CN105518149A - 靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于与衰老、疾病、另外的病况相关的细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的基于核酸的表达构建体。本发明还提供了递送那些基于核酸的表达构建体的载体和系统以及使用这类基于核酸的表达构建体、载体和系统降低、防止和/或消除衰老、疾病、或病况相关的细胞的生长和/或存活以及治疗与衰老、疾病或病况相关的细胞的疾病或病况的方法。
Description
发明人:
马修·R·斯科尔茨
奥依信生物技术公司
2800ElliotAvenue
Suite414
Seattle,WA98121
LoweGrahamJones编号:OSIN-11-0103WO01
靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统和方法
相关申请的交叉引用
该PCT国际专利申请(其于2014年3月24日以a提交)要求于2013年3月24日提交的美国临时专利申请第61/804,716号的权益,所述临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总体涉及医药领域,包括疾病的治疗、促进长寿、抗衰老和健康推广。更具体地,本公开涉及用于降低与衰老、疾病和其它病况相关的细胞的生长和/或存活的组合物和方法。提供了针对靶细胞特异的治疗性蛋白表达的表达构建体,所述构建体利用在靶细胞内存在的但在正常非靶细胞中不存在或大量降低的独特的胞内功能性,包括转录调控功能性。这类表达构建体被用于包含用于将核酸递送至靶细胞的载体的系统中,所述载体可以包括,但不一定需要用于增强表达构建体至靶细胞递送的靶向部分。
背景技术
相关技术的描述
癌细胞、衰老细胞和具有不期望表型的其它细胞可随着人生命的进程而积聚,在没有适当治疗的情况下,这类细胞可促成或甚至导致人的病态并最终导致死亡。
衰老细胞在疾病中的作用以及消除衰老细胞的潜在益处已在诸如Baker等Nature479:232-6(2011)中的科学出版物中讨论过。已描述了旨在解决积聚的衰老细胞问题的系统和方法。例如,Grigg的PCT专利公布第WO1992/009298号描述了用类似于肌肽的化合物防止或逆转细胞衰老的系统以及Gruber的美国专利公布第2012/0183534号描述了用辐射、超声、毒素、抗体和抗体-毒素偶联物杀伤衰老细胞的系统,该系统包括用于靶向治疗性分子的衰老细胞-表面蛋白。
已证明衰老细胞的选择性杀伤在除了基因修饰的实验室研究动物之外的哺乳动物中是不实际的。当前可用的系统和方法显示出大量的系统毒性、靶向所关注细胞的不足性和缺乏充分的安全性特征。本领域中的这些缺点已阻碍了用于治疗某些癌症和用于减缓衰老作用的安全且有效疗法的发展。
发明内容
本公开基于以下发现:细胞,如与衰老、疾病和/或另外的病况相关的细胞(统称为“靶细胞”)能够以靶细胞特异的方式被选择性杀伤而无需将治疗剂靶向递送至靶细胞。本文所述的表达构建体、系统和方法克服与使用治疗剂的靶向递送的目前技术相关的安全性和功效问题,所述技术已经在有需要的患者中产生有限的治疗益处。
如本文所述,本公开提供了以靶细胞特异的方式诱导编码蛋白质的核酸表达的表达盒、系统和方法,当在细胞中产生时,所述蛋白降低或消除细胞的生长和/或存活,如所述细胞是与衰老、疾病和/或其它病况相关的细胞。
本文所述的表达盒、系统和方法利用与衰老(如衰老细胞)、疾病(如癌症、传染性疾病和细菌疾病)以及其它病况相关的某些细胞所固有的独特的转录调节机制,所述转录调节机制在与衰老、疾病或其它病况无关的正常细胞(即,“非靶细胞”)中不可操作或显示出大量降低的活性。
由于靶细胞提供的且对于靶细胞特有的胞内功能性,本公开的表达盒、系统和方法实现高度的靶细胞特异性,正常的非靶细胞不提供所述胞内功能性,或所述胞内功能性在正常非靶细胞中大量降低。因此,本公开的系统和方法使用对细胞类型非特异的核酸递送载体,核酸被递送至所述细胞类型,实际上,本文所述的载体无需被配置成靶细胞特异的核酸递送(例如,表达盒)以实现靶细胞特异性以及因此,产生治疗上有效的降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。
在某些实施方式中,本公开提供了用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,所述靶细胞如与衰老、疾病和/或另外的病况相关的细胞。本文公开的表达构建体包含:(1)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在靶细胞内产生;以及(2)核酸,其可操作地连接于转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码能够降低、防止和/或消除包括所述靶细胞在内的细胞的生长和/或存活的治疗性蛋白。
在这些实施方式的某些方面内,转录启动子在与疾病、病况或衰老相关的靶细胞中被激活,但在与疾病、病况或衰老无关的正常哺乳动物细胞中未被激活。靶细胞特异的转录激活通过在靶细胞中产生但不在正常哺乳动物细胞中产生的一种或多种因子的作用来实现,所述正常哺乳细胞包括正常的人类细胞,如正常骨骼肌成肌细胞、正常脂肪细胞、正常眼部细胞、正常脑细胞、正常肝细胞、正常结肠细胞、正常肺细胞、正常胰腺细胞和/或正常心肌细胞,所述正常细胞与疾病、病况或衰老无关。
在这些实施方式的其它方面中,靶细胞可为哺乳动物细胞或细菌细胞。靶向哺乳动物细胞可包括人类细胞,如衰老细胞、癌细胞、癌前细胞、发育异常细胞和被传染剂感染的细胞。
在这些实施方式的某些方面,其中人类靶细胞为衰老细胞,转录启动子可包括pl6INK4a/CDKN2A转录启动子,其响应于诸如SP1、ETS1和/或ETS2的转录因子的激活。在这些实施方式的其它方面,其中人类靶细胞为衰老细胞,转录启动子可包括p21/CDKNlA转录启动子,其响应于p53/TP53。在诸如衰老细胞的靶细胞中,转录启动子诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白诸如例如CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶以及CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体,所述治疗性蛋白通过诸如例如经由细胞过程(包括凋亡)诱导衰老细胞的细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用通过例如经由细胞过程诱导细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活的其它治疗性蛋白,所述细胞过程包括坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡(paraptosis)、细胞焦亡(pyroptosis)、焦坏死(pyronecrosis)和细胞侵入性死亡(entosifs)。
在这些实施方式的其它方面,其中人类靶细胞为癌细胞,如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌症细胞和骨癌细胞,转录启动子可包括p21cip1/waf1启动子、p27kip1启动子、p57kip2启动子、TdT启动子、Rag-1启动子、B29启动子、Blk启动子、CD19启动子、BLNK启动子和/或λ5启动子,所述转录启动子响应于一种或多种转录因子的激活,所述转录因子如EBF3、O/E-1、Pax-5、E2A、p53、VP16、MLL、HSF1、NF-IL6、NFAT1、AP-1、AP-2、HOX、E2F3和/或NF-κΒ转录因子,并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白诸如例如CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶以及CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体,所述治疗性蛋白通过诸如例如经由细胞过程(包括凋亡)诱导衰老细胞的细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用通过例如经由细胞过程诱导细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活的其它治疗性蛋白,所述细胞过程包括坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
在这些实施方式的其它方面,其中靶细胞为被传染剂感染的人类细胞,所述传染剂如病毒,包括例如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和鼻病毒,或靶细胞为细菌细胞,转录启动子可被传染剂或细菌细胞表达的因子激活,所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白诸如例如CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶以及CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体,所述治疗性蛋白通过诸如例如经由细胞过程(包括凋亡)诱导衰老细胞的细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用通过例如经由细胞过程诱导细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活的其它治疗性蛋白,所述细胞过程包括坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
在其它实施方式中,本公开提供了靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统。这些系统包括能够将核酸递送至细胞(包括靶细胞以及非靶细胞)的载体,其中载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,其中表达构建体包含响应于一种或多种因子而被激活的转录启动子,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及核酸,其可操作地连接于转录启动子且在转录启动子的调节控制下,其中核酸编码这样的治疗性蛋白,其能够降低、防止和/或消除产生治疗性蛋白的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活。
在这些实施方式的其它方面,系统还包括一个或多个安全性特征,所述安全性特征允许诸如例如通过需要使靶细胞与除了促进表达构建体内启动子的转录激活或促进治疗性蛋白的功能性的胞内因子之外的化学或生物化合物接触,如通过促进CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶的二聚化以及可诱导变体来另外控制表达构建体内核酸的表达或该核酸编码的治疗性蛋白的功能性。
可以在本公开的表达构建体和系统中使用的另外的安全性元件包含利用针对哺乳动物表达使用pDEST26质粒的LifeTechnologiesGateway克隆载体系统(LifeTechnologiesGatewayCloningVectorSystem)的他莫昔芬-可诱导的Cre构建体。例如,Cre和雌激素受体的融合蛋白可被组成型表达,并在添加他莫昔芬时被诱导,这允许激活的Cre重定向转录启动子,从而表达治疗性蛋白。
在这些实施方式的其它方面,系统还可以包含编码诸如生物发光标志物的可检测标志物的核酸,从而允许鉴别表达治疗性蛋白的细胞,并且在可诱导的治疗性蛋白,如可诱导的CASP3、CASP8或CASP9的情况下,通过施用促进治疗性蛋白的活性的化合物,如通过诱导可诱导的CASP3、CASP8或CASP9的二聚化而杀伤细胞。
在另外的实施方式中,本公开提供了用于降低、防止和/或消除靶细胞生长的方法,所述方法包括使靶细胞与靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统接触,其中所述系统包括能够将核酸递送至细胞的载体,其中所述载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,其中表达构建体包含:(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在靶细胞内产生;以及(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码治疗性蛋白,所述治疗性蛋白在核酸表达时产生,并且其中靶细胞(即,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内产生的治疗性蛋白降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。
