CN112521511A - 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。该自组装纳米颗粒，包含第一多肽和第二多肽；所述第一多肽包含gB蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53‑50A1，所述第二载体亚基为I53‑50B.4PT1。本发明提供的自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gB蛋白展示在纳米颗粒表面，其粒径较抗原gB大，化学稳定性、与中和抗体的的结合能力高于抗原gB，有利于增加其在B细胞抗原受体的驻留时间，刺激抗体的产生；同时，自组装纳米颗粒能够诱导较高的动物免疫抗体滴度，可用于预防EB病毒感染及治疗EB病毒感染所引起的疾病。

Description

一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr Virus,EBV)，属于疱疹病毒家族，具有潜伏感染能力，是最早被鉴定的致癌病毒之一。EBV感染世界范围内95％人群，在青少年人群中主要引起传染性单核细胞增多症；而且在成人中与鼻咽癌、胃癌等上皮细胞性肿瘤以及Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等B细胞性肿瘤的发生发展有密切关系，因此开发EBV疫苗具有重大的公共卫生意义。
作为包膜病毒，EBV通过膜融合的方式感染宿主细胞。这一过程与病毒表面的膜融合蛋白gB、gH/gL、gp42等和宿主细胞受体的相互作用完成。目前已发现它们的中和抗体有抑制EBV感染上皮细胞或B细胞的能力，因此这些主要的膜融合蛋白是开发EBV疫苗理想的候选抗原。作为膜融合过程最后的共同执行蛋白，gH-gL和gB共同发挥作用，从而促进EBV的融合过程，但是，目前几乎所有的EBV疫苗都使用gp350以及gH-gL这些受体结合蛋白作为靶标，而极少使用gB作为免疫原。gB具有三聚化的构象，其结构相对gH-gL等蛋白更为复杂，功能更为多样，开发以gB作为免疫原的疫苗具有更多未知性以及挑战性。
发明内容
为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种含gB蛋白的自组装纳米颗粒。
本发明的第二个方面的目的，在于提供一种含gB蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法。
本发明的第三个方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。
本发明的第四个方面的目的，在于提供上述一种包含上述自组装纳米颗粒的疫苗。
本发明的第五方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种含gB蛋白的自组装纳米颗粒，包含第一多肽和第二多肽；所述第一多肽包含gB蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gB蛋白与第一载体亚基通过连接肽(linker)连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gB蛋白，更好地激发机体的免疫反应。
优选的，所述第一载体亚基与所述第二载体亚基以非共价相互作用自组装形成纳米结构，所述第一载体亚基包覆于所述第二载体亚基的表面，所述gB蛋白展示在纳米结构表面。
所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述gB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述连接肽(linker)为含5～20个氨基酸的多肽；优选为含10～15个氨基酸的多肽；更优选为氨基酸序列为SEQ ID NO：4～9中任一种的多肽；最优选为氨基酸序列为SEQID NO：9的多肽；连接肽用于抗原gB蛋白与载体蛋白的连接，不影响抗原的免疫原性以及蛋白的正确折叠。
优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。
优选的，所述稳定蛋白位于连接肽(linker)与第一载体亚基之间。
所述稳定蛋白优选为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：10)或GCN4肽段(SEQ ID NO：11)；更优选为T4噬菌体纤维蛋白原。
优选的，所述第一多肽为第一多肽三聚体。
优选的，所述第二多肽为第二多肽五聚体。
优选的，所述第一多肽三聚体的拷贝数为18～22，所述第二多肽五聚体的拷贝数为10～14；进一步优选的，所述第一多肽三聚体的拷贝数为20，所述第二多肽五聚体的拷贝数为12。
优选的，所述含gB蛋白的自组装纳米颗粒具有20面体对称性。
本发明的第二个方面，提供一种含gB蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法，将第一多肽与第二多肽孵育，得到；所述第一多肽包含gB蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gB蛋白与第一载体亚基通过连接肽(linker)连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示gB蛋白，更好地激发机体的免疫反应。
所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述第一多肽和第二多肽的摩尔质量比优选为1:(3～6)；更优选为1:5。
所述孵育的条件优选为在组装缓冲液中孵育0.5～2h。
所述组装缓冲液的组成优选为250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油。
所述gB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
所述连接肽(linker)为含5～20个氨基酸的多肽；优选为含10～15个氨基酸的多肽；更优选为氨基酸序列为SEQ ID NO：4～9中任一种的多肽；最优选为氨基酸序列为SEQID NO：9的多肽；连接肽用于抗原gB蛋白与载体蛋白的连接，不影响抗原的免疫原性以及蛋白的正确折叠。
优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。
优选的，所述稳定蛋白位于连接肽(linker)与第一载体亚基之间。
所述稳定蛋白优选为T4噬菌体纤维蛋白原(T4 fibritin)(SEQ ID NO：10)或者GCN4肽段(SEQ ID NO：11)；更优选为T4噬菌体纤维蛋白原。
优选的，所述第一多肽和第二多肽还包含纯化标签。
所述纯化标签优选为组氨酸标签(His标签)，链霉亲和素标签(Strep标签)和麦芽糖结合蛋白(MBP)中的至少一种；更优选为组氨酸标签(His标签)。
所述第一多肽的纯化标签位于稳定蛋白和第一载体亚基之间。
所述第二多肽的纯化标签位于第二载体亚基的末端。
所述第一多肽还含有信号肽，使目的蛋白在表达后能够分泌至上清。
所述信号肽选自CD5信号肽(SEQ ID NO：25)。
所述第一多肽优选通过如下方式获得：将表达第一多肽的核酸引入第一宿主细胞；孵育第一宿主细胞表达第一多肽。
所述第一宿主细胞优选为真核细胞；更优选为人类胚胎肾293细胞(HEK293F)，犬肾细胞(Madin-Daby canine kidney cells,MDCK)，非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)肾细胞(VERO)，SF9(Spodoptera frugiperda9)细胞，HighFive细胞、CHO(Chinese HamsterOvary，中国仓鼠卵巢)细胞和酵母细胞中的至少一种；最优选为人类胚胎肾293细胞。
所述第二多肽优选通过如下方式获得：将表达第二多肽的核酸引入第二宿主细胞；孵育第二宿主细胞表达第二多肽。
所述第二宿主细胞优选为原核细胞；更优选为大肠杆菌；最优选为Rosetta(DE3)。
本发明的第三个方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。
本发明的第四个方面，提供一种包含第一方面的自组装纳米颗粒的疫苗。
一种疫苗，包含上述含gB蛋白的自组装纳米颗粒。
所述疫苗还包括佐剂。
所述佐剂优选为铝佐剂，油乳佐剂如水包油、油包水、双向型乳液，微生物来源类佐剂如肽聚糖(PG)、革兰氏阴性菌外膜脂多糖(Lipopolysccharide,LPS)、分枝杆菌及其组份、GpG寡核苷酸(GpG ODN)、霍乱毒素(Cholera toxin,CT))，微粒抗原递送体系如脂质体、聚合微球体、惰性纳米微球、纳米铝佐剂、免疫刺激复合物(Immunostimulating comples,IS-COM)、细胞因子，多糖类如菊粉(MPI)，天然来源类如蜂胶(propolis)、皂苷(Sapoin)中的至少一种；更优选为铝佐剂和MF59佐剂中的至少一种。
本发明的第五方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。
所述疾病优选为传染性疾病、恶性肿瘤、慢性疾病和自身性免疫疾病中的至少一种；更优选为单核细胞增多症、鼻咽癌、胃癌、上皮细胞性肿瘤、Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性疲劳综合征、多发性硬化和强直性脊髓炎中的至少一种。
所述药品还包括药学上可接受的载体。
本发明的有益效果是：
本发明提供的自组装纳米颗粒首次将EB病毒的gB蛋白展示在纳米颗粒表面，其粒径较抗原(gB)大，热稳定与抗原(gB)相当，化学稳定性高于抗原(gB)，与中和抗体的的结合能力强于抗原(gB)，有利于增加其在B细胞抗原受体的驻留时间，刺激抗体的产生；同时，自组装纳米颗粒能够诱导较高的动物免疫抗体滴度，可用于预防EB病毒感染及治疗EB病毒感染所引起的疾病。
本发明提供的自组装纳米颗粒，虽然引入了异源基因，但其由于是来源于细菌的蛋白，避免了引起自身免疫疾病，具有安全性高的优势，且不影响免疫效果。
