CN112641935B

CN112641935B - 一种含颗粒载体的亚单位疫苗及其应用

Info

Publication number: CN112641935B
Application number: CN202011102325.2A
Authority: CN
Inventors: 赵兴旺; 李华珍; 章家泉
Original assignee: Baikui Rui Shenzhen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Baikui Rui Shenzhen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2040-10-15
Also published as: CN112641935A

Abstract

本发明公开了一种含颗粒载体的亚单位疫苗及其应用，并以新型冠状病毒COVID‑19疫苗为例，提供了一种纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID‑19疫苗。本发明的方案通过不同的纳米/微米材料为载体，实现亚单元抗原在载体上的自组装，充分模拟病毒或细菌的表面结构。实现提高免疫原性，简化生产工艺，降低生产成本的优点。不同的抗原蛋白通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到不同粒径的纳米/微球颗粒上，形成表明结构与病毒相似的类病毒颗粒或与细菌结构相似的类细菌颗粒，从而提高疫苗的免疫原性。

Description

一种含颗粒载体的亚单位疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种含颗粒载体的亚单位疫苗及其应用。

背景技术

疫苗仍然是控制和预防传染病的最具成本效益和最成功的干预措施，被确定为20世纪实现的人类平均寿命延长30年的关键因素。疫苗的广泛应用使自然发生的天花感染被根除，脊髓灰质炎几近根除，麻疹、风疹、腮腺炎、百日咳和白喉等疾病的发病率大大降低，这些都有助于降低全球传染病的死亡率和发病率。

传统的疫苗策略主要是基于减毒或灭活病原体(如病毒活细菌)。这些策略在诱导宿主有效的B细胞和T细胞反应以及长寿免疫反应方面表现出了良好的效果。一般来说，减毒或灭活病原体的传统疫苗表现出极好的免疫原性，以基于减毒病毒疫苗为例，其强免疫原性主要是由于以下几个关键参数：1)减毒病毒的复制能力；2)其重复的表面几何形状；3)颗粒性；4)刺激天然和适应性免疫反应的能力。但这些疫苗具有很高效力的同时也伴随一些副作用，比如生产过程中存在传播病原体的风险、化学灭活不彻底及弱毒毒力返强引起的免疫缺陷患者禁忌症等问题。

随着现代分子生物技术的兴起，特别是重组DNA技术和基因工程的不断发展，亚单位疫苗越来越受到研究者的关注。亚单位疫苗是将病原体的保护性抗原基因在表达系统中表达，并以蛋白质或多肽的形式制备成疫苗。该类疫苗具有安全性好，纯度高，稳定和生产方便等特点，但相比传统疫苗，其免疫效果较差，这就要求在实际使用中，需要增加剂量，或通过使用免疫增强剂或佐剂的方式提高免疫效力，从而使亚单位疫苗的实际应用受到了较大限制。

病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是亚单位疫苗研究中发现的一种具有高免疫效力、高安全性的疫苗。其含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，俗称伪病毒。虽然病毒样颗粒疫苗的出现降低了传统疫苗所带来的疫苗安全问题，也大大增强了免疫效果。但是，在抗原蛋白进行自组装的过程中，抗原蛋白的正确自组装与蛋白质亚基之间的错误聚集会形成竞争，带入错误聚集体，会导致严重的副反应，另一方面，VLP的自组装也有可能失败。当病毒发生变异时，抗原蛋白的疏水性和电荷会发生改变，为了平衡蛋白间的疏水作用和亚基间的电荷相互排斥作用力，需要重新对抗原蛋白进行改造使其正确组装，这个过程费时费力。导致疫苗研发难度加大。目前商业疫苗常见的多为多价疫苗，不同抗原的VLPs一般需要分别生产，再进行混合，导致研发、生产成本很高。

亚单位细菌疫苗也是亚单位疫苗的一种，其将致病原细菌可以激发免疫反应的蛋白或者多糖进行提取、提纯、组装等过程，筛选出的具有免疫活性的片段所制成的疫苗。其中蛋白类抗原刺激产生T细胞依赖性免疫反应，而多糖抗原则引发T细胞非依赖性免疫反应。由于多糖抗原免疫原性较弱，一般采用多糖与蛋白结合来增强免疫应答。亚单位细菌疫苗也存在与VLP疫苗类似的弊端，如蛋白错误聚集会产生严重的副反应，研发周期较长，研发成本高，生产工艺复杂等。