在另外的实施方式中,本公开提供了治疗人类衰老或患有疾病或另外病况的人的方法,其中衰老、疾病或另外的病况与人体内的靶细胞相关,所述方法包括向人施用用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统,其中所述系统包括能够将核酸递送至细胞的载体,其中所述载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,其中表达构建体包含:(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在靶细胞内产生;以及(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码治疗性蛋白,所述治疗性蛋白在核酸表达时产生,并且其中靶细胞(即,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内产生的治疗性蛋白降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活,从而减缓人类衰老和/或减缓、逆转和/或消除人类疾病或病况。
根据下述附图和详述应更好地理解本公开的这些和其它相关方面,所述附图和详述例示了多个实施方式的某些方面。
附图说明
图1为包含示例性表达盒的质粒的示意图,其中启动子序列为p16转录启动子(来自Baker等,Nature479(7372):232-67(2011))并且编码治疗性蛋白的核酸编码可诱导的半胱天冬酶9变体FCls.dCasp9。
图2为示例性表达盒的示意图,其中启动子序列为pl6转录启动子(来自Baker等,Nature479(7372):232-67(2011))并且编码治疗性蛋白的核酸编码半胱天冬酶9(不可诱导的)。该表达盒包含另外的安全性元件,其包含他莫昔芬-可诱导的Cre构建体。
图3为包含示例性表达盒的质粒的示意图,其中启动子序列为p16转录启动子(来自Baker等,Nature479(7372):232-67(2011))并且编码治疗性蛋白的核酸编码半胱天冬酶9(不可诱导的)。该实施方式包含另外的安全性元件,其包含使用针对哺乳动物表达利用pDEST26质粒的LifeTechnologiesGateway克隆载体系统的他莫昔芬-可诱导的Cre构建体。Cre和雌激素受体的融合蛋白被组成型表达的,并在添加他莫昔芬时被诱导,这允许激活的Cre重定向pl6-启动子,从而表达半胱天冬酶9。
图4为包含示例性表达盒的质粒的示意图,其中启动子序列为p16转录启动子(来自Baker等,Nature479(7372):232-67(2011))并且编码治疗性蛋白的核酸编码可诱导的半胱天冬酶9变体FCls.dCasp9。该实施方式包含另外的安全性元件,其包含使用针对哺乳动物表达利用pDEST26质粒的LifeTechnologiesGateway克隆载体系统的他莫昔芬-可诱导的Cre构建体。Cre和雌激素受体的融合蛋白被组成型表达,并在添加他莫昔芬时被诱导,这允许激活的Cre以重定向pl6-启动子,从而表达可诱导的半胱天冬酶9变体FCls.dCasp9。
图5为在图1-4中显示的且在Baker等的Nature479(7372):232-67(2011)和Wang等的JBiolChem276(52):48655-61(2001)中描述的p16启动子的核苷酸序列。
图6为来自如Noureddine等的PLoSGenet5(5):e1000462(2009)所述的人ConA基因的高亲和力p53结合序列。
图7为编码人半胱天冬酶9α的核苷酸序列(GeneID:842,证实的mRNA序列NM_001229)。
图8为编码人半胱天冬酶3前蛋白的核苷酸序列(GeneID:836,证实的mRNANM_004346)。
图9为编码人DFFB蛋白的核苷酸序列(GeneID:1677,证实的mRNANM_001282669)。
具体实施方式
本公开提供了选择性降低、防止和/或消除与衰老、疾病或另外的病况相关的细胞(统称为“靶细胞”)的生长和/或存活的表达盒、系统和方法,所述表达盒、系统和方法克服与目前技术相关的安全性和功效问题,目前技术依赖治疗性化合物的靶向递送以及由于例如,无效的靶细胞递送和/或脱靶效应具有有限的治疗益处。
更具体地,本文公开的表达盒、系统和方法利用靶细胞固有的细胞特异的转录调节机制,从而实现靶细胞特异的治疗益处而无需治疗性化合物的靶向递送。这些表达盒、系统和方法允许表达编码治疗性蛋白的核酸的靶细胞特异的诱导,所述蛋白质能够降低、防止和/或消除产生所述蛋白质的细胞的生长和/或存活。
因此,本公开提供的多种实施方式包括:
(1)靶向靶细胞内治疗性蛋白产生的表达构建体,所述靶细胞如与衰老、疾病和/或另外的病况相关的细胞,所述表达构建体包含:
(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在靶细胞内产生;以及
(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码能够降低、防止和/或消除包括所述靶细胞在内的细胞的生长和/或存活的治疗性蛋白;
(2)用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统,所述系统包括:
(a)载体,其能够将核酸递送至细胞,包括靶细胞以及非靶细胞,
其中所述载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体;
所述表达构建体包含:
(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,
其中所述核酸编码治疗性蛋白,其能够降低、防止和/或消除产生所述治疗性蛋白的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活。
(3)降低、防止和/或消除靶细胞生长的方法,所述方法包括:使靶细胞与靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统接触,
其中所述系统包括能够将核酸递送至细胞的载体,
其中所述载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体;
其中,所述表达构建体包含:
(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,
其中所述核酸编码治疗性蛋白,所述治疗性蛋白在核酸表达时产生,并且
其中在所述靶细胞(即,与衰老、疾病或另外病况相关的细胞)中产生的治疗性蛋白降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。
(4)治疗人的衰老、疾病或其它病况的方法,其中衰老、疾病或其它病况与靶细胞相关,所述方法包括:
向人施用靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统,
其中所述系统包括能够将核酸递送至细胞的载体,
其中所述载体包含靶细胞(例如,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)内而不是非靶细胞内的治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,
其中所述表达构建体包含:
(a)转录启动子,其响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,
其中所述核酸编码治疗性蛋白,该治疗性蛋白在核酸表达时产生,并且
其中靶细胞(即,与衰老、疾病和其它病况相关的细胞)中产生的治疗性蛋白降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活,从而减缓人的衰老和/或逆转和/或消除人的疾病或病况。
可通过参考下述非限制性定义更好地理解本公开的这些和其它方面。
定义
如本文所用,术语“转录启动子”是指引起特定基因转录的DNA区域的启动子。启动子位于基因的转录起始位点附近,在DNA的相同链上且在DNA的上游(朝向反义链的3'区,也称为模板链和非编码链)。启动子可为约100-1000个碱基对长。对于发生转录而言,合成RNA的酶(被称为RNA聚合酶)必须附着于基因附近的DNA。启动子含有特异性DNA序列和反应元件,其为RNA聚合酶和募集RNA聚合酶的被称为转录因子的蛋白质提供安全的起始结合位点。这些转录因子具有对应核苷酸的特异的激活剂或阻遏物序列,所述转录因子附着于特定的启动子并调节基因表达。该过程比较复杂,至少七种不同的因子对于RNA聚合酶II结合于启动子是必需的。启动子代表能够与其他调控区(增强子、沉默子、边界元件/隔离子)协作以规定给定基因转录水平的关键元件。
真核生物的转录启动子包含许多基本元件,这些基本元件共同构成核心启动子(即,引发转录必需的最小启动子部分)。这些元件包含(1)转录起始位点(TSS),(2)RNA聚合酶结合位点(尤其编码信使RNA的基因的启动子中的RNA聚合酶II结合位点),(3)通用的转录因子结合位点(例如,具有共有序列TATAAA的TATA盒,其为TATA-结合蛋白(TBP)的结合位点),(4)B识别元件(BRE),(5)大约250bp的近端启动子,其含有调控元件,(6)转录因子结合位点(例如,具有序列CACGTF的E-盒,其为包括BMAL11-ClocknadcMyc在内的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子的结合位点),以及(7)远端启动子,其含有另外的调控元件。如本文所用,术语“转录启动子”不同于术语“增强子”,所述“增强子”是指远离转录起始位点的调控元件。
真核生物的启动子通常根据下述类别进行分类:(1)基于AT的类别,(2)基于CG的类别,(3)ATCG-紧凑类别(compactclass),(4)ATCG-平衡的类别,(5)ATCG-中等类别(middleclass),(6)ATCG-较少类别,(7)AT-较少类别,(8)CG-尖峰类别(spikeclass),(9)CG-较少类别和(10)AT-尖峰类别。参见Gagniuc和Ionescu-Tirgoviste,BMCGenomics13:512(2012)。
真核生物的启动子可为“单向的”或“双向的”。单向启动子调节单个基因的转录并且特征为存在TATA盒。双向启动子为双向基因对中基因5'端之间(即,在相反链上编码的两个邻近基因具有朝向彼此的5'端)的短的(<1kbp)DNA基因间区域。双向基因通常为功能相关的,由于它们共用单个启动子,所以可被共调节和共表达。与单向启动子不同,双向的启动子不含有TATA盒,但含有GpC岛且在一侧占优势的Cs和As与在另一侧占优势的Gs和Ts的约中点处显示出对称性。由于为NRF-1、GABPA、YY1和ACTACAnnTCCC基序,所以CCAAT盒为双向启动子中常见的。
转录启动子通常含有两个或更多个转录因子结合位点。因此,在具有多个转录因子结合位点的启动子的下游的核酸的有效表达通常需要多个转录因子的协作作用。因此,转录调节以及因此相关核酸表达的特异性可通过使用具有两个或更多个转录因子结合位点的转录启动子来增加。
如本文所用,术语“转录因子”是指序列特异的DNA结合因子,其结合于转录启动子中的特定序列,从而调节可操作的邻近启动子和启动子下游的核酸转录。转录因子包括激活剂和阻遏物,所述激活剂促进转录,所述阻遏物通过防止RNA聚合酶的募集或结合来阻断转录。转录因子通常含有(1)一个或多个DNA-结合结构域(DBD),其促进转录启动子内与同源的转录因子结合位点(a/k/a反应元件)的序列特异性结合;(2)一个或多个信号感应结构域(SSD),其包含响应于外部信号的配体结合结构域;以及(3)一个或多个反式激活结构域(TAD),其含有其它蛋白(包括转录辅调节因子)的结合位点。
如本文所用,术语“转录因子”专门指具有一个或多个DBD的那些因子并且不打算包括不含DBD的其它调节蛋白,如辅激活物、染色质重塑剂、组蛋白乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶和甲基化酶。
在大约2,600个含有DNA-结合结构域的人蛋白中,多数被认为是转录因子。根据DNA-结合结构域的结构特征,将转录因子进行分类,所述结构特征包括碱性螺旋-环-螺旋结构域、碱性亮氨酸拉链(bZIP结构域)、两分反应调节子(bipartiteresponseregulators)的C-端效应结构域、GCC盒结构域、螺旋-转角-螺旋结构域、同源结构域、λ阻遏物样结构域、血清应答因子样(srf样)结构域、配对盒结构域、翼状螺旋结构域、锌指结构域、多-Cys2His2锌指结构域、Zn2Cys6结构域和Zn2Cys8细胞核受体锌指结构域。
许多转录因子为肿瘤抑制子或癌基因,因此,这类转录因子内的突变和异常表达与一些癌症以及其它疾病和病况相关。例如,在(1)NF-κB家族、(2)AP-1家族、(3)STAT家族和(4)类固醇受体家族内的转录因子已牵涉神经发育病症Rett综合征(MECP2转录因子)、糖尿病(肝细胞核因子(HNF)和胰岛素启动子因子-1(IPFl/Pdxl))、发育性语言运用障碍(FOXP2转录因子)、自身免疫性疾病(FOXP3转录因子)、Li-Raumeni综合征(p53肿瘤抑制子)和多发性癌(转录因子的STAT和HOX家族)。Clevenger,Am.J.Pathol.165(5):1449-60(2004);Carrithers等,AmJPathol166(1):185-196(2005);Herreros-Villanueve等,WorldJGastroenterology20(9):2247-2254(2014);和Campbell等,AmJPathol158 (1):25-32(2001)。