附图说明
图1是gB抗原与不同纳米颗粒骨架蛋白的对接示意图：其中，(A)为gB抗原与纳米颗粒骨架蛋白I53-50A1的对接示意图及形成的自组装纳米颗粒示意图；(B)为gB抗原与不同的纳米颗粒骨架蛋白的对接示意图。
图2是自组装纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色图。
图3是自组装纳米颗粒的分子筛色谱图。
图4是自组装纳米颗粒的动态光散射结果图。
图5是自组装纳米颗粒的负染电镜图。
图6是自组装纳米颗粒的冷冻电镜图：(A)为Relion3下自组装纳米颗粒的2D分类示意图；(B)为重构之后的电子密度图。
图7是自组装纳米颗粒的差示荧光扫描结果图：(A)为自组装纳米颗粒的蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化图；(B)为自组装纳米颗粒的蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化的一阶导数值图；(C)为自组装纳米颗粒的蛋白加热过程中散射光的变化图。
图8是自组装纳米颗粒的Tm onset及Tm图：其中，Tm onset为开始出现融解的温度，Tm则为融解温度。
图9是不同颗粒在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化图及蛋白加热过程中散射光的变化图：其中，(A)为纳米颗粒载体(I53-50A NP)在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化图；(B)为gB在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化图；(C)为自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化图；(D)为纳米颗粒载体(I53-50A NP)在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中散射光的变化图；(E)为gB在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中散射光的变化图；(F)为自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)在不同浓度盐酸胍下蛋白在加热过程中散射光的变化图。
图10是不同颗粒与抗体的亲和力检测图：其中，(A)为gB与AMMO5抗体的粘结点图；(B)为亚单位gB-I53-50A1与AMMO5抗体的粘结点图；(C)为自组装纳米颗粒(gB-I53-50ANP)与AMMO5抗体的粘结点图。
图11是小鼠免疫后抗gB的血清滴度图：其中，(A)为不同颗粒免疫小鼠两周后抗gB的血清滴度图；(B)为含佐剂MF59的不同颗粒免疫小鼠两周后抗gB的血清滴度图；(C)为添加/不添加纳米颗粒载体(I53-50A NP)的颗粒免疫小鼠两周后抗gB的血清滴度图；(D)为不同颗粒免疫小鼠五周后抗gB的血清滴度图；(E)为含佐剂MF59的不同颗粒免疫小鼠五周后抗gB的血清滴度图；(F)为添加/不添加纳米颗粒载体(I53-50A NP)的颗粒免疫小鼠五周后抗gB的血清滴度图；图中，*表示P<0.05；**表示P<0.005；***表示P<0.0005；****表示P<0.00005；ns表示P＞0.05。
图12是小鼠免疫五周后的血清对EBV感染上皮细胞的影响图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本申请的纳米颗粒疫苗制备方法包括以下：
A.通过Sic_axle、、Rosetta等计算机辅助设计，确定合适的相融间距，从而确定序列中用于纳米颗粒设计的铰链(linker)长度，并且基于该长度设计相应的纳米颗粒载体。
B.通过第一宿主细胞，利用瞬时转染技术将适量的真核表达载体转入第一细胞中表达，获得gB-I53-50A1的纳米颗粒亚单位蛋白(第一多肽)，同时利用第二宿主细胞，转化另一个I53-50B.4PT1的表达质粒，在IPTG诱导后表达获得I53-50B.4PT1这另一纳米颗粒亚单位蛋白(第二多肽)，两种蛋白通过亲和层级以及分子排阻色谱进行进一步纯化后经过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定确定纯度。
C.在组装缓冲液中按一定比例加入gB-I53-50A1及I53-50B.4PT1亚单位，在室温下孵育，利用分子排阻色谱分离组装成功的纳米颗粒，并利用负染电镜、动态光散射、差示扫描荧光确定蛋白的粒径分布和稳定性。
D.利用生物膜干涉技术(BLI)确定纳米颗粒的抗原性。
E.将纳米颗粒与佐剂进行混匀，通过Balb/C小鼠进行免疫，验证小鼠产生针对gB的抗体水平以及小鼠血清对EBV病毒中和能力。
以下进一步具体阐述本申请的纳米颗粒疫苗的。
实施例1铰链(linker)与载体设计
通过Sic_axle、Rosetta等计算机软件辅助设计，确定合适的抗原(gB蛋白,SEQ IDNO：3)与纳米颗粒载体(I53-50)相融间距，从而确定序列中用于连接抗原与纳米颗粒载体的铰链(linker)长度，并且基于该长度设计相应的纳米颗粒载体。
设计采用的软件：Sic_axle(Marcandalli et al.,2019,Cell 177,1420–1431),Rosetta(Bale et al.,2016,Science 353,389–394.)。
https://www.rosettacommons.org/docs/latest/scripting_documentation/RosettaScripts/Movers/movers_pages/RelaxScript。
结果如图1所示：图1中(A)，gB在对接后，显示其C端与纳米颗粒载体亚基的N端的间距为56.1A，因此合适的linker长度不应短于56.1A，因此设计了不同长度的linker铰链区(如表1所示)，以及选择了不同的载体(I53-50、T3-10、O3-33、T33-15、T33-31，相关信息参见表2)。预期构建的自组装纳米颗粒如图1中(A)所示，如图1中(B)所示，gB与其他纳米颗粒载体亚基对接的对接示意图。
通过比较最后的对接结构模型以及对接距离，，由于I53-50作为载体与抗原gB进行对接时最终能够获得最短的对接距离，最后我们挑选了载体I53-50，其包含亚基I53-50A1(SEQ ID NO：1)和I53-50B.4PT1(SEQ ID NO：2)，作为合适的载体进行进一步的设计。
表1linker序列
序列编号 铰链(linker)
SEQ ID NO:4 GGGGSGGGGS
SEQ ID NO:5 GGGGSGGGGSG
SEQ ID NO:6 GGGGSGGGGSGS
SEQ ID NO:7 GGGGSGGGGSGGS
SEQ ID NO:8 GGGGSGGGGSGGGS
SEQ ID NO:9 GGGGSGGGGSGGGGS
表2载体信息
Figure BDA0002820467660000051
实施例2重组载体的构建和蛋白表达
1.实验材料
(1)表达载体：真核表达载体：pcDNA3.1(+)(ThermoFisher)，原核表达载体：pET28a(+)(ThermoFisher)，大肠杆菌感受态细胞DH5α(Tiangen)。
(2)表达系统：真核表达系统细胞HEK293F(ATCC)，改造大肠杆菌细胞Rosetta(DE3)(Tiangen)。
(3)试剂与耗材：PCR酶(GeneStar)，重组酶(Vazyme)，限制性核酸内切酶(NEB)，胶回收试剂(GeneStar)，质粒中提试剂盒(MN)细胞转染试剂PEI(Polyscience),293F培养基(Union)，TB培养基(翔博生物)，组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖珠(Roche)，等其他常规试剂以及耗材均为商品化购买所得。
(4)基因：EB病毒(M81毒株)的gB基因以及基于细菌蛋白优化的I53-50A1/I53-50B颗粒亚单位基因均通过南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM密码子平台优化和合成。
2.铰链的筛选
我们尝试了不同长度的铰链(linker)，同样构建了表达载体转染表达后，通过最后纯化浓缩测定蛋白浓度，具体步骤如下：(1)通过PCR扩增、酶切重组方法将EB病毒gB基因(SEQ ID NO：12)、linker(核酸序列如表3所示)及T4 fibritin(SEQ ID NO：19)和I53-50A1(SEQ ID NO：20)插入到载体pcDNA3.1(+)中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：21)用于使表达的多肽分泌到细胞外，T4fibritin尾端带有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ ID NO：22)方便纯化，组氨酸标签末端接有连接序列(SEQ ID NO：26)，最终得到的表达载体表达的目的基因gB-I53-50A1；(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL)的TB培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书；(3)将293F细胞置于293F培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*106/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293F细胞中，在37℃、80％湿度、5％CO2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白gB-I53-50A1亚单位。结果如表3所示：linker为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:9)时，gB-I53-50A1亚单位产量最高。
