CN111467487A - 阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法，包括以下步骤：将聚乳酸类材料及阳离子表面活性剂溶于有机溶剂中作为油相，将水作为水相；在搅拌下将油相匀速缓慢地滴加到水相中，形成水包油型乳液；将水包油型乳液通过减压蒸发固化得到阳离子脂质纳米球的悬浮液；将阳离子脂质纳米球的悬浮液通过切向流超滤法进行循环洗涤，收集得到阳离子脂质纳米疫苗佐剂。本发明制备方法简单，批次间重复性良好，易于工业化生产，制得的阳离子脂质纳米疫苗佐剂对多种抗原吸附率良好，具有抗原普适性，且免疫效果显著。

Description

阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医药工程的药物制剂领域，尤其涉及一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法，可放大制备，易于工业化生产。
背景技术
佐剂是为了克服传统疫苗免疫原性弱的问题而在疫苗注射前或者与疫苗同时注入体内的一种能够增强机体免疫应答的物质。铝盐佐剂是如今临床应用最为广泛的被FDA批准的人用疫苗佐剂，但是随着使用范围的扩大其不足之处逐渐显露出来——注射后易在注射部位形成难以降解的硬结、不能诱导产生有效的细胞免疫应答等。生物可降解聚合物纳米颗粒具有无毒、粒径可控、能够最大程度提升机体免疫应答的优点，阳离子脂质纳米疫苗佐剂能够显著提高体液免疫和细胞免疫水平。阳离子纳米疫苗佐剂通常采用纳米沉淀法进行制备，充分固化后采用高转速离心后超声进行反复洗涤并浓缩。
传统纳米沉淀法制备阳离子脂质纳米疫苗佐剂的原理为溶剂挥发及扩散，这一过程往往需要在室温下长时间固化，未充分固化的阳离子脂质纳米疫苗佐剂表面形貌不佳、粒径分布不均匀且抗原携载量降低，这就要求传统纳米沉淀法制备阳离子脂质纳米疫苗佐剂时常温固化时间要达到10h以上。使用离心法洗涤收集纳米球的过程中，由于离心转速有限不能将大部分极小粒径的纳米球离心下来而造成洗涤过程中纳米球的损失较大，同时由于高速离心后纳米球沉积成块超声很难均匀分散开，超声功率太大又会影响到纳米球球形以及电位，进一步限制了纳米球的吸附率以及收率，使得使用传统离心法洗涤浓缩最终得到的纳米球产率极低(＜15％)。
总结而言，目前制备阳离子脂质纳米疫苗佐剂所使用的制备方法存在制备时间长、产率及效率低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的是提供一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法，以期至少部分地解决上述提及的技术问题中的至少之一。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
作为本发明的一个方面，提供了一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乳酸类材料及阳离子表面活性剂溶于有机溶剂中作为油相，将水作为水相；
(2)在搅拌下将所述油相匀速缓慢地滴加到水相中，形成水包油型乳液；
(3)将所述水包油型乳液通过减压蒸发固化得到阳离子脂质纳米球的悬浮液；
(4)将所述阳离子脂质纳米球的悬浮液通过切向流超滤法进行循环洗涤，收集得到阳离子脂质纳米疫苗佐剂。
作为本发明的另一个方面，提供了一种利用如上所述的制备方法制得的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，呈规则球形且粒径均匀分布。
基于上述技术方案，本发明的有益效果在于：
(1)有机试剂在真空的状态下沸点降低，通过减压蒸发能够加速有机试剂挥发进程，缩短固化时间；切向流超滤法较为温和，经过多次洗涤浓缩可以将充分固化后的纳米疫苗佐剂中未挥发完全的有机试剂以及表面活性剂不断置换出去，且能保留大多数粒径小的纳米球；
(2)通过优化投药量、油水比、旋转蒸发时间以及水循环次数，利用旋转蒸发法与切向流超滤法相结合的方法制备阳离子脂质纳米疫苗佐剂能够将制备时间从10h以上缩减到3～6h，产率从不足15％提高到90％以上，且操作简便、批次间重复性良好、易于工业化生产；
(3)使用该方法制备所得阳离子脂质纳米疫苗佐剂具有小粒径、带有稳定正电荷以及能够诱导较高水平的细胞和体液免疫应答的特点，对多种抗原具有普适性。
附图说明
图1是本发明实施例阳离子脂质纳米疫苗佐剂的制备装置及流程示意图；
图2-A是本发明实施例3所得阳离子脂质纳米疫苗佐剂的扫描电镜图；
图2-B是本发明比较例1所得阳离子脂质纳米疫苗佐剂的扫描电镜图；
图3是本发明实施例16免疫动物后血清中IgG抗体效价；
图4是本发明实施例16免疫后小鼠脾细胞γ-干扰素(IFN-γ)的分泌量；
图5是本发明实施例16免疫后小鼠脾细胞白细胞介素4(IL-4)的分泌量。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明公开了一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂及其制备方法，该制备方法具有缩短制备时间、产品收率高、批次间重复性良好、易于工业化生产的优点，使用该制备方法制备得到的阳离子脂质纳米疫苗佐剂具有小粒径、稳定正电荷以及能够有效诱导较高水平的细胞和体液免疫应答的特点，且对多种抗原具有普适性。