Olsson等,Oncogene26(7):1028-37描述了在人膀胱癌和前列腺癌中转录因子E2F3上调,所述E2F3为细胞周期的重要调节剂。Cantile等,CurrMedChem18(32):4872-84描述了在泌尿生殖癌中HOX基因上调;Cillo等,IntJ.Cancer129(11):2577-87(2011)描述了在肝细胞癌中HOX基因上调;Cantile等,IntJ.Cancer125(7):1532-41(2009)描述了在79种肿瘤组织类型中出现HOXD13表达;Cantile等,JCellPhysiol205(2):202-10(2005)描述了在前列腺癌中HOXD表达的上调;Cantile等,Oncogene22(41):6462-8(2003)描述了人膀胱移行细胞癌的HOX网络中基因座C基因的过表达;Morgan等,BioMedCentral14:15(2014)描述了作为前列腺癌的靶标的HOX转录因子;以及Alharbi等,Leukemia27(5):1000-8(2013)描述了HOXC基因在血细胞生成和急性白血病中的作用。
AP-2家族包括五种转录因子,它们可充当阻遏物和激活剂。ΑΡ-2γ通过阻断p21CIP基因的p53激活来调节癌细胞存活。高水平的ΑΡ-2γ与乳腺癌的不良预后相关。Gee等,JPathol217(1):32-41(2009)和Williams等,EMBOJ28(22):3591-601(2009)。促进细胞存活的其它转录因子为叉头(forkhead)转录因子(FOX),其可促进参与抗药性的蛋白质的表达,也阻断程序化细胞死亡并且因此可以保护癌细胞免于化学治疗药物。Gomes等,ChinJ.Cancer32(7):365-70(2013)描述了FOXO3a和FOXM1在癌发生和抗药性中的作用。
转录因子可结合于启动子以及增强子。如本公开所用,术语转录因子是指结合于启动子中转录因子结合位点的转录因子亚组且排除结合于增强子序列的因子。转录因子还可上调或下调相关核酸的表达。本公开使用具有针对转录因子的转录因子结合位点的转录启动子,所述转录因子促进而非抑制表达,因此引起相关核酸的表达上调。上调核酸表达的这类转录因子包括例如但不限于如下转录因子:(1)使结合至其同源结合位点的RNA聚合酶稳定,(2)将辅激活蛋白或辅阻遏蛋白募集至转录因子DNA复合物,和/或(3)催化组蛋白乙酰化(或募集一种或多种催化组蛋白乙酰化的其它蛋白质)。这类组蛋白乙酰转移酶(HAT)活性降低组蛋白与DNA结合的亲和力,从而使DNA更易于转录。
如本文所用,术语“坏死”是指当细胞被外力损伤时发生的导致细胞死亡的过程,所述外力如毒物、身体损伤、感染或血供不足。来自坏死的细胞死亡引起炎症,所述炎症可导致体内进一步痛苦或损伤。如本文所用,术语“凋亡”是指导致如下的细胞死亡的过程,其中程序化的事件顺序导致细胞消除而不会释放有害物质。凋亡通过消除衰老细胞、无用细胞和不健康细胞而在身体健康的发展和维持中起重要作用。凋亡通过自杀基因产生的蛋白(包括半胱天冬酶蛋白)介导,所述蛋白分解存活所需的细胞组分并诱导产生破坏核DNA的DNA酶。
如本文所用,术语“自杀基因”是指产生诱导p53-介导的凋亡细胞杀伤的蛋白的一类基因。可在本公开的表达构建体和系统中使用的自杀基因包括半胱天冬酶、CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)和胞嘧啶脱氨酶以及CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、疱疹HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体。
本公开的表达构建体和系统被用于治疗衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或其它病况的方法中以及被用于杀伤与衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或其它病况相关且使用降低靶细胞生长和/或增殖的治疗性蛋白的细胞的方法中。在某些实施方式中,治疗性蛋白可由自杀基因表达,所述自杀基因编码CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶以及CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体。表达盒和系统也可与常规的化学疗法结合使用以增强用于治疗衰老、癌症、传染病、细菌感染以及其它疾病和病况的治疗方案的有效性。
除非有相反的指示,否则本公开的实施使用病毒学、肿瘤学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA领域中普遍使用的常规方法和技术,所述方法和技术为本领域技术人员熟知的且本领域技术人员容易获得。此类方法和技术在实验手册以及科学和专利文献中得到充分说明。参见,例如Sambrook等,“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(第二版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,冷泉港,N.Y.,1989);Maniatis等,“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(1982);“DNACloning:APracticalApproach,第I&II”卷(Glover编);“OligonucleotideSynthesis”(Gait编,1984);Ausubel等(编),“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(JohnWiley&Sons,1994);“NucleicAcidHybridization”(Hames&Higgins编,1985);“TranscriptionandTranslation”(Hames&Higgins编,1984);“AnimalCellCulture”(Freshney编,1986);和Perbal,“APracticalGuidetoMolecularCloning”(1984)。本文引用的所有出版物、专利和专利申请,无论上文或下文,在此通过引用整体并入。
用于降低、防止和/或消除靶细胞生长和/或存活的系统和表达构建体
在某些实施方式中,本公开提供了表达构建体和包括递送载体和表达构建体的系统,用于实现靶细胞特异的降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。
系统
本公开的系统包括:(1)载体,其能够将核酸非特异递送至细胞,无论细胞为靶细胞或非靶细胞,以及(b)表达构建体,其包含靶细胞特异的转录启动子和编码治疗性蛋白的核酸,所述表达构建体实现靶细胞特异的治疗性蛋白的产生。本文公开的系统将发现用于广泛的治疗应用中,其中需要实现靶细胞(如与衰老、疾病或另外的病况相关的细胞)的生长或存活特性,但同时不能实现与衰老、疾病或另外的病况无关的正常非靶细胞的生长或存活特性。
本公开提供了用于实现与衰老、疾病或其它病况相关的广泛细胞的生长和/或存活的系统,所述系统相似地包括(1)非特异的核酸递送载体,以及(2)表达构建体,其包含(a)靶细胞特异的转录启动子和(b)编码治疗性蛋白的核酸。本公开的系统的这些方面中的每一个在本文进一步详述。
在某些实施方式中,本文提供了实现靶细胞生长和/或存活的系统,所述系统包括:(1)非特异的核酸递送载体,以及(2)表达构建体,其包含:(a)转录启动子,所述转录启动子在靶细胞中被激活,但在正常非靶细胞中未被激活,以及(b)核酸,其在转录启动子的控制下,所述核酸编码治疗性蛋白,所述治疗性蛋白可通过例如诱导产生其的细胞的程序化细胞死亡的机制来降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活。因此,这些系统通过利用在靶细胞内产生的和靶细胞固有的转录机制来实现靶细胞的选择性杀伤;而无需使用毒素以及不存在表达构建体的靶细胞特异的递送。
在这些实施方式的某些方面,其中人类靶细胞为衰老细胞,转录启动子可包含如在Wang等的J.Biol.Chem.276(52):48655-61(2001)中所述的pl6INK4a/CDKN2A的至少一个转录因子结合位点(即,反应元件),所述转录启动子响应于诸如SP1、ETS1和ETS2的因子的激活。转录启动子也可包含p21/CDKNlA的至少一个转录因子结合位点(即,反应元件),所述转录启动子响应于诸如p53/TP53的因子的激活。转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白如CASP3、CASP8、CASP9、DFF40、BAX、HSV-TK或碳酸酐酶或CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体。
在这些实施方式的其它方面,其中人类靶细胞为癌细胞,如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌症细胞和骨癌细胞,所述转录启动子可包含p21cip1/waf1启动子、p27kip1启动子、p57kip2启动子、TdT启动子、Rag-1启动子、B29启动子、Blk启动子、CD19启动子、BLNK启动子和/或λ5启动子中的至少一个转录因子结合位点(即,反应元件),所述转录启动子响应于被一种或多种转录因子激活,所述转录因子如EBF3、O/E-1、Pax-5、E2A、p53、VP16、MLL、HSFl、NF-IL6、NFATl、AP-1、AP-2、HOX、E2F3和/或NF-κΒ转录因子,并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白诸如,例如CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶或者CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体,所述治疗性蛋白通过诸如,例如经由细胞过程(包括细胞凋亡)诱导衰老细胞的细胞死亡来降低、防止、和/或消除癌细胞的生长和/或存活。可以使用通过例如经由细胞过程诱导细胞死亡来降低、防止和/或消除癌细胞的生长和/或存活的其它治疗性蛋白,所述细胞过程包括坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
在这些实施方式的其它方面,其中靶细胞为被传染剂感染的人类细胞,所述传染剂如病毒,包括例如疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和鼻病毒,或者靶细胞为细菌细胞,转录启动子可被传染剂或细菌细胞表达的因子激活,所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白诸如,例如CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶或者CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK或胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体,所述治疗性蛋白通过诸如,例如经由细胞过程(包括细胞凋亡)诱导衰老细胞的细胞死亡来降低、防止、和/或消除衰老细胞的生长和/或存活。可以使用通过例如经由细胞过程诱导细胞死亡来降低、防止和/或消除衰老细胞的生长和/或存活的其它治疗性蛋白,所述细胞过程包括坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
本文公开的系统的这些方面中的每一个在此进一步详述。
非特异的核酸递送载体
本公开的系统通过利用靶细胞特有的转录机制来实现靶细胞特异性。因此,本文所述的系统使用可容易地适于将表达构建体非特异的递送至细胞的核酸递送载体,所述细胞包括但不限于靶细胞。
多种非病毒和病毒核酸递送载体为本领域熟知的且容易获得的,并且可以适于用于本文公开的表达构建体的非特异的细胞递送。对于病毒和非病毒核酸递送方法的一般性描述,参见例如Elsabahy等的CurrentDrugDelivery8(3):235-244(2011)。将核酸成功递送至哺乳动物细胞依赖于有效递送载体的使用。病毒载体显示出期望水平的递送效率,但经常也显示出不想要的免疫原性、炎症反应和与放大相关的问题,所有这些可限制它们的临床使用。用于递送核酸的理想载体为安全的,然而确保核酸稳定性以及将核酸有效转移至适当的细胞区室。
本文描述了以及科学和专利文献中公开了非病毒和病毒核酸递送载体的非限制性实例。更具体地,本公开的系统可以使用一种或多种脂质体载体、病毒载体、纳米颗粒、复合物(polyplexesm)树状物,其每一种已被开发用于核酸的非特异递送,可适于本文所述的表达构建体的非特异递送以及可被修饰以掺入一种或多种制剂用于促进系统至所关注的靶细胞的靶向递送,从而增强本文公开的系统的靶细胞特异性。
1.脂质体载体