表3不同linker的载体的蛋白产量
Figure BDA0002820467660000052
Figure BDA0002820467660000061
3.自组装纳米颗粒的制备步骤
(1)通过PCR扩增、酶切重组方法将EB病毒gB基因(SEQ ID NO：12)、linker(SEQ IDNO:18)及T4 fibritin(SEQ ID NO：19)和I53-50A1(SEQ ID NO：20)插入到载体pcDNA3.1(+)中，而其前端带有CD5信号肽(SEQ ID NO：21)用于使表达的多肽分泌到细胞外，T4fibritin尾端带有8个组氨酸的组氨酸标签(SEQ ID NO：22)方便纯化，组氨酸标签末端接有连接序列(SEQ ID NO：26)，最终得到的表达载体表达的目的基因gB-I53-50A1(SEQ IDNO：27)。而I53-50B.4PT1(SEQ ID NO:23)则在合成中直接插入到pET28a(+)载体中，并且其尾端带有6个组氨酸的组氨酸(SEQ ID NO:24)标签便于纯化，通过测序比对后选择成功构建的载体进行下一步的实验。
(2)将重组载体于pcDNA3.1的基因转化至DH5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/mL)的TB培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书。
(3)将重组载体于pET28a(+)的基因转化至Rosetta(DE3)感受态细菌中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％卡那霉素(0.03g/mL)的TB培养基中扩大，随后利用锥形瓶进一步扩大到1L培养，并加入卡那霉素和氯霉素用于筛选阳性细胞，在18℃加入0.2mM化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，经过20h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白I53-50B.4PT1亚单位(SEQ ID NO：29)。
(4)将293F细胞置于293F培养基(Union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1L密度为1*106/mL，随后用新鲜培养基配置1mg pcDNA3.1-目标蛋白载体5mgPEI的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293F细胞中，在37℃、80％湿度、5％CO2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白gB-I53-50A1亚单位(SEQ IDNO：28)。
(5)将两亚单位(gB-I53-50A1和I53-50B.4PT1)按1：5的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的100％展示密度的纳米颗粒(gB-I53-50A NP)；将两亚单位(gB-I53-50A1和I53-50B.4PT1)按1：2的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的33％展示密度的纳米颗粒(gB-I53-50ANP)；将两亚单位(gB-I53-50A1和I53-50B.4PT1)按2：1的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mM NaCl,50mM Tris-HCl pH8.0,5％甘油)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的67％展示密度的纳米颗粒(gB-I53-50A NP)。
4.结果
如图2、3所示，图2为纳米颗粒的SDS-PAGE电泳的考马斯亮蓝染色的结果：从左到右显示了纳米载体亚基I53-50A1(制备方法同第3点中gB-I53-50A1亚单位制备过程，区别仅在于：步骤(1)中载体pcDNA3.1(+)中不包含EB病毒gB基因、linker及T4 fibritin)、纳米载体亚基I53-50B.4PT1(制备方法同第3点中I53-50B.4PT1亚单位制备过程)、抗原gB(SEQID NO：3)、仅含纳米载体亚基I53-50A1的重组的纳米颗粒gB-I53-50A1(制备方法同第3点中gB-I53-50A1亚单位制备过程)、不含抗原的纳米颗粒载体I53-50A NP(制备方法同第3点中100％展示密度的纳米颗粒(gB-I53-50A NP)制备过程，区别仅在于：步骤(1)中载体pcDNA3.1(+)中不包含EB病毒gB基因、linker及T4 fibritin)，含抗原gB以及I53-50A1和I53-50B.4PT1的多个展示密度的重组的纳米颗粒蛋白gB-I53-50A NP(制备方法同第3点中不同展示密度的纳米颗粒(gB-I53-50A NP)制备过程)；图3为纳米颗粒的分子筛色谱图：可以看出，重组载体构建成功，并且能获得高纯度的纳米颗粒蛋白(gB-I53-50A NP)；gB-I53-50A1比gB分子质量要大，并且纳米颗粒化后gB-I53-50A NP大小也大于空白颗粒I53-50NP，显示了纳米颗粒组装后其表面确实展示了gB。
实施例3检测纳米颗粒的结构特征和化学稳定性
1.实验材料
(1)Unchained Uncle高通量蛋白质稳定性分析仪(Unchained Labs)。
(2)NanoTemper Promethus 48蛋白质稳定性分析仪(Nanotemper)。
(3)120KV透射电镜(FEI)。
(4)300KV冷冻电镜(Thermo)。
2.实验步骤
(1)检测纳米颗粒的粒径分布
首先将实施例2中100％展示密度的gB自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)、纳米颗粒载体(I53-50NP)、抗原(gB)稀释至0.5mg/mL，加入200uL样品至Uncle专用的加样槽中，静置5min后，使用Unchained公司的Uncle仪器进行纳米颗粒粒径的检测。
(2)检测纳米颗粒的结构特征
稀释实施例2中100％展示密度的gB自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)、纳米颗粒载体(I53-50NP)浓度为0.02-0.2mg/mL，将蛋白孵育在碳涂层铜网格上，然后与2％乙酸铀孵育染色2min，风干。随后利用120KV透射电镜观察颗粒的大小和形态。
稀释实施例2中100％展示密度的gB自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)、纳米颗粒载体(I53-50NP)至0.5mg/mL，使用制样机制备薄层冷冻电镜样品，随后使用300KV冷冻电镜进行观察，并利用Relion3进行结构搭建。
(3)检测纳米颗粒的热稳定性
首先将实施例2中100％展示密度的gB自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)、纳米颗粒载体(I53-50NP)、抗原(gB)、gB-I53-50A1稀释至0.5mg/mL，随后我们利用NanoTemper公司的Promethus仪器从25℃到90℃进行升温扫描，记录其双荧光信号比和背反射聚集信号的变化，通过一阶导数得到其Tm值以及聚集温度。
(4)检测纳米颗粒的化学稳定性
首先将纳米颗粒蛋白稀释至0.5mg/mL，然后按照梯度加入从0M到7M的盐酸胍溶液，室温孵育过夜，随后利用NanoTemper公司的Promethus仪器检测不同的盐酸胍溶液下蛋白的双荧光信号比变化，通过一阶导数获得其吉布斯自由能变化△G的值。
3.实验结果
如图4所示，gB自组装纳米颗粒(gB-I53-50A NP)具有较均一的粒径分布特征，且其粒径显著大于纳米颗粒载体(I53-50 NP)以及抗原(gB)，说明了gB成功展示在了颗粒表面。
如图5所示，负染电镜下可以看到gB-I53-50A NP、I53-50 NP具有较好的均一性，且gB-I53-50 NP的颗粒表面较I53-50 NP空颗粒比有明显的外部的突起，说明gB成功展示在了纳米颗粒载体表面。
如图6所示，图6中(A)为Relion3下纳米颗粒的2D分类示意图，明显看到纳米颗粒呈正二十面体对称，图6中(B)为重构之后的电子密度图，可见明显的20个拷贝的三聚体I53-50A1和12个拷贝的五聚体的I53-50B4.PT1形成的纳米颗粒。
如图7、8所示，图7中(A)～(C)展示了gB、gB-I53-50A1、I53-50 NP、gB-I53-50A NP的差示荧光扫描结果，(A)为其蛋白在加热过程中F330与F350的比值变化，(B)为比值变化的一阶导数值，(C)为加热过程中散射光的变化，可见gB、gB-I53-50A1、gB-I53-50A NP中gB的融解温度(melting temperature)几乎相同，证明颗粒化对gB结构并无明显影响，且在聚集信息(散射光升高)上，gB-I53-50A NP颗粒相比gB和gB-I53-50A1在加热过程中并未见到明显的聚集，其热稳定性更强；图8展示了根据差示荧光扫描结果得出的融解温度结果，Tmonset为开始出现融解的温度，Tm则为融解温度，可见gB、gB-I53-50A1、gB-I53-50A NP的溶解温度相近，证明其从热稳定结构上是具有高度相似性的，结构的改变未破坏gB本身的理化特性。
如图9中(A)～(F)所示，在不同浓度的盐酸胍处理下，gB显示出的半数变性浓度低于gB-I53-50A NP，意味着颗粒化后gB(gB-I53-50A NP)的化学稳定性高于gB，且其吉布斯自由能较gB降低，可见，纳米颗粒(gB-I53-50A NP)在保证均一性的前提下，不但没有破坏抗原gB本身的理化特性，且具有了高于gB的稳定性，证明I53-50 NP具有稳定gB的功能。
实施例4纳米颗粒的抗原性
1.实验材料
(1)ProteinA传感器(Fortebio)，PBS，Tween 20(Sigma-Aldrich)。
(2)Fortebio Octet 96仪器。