纳米/微球颗粒是粒径为纳米或微米级的球状材料，由于粒径的特异性，具有独特的物化性质，如巨大的比表面积、强烈的量子效应和界面效应等，使其在工业、科技和医学等领域均有广泛的应用，成为各国发展最快的科学研究和技术开发领域之一。纳米/微球颗粒的大小和病毒或细菌的大小相类似。其中纳米颗粒可应用胞吞机制，尤其是胞饮作用而进入细胞。纳米颗粒不仅具有免疫佐剂活性，有助于抗原在细胞内加工，与主要组织相容性复合体分子特异性结合、运输并递呈给效应细胞，增强机体产生天然免疫应答，而且还能够通过多种途径到达抗原提呈细胞，调节免疫应答。在预防性和治疗性疫苗中，纳米颗粒被用作运输系统增加抗原提呈或作为免疫佐剂激活和增强机体产生免疫应答。因此，结合上述纳米/微球颗粒的优势，开发一种含颗粒载体的亚单位疫苗以提高疫苗的免疫原性是业界亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种含颗粒载体的亚单位疫苗。

本发明所解决的技术问题还在于公开了该颗粒载体的亚单位疫苗技术在制备疫苗中的应用。并以新型冠状病毒COVID-19疫苗为例，提供了一种纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种含颗粒载体的亚单位疫苗，该亚单位疫苗包括颗粒载体和结合于所述颗粒载体上的抗原，所述抗原为抗原蛋白或者抗原多肽，所述抗原为病原体特异性抗原，所述抗原结合于所述颗粒载体形成易发生免疫反应的类病原体颗粒。

优选地，所述颗粒载体为纳米颗粒载体。所述纳米颗粒载体为非生物原的纳米颗粒生物原的纳米颗粒，非生物原的纳米颗粒包括树状分子、碳富勒烯、固体脂质纳米颗粒、纳米乳剂；生物原的纳米颗粒如寡核苷酸、多糖以及可作为抗原、变应原、病原体的相关分子模式。

优选地，所述颗粒载体为微球颗粒载体。所述纳米颗粒载体为微米级的硅胶颗粒、三氧化二铝微米颗粒、二氧化钛微米颗粒、碳酸钙微米颗粒。

优选地，所述抗原通过包括静电作用、疏水作用、氢键在内的物理吸附、化学共价偶联或特异性结合吸附到颗粒载体上。

对于颗粒载体粒径尺寸的选择，通常是基于疫苗对应的病原体，为了能够形成易发生免疫反应的类病原体颗粒，一般使用颗粒载体来控制疫苗的大小和形态。不同的抗原蛋白通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到特定粒径的纳米/微球颗粒上，形成类病毒颗粒或类细菌颗粒。

首先，抗原蛋白种类不限；不拘泥于表达系统(大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、枯草杆菌表达系统，昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、杆状病毒表达系统)。

纳米/微球颗粒种类不限上述已举例，品种繁多的合成的多聚体被用来制备纳米颗粒，例如聚丙交酯乙交酯(PLG)、聚乳酸乙醇酸(PLGA)、聚谷氨酸(g-PGA)、聚乙二醇(PEG)及聚苯乙烯。碳纳米颗粒、硅纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒等。非生物原的纳米颗粒如树状分子、碳富勒烯、固体脂质纳米颗粒、纳米乳剂；生物原的纳米颗粒如寡核苷酸、多糖以及可作为抗原、变应原、病原体的相关分子模式等；

微米级的硅胶颗粒、三氧化二铝微米颗粒、二氧化钛微米颗粒、碳酸钙微米颗粒等。

吸附方法不限。通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到不同粒径的纳米/微球颗粒上。

另一方面，本发明还提供了该颗粒载体的亚单位疫苗技术在制备疫苗中的应用。并以新型冠状病毒COVID-19疫苗为例，提供了一种纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗：

一种纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗，该疫苗包括纳米颗粒载体和结合于所述颗粒载体上的抗原，所述抗原为基于新型冠状病毒 SARS-CoV-2RBD-SD1蛋白设计的自组装蛋白，所述自组装蛋白包含与纳米颗粒载体相接的一端连接的一段连接肽，以及与纳米颗粒载体相结合的结合肽。

优选地，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2RBD-SD1蛋白的序列如SEQ ID NO：2所示，其编码基因NDA序列如SEQ ID NO：1所示，所述自组装蛋白序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，所述纳米颗粒载体为二氧化硅纳米颗粒，所述结合肽为二氧化硅结合肽。