表达盒可以被掺入脂膜、脂双层和/或脂质复合物内和/或与以上结合,所述脂质复合物诸如,例如,脂质体、囊泡、微团/或微球。用于制备可以与本公开的表达构建体一起使用的基于脂质的递送系统的合适方法描述于Metselaar等,MiniRev.Med.Chem.2(4):319-29(2002);O’Hagen等,ExpertRev.Vaccines2(2):269-83(2003);O’Hagan,Curr.DurgTargetsInfect.Disord.1(3):273-86(2001);Zho等,BiosciRep.22(2):355-69(2002);Chikh等,BiosciRep.22(2):339-53(2002);Bungener等,Biosci.Rep.22(2):323-38(2002);Park,BiosciRep.22(2):267-81(2002);Ulrich,Biosci.Rep.22(2):129-50;Lofthouse,Adv.DrugDeliv.Rev.54(6):863-70(2002);Zhou等,J.Immunother.25(4):289-303(2002);Singh等,PharmRes.19(6):715-28(2002);Wong等,Curr.Med.Chem.8(9):1123-36(2001);和Zhou等,Immunomethods4(3):229-35(1994)。Midoux等的BritishJ.Pharmacol157:166-178(2009)描述了用于递送核酸的化学载体,包括聚合物、肽和脂质。Sioud和Sorensen的BiochemBiophysResCommun312(4):1220-5(2003)描述了用于递送核酸的阳离子脂质体。
由于具有正电荷,阳离子脂质已被用于缩合带负电荷的DNA分子,以及促进DNA包封至脂质体中。阳离子脂质还为脂质体提供高度的稳定性。阳离子脂质体与细胞膜相互作用并通过胞吞作用的过程被细胞摄取。由于胞吞作用形成的核内体在细胞质中分解,从而释放出货运物核酸。然而,由于阳离子脂质体固有的稳定性,转染率由于货运物核酸的溶酶体降解而为低的。
辅助脂(helperlipids)(诸如电中性脂质DOPE和L-a-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC))可与阳离子脂质组合使用以形成稳定性降低且因此显示出改善的转染率的脂质体。这些电中性脂质被称为基因融合脂质。参见,Gruner等的Biochemistry27(8):2853-66(1988)和Farhood等的BiochimBiophysActa1235(2):289-95(1995)。DOPE形成诱导超分子排列的HII相结构,从而导致在超过5℃至10℃的温度下脂质双层融合。DOPE掺入脂质体也帮助形成破坏核内体膜稳定的HII相。
胆固醇可与DOPE脂质体组合使用用于其中静脉内施用脂质体载体的应用。Sakurai等,EurJPharmBiopharm52(2):165-72(2001)。DOPE的酰基链中存在的一个不饱和度是膜融合活性的重要因素。Talbot等,Biochemistry36(19):5827-36(1997)。
具有饱和链的氟化辅助脂,如DF4C11PE(rac-2,3-二[ll-(F-丁基)十一酰)甘油基-l-磷酸乙醇胺)也增强脂多胺脂质体的转染效率。Boussif等,JGeneMed3(2):109-14(2001);Gaucheron等,BioconjChem12(6):949-63(2001);和Gaucheron等,JGeneMed3 (4):338-44(2001)。
与DOPE脂复合物相比,辅助脂l,2-二油酰基-3-三甲胺-丙烷(DOTAP)增强体外细胞转染的效率。Prata等,ChemCommun13:1566-8(2008)。也已经显示用二硬脂酰-4-基(Distear-4-ynoyl)L-a-磷脂酰乙醇胺[DS(9-炔)PE]中的三键替代DOPE的油酸链的双键能产生更稳定的脂复合物。Fletcher等,OrgBiomolChem4(2):196-9(2006)。
来源于流感病毒血凝素的HA-2亚基的N-末端片段的两亲性阴离子肽,如IFN7(GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG)肽和E5CA(GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA)肽可被用于将脂质体的转染效率增加几个数量级。Wagner等,ProcNatlAcadSciU.S.A.89(17):7934-8(1992);Midoux等,NuclAcidsRes.21(4):871-8(1993);Kichler等,BioconjugChem8(2):213-21(1997);Wagner,AdvDrugDelivRev38(3):279-289(1999);Zhang等,JGeneMed3 (6):560-8(2001)。一些人工肽如GALA也已被用作基因融合肽。参见,例如Li等,AdvDrugDelivRev56(7):967-85(2004)和Sasaki等,AnalBioanalChem391(8):2717-27(2008)。来自单纯疱疹病毒的糖蛋白H的基因融合肽改善人类细胞中DNA/脂质体脂复合物的核内体释放和转基因表达(Tu和Kim,JGeneMed10(6):646-54(2008)。
PCT专利公布第WO2002/044206号描述了来自呼肠病毒科(Reoviridae)家族的一类蛋白,所述蛋白促进膜融合。这些蛋白通过来自爬虫类动物呼肠孤病毒的pl4蛋白和来自水生呼肠孤病毒的pl6蛋白来例示。PCT专利公布第WO2012/040825号描述了促进膜融合的重组多肽,所述多肽与pl4融合相关的小跨膜(FAST)蛋白的外部结构域具有至少80%的序列同一性并且具有功能性豆蔻酰化基序、来自FAST蛋白的跨膜结构域以及与p15FAST蛋白的内部结构域具有至少80%的序列同一性的序列。'825PCT进一步描述了将靶向配体添加至重组多肽用于选择性融合。可将'825PCT中呈现的重组多肽掺入脂质体的膜内以促进核酸的递送。用于将治疗性化合物(包括核酸)递送至哺乳动物细胞的细胞质的基因融合脂质体可商购自InnovascreenInc.(Halifax,新斯科舍,CA),所述基因融合脂质体降低脂质体破裂,随后货运物核酸全身分散和/或摄取入核内体并破坏所得的核酸。
2.纳米颗粒
多种无机纳米颗粒已被描述用于核酸的递送并且可适于本文所述的表达构建体的递送,所述无机纳米颗粒包括金、二氧化硅、铁氧化物、钛、水凝胶和磷酸钙。参见,例如Wagner和Bhaduri,TissueEngineering18(1):1-14(2012)(描述用于递送核酸序列的无机纳米颗粒);Ding等,MolThere-pub(2014)(描述用于核酸递送的金纳米颗粒);Zhang等,Langmuir30(3):839-45(2014)(描述用于递送DNA寡核苷酸的二氧化钛纳米颗粒);Xie等,CurrPharmBiotechnol14(10):918-25(2014)(描述用于基因递送的可生物降解的磷酸钙纳米颗粒);Sizovs等,JAmChemSoc136(1):234-40(2014)(描述sub-30单分散寡核苷酸纳米颗粒)。
无机载体的优势为其保存稳定性、低免疫原性和对微生物攻击的抗性。小于100nm的纳米颗粒能够有效地捕获核酸并允许其在没有降解的情况下从核内体逃逸。由于贴壁细胞系的高密度和优先位于培养皿的底部,所以无机纳米颗粒对贴壁细胞系显示出改善的体外转染。量子点已描述允许将核酸递送与稳定的荧光标志物结合。
明确大小和组成的水凝胶纳米颗粒可经由颗粒成型工艺(被称为PRINT(在非浸润模板中的粒子复制))来制备,并且可被用作针对本文公开的表达构建体的递送载体。核酸可通过静电缔合和物理捕获而被包封入颗粒。为防止全身施用后货运物核酸从纳米颗粒离解,可使用具有可降解的二硫键的可聚合的偶联物。
PRINT技术允许生成增强表达盒靶向靶细胞的改造的纳米颗粒,其具有精确控制的性质,包括尺寸、形状、模数、化学组成和表面功能性。参见,例如Wang等,JAmChemSoc132:11306-11313(2010);Enlow等,NanoLett11:808-813(2011);Gratton等,ProcNatlAcadSciUSA105:11613-11618(2008);Kelly,JAmChemSoc130:5438-5439(2008);Merkel等,ProcNatlAcadSciUSA108:586-591(2011)。PRINT也适宜连续的卷装进出(roll-to-roll)制造技术,其允许在优良制造规范(GMP)条件下将颗粒制造按比例放大。
纳米颗粒可用脂质包衣包封以改善口服生物利用度、使酶降解和穿过血脑屏障最小化。纳米颗粒表面还可被聚乙二醇化以改善水溶性、体内循环和隐密(stealth)性质。
3.病毒载体
多种病毒载体为本领域技术人员熟知的且本领域技术人员容易获得,所述病毒载体包括例如,单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体,所述病毒载体可适用于本文公开的系统用于核酸的递送,具体地,所述核酸为包含针对靶细胞特异性表达治疗性蛋白的表达盒的核酸。
天然的或改造的病毒对特异性受体的趋性为用于构建递送核酸的病毒载体的基础。在病毒载体上的配体识别细胞表面的特异性受体时,这些载体与靶细胞的结合是偶然的。在病毒表面呈现非常特异性的配体的病毒锚定至细胞上的特异性受体。可改造病毒以显示出针对所关注的靶细胞表面所呈现的受体的配体。细胞受体与病毒配体之间的相互作用通过toll样受体体内调节。
病毒载体进入细胞(无论经由受体介导的胞吞作用或膜融合)需要特异的结构域组,其允许病毒载体从核内体和/或溶酶体途径逃逸。其它结构域促进进入细胞核。复制、组装和潜伏期决定载体与细胞之间相互作用的动力学并且在选择病毒载体以及改造携带治疗性货运物细胞,在设计癌症自杀基因疗法中是重要的考虑因素。
单纯疱疹病毒(HSV)属于疱疹病毒科家族,其为包膜DNA的病毒。HSV通过它们的三个主要配体糖蛋白:gB、gH和gL的同源物结合于细胞受体并且有时使用辅助蛋白。这些配体在病毒进入口腔疾病形式、眼部疾病形式和生殖疾病形式的主要途径中起着决定性作用。HSV对神经系统的细胞受体具有高趋性,改造的重组病毒可利用该点用于将表达盒递送至靶细胞,包括衰老细胞、癌细胞和被传染剂感染的细胞。治疗性旁观者效应(therapeuticbystandereffects)通过将编码连接蛋白的序列包含入构建体来增强。将核酸递送至靶细胞的单纯疱疹病毒载体已经在以下进行了综述:Anesti和Coffin,ExpertOpinBiolTher10(1):89-103(2010);Marconi等,AdvExpMedBiol655:118-44(2009);以及Kasai和Saeki,CurrGeneTher6(3):303-14(2006)。
慢病毒属于逆转录病毒科(retroviridae)家族,其为包膜单链RNA的逆转录病毒并且包括人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV包膜蛋白结合CD4,其存在于人免疫系统的细胞上,所述细胞如CD4+T细胞、巨噬细胞和树突细胞。在进入细胞时,病毒RNA基因组逆转录成双链DNA,所述双链DNA被引入细胞核并整合至细胞DNA。HIV载体已被用于向白血病细胞递送治疗性基因。重组慢病毒已被描述用于将核酸通过粘蛋白介导而递送至胰腺癌细胞、至上皮卵巢癌细胞和至神经胶质瘤细胞,而无大量的非特异递送至正常细胞。将核酸递送至靶细胞的慢病毒载体已在以下进行了综述:Primo等,ExpDermatol21(3):162-70(2012);Staunstrup和Mikkelsen,CurrGeneTher11(5):350-62(2011);以及Dreyer,MolBiotechnol47(2):169-87(2011)。
(7):365-76(2012);以及Mowa等,ExpertOpinDrugDeliv7(12):1373-85(2010)。
腺相关病毒(AAV)为感染人和一些其它灵长类物种的小病毒。目前未得知AAV能引起疾病,因此该病毒引起非常轻度的免疫应答。使用AAV的载体可感染分裂细胞和休眠细胞并持续处于染色体外状态而不会整合至宿主细胞的基因组。这些特征使AAV成为产生本公开系统中使用的病毒载体的非常有吸引力的候选物。用于将核酸递送至靶细胞的腺相关病毒(AAV)载体已在以下进行了综述:Li等,J.ControlRelease172(2):589-600(2013);Hajitou,AdvGenet69:65-82(2010);McCarty,MolTher16(10):1648-56(2008);和Grimm等,MethodsEnzymol392:381-405(2005)。
4.复合物
复合物为具有DNA的聚合物的复合体。复合物由阳离子聚合物组成并且它们的制造基于离子相互作用的自组装。复合物与脂质体和脂复合物作用方法之间的一个重要差别为复合物不能将它们的核酸货运物直接释放至靶细胞的细胞质中。因此,需要与核内体-溶解剂(如灭活的腺病毒)进行共转染以促进颗粒摄取期间从制得的胞吞囊泡中逃逸。更好地理解DNA能够从内溶酶体途径逃逸的机制(即,质子海绵效应)已触发新的聚合物合成策略,如在聚合物主链中引入质子化残基以及已使基于聚阳离子的系统的研究恢复生气。参见,例如Parhamifar等,Methodse-pub(2014);Rychgak和Kilbanov,AdvDrugDelivReve-pub(2014);Jafari等,CurrMedChem19(2):197-208(2012)。
由于低毒性、高装载容量和易于制造,聚阳离子纳米载体显示出优于病毒载体和基于脂质的载体的大量优势,所述病毒载体显示出高免疫原性和潜在的致癌性,所述基于脂质的载体引起剂量依赖性毒性。聚乙烯亚胺、壳聚糖、聚(β-氨基酯)和聚磷酰胺酯已被描述用于核酸的递送。参见,例如Buschmann等,AdvDrugDelivRev65(9):1234-70(2013)。可容易地操作这些聚合纳米载体的大小、形状和表面化学。
5.树状物