(3)预湿板、96孔板等均来自商品化常规耗材。
2.实验步骤(1)利用BLI检测纳米颗粒与中和抗体的亲和力
配置0.5％PBST用于动力学检测，使用proteinA传感器前先在预湿板上加入150uLPBST，放入proteinA传感器孵育10min，随后稀释抗体AMMO5(制备方法参考文献Snijder etal.,2018,Immunity 48,799–811)用于偶联，平衡后开始进行偶联，随后将纳米颗粒蛋白等抗原(实施例2中的gB、gB-I53-50A1、100％展示密度的gB-I53-50A NP)进行梯度稀释(6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM)，与传感器进行结合，记录其结合信号和解离信号，最后利用甘氨酸溶液进行传感器再生。结合信号利用1：1的结合模型进行拟合，以计算其动力学参数。
3.实验结果
如图10中(A)～(C)和表4所示，gB纳米颗粒(gB-I53-50A NP)与AMMO5抗体的结合能力与gB相比要更强，证明其抗原性强于gB，而且解离时间更慢，尤其是纳米颗粒几乎难以从抗体上解离，这一特性有助于在BCR(B细胞抗原受体)上长期驻留，刺激抗体的产生。
表4gB、gB-I53-50A1和gB-I53-50A NP的抗体亲和力动力学参数
KD(M) kon(1/Ms) Kdis(1/s)
gB 1.82E-09 2.12E+05 3.87E-04
gB-I53-50A1 1.63E-09 1.24E+05 2.03E-04
gB-I53-50A NP 1.24E-09 8.95E+05 1.11E-04
实施例5纳米颗粒蛋白的动物免疫原性
1.实验材料
(1)小鼠：雌性6～8周的BalB/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。
(2)佐剂：Inject A铝佐剂(ThermoFisher)，MF59佐剂{0.5％(v/v)Tween 80，0.5％(v/v)Span 85，4.3％(v/v)角鲨烯，10nM柠檬酸钠缓冲液}。
(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。
2.实验步骤
(1)将0.5ug空载的纳米载体(empty-NP，实施例2中的I53-50 NP)、5ug EB病毒gB蛋白、以及含等摩尔质量gB的33％，67％，以及100％展示密度的颗粒(实施例2中的gB-I53-50A NP)，分别与上述两种佐剂(Inject A铝佐剂、MF59佐剂)混合或者仅仅用PBST稀释，即将佐剂或者PBS与抗原按质量比1：1的混合，在4℃摇晃孵育过夜，经皮下免疫的方式免疫小鼠。
(2)在免疫之后的第三周再进行一次免疫，在免疫后第二周以及第五周采集小鼠眼眶血分离收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清gB的总抗滴度。
3.实验结果
由于展示密度与BCR亲和力之间存在一定的正向关系，为了检测gB的展示密度与诱导的抗体滴度的关系，我们同时免疫了不同展示密度纳米颗粒，以判断展示密度对纳米颗粒免疫效果的影响，如图11中(A)～(F)所示，在第2周和第5周的血清抗体滴度检测中，各个展示密度(33％，67％，以及100％)的重组纳米颗粒(gB-I53-50A NP)诱导的血清总抗体滴度相对于单体gB来说均要更高，展示密度越高，血清总抗体滴度越高，无论是使用铝佐剂或者MF59佐剂或者不使用佐剂的情况下，gB纳米颗粒(gB-I53-50A NP)诱导的血清总抗体滴度较gB强10倍左右。佐剂的使用可进一步加强重组纳米颗粒的诱导的免疫原性。
实施例6纳米颗粒免疫后小鼠血清对病毒感染效率的影响
1.实验材料：
(1)试剂：羊抗人IgG(ThermoFisher)，其他均为商品化购买使用的试剂与耗材。
(2)细胞株：Akata-EBV-P(维百奥(北京)生物科技有限公司)，HNE1(ATCC)。
(3)病毒：Akata-EBV-GFP病毒由细胞株Akata-EBV诱导产生。
2.实验步骤：
(1)利用IgG诱导Akata-EBV产生Akata-EBV-GFP病毒，并通过高速离心富集后用无血清1640重悬，存放于-80℃中；
(2)将Akata病毒用无血清1640培养基(Gibco)1：5稀释，加入到96孔板中，每孔50uL，将实施例5中第5周采集的小鼠血清按1：5比例稀释，然后以10倍倍比稀释至病毒中，于37℃孵育2个小时；
(3)将血清与病毒的混合物加入到铺好的HNE1细胞中(7000个/well)，在37℃中感染3.5小时；
(4)感染完毕后，去上清，更换为5％FBS 1640培养基，培养48小时后，利用胰酶消化细胞，随后检测GFP阳性细胞数占总细胞数的比例以判断细胞感染效率。
3.实验结果
如图12所示，33％，67％，100％展示密度的gB-I53-50A NP均能够有效的产生大量的中和性抗体，尤其是100％展示密度的gB产生的中和性抗体，其滴度约为gB的10倍，能够有效中和EBV感染上皮细胞，对无佐剂组该诱导中和抗体产生的能力差别更为明显。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学；中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大
学肿瘤研究所)
<120> 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用
<130>
<160> 29
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu
1 5 10 15
Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe
20 25 30
Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala
35 40 45
Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile
50 55 60
Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val
65 70 75 80
Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile
85 90 95
Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met
100 105 110
Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu
115 120 125
Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met
130 135 140
Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn
145 150 155 160
Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly
165 170 175
Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys
180 185 190
Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu
195 200 205
Glu
<210> 2
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val
1 5 10 15
Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp
35 40 45
Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val
65 70 75 80
Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile
85 90 95
Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser
100 105 110
Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu
115 120 125
Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu
145 150 155 160
<210> 3
<211> 661
<212> PRT
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 3
Gln Thr Pro Glu Gln Pro Ala Pro Pro Ala Thr Thr Val Gln Pro Thr
1 5 10 15
Ala Thr Arg Gln Gln Thr Ser Phe Pro Phe Arg Val Cys Glu Leu Ser
20 25 30
Ser His Gly Asp Leu Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ile Gln Cys Pro Ser
35 40 45
Phe Gly Thr Arg Glu Asn His Thr Glu Gly Leu Leu Met Val Phe Lys
50 55 60
Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ser Phe Lys Val Arg Ser Tyr Thr Lys Ile
65 70 75 80
Val Thr Asn Ile Leu Ile Tyr Asn Gly His Arg Ala Asp Ser Val Thr
85 90 95
Asn Arg His Glu Glu Lys Phe Ser Val Glu Ser Tyr Glu Thr Asp Gln
100 105 110
