JP2000514438A

JP2000514438A - Ｇｒｂ２またはＣｒｋ１へのリポソームアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド標的化による慢性骨髄性白血病細胞増殖の阻害

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Publication number: JP2000514438A
Application number: JP10505197A
Authority: JP
Inventors: ロペス―バーレシュタイン，カブリエル; エム．タリ，アナ; ビー．エーリングハウス，ラルフ
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1997-07-08
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CA2259144A1; CA2259144C; ATE383422T1; EP1234876B1; ES2299536T3; EP1234876A1; US7923548B2; CA2741501A1; US20030153526A1; DE69736290T2; EP0912729B1; DE69736290D1; AU740289B2; ES2268731T3; EP0912729A1; AU3569497A; US20070238686A1; US7309692B1; DE69738459D1; DE69738459T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ガンの処置、特に慢性骨髄性白血病（CML）の処置における使用のための新規な組成物および方法を提供する。組成物は、遺伝子産物が腫瘍化タンパク質bcr-ablと相互作用することが公知であるGrb2およびCrk1核酸にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。これらの組成物は、単独で、互いの組合せで、そしてbcr-abl核酸に向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドとの組合せでさえ使用された場合、CMLガン細胞の増殖を阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】 Grb2またはCrk1へのリポソームアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド標的化による慢性骨髄性白血病細胞増殖の阻害発明の背景Ａ．発明の背景本発明は、ガン治療、特に慢性骨髄性白血病の処置の分野に関する。より詳細には、これらの処置は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそのリポソーム処方物の使用を含む。Ｂ．関連分野慢性骨髄性白血病（CML）は、顆粒球の制御されない増殖を生じる血液悪性腫瘍である。それは、しばしば、第９染色体および第22染色体の相互転移によって特徴づけられる。これは、切断点クラスター領域（bcr）の3'末端上にAbleson（ abl）プロトオンコジーンを再配置する。これは、p210^bcr-abl融合タンパク質をコードするキメラbcr-abl遺伝子を産生する。これは腫瘍原生であり、そしてCML 細胞の増殖に必要である（Szczylikら、1991；Skorskiら、1994；Tariら、1994 ；McGahonら、1994；Bediら、1994）。 bcr-ablタンパク質は、bcrの第１エキソン内に見いだされる177チロシンアミノ酸で自己リン酸化し得る。リン酸化された場合、bcr-ablタンパク質のbcrドメインは、増殖因子レセプター結合タンパク質２（Grb２）アダプタータンパク質のSH2ドメインに結合する。SH3ドメインを介して、Grb2は、rasタンパク質活性化を生じるヒトSonのセブンレス１（hSos1）GDP/GTP変換因子に結合する。bcr-a blタンパク質はまた、正常なbcrタンパク質内に見いだされる177チロシンアミノ酸をトランスリン酸化し得る。正常なbcrタンパク質がアミノ酸177位でチロシンリン酸化を生じる場合、Grb2と複合体化すると考えられている。bcr-ablタンパク質が発現される場合、p46およびp52 Shc（Puilら、1994）タンパク質は、同様にチロシンリン酸化を生じる。Shcタンパク質はまた、Grb2との安定な複合体を形成することが示されている。それゆえ、Gbr2は、bcr-ablタンパク質によって媒介される腫瘍形成能において非常に重要な役割を果たすようである（Puilら、19 94；Pendergastら、1993）。別のアダプタータンパク質（Crk様(Crk1)）もまた、bcr-ablに結合することが見いだされている。Grb2と異なり、Crk1は、ablドメインを介してbcr-ablに結合する。そのSH3ドメインを介して、Crk1はまたhSoslに結合し得る。これは、Ras タンパク質活性化をさらに導く（ten Hoeveら、1994aおよび1994b）。従って、G rb2およびCrk1アダプタータンパク質を介して、bcr-ablタンパク質はras活性化に関連している。これは、腫瘍形成能を導くことが公知である。rasタンパク質の発現が阻害される場合、CML細胞の増殖もまた阻害される。それゆえ、bcr-abl タンパク質がCML増殖を促進させる主要な経路の１つは、rasタンパク質活性化によるものである（Skorskiら、1994；1995）。 bcr-ablに標的化されたリポソームーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Clv IL細胞の増殖を減少させ得る。最大の阻害（75％増殖阻害および90％タンパク質阻害）後、CML細胞は、リポソーム-アンチセンスオリゴヌクレオチドが培養培地から除去される場合、なお回復し得、そして増殖し得る。これは、bcr-ablタンパク質合成の不完全な阻害によって引き起こされるようである（Tariら、1994）。従って、CML細胞の増殖を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力にもかかわらず、ガンのこの形態に対するより効果的な組成物および処置のための必要性が残存する。発明の要旨本発明は、CMLの処置のための改良された組成物および方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服するために設計される。特に、本発明は、CML患者の細胞内の特定の核酸を標的するために、新規なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。従って、１つの実施態様において、Grb2をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。別の実施態様において、Crk1をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。これらのポリヌクレオチドは、８〜50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドであり得る。