树状物为具有球形的高度分枝的大分子。树状物颗粒的表面可以诸如,例如用阳性表面电荷功能化(阳离子树状物),其可以用于核酸的递送。经由胞吞作用,树状物-核酸复合体被摄入细胞。树状物提供稳健的共价构造并严格控制分子结构和大小。树状物可商购自DendriticNanotechnologiesInc.(Priostar;MtPleasant,MI),该公司使用动力学驱动的化学生产树状物,所述树状物可适于递送核酸并且可以以高效率和低毒性转染细胞。
应理解,虽然表达构建体的靶向递送不是本公开的系统所必需的,靶向降低、防止和/或消除靶细胞的生长和/或存活可以通过利用靶细胞的细胞内转录机制来实现,所述细胞内转录机制是靶细胞特有的,但期望的是,根据预期的精确应用,将一种或多种促进靶向递送至细胞亚组的组分掺入另外的非特异递送载体中,细胞亚组中的一些包括靶细胞,所述靶细胞易受本公开表达构建体的生长和/或存活抑制的影响。
通过本文所述的脂质体、纳米颗粒、病毒和其它载体靶向递送核酸已在科学和专利文献中描述,为本领域技术人员熟知的且本领域技术人员容易获得的。因此,此类靶向递送技术可适于靶向本公开的表达构建体的递送以增强靶细胞内实现的降低、防止和/或消除生长和/或存活的特异性。本文提供了靶向递送技术的下述实例以例示而非限制可以适于实现本公开系统的靶向递送载体。
表达构建体
本公开的表达构建体包含:(a)转录启动子,其响应于靶细胞中产生的一种或多种因子,所述因子中的一种或多种不在非靶细胞中产生、在非靶细胞中以显著降低的水平产生、在非靶细胞中为无活性的和/或在非靶细胞中显示出显著降低的活性;以及(b)核酸,其可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码这样的蛋白,其能够降低、防止和/或消除产生所述蛋白的细胞(包括靶细胞)的生长和/或存活。
1.靶细胞特异的转录启动子
本公开提供了包含将核酸递送至细胞的载体的系统,其中所述核酸在启动子的转录控制下,所述启动子在靶细胞中为脱阻抑的或激活的,但在正常细胞、非靶细胞中为抑制的或失活的。
因此,应理解,不考虑细胞是否为靶细胞,通过编码降低、防止、和/或消除细胞生长和/或存活的蛋白质的核酸的靶细胞特异的转录激活,实现本公开的系统对靶细胞的特异性。因此,本公开系统的靶细胞特异性来源于转录启动子,所述转录启动子与转录调控机制一起调节表达盒内核酸的表达,所述转录调控机制由靶细胞提供或为靶细胞特有的。
因此,可以适于用于本公开的表达构建体、系统和方法的转录启动子包括那些转录启动子,所述转录启动子能够促进靶细胞(即,与衰老、疾病或其它病况相关的细胞)中核酸的表达,但不能促进非靶细胞中核酸的表达或在促进非靶细胞中核酸的表达方面显示出显著降低的能力。
本文例示的为表达构建体和包含表达构建体的系统,其中转录启动子在与衰老、疾病或另外病况相关的靶细胞中被激活。
在一些实施方式中,本公开提供了可以用于治疗衰老的方法中降低、防止和/或消除与衰老相关的细胞的生长和/或存活的表达构建体和系统,所述细胞如衰老细胞。在那些实施方式的某些方面,表达构建体使用响应于一种或多种因子的转录启动子,所述因子在靶细胞(如衰老细胞)内产生,但不在非靶细胞中产生,其中那些一种或多种因子去阻抑和/或激活转录启动子,因此促进编码治疗性蛋白的核酸进行表达,所述治疗性蛋白降低、防止、和/或消除与衰老相关的细胞(包括衰老细胞)的生长和/或存活。
转录启动子自身为主要机制,本公开中所述的系统通过该机制优先地靶向衰老细胞。本公开中系统所用的靶向特异的转录启动子的原型实例为仅在衰老细胞中活化或主要在衰老细胞中活化的启动子。技术人员已知的在衰老细胞中活化的许多启动子可以与该系统一起使用。
在这些实施方式的某些方面,其中人靶细胞为衰老细胞,转录启动子可包括如在Wang等的J.Biol.Chem.276(52):48655-61(2001)中所述的p16INK4a/CDKN2A的启动子区,所述转录启动子响应于因子的激活,所述因子如SP1、ETS1和ETS2。转录启动子也可包括p21/CDKNlA的启动子区,所述转录启动子响应于诸如p53/TP53的因子的激活。
在这些实施方式的其它方面,其中人类靶细胞为癌细胞,如脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌症细胞和骨癌细胞,转录启动子可包括p21cip1/waf1启动子、p27kip1启动子、p57kip2启动子、TdT启动子、Rag-1启动子、B29启动子、Blk启动子、CD19启动子、BLNK启动子和/或λ5启动子,所述转录启动子响应于一种或多种转录因子的激活,所述转录因子如EBF3、O/E-1、Pax-5、E2A、p53、VP16、MLL、HSF1、NF-IL6、NFAT1、AP-1、AP-2、HOX、E2F3和/或NF-κB转录因子,并且所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达。
在这些实施方式的其它方面,其中靶细胞为被传染剂感染的人类细胞,所述传染剂如病毒,包括例如,疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和鼻病毒,或靶细胞为细菌细胞,转录启动子可被传染剂或细菌细胞表达的因子激活,所述转录激活诱导编码治疗性蛋白的核酸进行表达。p16转录启动子
在一个实施方式中,可将自杀基因置于p16启动子的控制中,所述p16启动子如pl6Ink4a基因启动子,其在衰老细胞中为转录活化的,但在非衰老细胞中不是转录活化的。
在人中,p16由CDKN2A基因编码,所述基因在多种肿瘤中频繁地突变或缺失。p16为细胞周期蛋白依赖性激酶(如CDK4和CDK6)的抑制剂,磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白质(pRB)从而引起Gl期进展至S期。pl6通过使Gl期至S期的进展减速而在细胞周期调节中起重要作用,并且因此充当涉及预防癌症的肿瘤抑制子,所述癌症包括,例如,黑素瘤、口咽鳞状细胞癌和食道癌。名称pl6Ink4A是指由CDKN2A基因的其中一个剪接变体编码的分子量为15,845的蛋白质并且其作用为抑制CDK4。
在人中,p16由位于第9号染色体(9p21.3)的CDKN2A基因编码。该基因产生几种转录物变体,所述转录物变体在它们的第一外显子中存在不同。已报道编码不同蛋白的至少三种选择性剪接变体,其中的两种编码结构上相关的已知起CDK4抑制剂作用的同工型。剩余的转录物包括位于基因剩余部分上游20kb的选择性外显子1;该转录物含有选择性开放阅读框(ARF),其指定结构上与其它变体的产物无关的蛋白质。ARF产物起到肿瘤抑制蛋白p53的稳定剂的作用,因为所述ARF产物可与MDM2相互作用并使MDM2分离,所述MDM2为负责p53降解的蛋白。尽管存在结构和功能差异,但该基因编码的CDK抑制剂同工型和ARF产物通过CDK4和p53在细胞周期Gl进程中的调控作用在控制细胞周期的G1期中共用共同的功能性。该基因在多种肿瘤中频繁突变或缺失,并且已知所述基因为重要的肿瘤抑制基因。
pl6INK4a的浓度随组织衰老而显著增加。Liu等,AgingCell8(4):439-48(2009)和Krishnamurthy,Nature443(7110):453-7(2006)。随年龄而增加的pl6基因的表达降低干细胞的增殖,从而增加人的细胞衰老相关的健康风险。
p16为通过抑制Gl期至S期的进程而减缓细胞周期的周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂。通常地,CDK4/6结合细胞周期蛋白D并形成活性蛋白复合体,其使视网膜母细胞瘤蛋白质(pRB)磷酸化。一旦被磷酸化,pRB从转录因子E2F1脱离,从而将E2F1从其细胞质结合状态释放,允许E2F1进入细胞核。一旦在细胞核中,E2F1促进靶基因的转录,所述靶基因对于从Gl期转变至S期是必不可少的。
p16通过结合于CDK4/6并防止其与细胞周期蛋白D相互作用而充当肿瘤抑制子。该相互作用最终抑制转录因子(如E2F1)的下游活性并阻滞细胞增殖。该途径与肿瘤形成和衰老的过程有关,将其固定于范围的相反端。在一端,p16的超甲基化、突变或缺失导致基因的下调并且可通过细胞周期进程的失调而导致癌症。相反地,通过ROS途径、DNA损伤或衰老激活p16导致组织中pl6的积累并涉及细胞的衰老。
p16的调控为复杂的,并涉及几种转录因子的相互作用以及参与通过甲基化的表观遗传修饰的几种蛋白质和启动子区的阻抑。PRC1和PRC2为两种蛋白复合体,其通过多种转录因子的相互作用修饰pl6的表达,所述转录因子实施能够阻抑pl6转录的甲基化模式。这些途径在降低衰老的细胞反应中被激活。
p21转录启动子
编码治疗性蛋白的核酸可被置于p21/CDKNlA转录启动子的控制下,所述p21/CDKNlA转录启动子在衰老细胞和癌细胞或癌前细胞中经常为转录活化的。当受损时,p53/TP53在调控p21以及因此,细胞的生长停滞中起重要作用。p21蛋白直接结合于驱动细胞周期的细胞周期蛋白-CDK复合体并抑制其激酶活性,从而引起细胞周期停滞以允许进行修复。p21还介导与分化相关的生长停滞以及与细胞衰老相关的更持久的生长停滞。p21基因含有介导p53蛋白直接结合的几种p53反应元件,从而致使编码p21蛋白的基因的转录激活。p53基因调控在细胞衰老中的作用描述于Kelley等的CancerResearch70(9):3566-75.(2010)。
2.核酸和借以编码的治疗性蛋白
可以适用于本公开的表达构建体、系统和方法的核酸编码这样的蛋白,其能够降低、防止和/或消除产生所述蛋白的细胞的生长和/或存活,所述细胞包括靶细胞。因此,本公开的表达构建体和系统的靶细胞特异性通过在编码治疗性蛋白的核酸的靶细胞内而不是非靶细胞内的表达来实现。
可以用于本公开的表达构建体和系统的编码治疗性蛋白的核酸包括编码一种或多种如下蛋白的核酸,所述蛋白诱导产生其的细胞凋亡。本文例示的为包含一种或多种“自杀基因”的表达构建体和系统,所述“自杀基因”如编码单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶、CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、胞嘧啶脱氨酶的核酸或编码能够诱导细胞凋亡的蛋白的其它核酸。
凋亡或程序化细胞死亡(PCD)为所有后生动物的共有的且进化上保守的性质。在许多生物过程中,凋亡对于消除多余的或危险(如癌前)细胞以及促进正常发育是必需的。因此,凋亡的失调可有助于许多主要疾病的进展,所述疾病包括癌症、自身免疫性疾病和神经变性病症。在多数情况下,半胱天冬酶家族的蛋白实施导致细胞死亡的基因程序。
凋亡通过半胱天冬酶蛋白的激活而在哺乳动物细胞、尤其人类细胞中触发,所述半胱天冬酶蛋白尤其为半胱天冬酶蛋白CASP3、CASP8和CASP9。参见,例如,Xie等,CancerRes61(18):186-91(2001);Carlotti等,CancerGeneTher12(7):627-39(2005);Lowe等,GeneTher8(18):1363-71(2001);和Shariat等,CancerRes61(6):2562-71(2001)。
DNA片段化因子(DFF)为DNA酶DFF40(CAD)及其分子伴侣/抑制剂DFF45(ICAD-L)的复合体。在非活性形式时,DFF为由45kDa分子伴侣抑制剂亚基(DFF45或ICAD)和40kDa潜在的核酸内切酶亚基(DFF40或CAD)组成的异源二聚体。在半胱天冬酶-3切割DFF45时,DFF40形成活性核酸内切酶同源寡聚物。它在凋亡期间被激活以诱导DNA片段化。DFF结合于DNA由核酸酶亚基介导,在从DFF释放之后,所述核酸酶亚基也可形成稳定的DNA复合物。核酸酶亚基在DNA切割中受抑制,但在DNA结合中并不受抑制。DFF45也能够被半胱天冬酶-7切割和失活,但不能被半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-8切割和失活。切割的DFF45片段从DFF40离解,使DFF40寡聚体化,从而形成通过引入双链断裂切割DNA的大的复合体。组蛋白H1赋予DFF与DNA结合的能力并刺激DFF40的核酸酶活性。细胞凋亡的核酸内切酶DFF-40的激活描述于Liu等的JBiolChem274(20):13836-40(1999)。
胸苷激酶(TK)为ATP-胸苷5'-磷酸转移酶,其存在于所有活细胞以及某些病毒中,所述病毒包括单纯疱疹病毒(HSV)、水痘带状疱疹病毒(VZV)和爱泼斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒(EBV)。胸苷激酶将脱氧胸苷转化成脱氧胸苷5'-单磷酸(TMP),其分别通过胸苷酸激酶和核苷二磷酸激酶而被磷酸化成脱氧胸苷二磷酸和脱氧胸苷三磷酸。脱氧胸苷三磷酸通过DNA聚合酶和病毒逆转录酶而被掺入细胞DNA中。
当掺入DNA中时,某些dNTP类似物,如2'-脱氧-鸟苷(例如更昔洛韦)的合成类似物引起DNA合成的过早终止,这触发细胞凋亡。
在某些实施方式中,本公开的表达盒和系统使用编码HSV-TK的核酸。在将使用编码HSV-TK的核酸的系统施用于人之后,将2'-脱氧-核苷酸(如2'-脱氧-鸟苷)的类似物施用于人。HSV-TK将2'-脱氧-核苷酸类似物有效地转化成dNTP类似物,当掺入DNA时,所述dNTP类似物诱导靶细胞凋亡。
胞嘧啶脱氨酶(CD)将DNA的胞嘧啶催化水解转化成尿嘧啶和铵。如果CD-修饰的位点被核酸内切酶识别,则磷酸二酯键被切割,并且在正常细胞中,所述磷酸二酯键通过掺入新的胞嘧啶进行修复。在存在5-氟胞嘧啶(5-FC)的情况下,胞嘧啶脱氨酶将5-FC转化成5-氟尿嘧啶(5-FU),其可抑制靶细胞生长。因此,CD在靶细胞中的转基因表达降低靶细胞的生长和/或存活。