Met Asp Thr Ile Tyr Gln Cys Tyr Asn Ala Val Lys Met Thr Lys Asp
115 120 125
Gly Leu Thr Arg Val Tyr Val Asp Arg Asp Gly Val Asn Ile Thr Val
130 135 140
Asn Leu Lys Pro Thr Gly Gly Leu Ala Asn Gly Val Arg Arg Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Gln Thr Glu Leu Tyr Asp Ala Pro Gly Arg Val Glu Ala Thr Tyr
165 170 175
Arg Thr Arg Thr Thr Val Asn Cys Leu Ile Thr Asp Met Met Ala Lys
180 185 190
Ser Asn Ser Pro Phe Asp Phe Phe Val Thr Thr Thr Gly Gln Thr Val
195 200 205
Glu Met Ser Pro Phe Tyr Asp Gly Lys Asn Thr Glu Thr Phe His Glu
210 215 220
Arg Ala Asp Ser Phe His Val Arg Thr Asn Tyr Lys Ile Val Asp Tyr
225 230 235 240
Asp Asn Arg Gly Thr Asn Pro Gln Gly Glu Arg Arg Ala Phe Leu Asp
245 250 255
Lys Gly Thr Tyr Thr Leu Ser Trp Lys Leu Glu Asn Arg Thr Ala Tyr
260 265 270
Cys Pro Leu Gln His Trp Gln Thr Phe Asp Ser Thr Ile Ala Thr Glu
275 280 285
Thr Gly Lys Ser Ile His Phe Val Thr Asp Glu Gly Thr Ser Ser Phe
290 295 300
Val Thr Asn Thr Thr Val Gly Ile Glu Leu Pro Asp Ala Phe Lys Cys
305 310 315 320
Ile Glu Glu Gln Val Asn Lys Thr Met His Glu Lys Tyr Glu Ala Val
325 330 335
Gln Asp Arg Tyr Thr Lys Gly Gln Glu Ala Ile Thr Tyr Phe Ile Thr
340 345 350
Ser Gly Gly Leu Leu Leu Ala Trp Leu Pro Leu Thr Pro Arg Ser Leu
355 360 365
Ala Thr Val Lys Asn Leu Thr Glu Leu Thr Thr Pro Thr Ser Ser Pro
370 375 380
Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Ala Pro Pro Ala Ala Arg Gly Ser Thr
385 390 395 400
Ser Ala Ala Val Leu Arg Arg Arg Arg Arg Asn Ala Gly Asn Ala Thr
405 410 415
Thr Pro Val Pro Pro Ala Ala Pro Gly Lys Ser Leu Gly Thr Leu Asn
420 425 430
Asn Pro Ala Thr Val Gln Ile Gln Phe Ala Tyr Asp Ser Leu Arg Arg
435 440 445
Gln Ile Asn Arg Met Leu Gly Asp Leu Ala Arg Ala Trp Cys Leu Glu
450 455 460
Gln Lys Arg Gln Asn Met Val Leu Arg Glu Leu Thr Lys Ile Asn Pro
465 470 475 480
Thr Thr Val Met Ser Ser Ile Tyr Gly Lys Ala Val Ala Ala Lys Arg
485 490 495
Leu Gly Asp Val Ile Ser Val Ser Gln Cys Val Pro Val Asn Gln Ala
500 505 510
Thr Val Thr Leu Arg Lys Ser Met Arg Val Pro Gly Ser Glu Thr Met
515 520 525
Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser Phe Ser Phe Ile Asn Asp Thr Lys
530 535 540
Thr Tyr Glu Gly Gln Leu Gly Thr Asp Asn Glu Ile Phe Leu Thr Lys
545 550 555 560
Lys Met Thr Glu Val Cys Gln Ala Thr Ser Gln Tyr Tyr Phe Gln Ser
565 570 575
Gly Asn Glu Ile His Val Tyr Asn Asp Tyr His His Phe Lys Thr Ile
580 585 590
Glu Leu Asp Gly Ile Ala Thr Leu Gln Thr Phe Ile Ser Leu Asn Thr
595 600 605
Ser Leu Ile Glu Asn Ile Asp Phe Ala Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Arg
610 615 620
Asp Glu Gln Arg Ala Ser Asn Val Phe Asp Leu Glu Gly Ile Phe Arg
625 630 635 640
Glu Tyr Asn Phe Gln Ala Gln Asn Ile Ala Gly Leu Arg Lys Asp Leu
645 650 655
Asp Asn Ala Val Ser
660
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
20 25
<210> 11
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile Tyr
1 5 10 15
His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu Val
20 25 30
<210> 12
<211> 1983
<212> DNA
<213> Epstein-Barr Virus
<400> 12
cagaccccag agcagcctgc accacctgcc accacagtgc agcctacagc caccagacag 60
cagaccagct tccccttccg ggtgtgcgag ctgagctccc acggcgacct gttcagattt 120
tctagcgata tccagtgtcc ctccttcggc acaagggaga accacaccga gggcctgctg 180
atggtgttca aggacaatat catcccttac tcctttaagg tgagatctta tacaaagatc 240
gtgaccaaca tcctgatcta caatggccac agagccgatt ctgtgaccaa caggcacgag 300
gagaagttta gcgtggagtc ctatgagaca gaccagatgg ataccatcta ccagtgctat 360
aatgccgtga agatgacaaa ggacggcctg accagagtgt acgtggacag ggatggcgtg 420
aacatcacag tgaatctgaa gcctaccgga ggactggcaa acggcgtgcg gagatacgcc 480
agccagaccg agctgtatga tgcaccagga agggtggagg caacatacag gaccaggacc 540
acagtgaact gtctgatcac agacatgatg gccaagagca attccccatt cgatttcttt 600
gtgaccacaa ccggccagac cgtggagatg agcccctttt atgacggcaa gaacacagag 660
accttccacg agcgcgccga ttcctttcac gtgcggacaa attacaagat cgtggactat 720
gataacagag gaaccaatcc acagggagag aggagggcct tcctggacaa gggcacatac 780
accctgtcct ggaagctgga gaacaggaca gcctattgcc ccctgcagca ctggcagaca 840
tttgactcca ccatcgccac agagaccggc aagtctatcc acttcgtgac agatgagggc 900
acctcctctt ttgtgaccaa cacaaccgtg ggcatcgagc tgcccgacgc cttcaagtgt 960
atcgaggagc aagtgaataa gacaatgcac gagaagtacg aggccgtgca ggatcgctat 1020
accaagggcc aggaagccat cacatacttt atcaccagcg gaggactgct gctggcatgg 1080
ctgccactga caccacggtc cctggccaca gtgaagaatc tgaccgagct gacaacccca 1140
accagctccc caccatctag cccaagccct ccagcaccac ctgcagcacg gggctctacc 1200