本发明提供了一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将聚乳酸类材料及阳离子表面活性剂溶于有机溶剂中作为油相，将水作为水相；
(2)在搅拌下将所述油相匀速缓慢地滴加到水相中，形成水包油型乳液；
(3)将所述水包油型乳液通过减压蒸发固化得到阳离子脂质纳米球的悬浮液；
(4)将所述阳离子脂质纳米球的悬浮液通过切向流超滤法进行循环洗涤，收集得到阳离子脂质纳米疫苗佐剂。
步骤(1)中，所述聚乳酸类材料为聚乳酸共聚物、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乳酸-聚乙二醇共聚物中的任意一种或至少两种的混合物；所述聚乳酸材料的分子量为6000～30000，例如可以是6000、6500、7000、8000、8200、9000、10000、12000、15000、16000、19000、19500、20000、25000、30000等；优选为8000～20000；
所述有机溶剂具体为乙醇及丙酮混合物，当然不局限于此，还可以是其它水溶性或可挥发溶剂；本发明具体使用超纯水作为水相，“超纯水”在本领域中是指几乎不含任何杂质的水，具体指25℃下电阻率达到或接近18MΩ·cm的水。
所述阳离子表面活性剂具体为双十八烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵和双十烷基二甲基溴化铵中的任意一种或至少两种的混合物。
以聚乳酸类材料和阳离子表面活性剂的总质量为100％，所述聚乳酸类材料的加入量为总质量的74％～91，例如可以是74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、85％、87％、89％、91％等，优选为77～83％；所述阳离子表面活性剂的加入量为总质量的9％～26％，例如可以是9％、11％、13％、15％、17％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％，优选为17～23％。
步骤(2)中，油相和水相的体积比为1∶4～1∶7.3，例如可以是1∶4、1∶4.5、1∶5、1∶5.5、1∶6、1∶6.5、1∶7.3；优选为15～16；滴加时间为0.5～3h，例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、1h、1.1h、1.5h、2h、2.1h、2.5h、3h；优选为0.6～2h。滴加速度对粒径的影响不大，但对抗原吸附率有影响，滴加速度过快会导致抗原吸附率降低。
步骤(3)中，减压蒸发时间为0.5～10h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h；优选为3～6h；优选地，减压蒸发温度为10～70℃；减压蒸发压力为-0.01～0.8Pa。可以理解，减压蒸发的温度和压力根据具体选择的溶剂进行调整，从而更好地控制减压蒸发时间。
步骤(4)中，切向流超滤法循环洗涤的次数为1～6次，例如可以是1次、2次、3次、4次、5次、6次；优选为3～4次。优选地，切向流超滤膜的截留分子量为100kDa。
本发明还提供了一种如上述的制备方法制得的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，其呈规则球形且粒径均匀分布。具体地，其粒径介于120～200nm。
以下是列举具体实施例来对本发明的技术方案做详细说明：
实施例1
如图1所示，准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相匀速滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发10h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂，粒径在140～160nm产率为95％。
将制备所得的阳离子脂质纳米球悬浮液与抗原溶液等体积混合，抗原终浓度为250μg/ml，纳米球的终浓度为5mg/ml，室温下垂直混悬3h，将疫苗制剂于16000g力下离心5min，吸取上清，使用micro BCA试剂盒测量上清中游离抗原浓度，间接计算出吸附到纳米球表面抗原的含量，测得阳离子脂质纳米球对OVA抗原吸附率为75％。
实施例2
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发0.5h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂，粒径在190～220nm，产率为93％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为60％。
实施例3
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。电镜图如图2-A所示，粒径在120～140nm，产率为97％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为85％。
实施例4
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为20kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在150～160nm，产率为94％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为80％。