本发明以纳米/微球颗粒为载体，构建与病原体形态相似的亚单元疫苗。抗原蛋白通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到特定粒径的纳米/微球颗粒上，形成类病毒颗粒或类细菌颗粒(其原料如图1所示)，其外观结构与病毒或细菌接近，从而提高疫苗的免疫原性。并具有如下有益效果：

1、本发明的方案通过不同的纳米/微米材料为载体，实现亚单元抗原在载体上的自组装，充分模拟病毒或细菌的表面结构。实现提高免疫原性，简化生产工艺，降低生产成本的优点。不同的抗原蛋白通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到不同粒径的纳米/微球颗粒上，形成表明结构与病毒相似的类病毒颗粒或与细菌结构相似的类细菌颗粒。

2、避免了抗原蛋白的聚集沉淀现象

3、病毒或细菌产生变异时，只需更改蛋白的种类，即可得到相应的类病毒颗粒/类细菌颗粒样品。不需要进行抗原蛋白的重头设计，节约研发时间，降低研发成本。

4、通过改变纳米/微球颗粒的粒径，可以改变类病毒颗粒/类细菌颗粒的粒径。

5、形成的类病毒颗粒/类细菌颗粒具有病毒/细菌的外观结构，有着较强的免疫原活性。

6、由于不含有病毒或细菌的遗传物质，不能进行自我复制，大大的提高了安全性。

附图说明

图1是本发明技术原理图。

图2是本发明实施例1的技术原理图。

图3目标蛋白纯化概况。考马斯亮蓝染色，免疫印迹法，M.分子量标记。 ME.培养基。FT.流出液W.洗涤液E.洗脱组分。

图4最终样品考马斯亮蓝染色，M.分子量标记。1.还原性样品.2.非还原性样品。

图5直径20nm的二氧化硅纳米颗粒扫描电镜图。

图6纯化后抗体检测结果图。

图7抗体纯度检测图。

图8不同蛋白浓度的硅球(10μm)吸附量比较图。

图9直径10μm的二氧化硅微米颗粒扫描电镜图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗的制备

本实施例是一种基于蛋白自组装的可控纳米病毒样颗粒新型冠状病毒 COVID-19疫苗的制备。其中抗原蛋白选择新型冠状病毒SARS-CoV-2 RBD-SD1 蛋白，抗原蛋白上接上一段多肽linker、以及一段二氧化硅结合肽(silica binding peptide)。其中，linker的作用是连接结合肽与抗原蛋白，二氧化硅结合肽的作用是增加抗原蛋白与二氧化硅纳米颗粒的特异性结合力。表达系统为哺乳动物细胞。连接linker及结合肽的抗原蛋白通过与粒径20nm的二氧化硅纳米颗粒结合，组装成病毒样COVID-19疫苗，其原理如图2所示

通过对小鼠的免疫制备多克隆抗体。ELISA实验检测血清效价，比较抗体滴度。具体步骤如下：

1、病原体及抗原蛋白的选择

病原体选择如今新兴的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，SARS-CoV-2利用其表面的S蛋白锁定人类细胞表面的ACE2受体。一旦进入细胞，病毒会利用细胞的场所和物质将自身RNA转化成更多的病毒。故抗原蛋白选择SARS-CoV-2 RBD-SD1蛋白。如SEQ ID NO：2所示。

2、SARS-CoV-2 RBD-SD1自组装蛋白的设计，最终设计出的自组装蛋白序列如SEQID NO：3所示。

3、SARS-CoV-2 RBD-SD1自组装蛋白的小试表达

抗原蛋白：SARS-CoV-2 RBD-SD1自组装蛋白

蛋白序号：P300197

表达系统：哺乳动物细胞Expi293

实验设计：用Expi293细胞转染P300197。转染后第5天收集培养液。将培养基混合，用Ni-NTA进行纯化。

纯化方案:由His-NTA净化,-PBS,20mM咪唑，pH7.4，-PBS洗脱，500mM 咪唑，pH7.4，通过sds-page分析，结果如图3所示。将E组分合并，置换buffer 后浓缩。得到最终的样品进行SDS-page分析，结果如图2所示。小试表达最终得到：a)蛋白质量:1.1mg；b)蛋白浓度:0.22mg/ml,5ml；c)蛋白质浓度测定方法:By Nano-drop one；d)缓冲液:PBS,pH 7.4。