本公开提供了表达构建体和系统,其进一步包含一种或多种安全性特征以确保编码治疗性蛋白的核酸的表达在适当的细胞中上调、在期望的时段内上调,和/或上调至指定水平。
在一个此类实施方式中,本公开的表达构建体和系统使用编码治疗性蛋白的可诱导变体的核酸,所述可诱导变体包括例如,CASP3、CASP8和CASP9的可诱导变体,所述表达构建体或系统需要将细胞与激活治疗性蛋白的化学或生物化合物进一步接触或向人施用激活治疗性蛋白的化学或生物化合物。
可诱导的自杀基因系统为本领域熟知的、为本领域容易获得的且已描述于例如Miller等的PCT专利公布第WO2008/154644号和Brenner的美国专利公布第2011/0286980号。另外,Shah等的Genesis45(4):104-199(2007)描述了半胱天冬酶3和半胱天冬酶9的双诱导系统,其使用RU486和二聚化的化学诱导剂(CID)。Straathof等的Blood105(11):4247-4254(2005)描述了可诱导的半胱天冬酶9系统,其中使用小分子AP20187(ARIADPharmaceuticals,Cambridge,MA),将半胱天冬酶9融合至人FK506结合蛋白(FKBP)以允许条件二聚化,所述小分子AP20187为FK506的无毒合成类似物。Carlotti等的CancerGeneTher12(7):627-39(2005)描述了通过使用ARIADTM同源二聚化系统(FKC8;ARIADPharmaceuticals)可诱导的半胱天冬酶8系统。
全长可诱导的半胱天冬酶9(F'F-C-Casp9.I.GFP)包括全长半胱天冬酶9,包括其半胱天冬酶募集结构域(CARD;GenBankNM001229),其连接至两个12kDa的人FK506结合蛋白(FKBP12;GenBankAH002818),所述人FK506结合蛋白含有F36V突变,如在Clackson等的Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:10437-10442(1998)中所述并通过Ser-Gly-Gly-Gly-Ser连接子连接,所述连接子连接FKBP和半胱天冬酶9以增强柔性。
在进一步实施方式中,可诱导的自杀基因可被连接至针对可检测生物标志物(如荧光素酶或绿色荧光蛋白)的核酸序列以允许在施用激活可诱导的治疗性蛋白的化合物之前检测靶细胞。
包含载体和表达盒的系统的组合物和制剂
本公开提供了包含载体和表达盒的系统,其中表达盒包含转录启动子和编码治疗性蛋白的核酸,所述转录启动子响应于靶细胞中表达的一种或多种转录因子。可将系统本身施用于人患者或将含系统的药物组合物施用于人患者,在药物组合物中,将所述系统在治疗或减轻本文所述的疾病或病况的剂量下与合适的载体或赋形剂混合。也可将这些系统的混合物以简单混合物或含于药物组合物中施用于患者。
本公开范围内的组合物包括这样的组合物,其中治疗剂为有效降低或消除靶细胞生长和/或存活的量的包含载体和表达盒的系统,所述靶细胞如衰老细胞、癌细胞、被传染剂感染的细胞、细菌细胞或与另外的疾病或病况相关的细胞。每种组分的有效量的最佳范围的测定在本领域技术人员的范围内。有效剂量为许多因素的函数,所述因素包括:具体的系统、组合物内或与系统同时给予的一种或多种另外治疗剂的存在、治疗频率以及患者的临床状态、年龄、健康和体重。
包含系统的组合物可以经胃肠外施用。如本文所用,术语“胃肠外施用”是指除肠内和外用之外的施用模式,通常通过注射,并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。可选地或同时地,施用可以为口服地。
包含系统的组合物可以例如经由静脉推注或快速注射静脉内施用。可选地,包含系统的组合物可以经由静脉内输注施用。
组合物包含治疗有效量的系统和药学上可接受的载体。如本文所用,术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其它通常认可的药典上列出,以用于动物并且更具体地为用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌液体如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时,水为优选的载体。生理盐水和右旋糖以及丙三醇水溶液也可用作液态载体,特别是对于注射液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要,组合物也可含有微量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。
这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。组合物可利用常规的粘合剂和载体(如甘油三酯)被配制成栓剂。口服制剂可包含标准载体,如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这类组合物含有治疗有效量的抑制剂(优选呈纯化形式)以及合适量的载体以便提供向患者适当施用的形式。制剂应当适合于施用模式。
根据适合静脉内施用于人的药物组合物的常规程序可配制组合物。通常,静脉内施用的组合物为无菌等渗缓冲水溶液的溶液。必要时,组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以缓和注射位置上的疼痛。一般地,可分开地或混合在一起以单位剂量形式(例如,作为密封于容器如标示活性剂的量的安瓿或小袋(sachette)中的干燥冻干粉或无水浓缩物)提供成分。在通过输注施用组合物的情况下,可无需含有无菌药物级水或盐水的输液瓶。当通过注射施用组合物时,可提供一安瓿的无菌注射用水或盐水,以便在施用之前混合成分。
本文公开的系统可被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与诸如来自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的那些盐以及与诸如来自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子形成的那些盐。
用于治疗与衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或其它疾病或病况相关的细胞有关
的疾病或病况的方法以及用于降低、抑制和/或防止与衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或
其它疾病或病况相关的细胞的生长和/或存活的方法
本公开提供了用于降低、抑制和/或防止与衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或其它疾病或病况相关的细胞的生长和/或存活的方法,所述方法包括使靶细胞或包含靶细胞的细胞群与本文所述的系统接触,所述系统包括载体和表达构建体,所述表达构建体包含转录启动子和核酸。
本公开还提供了用于治疗患者中衰老、癌症、传染病、细菌感染和/或其它疾病或病况的方法,所述方法包括施用本文所述的系统,所述系统包括载体和表达构建体,所述表达构建体包含转录启动子和核酸。
本治疗方法涉及使靶细胞与包含含有载体和表达盒的一种或多种系统的组合物接触,或向人患者施用包含含有载体和表达盒的一种或多种系统的组合物用于降低和/或消除与衰老、癌症、传染病、细菌感染或另外的疾病或病况相关的细胞的生长和/或存活。
可通过标准临床技术确定有效治疗、抑制和/或防止衰老、癌症、传染病、细菌感染或与升高的一种或多种转录因子的表达相关的其它疾病或病况的系统的量。可以任选地使用体外测定以帮助鉴别最佳剂量范围。待在制剂中使用的精确剂量也取决于施用途径和疾病或病症的严重性。可以由来源于体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线来外推有效剂量。
在用于人之前,可在体外测试本公开的系统或药物组合物的期望治疗或预防活性,然后体内测试其期望治疗或预防活性。例如,证明化合物或药物组合物的治疗或预防实用性的体外测定包括系统对细胞系或患者组织样品的作用。系统或其药物组合物对细胞系和/或组织样品的作用可利用本领域技术人员已知的技术来测定,所述技术包括但不限于增殖和凋亡测定。根据本公开,可用于测定是否表明施用了具体化合物的体外测定包括体外细胞培养测定,其中患者组织样品在培养物中生长,暴露于化合物或以其他方式施用化合物,并观察此类化合物对组织样品的作用。
本公开通过向对象施用有效量的本文所述的系统或其药物组合物提供了用于治疗和生长和/或存活抑制的方法。在一方面,系统为基本上纯化的,使得该系统基本上不含限制其作用或产生不期望副作用的物质。
施用方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。系统或其组合物可以通过任何方便的途径施用,例如通过输注或快速注射,通过经由上皮或皮肤粘膜衬膜(例如,口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部的。另外,期望通过任何合适的途径将抑制剂或组合物引入中枢神经系统,所述途径包括心室内和鞘内注射。可以通过例如连接到储器(如Ommaya储器)的心室内导管来促进心室内注射。也可使用肺部施用,例如,通过使用吸入器或喷雾器以及含有雾化剂的制剂。
期望将系统或其组合物局部施用至需要治疗的区域;这可以通过以下实现,例如,手术期间局部输注、局部应用、通过注射、凭借导管、凭借栓剂或凭借移植物,所述移植物为多孔的、无孔的或凝胶状材料,包括膜(如硅橡胶膜(sialasticmembrane))或纤维。
系统可以设置成接近治疗靶标的控释系统递送,因此仅需要全身剂量的一部分(参见,例如Goodson,inMedicalApplicationsofControlledRelease2:115-138(1984))。
包含系统的组合物的静脉内输注可以持续至少约1天、或至少约3天、或至少约7天、或至少约14天、或至少约21天、或至少约28天、或至少约42天、或至少约56天、或至少约84天、或至少约112天的时间。
包含系统的组合物的连续静脉内输注可以保持指定的持续期间,随后保持剩余的另外持续时段。例如,连续输注持续时间可以从约1天、至约7天、至约14天、至约21天、至约28天、至约42天、至约56天、至约84天或至约112天。然后,可以紧跟从约1天、至约2天、至约3天、至约7天、至约14天或至约28天的剩余时段进行连续输注。然后,可以如上以及随后在另外的剩余时段内重复连续输注。
尽管采用了精确输注方案,应理解包含系统的组合物的连续输注应持续直至实现期望功效或不可接受的毒性水平变得明显。
应理解,除非有相反的指示,否则术语旨为“开放的”(例如,术语“包括(including)”应被解释为“包括但不限于”,术语“具有”应被解释为“具有至少”,术语“包括(includes)”应被解释为“包括但不限于”等)。诸如“至少一个”和“一个或多个”的短语以及诸如“一个/一种”("a/an")的术语包括单数和复数。
应进一步理解,其中本公开的特征或方面按照马库什组(Markushgroup)描述,因而本公开也旨在按照马库什组中的任何单个成员或成员亚组来描述。类似地,本文公开的所有范围也涵盖所有可能的子范围和子范围的组合,并且诸如“在……之间”、“多达”、“至少”、“大于”“小于”等的措辞包括范围内列举的数值且包括每个单独成员。
本文引用的所有参考文献(包括但不限于专利、专利申请、专利公布(无论美国的、PCT或非美国的外国的)和所有技术和/或科学出版物),无论上文或下文,据此通过引用整体并入。
虽然本文已经公开了多种实施方式,其它实施方式对于本领域技术人员是显而易见的。本文公开的多种实施方式出于例示目的且并非旨在限制性的,其中真实范围和精神由以下权利要求所指出。
参考下述非限制性实施例将进一步描述本公开。本文引用的所有专利、专利申请和所有其它出版物的教导通过引用整体并入。
Claims (46)
1.一种用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,所述表达构建体包含:
a.转录启动子,所述转录启动子响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在靶细胞内产生;以及
b.核酸,所述核酸可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码能够降低、防止和/或消除包括所述靶细胞在内的细胞的生长和/或存活的治疗性蛋白。
2.如权利要求1所述的表达构建体,其中所述转录启动子在所述靶细胞中被激活,但在与所述疾病无关的正常哺乳动物细胞中未被激活。
3.如权利要求2所述的表达构建体,其中所述因子中的至少一种因子未在与所述疾病无关的所述正常哺乳动物细胞中产生。
4.如权利要求3所述的表达构建体,其中所述正常哺乳动物细胞为正常的人类细胞。
5.如权利要求4所述的表达构建体,其中所述正常的人类细胞选自由正常骨骼肌成肌细胞、正常脂肪细胞、正常眼部细胞、正常脑细胞、正常肝细胞、正常结肠细胞、正常肺细胞、正常胰腺细胞、和/或正常心肌细胞构成的组,所述正常细胞与疾病、病况或衰老无关。
6.如权利要求1所述的表达构建体,其中所述靶细胞选自由哺乳动物细胞和细菌细胞构成的组。
7.如权利要求6所述的表达构建体,其中所述靶细胞为哺乳动物细胞。
8.如权利要求7所述的表达构建体,其中所述哺乳动物靶细胞为选自由以下构成的组的人类细胞:衰老细胞、癌细胞以及被传染病剂感染的细胞。