实施例5
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为0.5h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在150～170nm，产率为95％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为55％。
实施例6
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.35g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在140～150nm，产率为98％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为80％。
实施例7
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.1g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在110～130nm，产率为96％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为73％。
实施例8
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于200ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在120～140nm，产率为95％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为76％。
实施例9
准确量取1000ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于200ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的VivaflowS0膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在120～130nm，产率为96％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为82％。
实施例10
准确量取1050ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的VivaflowS0膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在120～130nm，产率为97％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为75％。
实施例11
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在130～140nm，产率为96％。采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为乙肝重组抗原，得到对乙肝重组抗原吸附率为92％。
实施例12
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在130～140nm，产率为97.5％。采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为流感病毒NM2e，得到对流感病毒NM2e吸附率为80％。
实施例13
准确量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤3次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在130～140nm，产率为97％。采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为MERS病毒抗原，得到对MERS病毒抗原吸附率为90％。
实施例14
准量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤1次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在140～150nm，产率为96％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为73％。
实施例15
准量取900ml超纯水置于中型反应釜内作为水相，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.3g及分子量为10kDa的PLA 1g溶于150ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相装入反应釜滴定装置内，在210～260rpm/min恒定转速的搅拌下，将油相逐渐滴加到水相中，滴加时间为1h，滴加完毕后将反应釜内液体立即转移至2L烧瓶内，在温度25℃、压力为0.08Pa减压蒸发条件下旋转蒸发6h后得到阳离子脂质纳米球悬浮液，使用截留分子量为100kDa的Vivaflow50膜循环洗涤6次并浓缩，即得阳离子脂质纳米疫苗佐剂。粒径在140～150nm，产率为96％。采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为82％。