4、SARS-CoV-2 RBD-SD1自组装蛋白的放大表达

为了获得更多的自组装蛋白，进行放大表达。表达方法与上述一致，最终得到：a)蛋白质含量:5.5毫克；b)蛋白浓度:1.1mg/ml,5ml；c)蛋白质浓度测定方法:By Nano-dropone；d)缓冲液:PBS,pH 7.4

5、小鼠免疫实验及抗体的制备

利用制备的SARS-CoV-2 RBD-SD1重组自组装蛋白(哺乳表达)作为抗原，进行小鼠免疫。所用纳米/微球颗粒为粒径为20nm的二氧化硅纳米颗粒，浓度为100mg/g水，扫描电镜结果如图5所示。

(1)免疫实验设计：

选择5只6周龄雌性小鼠，对小鼠进行标记并编号，尾静脉采血10～30μl，凝血后离心收集免疫前空白鼠血清。

(2)血清采集：二免后一周和三免后一周，均尾静脉采血，凝血后离心收集血清10～30μl。

(3)ELISA检测血清效价

表1为二免后的ELISA效价检测结果。表2为三免后的ELISA效价结果。结果显示，三次免疫后5只小鼠血清效价相近，可达到1:729000。

表1二次免疫后小鼠血清效价检测OD450读数

表2三次免疫后小鼠血清效价检测OD450读数

(4)抗体的纯化制备

采用抗原亲和纯化法，纯化血清中的抗体，进行纯化抗体效价检测，以及纯化抗体的纯度和浓度检测。纯化后抗体检测结果如图4所示。纯化抗体效价检测结果见表3。抗体纯度检测结果如图5所示。纯化抗体浓度检测结果为 0.33mg/ml。

表3透析样ELISA检测OD450读数

集合上述实施例中的方案可知，本发明以纳米/微球颗粒为载体，构建与病原体形态相似的亚单元疫苗。抗原蛋白通过物理吸附(静电作用，疏水作用、氢键以及其他特定的物理作用)、化学共价偶联或特异性结合吸附到特定粒径的纳米/微球颗粒上，形成类病毒颗粒或类细菌颗粒(其原料如图1所示)，其外观结构与病毒或细菌接近，从而提高疫苗的免疫原性。并具有如下有益效果：

2、避免了抗原蛋白的聚集沉淀现象

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 百葵锐（天津）生物科技有限公司

<120> 一种含颗粒载体的亚单位疫苗及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1004

<212> DNA

<213> 新冠病毒(COVID-19)

<400> 1

atgggcgtgc ccgctgtgcc agaggccagc tctcctaggt ggggcaccct gctgctggcc 60

atctttctgg ccgccagcag aggcctggtg gccgctagag tgcagcctac cgagagcatc 120

gtgagatttc ccaacatcac caacctgtgt cccttcggcg aggtgtttaa tgccaccagg 180

tcgccagcgt gtacgcctgg aacagaaaga ggatcagcaa ctgcgtggcc gattacagcg 240

tgctgtacaa cagcgccagc tttagcacct ttaagtgtta cggcgtgtcc cccaccaagc 300

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ccaagaagag cacaaacctg gtgaagaaca agtgtgtgaa tttcaatttc aacggcctga 780

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tcacaccttg ctccggcggc ggcggcagca tgtctggaag agccagagcc cagaggcagt 960

ccagcagggg caggggaggc agccaccacc accaccatca ctga 1004

<210> 2

<211> 273

<212> PRT

<213> 新冠病毒(COVID-19)

<400> 2

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

225 230 235 240

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

245 250 255

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

260 265 270

Ser

<210> 3

<211> 334

<212> PRT

<213> 新冠病毒(COVID-19)

<400> 3

Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala

20 25 30

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

35 40 45

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

50 55 60

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

65 70 75 80

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

85 90 95

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

100 105 110

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

115 120 125

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

130 135 140

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

145 150 155 160

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

165 170 175

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

180 185 190

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

195 200 205

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

210 215 220

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

225 230 235 240

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

245 250 255

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys

260 265 270

Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp

275 280 285

Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys

290 295 300

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Gly Arg Ala Arg Ala Gln Arg Gln

305 310 315 320

Ser Ser Arg Gly Arg Gly Gly Ser His His His His His His

325 330

Claims

1.一种纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗，其特征在于：该疫苗包括二氧化硅纳米颗粒载体和结合于所述载体上的抗原蛋白，所述抗原蛋白的序列如SEQ ID NO：3所示。

2.如权利1任意一项所述的纳米病毒样颗粒新型冠状病毒COVID-19疫苗在制备疫苗产品中的应用。