9.如权利要求8所述的表达构建体,其中所述人类靶细胞为衰老细胞。
10.如权利要求9所述的表达构建体,其中所述转录启动子选自由pl6INK4a/CDKN2A转录启动子和p21/CDKNlA转录启动子构成的组。
11.如权利要求9所述的表达构建体,其中所述转录启动子响应于选自由SPl、ETSl、ETS2和p53/TP53构成的组的因子。
12.如权利要求9所述的表达构建体,其中所述核酸编码选自由CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶构成的组的治疗性蛋白。
13.如权利要求9所述的表达构建体,其中所述治疗性蛋白诱导所述靶细胞中的细胞死亡。
14.如权利要求13所述的表达构建体,其中所述诱导的细胞死亡经由选自由以下构成的组的细胞过程发生:凋亡、坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
15.如权利要求8所述的表达构建体,其中所述人类哺乳动物靶细胞为癌细胞。
16.如权利要求13所述的表达构建体,其中所述癌细胞选自由脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌症细胞和骨癌细胞构成的组。
17.如权利要求13所述的表达构建体,其中所述转录启动子选自由p21cip1/waf1启动子、p27kip1启动子、p57kip2启动子、TdT启动子、Rag-1启动子、B29启动子、Blk启动子、CD19启动子、BLNK启动子和λ5启动子构成的组。
18.如权利要求13所述的表达构建体,其中所述转录启动子响应于选自由以下构成的组的因子:EBF3、O/E-1、Pax-5、E2A、p53、VP16、MLL、HSFl、NF-IL6、NFATl、AP-1、AP-2、HOX、E2F3、和/或NF-κB转录因子。
19.如权利要求13所述的表达构建体,其中所述核酸编码选自由以下构成的组的治疗性蛋白:CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶。
20.如权利要求8所述的表达构建体,其中所述靶细胞为被传染病剂感染的人类细胞或细菌细胞。
21.如权利要求20所述的表达构建体,其中所述传染剂为选自由以下构成的组的病毒:疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和鼻病毒。
22.如权利要求20所述的表达构建体,其中所述核酸编码选自由以下构成的组的治疗性蛋白:CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶。
23.一种用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统,所述系统包括:
a.载体,所述载体能够将核酸递送至细胞,所述载体包含表达构建体;以及
b.用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,所述表达构建体包含:
i.转录启动子,所述转录启动子响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
ii.核酸,所述核酸可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码能够降低、防止和/或消除包括所述靶细胞在内的细胞的生长和/或存活的治疗性蛋白。
24.如权利要求23所述的系统,其中所述载体选自由脂质体、病毒载体、纳米颗粒、复合物和树状物构成的组。
25.如权利要求23所述的系统,其中所述载体为脂质体,其中所述脂质体包含基因融合肽。
26.如权利要求23所述的系统,其中所述载体为病毒载体,其中所述病毒载体包括选自由单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体构成的组。
27.如权利要求23所述的系统,其中所述载体为纳米颗粒,其中所述纳米颗粒选自由金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒、铁氧化物纳米颗粒、钛纳米颗粒、水凝胶纳米颗粒和磷酸钙纳米颗粒构成的组。
28.如权利要求23所述的系统,其中所述转录启动子在所述靶细胞中被激活但在与所述疾病无关的正常哺乳动物细胞中未被激活。
29.如权利要求23所述的系统,其中所述因子中的至少一种因子未在与所述疾病无关的所述正常哺乳动物细胞中产生。
30.如权利要求23所述的系统,其中所述哺乳动物靶细胞为选自由以下构成的组的人类细胞:衰老细胞、癌细胞和被传染病剂感染的细胞。
31.如权利要求30所述的系统,其中所述人类靶细胞为衰老细胞。
32.如权利要求30所述的系统,其中所述转录启动子选自由pl6INK4a/CDKN2A转录启动子和p21/CDKNlA转录启动子构成的组。
33.如权利要求32所述的系统,其中所述转录启动子响应于选自由SP1、ETS1、ETS2和p53/TP53构成的组的因子。
34.如权利要求30所述的系统,其中所述核酸编码选自由CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶构成的组的治疗性蛋白。
35.如权利要求34所述的系统,其中所述治疗性蛋白诱导所述靶细胞中的细胞死亡。
36.如权利要求35所述的系统,其中所述诱导的细胞死亡经由选自由以下构成的组的细胞过程发生:凋亡、坏死/坏死性凋亡、自体吞噬的细胞死亡、内质网应激相关的细胞毒性、有丝分裂障碍、类凋亡、细胞焦亡、焦坏死和细胞侵入性死亡。
37.如权利要求30所述的系统,其中所述人类哺乳动物靶细胞为癌细胞。
38.如权利要求37所述的系统,其中所述癌细胞选自由脑癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠直肠癌细胞、乳腺癌细胞、肝癌细胞、血液癌症细胞和骨癌细胞构成的组。
39.如权利要求37所述的系统,其中所述转录启动子选自由p21cip1/waf1启动子、p27kipl启动子、p57kip2启动子、TdT启动子、Rag-1启动子、B29启动子、Blk启动子、CD19启动子、BLNK启动子和λ5启动子构成的组。
40.如权利要求37所述的系统,其中所述转录启动子响应于选自由以下构成的组的因子:EBF3、O/E-1、Pax-5、E2A、p53、VP16、MLL、HSF1、NF-IL6、NFAT1和NF-κB。
41.如权利要求37所述的系统,其中所述核酸编码选自由以下构成的组的治疗性蛋白:CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶。
42.如权利要求30所述的系统,其中所述靶细胞为被传染病剂感染的人类细胞。
43.如权利要求42所述的系统,其中所述传染剂为选自由以下构成的组的病毒:疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、肝炎病毒、逆转录病毒、流感病毒和鼻病毒。
44.如权利要求42所述的系统,其中所述核酸编码选自由以下构成的组的治疗性蛋白:CASP3、CASP8、CASP9、BAX、DFF40、HSV-TK和胞嘧啶脱氨酶。
45.一种降低、防止和/或消除靶细胞生长的方法,所述方法包括:
使靶细胞与用于所述靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统接触,所述系统包括:
a.载体,所述载体能够将核酸递送至细胞,所述载体包含表达构建体;以及
b.用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,所述表达构建体包含:
i.转录启动子,所述转录启动子响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
ii.核酸,所述核酸可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码治疗性蛋白,
其中在所述靶细胞中产生的所述治疗性蛋白降低、防止和/或消除所述靶细胞的生长和/或存活。
46.一种用于治疗具有靶细胞的患者的疾病或病况的方法,所述方法包括:
向所述患者施用用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的系统,所述系统包括:
a.载体,所述载体能够将核酸递送至细胞,所述载体包含表达构建体;以及
b.用于靶细胞内治疗性蛋白的靶向产生的表达构建体,所述表达构建体包含:
i.转录启动子,所述转录启动子响应于一种或多种因子而被激活,所述因子中的每一种在所述靶细胞内产生;以及
ii.核酸,所述核酸可操作地连接于所述转录启动子且在所述转录启动子的调节控制下,其中所述核酸编码治疗性蛋白,
其中所述靶细胞中产生的所述治疗性蛋白降低、防止和/或消除所述靶细胞的生长和/或存活,从而减缓、逆转和/或消除所述患者的疾病或病况。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111770763A (zh) * | 2018-01-23 | 2020-10-13 | 埃森德生物制药有限公司 | 增强型病毒递送制剂 |
CN112521511A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 中山大学 | 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 |
CN112823027A (zh) * | 2018-07-24 | 2021-05-18 | 青春生命科学公司 | 将蛋白质和编码所述蛋白质的基因递送至活细胞的脂质体的应用 |
Families Citing this family (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11951139B2 (en) | 2015-11-30 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of osteoporosis |
US11951140B2 (en) | 2011-02-04 | 2024-04-09 | Seed Health, Inc. | Modulation of an individual's gut microbiome to address osteoporosis and bone disease |
US10835560B2 (en) | 2013-12-20 | 2020-11-17 | Joseph E. Kovarik | Reducing the likelihood of skin cancer in an individual human being |
US10940169B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-03-09 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing cancer in an individual human being |
US11844720B2 (en) | 2011-02-04 | 2023-12-19 | Seed Health, Inc. | Method and system to reduce the likelihood of dental caries and halitosis |
US11998479B2 (en) | 2011-02-04 | 2024-06-04 | Seed Health, Inc. | Method and system for addressing adverse effects on the oral microbiome and restoring gingival health caused by sodium lauryl sulphate exposure |
US20140189897A1 (en) | 2011-06-21 | 2014-07-03 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Transgenic animals capable of being induced to delete senescent cells |
US20150064137A1 (en) | 2012-04-17 | 2015-03-05 | Kythera Biopharmaceuticals, Inc. | Use of engineered viruses to specifically kill senescent cells |
US9901080B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-02-27 | Buck Institute For Research On Aging | Transgenic mouse having a transgene that converts a prodrug into a cytotoxic compound in senescent cells |
US9901081B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-02-27 | Buck Institute For Research On Aging | Transgenic mouse for determining the role of senescent cells in cancer |