比较例1
准确量取90ml超纯水放于250ml烧杯内作为水相，将烧杯置于磁力搅拌器上，调整磁力搅拌转速为500rpm，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.03g及分子量为10kDa的PLA0.1g溶于15ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相，使用胶头滴管在500rpm/min恒定转速的搅拌下将油相缓慢滴加到水相中，采用相同制备方法制备10批，均置于通风橱内过夜挥发10h。将固化后的纳米球20000g离心力下离心15min，重复洗涤三次，向洗好的纳米球中加入少量的超纯水超声重悬后，5000g离心力下离心10min收集上清，即得传统纳米沉淀法制备、离心法洗涤的阳离子脂质纳米疫苗佐剂。扫描电镜图如图2-B所示，粒径在170～180nm，产率为15％，采用与实施例1相同的吸附操作，得到对OVA抗原吸附率为84％。
比较例2
准确量取90ml超纯水放于250ml烧杯内作为水相，将烧杯置于磁力搅拌器上，调整磁力搅拌转速为500rpm，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.03g及分子量为10kDa的PLA0.1g溶于15ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)，超声使其均匀混合后作为油相，使用胶头滴管在500rpm/min恒定转速的搅拌，下将油相缓慢滴加到水相中，采用相同制备方法制备10批，均置于通风橱内过夜挥发10h。将固化后的纳米球20000g离心力下离心15min，重复洗涤三次，向洗好的纳米球中加入少量的超纯水超声重悬后，5000g离心力下离心10min收集上清，即得传统纳米沉淀法制备、离心法洗涤的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，产率为14％，采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为乙肝重组抗原，得到对乙肝重组抗原吸附率为95％。
比较例3
准确量取90ml超纯水放于250ml烧杯内作为水相，将烧杯置于磁力搅拌器上，调整磁力搅拌转速为500rpm，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.03g及分子量为10kDa的PLA0.1g溶于15ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)超声使其均匀混合后作为油相，使用胶头滴管在500rpm/min恒定转速的搅拌下将油相缓慢滴加到水相中，采用相同制备方法制备10批，均置于通风橱内过夜挥发10h。将固化后的纳米球20000g离心力下离心15min，重复洗涤三次，向洗好的纳米球中加入少量的超纯水超声重悬后，5000g离心力下离心10min收集上清，即得传统纳米沉淀法制备、离心法洗涤的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，产率为15％，采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为流感病毒NM2e，得到对流感病毒NM2e吸附率为79％。
比较例4
准确量取90ml超纯水放于250ml烧杯内作为水相，将烧杯置于磁力搅拌器上，调整磁力搅拌转速为500rpm，准确称取双十八烷基二甲基溴化铵0.03g及分子量为10kDa的PLA0.1g溶于15ml有机溶剂中(乙醇∶丙酮＝1∶1)超声使其均匀混合后作为油相，使用胶头滴管在500rpm/min恒定转速的搅拌下将油相缓慢滴加到水相中，采用相同制备方法制备10批，均置于通风橱内过夜挥发10h。将固化后的纳米球20000g离心力下离心15min，重复洗涤三次，向洗好的纳米球中加入少量的超纯水超声重悬后，5000g离心力下离心10min收集上清，即得传统纳米沉淀法制备、离心法洗涤的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，产率为16％，采用与实施例1相同的吸附操作，区别在于仅将抗原替换为MERS病毒抗原，得到对MERS病毒抗原吸附率为86％
实施例16
选择6～8周的雌性BALB/c小鼠，采用腿部肌肉注射免疫方式，分别在第0、14和28天免疫一次，由实施例3制得的阳离子纳米疫苗佐剂作为实验组，铝盐佐剂以及以及纯抗原组作为对照组，OVA为抗原，各疫苗制剂每只小鼠的免疫剂量为100μL，相应的抗原量均为25μg。于免疫后的第14、21、28和35天收集小鼠血清，用于检测血清IgG抗体效价，第35天处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，体外刺激培养收集细胞培养上清，用于测定脾细胞细胞因子分泌水平。免疫结果表明，使用减压蒸发结合切向流超滤法制备而得的阳离子纳米疫苗佐剂与铝佐剂及纯抗原相比能够显著提升血清中特异性IgG抗体效价(图3)，同时细胞免疫相关细胞因子的水平如γ-干扰素(IFN-γ)(图4)和白细胞介素4(IL-4)(图5)分泌的水平上，也显示出比纯抗原及铝盐佐剂更好的免疫应答效果。
实施例17