agcgccgccg tgctgcggag aaggcgccgg aacgcaggaa atgcaacaac ccctgtgcca 1260
ccagcagcac ctggcaagtc tctgggcaca ctgaacaatc ccgccaccgt gcagatccag 1320
ttcgcctacg acagcctgag aaggcagatc aacagaatgc tgggcgatct ggcaagggca 1380
tggtgcctgg agcagaagcg ccagaacatg gtgctgcggg agctgaccaa gatcaatcct 1440
acaaccgtga tgtcctctat ctatggcaag gcagtggcag caaagagact gggcgacgtg 1500
atctccgtgt ctcagtgcgt gccagtgaat caggccacag tgaccctgag aaagagcatg 1560
agggtgcccg gctccgagac catgtgctac tctaggcctc tggtgagctt ctcctttatc 1620
aacgacacaa agacctatga gggccagctg ggcacagata atgagatctt cctgacaaag 1680
aagatgaccg aggtgtgcca ggccaccagc cagtactatt tccagtccgg caacgagatc 1740
cacgtgtaca atgactatca ccactttaag acaatcgagc tggatggcat cgccacactg 1800
cagaccttca tctctctgaa caccagcctg atcgagaata tcgactttgc cagcctggag 1860
ctgtactcca gggacgagca gagggcatcc aacgtgttcg atctggaggg catcttccgc 1920
gagtataact ttcaggccca gaatatcgcc ggcctgcgga aggacctgga taatgccgtg 1980
tct 1983
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc 30
<210> 14
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc ggc 33
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc ggcggc 36
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc ggcggcggc 39
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc ggcggcggcg gc 42
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatcc ggcggcggcg gctct 45
<210> 19
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggatacatcc ctgaggcacc aagggacgga caggcctatg tgcggaagga tggcgagtgg 60
gtgctgctgt ccaccttcct g 81
<210> 20
<211> 627
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atgaagatgg aggagctgtt taagaagcac aagatcgtgg ccgtgctgag ggccaactcc 60
gtggaggagg ccatcgagaa ggcagtggcc gtgttcgcag gaggagtgca cctgatcgag 120
atcaccttca ccgtgccaga cgccgatacc gtgatcaagg ccctgtccgt gctgaaggag 180
aagggagcaa tcatcggagc aggaacagtg acctctgtgg agcagtgcag gaaggcagtg 240
gagtctggag ccgagttcat cgtgagccct cacctggacg aggagatcag ccagttctgt 300
aaggagaagg gcgtgtttta catgcccggc gtgatgacac ctaccgagct ggtgaaggcc 360
atgaagctgg gccacgatat cctgaagctg ttcccaggag aggtggtggg acctcagttt 420
gtgaaggcca tgaagggccc tttcccaaac gtgaagtttg tgcccacagg cggcgtgaac 480
ctggacaacg tgtgcgagtg gttcaaggca ggcgtgctgg cagtgggagt gggcgatgcc 540
ctggtgaagg gcgaccctga tgaggtgcgc gagaaggcca agaagtttgt ggagaagatc 600
aggggatgta ccgagggcag cctggag 627
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60
agctgcctgg ga 72
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
catcatcacc accaccacca ccac 24
<210> 23
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
atgaaccagc acagccacaa ggaccacgag accgtgcgta ttgcggtggt tcgtgcgcgt 60
tggcatgcgg agattgtgga tgcgtgcgtt agcgcgttcg aagcggcgat gcgtgacatc 120
ggtggcgatc gtttcgcggt ggacgttttt gatgtgccgg gtgcgtacga gattccgctg 180
catgcgcgta ccctggcgga aaccggtcgt tatggcgcgg ttctgggcac cgcgttcgtg 240
gttaacggtg gcatctaccg tcacgaattt gtggcgagcg cggttattaa cggtatgatg 300
aacgtgcaac tgaacaccgg cgtgccggtt ctgagcgcgg ttctgacccc gcacaactat 360
gacaagagca aagcgcacac cctgctgttc ctggcgctgt ttgcggtgaa gggtatggaa 420
gcggcgcgtg cgtgcgttga gatcctggcg gcgcgtgaaa aaattgcggc gggcagcctg 480
gaa 483
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
catcatcacc accaccac 18
<210> 25
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly
20
<210> 26
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
caccaccacc ac 12
<210> 27
<211> 2844
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atgccaatgg gctctctgca gcccctggcc acactgtacc tgctgggaat gctggtggca 60
agctgcctgg gacagacccc agagcagcct gcaccacctg ccaccacagt gcagcctaca 120
gccaccagac agcagaccag cttccccttc cgggtgtgcg agctgagctc ccacggcgac 180
ctgttcagat tttctagcga tatccagtgt ccctccttcg gcacaaggga gaaccacacc 240
gagggcctgc tgatggtgtt caaggacaat atcatccctt actcctttaa ggtgagatct 300
tatacaaaga tcgtgaccaa catcctgatc tacaatggcc acagagccga ttctgtgacc 360
aacaggcacg aggagaagtt tagcgtggag tcctatgaga cagaccagat ggataccatc 420
taccagtgct ataatgccgt gaagatgaca aaggacggcc tgaccagagt gtacgtggac 480
agggatggcg tgaacatcac agtgaatctg aagcctaccg gaggactggc aaacggcgtg 540
cggagatacg ccagccagac cgagctgtat gatgcaccag gaagggtgga ggcaacatac 600
aggaccagga ccacagtgaa ctgtctgatc acagacatga tggccaagag caattcccca 660
ttcgatttct ttgtgaccac aaccggccag accgtggaga tgagcccctt ttatgacggc 720
aagaacacag agaccttcca cgagcgcgcc gattcctttc acgtgcggac aaattacaag 780
atcgtggact atgataacag aggaaccaat ccacagggag agaggagggc cttcctggac 840
aagggcacat acaccctgtc ctggaagctg gagaacagga cagcctattg ccccctgcag 900