WO2014089124A1 (en) | 2012-12-03 | 2014-06-12 | Cenexys, Inc. | Immunogenic compositions for inducing an immune response for elimination of senescent cells |
US11672835B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-06-13 | Seed Health, Inc. | Method for treating individuals having cancer and who are receiving cancer immunotherapy |
US11826388B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-11-28 | Seed Health, Inc. | Topical application of Lactobacillus crispatus to ameliorate barrier damage and inflammation |
US11998574B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-06-04 | Seed Health, Inc. | Method and system for modulating an individual's skin microbiome |
US11213552B2 (en) | 2015-11-30 | 2022-01-04 | Joseph E. Kovarik | Method for treating an individual suffering from a chronic infectious disease and cancer |
US11969445B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-30 | Seed Health, Inc. | Probiotic composition and method for controlling excess weight, obesity, NAFLD and NASH |
US11529379B2 (en) | 2013-12-20 | 2022-12-20 | Seed Health, Inc. | Method and system for reducing the likelihood of developing colorectal cancer in an individual human being |
US11839632B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-12 | Seed Health, Inc. | Topical application of CRISPR-modified bacteria to treat acne vulgaris |
US11026982B2 (en) | 2015-11-30 | 2021-06-08 | Joseph E. Kovarik | Method for reducing the likelihood of developing bladder or colorectal cancer in an individual human being |
US11980643B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-05-14 | Seed Health, Inc. | Method and system to modify an individual's gut-brain axis to provide neurocognitive protection |
US12005085B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-06-11 | Seed Health, Inc. | Probiotic method and composition for maintaining a healthy vaginal microbiome |
US11642382B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-05-09 | Seed Health, Inc. | Method for treating an individual suffering from bladder cancer |
US11833177B2 (en) | 2013-12-20 | 2023-12-05 | Seed Health, Inc. | Probiotic to enhance an individual's skin microbiome |
WO2017223107A1 (en) * | 2016-06-20 | 2017-12-28 | Unity Biotechnology, Inc. | Genome modifying enzyme therapy for diseases modulated by senescent cells |
CA3047140A1 (en) * | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Oisin Biotechnologies | Constructs for expression of therapeutic proteins in target cells |
CN112312918A (zh) * | 2018-04-18 | 2021-02-02 | 奥依信生物技术公司 | 促融合脂质纳米粒和制备其的方法以及其用于靶细胞特异性产生治疗蛋白和治疗与靶细胞有关的疾病、病况或障碍的用途 |
EP3653716A1 (en) * | 2018-11-19 | 2020-05-20 | HSF Pharmaceuticals | Replication-competent controlled alpha-herpesvirus virus vectors and uses therefore |
US20240238447A1 (en) * | 2021-05-19 | 2024-07-18 | Shape Therapeutics Inc. | Compositions and methods for modulating payload expression at a transcriptional level |
KR20230136406A (ko) | 2022-03-18 | 2023-09-26 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | Fast 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터 및 암 유전자치료제로서의 용도 |
WO2024073370A2 (en) * | 2022-09-27 | 2024-04-04 | The Regents Of The University Of California | Methods to rejuvenate human cells through transcriptional reprogramming |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012177927A1 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Transgenic animals capable of being induced to delete senescent cells |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0571390B1 (en) | 1990-11-23 | 2000-03-08 | Peptech Limited | The delay, prevention and/or reversal of cell senescence |
CA2325088A1 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-01 | Fusogenix Inc. | Novel membrane fusion proteins derived from poikilothermic reovirus |
JP2005504520A (ja) * | 2001-06-13 | 2005-02-17 | イースタン ヴァージニア メディカル スクール | 治療用核酸の標的化発現の方法 |
CN100361710C (zh) * | 2004-06-07 | 2008-01-16 | 成都康弘生物科技有限公司 | 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm-csf的溶瘤性腺病毒重组体的构建及其应用 |
CA2690815A1 (en) | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Case Western Reserve University | Targeted cell death |
RU2553225C2 (ru) | 2008-05-23 | 2015-06-10 | Сива Корпорейшн | Способ облегчения регенерации |
US9089520B2 (en) | 2010-05-21 | 2015-07-28 | Baylor College Of Medicine | Methods for inducing selective apoptosis |
US10227386B2 (en) | 2010-09-29 | 2019-03-12 | Entos Pharmaceuticals Inc. | Recombinant polypeptides for membrane fusion and uses thereof |
CA3047140A1 (en) * | 2017-01-09 | 2018-07-12 | Oisin Biotechnologies | Constructs for expression of therapeutic proteins in target cells |
-
2014
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-
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-
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-
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012177927A1 (en) * | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Transgenic animals capable of being induced to delete senescent cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
XIAOMING XIE ET AL.: ""Adenovirus-mediated Tissue-targeted Expression of a Caspase-9-based Artificial Death Switch for the Treatment of Prostate Cancer"", 《CANCER RESEARCH》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111770763A (zh) * | 2018-01-23 | 2020-10-13 | 埃森德生物制药有限公司 | 增强型病毒递送制剂 |
CN112823027A (zh) * | 2018-07-24 | 2021-05-18 | 青春生命科学公司 | 将蛋白质和编码所述蛋白质的基因递送至活细胞的脂质体的应用 |
CN112521511A (zh) * | 2020-12-07 | 2021-03-19 | 中山大学 | 一种含EB病毒gB蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用 |
US12098167B2 (en) | 2020-12-07 | 2024-09-24 | Sun Yat-Sen University | Self-assembled nanoparticle containing gB protein of EB virus and preparation method and use thereof |
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