选择6～8周的雌性BALB/c小鼠，采用腿部肌肉注射免疫方式，分别在第0、14和28天免疫一次，由实施例10制得的阳离子纳米疫苗佐剂作为实验组，铝盐佐剂以及以及纯抗原组作为对照组，重组乙肝为抗原，各疫苗制剂每只小鼠的免疫剂量为100μL，相应的抗原量均为2μg。于免疫后的第14、21、28和35天收集小鼠血清，用于检测血清IgG抗体效价，第35天处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，体外刺激培养收集细胞培养上清，用于测定脾细胞细胞因子分泌水平。免疫结果证实，使用减压蒸发结合切向流超滤法制备而得的阳离子纳米疫苗佐剂与铝佐剂及纯抗原相比能够显著提升血清中特异性IgG抗体效价，并且能显著提高细胞免疫相关细胞因子分泌。
实施例18
选择6～8周的雌性BALB/c小鼠，采用腿部肌肉注射免疫方式，分别在第0和28天免疫一次，由实施例11制得的阳离子纳米疫苗佐剂作为实验组，铝盐佐剂以及以及纯抗原组作为对照组，流感病毒NM2e为抗原，各疫苗制剂每只小鼠的免疫剂量为100μL，相应的抗原量均为10μg。于免疫后的第14、35和42天收集小鼠血清，用于检测血清IgG抗体效价，第42天处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，体外刺激培养收集细胞培养上清，用于测定脾细胞细胞因子分泌水平。免疫结果证实，使用减压蒸发结合切向流超滤法制备而得的阳离子纳米疫苗佐剂与铝佐剂及纯抗原相比能够显著增强体液免疫和细胞免疫水平，尤其是细胞免疫水平。
实施例19
选择6～8周的雌性BALB/c小鼠，采用腿部肌肉注射免疫方式，分别在第0和28天免疫一次，由实施例12制得的阳离子纳米疫苗佐剂作为实验组，铝盐佐剂以及以及纯抗原组作为对照组，流感病毒MERS为抗原，各疫苗制剂每只小鼠的免疫剂量为100μL，相应的抗原量均为10μg。于免疫后的第14、35和42天收集小鼠血清，用于检测血清IgG抗体效价，第42天处死小鼠，无菌条件下取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，体外刺激培养收集细胞培养上清，用于测定脾细胞细胞因子分泌水平。免疫结果证实，使用减压蒸发结合切向流超滤法制备而得的阳离子纳米疫苗佐剂与铝佐剂及纯抗原相比能够显著增强体液免疫和细胞免疫水平。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种阳离子脂质纳米疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将聚乳酸类材料及阳离子表面活性剂溶于有机溶剂中作为油相，将水作为水相；
(2)在搅拌下将所述油相匀速缓慢地滴加到水相中，形成水包油型乳液；
(3)将所述水包油型乳液通过减压蒸发固化得到阳离子脂质纳米球的悬浮液；
(4)将所述阳离子脂质纳米球的悬浮液通过切向流超滤法进行循环洗涤，收集得到阳离子脂质纳米疫苗佐剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚乳酸类材料为聚乳酸共聚物、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乳酸-聚乙二醇共聚物中的任意一种或至少两种的混合物；
所述聚乳酸类材料的分子量为6000～30000，优选为10000～20000。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中：
所述有机溶剂为乙醇和丙酮混合物；
所述阳离子表面活性剂为双十八烷基二甲基溴化铵、双十二烷基二甲基溴化铵和双十烷基二甲基溴化铵中的任意一种或至少两种的混合物，优选为双十八烷基二甲基溴化铵。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，以聚乳酸类材料和阳离子表面活性剂的总质量为100％，所述聚乳酸类材料的加入量为总质量的74％～91％，优选为77％～83％；所述阳离子表面活性剂的加入量为总质量的9～26％，优选为17～23％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述油相和水相的体积比为1∶4～1∶7，优选为1∶5～1∶6；滴加时间为0.5～3h，优选为0.6～2h。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，减压蒸发时间为0.5～10h，优选为3～6h；
优选地，减压蒸发温度为10～70℃；减压蒸发压力为-0.01～0.8Pa。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述切向流超滤法循环洗涤的次数为1～6次，优选为3～4次。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述切向流超滤法使用的滤膜的截留分子量优选为100KDa。
9.一种利用如权利要求1至8任意一项所述的制备方法制得的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，其呈规则球形且粒径均匀分布。
10.如权利要求9所述的阳离子脂质纳米疫苗佐剂，其特征在于，其粒径介于120～200nm。
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