cactggcaga catttgactc caccatcgcc acagagaccg gcaagtctat ccacttcgtg 960
acagatgagg gcacctcctc ttttgtgacc aacacaaccg tgggcatcga gctgcccgac 1020
gccttcaagt gtatcgagga gcaagtgaat aagacaatgc acgagaagta cgaggccgtg 1080
caggatcgct ataccaaggg ccaggaagcc atcacatact ttatcaccag cggaggactg 1140
ctgctggcat ggctgccact gacaccacgg tccctggcca cagtgaagaa tctgaccgag 1200
ctgacaaccc caaccagctc cccaccatct agcccaagcc ctccagcacc acctgcagca 1260
cggggctcta ccagcgccgc cgtgctgcgg agaaggcgcc ggaacgcagg aaatgcaaca 1320
acccctgtgc caccagcagc acctggcaag tctctgggca cactgaacaa tcccgccacc 1380
gtgcagatcc agttcgccta cgacagcctg agaaggcaga tcaacagaat gctgggcgat 1440
ctggcaaggg catggtgcct ggagcagaag cgccagaaca tggtgctgcg ggagctgacc 1500
aagatcaatc ctacaaccgt gatgtcctct atctatggca aggcagtggc agcaaagaga 1560
ctgggcgacg tgatctccgt gtctcagtgc gtgccagtga atcaggccac agtgaccctg 1620
agaaagagca tgagggtgcc cggctccgag accatgtgct actctaggcc tctggtgagc 1680
ttctccttta tcaacgacac aaagacctat gagggccagc tgggcacaga taatgagatc 1740
ttcctgacaa agaagatgac cgaggtgtgc caggccacca gccagtacta tttccagtcc 1800
ggcaacgaga tccacgtgta caatgactat caccacttta agacaatcga gctggatggc 1860
atcgccacac tgcagacctt catctctctg aacaccagcc tgatcgagaa tatcgacttt 1920
gccagcctgg agctgtactc cagggacgag cagagggcat ccaacgtgtt cgatctggag 1980
ggcatcttcc gcgagtataa ctttcaggcc cagaatatcg ccggcctgcg gaaggacctg 2040
gataatgccg tgtctggagg aggaggaagc ggaggaggag gatccggcgg cggcggctct 2100
ggatacatcc ctgaggcacc aagggacgga caggcctatg tgcggaagga tggcgagtgg 2160
gtgctgctgt ccaccttcct gggctctggc agccatcatc accaccacca ccaccacatg 2220
aagatggagg agctgtttaa gaagcacaag atcgtggccg tgctgagggc caactccgtg 2280
gaggaggcca tcgagaaggc agtggccgtg ttcgcaggag gagtgcacct gatcgagatc 2340
accttcaccg tgccagacgc cgataccgtg atcaaggccc tgtccgtgct gaaggagaag 2400
ggagcaatca tcggagcagg aacagtgacc tctgtggagc agtgcaggaa ggcagtggag 2460
tctggagccg agttcatcgt gagccctcac ctggacgagg agatcagcca gttctgtaag 2520
gagaagggcg tgttttacat gcccggcgtg atgacaccta ccgagctggt gaaggccatg 2580
aagctgggcc acgatatcct gaagctgttc ccaggagagg tggtgggacc tcagtttgtg 2640
aaggccatga agggcccttt cccaaacgtg aagtttgtgc ccacaggcgg cgtgaacctg 2700
gacaacgtgt gcgagtggtt caaggcaggc gtgctggcag tgggagtggg cgatgccctg 2760
gtgaagggcg accctgatga ggtgcgcgag aaggccaaga agtttgtgga gaagatcagg 2820
ggatgtaccg agggcagcct ggag 2844
<210> 28
<211> 948
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Met Pro Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly
1 5 10 15
Met Leu Val Ala Ser Cys Leu Gly Gln Thr Pro Glu Gln Pro Ala Pro
20 25 30
Pro Ala Thr Thr Val Gln Pro Thr Ala Thr Arg Gln Gln Thr Ser Phe
35 40 45
Pro Phe Arg Val Cys Glu Leu Ser Ser His Gly Asp Leu Phe Arg Phe
50 55 60
Ser Ser Asp Ile Gln Cys Pro Ser Phe Gly Thr Arg Glu Asn His Thr
65 70 75 80
Glu Gly Leu Leu Met Val Phe Lys Asp Asn Ile Ile Pro Tyr Ser Phe
85 90 95
Lys Val Arg Ser Tyr Thr Lys Ile Val Thr Asn Ile Leu Ile Tyr Asn
100 105 110
Gly His Arg Ala Asp Ser Val Thr Asn Arg His Glu Glu Lys Phe Ser
115 120 125
Val Glu Ser Tyr Glu Thr Asp Gln Met Asp Thr Ile Tyr Gln Cys Tyr
130 135 140
Asn Ala Val Lys Met Thr Lys Asp Gly Leu Thr Arg Val Tyr Val Asp
145 150 155 160
Arg Asp Gly Val Asn Ile Thr Val Asn Leu Lys Pro Thr Gly Gly Leu
165 170 175
Ala Asn Gly Val Arg Arg Tyr Ala Ser Gln Thr Glu Leu Tyr Asp Ala
180 185 190
Pro Gly Arg Val Glu Ala Thr Tyr Arg Thr Arg Thr Thr Val Asn Cys
195 200 205
Leu Ile Thr Asp Met Met Ala Lys Ser Asn Ser Pro Phe Asp Phe Phe
210 215 220
Val Thr Thr Thr Gly Gln Thr Val Glu Met Ser Pro Phe Tyr Asp Gly
225 230 235 240
Lys Asn Thr Glu Thr Phe His Glu Arg Ala Asp Ser Phe His Val Arg
245 250 255
Thr Asn Tyr Lys Ile Val Asp Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Asn Pro Gln
260 265 270
Gly Glu Arg Arg Ala Phe Leu Asp Lys Gly Thr Tyr Thr Leu Ser Trp
275 280 285
Lys Leu Glu Asn Arg Thr Ala Tyr Cys Pro Leu Gln His Trp Gln Thr
290 295 300
Phe Asp Ser Thr Ile Ala Thr Glu Thr Gly Lys Ser Ile His Phe Val
305 310 315 320
Thr Asp Glu Gly Thr Ser Ser Phe Val Thr Asn Thr Thr Val Gly Ile
325 330 335
Glu Leu Pro Asp Ala Phe Lys Cys Ile Glu Glu Gln Val Asn Lys Thr
340 345 350
Met His Glu Lys Tyr Glu Ala Val Gln Asp Arg Tyr Thr Lys Gly Gln
355 360 365
Glu Ala Ile Thr Tyr Phe Ile Thr Ser Gly Gly Leu Leu Leu Ala Trp
370 375 380
Leu Pro Leu Thr Pro Arg Ser Leu Ala Thr Val Lys Asn Leu Thr Glu
385 390 395 400
Leu Thr Thr Pro Thr Ser Ser Pro Pro Ser Ser Pro Ser Pro Pro Ala
405 410 415
