附采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为7组，每组6只，分别DDAB/PLA纳米粒子佐剂组、1μm微球佐剂组、纯抗原组、不免疫组、商用206油佐剂对照组和商用15A佐剂对照组，进行免疫实验，免疫剂量为200μL/只，其中猪圆环灭活病毒含量10μL(10^6.5TCID₅₀/mL)，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射100μL。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天免疫。在预先设定的时间点即一免后14天、28天、35天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG的含量，抗体结果如图11所示，结果表明，纳米粒子的免疫效果显著优于1μm微球佐剂组和商品化206油佐剂组，与商用佐剂15抗体水平相近，表明DDAB/PLA纳米佐剂具有良好的佐剂效果。

实施例19

采用实施例9的DC-Chol/PLA纳米球和比较例2的DC-Chol/PLA微球对模式抗原OVA进行吸附携载，抗原吸附采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用C57小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DC-Chol/PLA纳米粒子佐剂组、1μm的DC-Chol/PLA微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，免疫剂量为100μL/只，其中OVA含量为25mg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天进行免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，结果表明100nm纳米球佐剂组抗体水平显著高于铝盐佐剂组和1μm佐剂组，其中纳米佐剂组抗体水平是1μm佐剂组的5～6倍。

实施例20

采用实施例11的DOTAP/PLGA纳米球和比较例3的DOTAP/PLGA微球对流感裂解疫苗H1N1进行吸附携载，抗原吸附采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DOTAP/PLGA纳米球组、1μm DOTAP/PLGA组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，免疫剂量为100μL/只，其中流感疫苗HA含量为3μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分两次免疫，分别于第0天、14天进行免疫。在预先设定的时间14天、28天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG和血凝抑制抗体HI的检测，结果表明，纳米球佐剂组优于铝盐佐剂组和微米球佐剂组，显示了优良的佐剂性能。

实施例21

采用实施例13的DDAB/PELA纳米球和比较例4的DDAB/PELA微球对多肽疫苗HPV进行吸附携载，抗原吸附采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DDAB/PELA纳米粒子佐剂组、1μm的DDAB/PELA微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，免疫剂量为100μL/只，其中多肽疫苗10μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分两次免疫，分别于第0天、28天免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，结果表明纳米粒子的免疫效果显著优于其他组别。

实施例22

采用实施例14的DDAB/PGA纳米球和比较例5的DDAB/PGA微球对流感DNA疫苗进行吸附携载，DNA吸附采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DDAB/PGA纳米粒子佐剂组、1μm的DDAB/PGA微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，免疫剂量为100μL/只，其中流感疫苗DNA含量为10μg，采用腿部肌肉注射的方式免疫，每只腿注射50μL。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天进行免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，检测结果表明，纳米粒子的免疫效果显著优于1μm微球佐剂组和铝盐佐剂组。

实施例23

采用实施例15的DDAB/PCL纳米球和比较例6的DDAB/PCL微球对炭疽疫苗rPA进行吸附携载，抗原吸附量采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DDAB/PCL纳米粒子佐剂组、1μm的DDAB/PCL微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，采用背部皮下免疫方式，免疫剂量为100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天进行免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，检测结果表明纳米粒子佐剂组的免疫效果显著优于1μm的微球佐剂组和铝盐佐剂组。

实施例24

采用实施例16的DDAB/PAA纳米球和比较例7的DDAB/PAA微球对炭疽疫苗rPA进行吸附携载，抗原吸附量采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DDAB/PAA纳米粒子佐剂组、1μm的DDAB/PAA微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，采用背部皮下免疫方式，免疫剂量为100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天进行免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，检测结果表明纳米粒子佐剂组的免疫效果显著优于1μm的微球佐剂组和铝盐佐剂组。

实施例25

采用实施例17的DDAB/PCS纳米球和比较例8的DDAB/PCS微球对炭疽疫苗rPA进行吸附携载，抗原吸附量采用BCA法进行检测，抗原吸附率达80％以上；随后采用Balb/C小鼠(雌性，4-6周)，对其进行免疫实验，实验分为五组，每组6只，分别为不免疫组、纯抗原组、DDAB/PCS纳米粒子佐剂组、1μm的DDAB/PCS微球佐剂组和铝盐佐剂对照组，进行免疫实验，采用背部皮下免疫方式，免疫剂量为100μL/只，其中rPA含量5μg。分三次免疫，分别于第0天、14天、28天进行免疫。在预先设定的时间第14天、28天、38天，进行静脉取血，测定血清中特异性抗体IgG含量，检测结果表明纳米粒子佐剂组的免疫效果显著优于1μm的微球佐剂组和铝盐佐剂组。

Claims

1.一种载蛋白抗原、多肽抗原或病毒抗原活性药物的聚合物纳米粒子，由高分子聚合物聚合形成的内核和阳离子脂质组成，其特征在于，阳离子脂质穿插在内核中，阳离子脂质头部暴露于纳米粒子表面，使纳米粒子表面带有正电荷；所述聚合物纳米粒子表面通过吸附携载抗原的活性物质；所述聚合物纳米粒子的平均粒径在90-300nm之间，分散系数小于0.2，Zeta电位平均值大于20mV；

所述聚合物为可降解聚合物，选自聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-b-聚乙二醇共聚物(PELA)、聚乙醇酸(PGA)、聚内酯、聚酸酐(PAA)、聚三亚甲基碳酸酯(PCS)；

所述阳离子脂质为双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、双十八烷基二甲基溴化铵、DC-胆固醇(DC-Chol)或[1-(2，3-二油酰基)]-N，N，N-三甲胺丙烷甲基硫酸盐(DOTAP)。

2.一种根据权利要求1所述聚合物纳米粒子的制备方法，其特征在于，所述聚合物纳米粒子通过吸附携载表面带有负电的蛋白质、多肽、病毒粒子，吸附的主要作用力为正负电荷相互作用；所述的聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

(1)将可降解聚合物和阳离子脂质共同溶于有机溶剂中作为油相O；

(2)将去离子水作为水相W；

(3)将所述含聚合物和阳离子脂质的油相加入水相W，机械搅拌形成聚合物纳米粒子悬浊液；

(4)将所述得到的聚合物纳米粒子悬浊液，持续搅拌去除残留有机溶剂，离心或者过膜，洗涤，冷冻干燥，得到聚合物纳米粒子。

3.一种制备权利要求1所述的载活性药物的聚合物纳米粒子的方法，包括以下步骤：

(2)将去离子水作为水相W；

(4)将所述得到的聚合物纳米粒子悬浊液，持续搅拌去除残留有机溶剂，离心或者过膜，洗涤，冷冻干燥，得到聚合物脂质球；

(5)将药物溶于去离子水中或缓冲液中，与制备得到的聚合物纳米粒子悬浊液混合，药物被纳米粒子吸附，使其携载到纳米粒子上。

4.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于，所述表面带负电荷的药物携载于聚合物纳米粒子表面的量为5-30μg/mg。

5.根据权利要求2、3任一项所述的方法，其特征在于，所述的油相由乙醇和丙酮组成，油相中乙醇的体积比为20-60％；所述油相中的阳离子脂质材料与不同的生物可降解的聚合物材料进行配比，聚合物材料与阳离子脂质材料的质量比为10∶1-10∶5；

所述聚合物在油相中的浓度为3-10mg/mL；油相与水相的体积比为1∶20-1∶3。

6.根据权利要求2、3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的搅拌转速为200-600rpm；所述步骤(4)中持续搅拌时间为10-12小时。