Pro Pro Ala Ala Arg Gly Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Arg Arg Arg
420 425 430
Arg Arg Asn Ala Gly Asn Ala Thr Thr Pro Val Pro Pro Ala Ala Pro
435 440 445
Gly Lys Ser Leu Gly Thr Leu Asn Asn Pro Ala Thr Val Gln Ile Gln
450 455 460
Phe Ala Tyr Asp Ser Leu Arg Arg Gln Ile Asn Arg Met Leu Gly Asp
465 470 475 480
Leu Ala Arg Ala Trp Cys Leu Glu Gln Lys Arg Gln Asn Met Val Leu
485 490 495
Arg Glu Leu Thr Lys Ile Asn Pro Thr Thr Val Met Ser Ser Ile Tyr
500 505 510
Gly Lys Ala Val Ala Ala Lys Arg Leu Gly Asp Val Ile Ser Val Ser
515 520 525
Gln Cys Val Pro Val Asn Gln Ala Thr Val Thr Leu Arg Lys Ser Met
530 535 540
Arg Val Pro Gly Ser Glu Thr Met Cys Tyr Ser Arg Pro Leu Val Ser
545 550 555 560
Phe Ser Phe Ile Asn Asp Thr Lys Thr Tyr Glu Gly Gln Leu Gly Thr
565 570 575
Asp Asn Glu Ile Phe Leu Thr Lys Lys Met Thr Glu Val Cys Gln Ala
580 585 590
Thr Ser Gln Tyr Tyr Phe Gln Ser Gly Asn Glu Ile His Val Tyr Asn
595 600 605
Asp Tyr His His Phe Lys Thr Ile Glu Leu Asp Gly Ile Ala Thr Leu
610 615 620
Gln Thr Phe Ile Ser Leu Asn Thr Ser Leu Ile Glu Asn Ile Asp Phe
625 630 635 640
Ala Ser Leu Glu Leu Tyr Ser Arg Asp Glu Gln Arg Ala Ser Asn Val
645 650 655
Phe Asp Leu Glu Gly Ile Phe Arg Glu Tyr Asn Phe Gln Ala Gln Asn
660 665 670
Ile Ala Gly Leu Arg Lys Asp Leu Asp Asn Ala Val Ser Gly Gly Gly
675 680 685
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Tyr Ile Pro
690 695 700
Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp
705 710 715 720
Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly Ser Gly Ser His His His His His
725 730 735
His His His Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val
740 745 750
Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val
755 760 765
Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val
770 775 780
Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys
785 790 795 800
Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg
805 810 815
Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp
820 825 830
Glu Glu Ile Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro
835 840 845
Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His
850 855 860
Asp Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val
865 870 875 880
Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly
885 890 895
Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu
900 905 910
Ala Val Gly Val Gly Asp Ala Leu Val Lys Gly Asp Pro Asp Glu Val
915 920 925
Arg Glu Lys Ala Lys Lys Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu
930 935 940
Gly Ser Leu Glu
945
<210> 29
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val
1 5 10 15
Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala
20 25 30
Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp
35 40 45
Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr
50 55 60
Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val
65 70 75 80
Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile
85 90 95
Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser
100 105 110
Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu
115 120 125
Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala
130 135 140
Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu
145 150 155 160
Glu His His His His His His
165

Claims (10)

1.一种自组装纳米颗粒，其特征在于：包含第一多肽和第二多肽；所述第一多肽包含gB蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为I53-50A1，所述第二载体亚基为I53-50B.4PT1；所述gB蛋白与第一载体亚基通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：
所述I53-50A1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述I53-50B.4PT1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述连接肽优选为含5～20个氨基酸的多肽；更优选为氨基酸序列为SEQ ID NO：4～9中任一种的多肽。
3.根据权利要求2所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：
所述第一多肽还包含稳定蛋白；
所述稳定蛋白位于第一载体亚基与连接肽之间；
所述稳定蛋白优选为T4噬菌体纤维蛋白原(SEQ ID NO：10)或GCN4肽段(SEQ ID NO：11)。
4.根据权利要求3所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：
所述第一多肽为第一多肽三聚体，所述第二多肽为第二多肽五聚体。
5.根据权利要求4所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：
所述第一多肽三聚体的拷贝数为18～22，所述第二多肽五聚体的拷贝数为10～14。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的自组装纳米颗粒，其特征在于：
所述gB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
7.权利要求1～6中任一项所述的自组装纳米颗粒的制备方法，其特征在于：将第一多肽与第二多肽孵育，得到；
所述第一多肽和第二多肽的摩尔质量比优选为1:(3～6)。
8.权利要求1～6中任一项所述的自组装纳米颗粒在制备预防EB病毒感染的药品中的应用。
9.一种疫苗，其特征在于：包含权利要求1～6中任一项所述的自组装纳米颗粒；
所述疫苗优选还包括佐剂。
10.权利要求1～6中任一项所述的自组装纳米颗粒在制备治疗EB病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。
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