さらなる実施態様において、ポリヌクレオチドはGrb2 mRNAまたはCrk1 mRNAの翻訳開始部位にハイブリダイズする。特定の実施態様において、ポリヌクレオチドは配列ATATTTGGCGATGGCTTCまたはGTCG AACCGGCGGAGGAを有するオリゴヌクレオチドである。別の実施態様において、ポリヌクレオチドはリポソーム中にカプセル化される。リポソームは、脂質ジオレオイルスファチジルコリンから有利に構成され得る。なお別の実施態様において、（i）Grb2をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。組成物は、bcr-ablをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに包含し得る。なおさらなる別の実施態様において、Grb2をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１ポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物が提供される。ここで、この第１ポリヌクレオチドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。同様に、Crk1をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１ポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物が提供される。ここで、この第１ポリヌクレオチドは、真核生物細胞において活性であるプロモーターの制御下にある。なおさらなる別の実施態様において、上記のガン細胞を、少なくとも（i）Grb 2核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させる工程を含む、ガン細胞の増殖を阻害する方法が提供される。このポリヌクレオチドは、８〜50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドであり得る。方法はさらに、ガン細胞を、bcr-ab l核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させる工程を含む。この組成物は、（i）Grb2核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドの両方を含み得る。上記の方法は、白血病細胞、またはより詳細には、慢性骨髄性白血病細胞であるガン細胞に、有利に適用され得る。組成物は、ポリヌクレオチドがカプセル化されるリポソームを含み得る。特定の実施態様において、接触は、患者において起こる。患者は、ヒトであり得る。組成物は、１用量あたり0.50〜10.0mlの容量、または１m²あたり５〜30mgのポリヌクレオチドの量で、ヒト患者に有利に送達され得る。特定の療法において、組成物は、８週間、１週あたり３回投与される。本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、本発明の好ましい実施態様が示されるが、詳細な説明および特定の実施例は、例示の目的のみに与えられることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせて、１つ以上のこれらの図面を参照して理解され得る：図１：白血病細胞の増殖におけるGrb2に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果。 BV173細胞、K562細胞、およびHL60細胞は、Grb2に特異的な漸増濃度のリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドとインキュベートされた。インキュベーションの３日後、白血病細胞におけるこれらのオリゴヌクレオチドの増殖阻害効果を決定するために、alamarBlueアッセイが行われた。生存度は、未処理の細胞の割合として表された。これは、100倍（処理した細胞の吸光度／未処理細胞の吸光度）によって決定された。図２：白血病細胞の増殖におけるCrk1に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果。 BV173細胞、K562細胞、およびHL60細胞は、Crk1に特異的な漸増濃度のリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドとインキュベートされた。インキュベーションの３日後、白血病細胞におけるこれらのオリゴヌクレオチドの増殖阻害効果を決定するために、alamarBlueアッセイが行われた。生存度は、未処理の細胞の割合として表された。これは、100倍（処理した細胞の吸光度／未処理の細胞の吸光度）によって決定された。図３：白血病細胞の増殖におけるリポソームコントロールオリゴヌクレオチドの効果。 BV173細胞、K562細胞、およびHL60細胞は、漸増濃度のリポソームコントロールオリゴヌクレオチドとインキュベートされた。インキュベーションの３日後、白血病細胞におけるこれらのオリゴヌクレオチドの増殖阻害効果を決定するために、alamarBlueアッセイが行われた。生存度は、未処理の細胞の割合として表された。これは、100倍（処理した細胞の吸光度）／（未処理の細胞の吸光度）によって決定された。図４：GRB2 のcDNA配列およびタンパク質配列。5'および3'非翻訳隣接配列は、コード領域およびアミノ酸配列に沿って図示される。SH2（太線）およびSH3（細線）ドメインが示される。図５：CRK1 のcDNA配列およびタンパク質配列。5'および3'非翻訳隣接配列は、コード領域およびアミノ酸配列に沿って図示される。SH2、SH2'、SH3、およびSH 4ドメインは、下線によって示される。好ましい実施態様の詳細な説明Ａ．本発明慢性骨髄性白血病（即ちCML）は、白血病性幹細胞が、赤血球、好中球、好酸球、好塩基球、単球マクロファージ、血小板、Ｔ細胞、およびＢ細胞を誘発するクローン性疾患である。第９染色体と第22染色体との間の相互転位は、フィラデルフィア染色体（Ph¹）と称される短縮化された第22染色体を生じる。10％までのCMLの場合は、Phネガティブとして分類されているが、このような場合は、現在非常に希であると考えられている。この転位は、融合遺伝子bcr-ablを生じ、この産物（p210）は、腫瘍形成能において重要な役割を果たす。この細胞質タンパク質は約1910アミノ酸残基を有し、そしてbcrのエキソン２および３、ならびにablのエキソン２を含む。アンチセンス構築物を用いるbcr-ablの合成を阻害することに方向付ける努力にも関わらず、Phポジティブ細胞の腫瘍化の表現型は、処置後すぐに回復するようである。本発明は、Grb2遺伝子およびCrk1遺伝子の部分を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、ならびにガンの処置におけるそれらの使用に関する。Grb2およびCrk1遺伝子産物の両方は、bcr-abl産物と相互作用し、それゆえCML細胞の形質転換に関与すると考えられている。これらの分子の合成を阻害することは、腫瘍（rumor）細胞の増殖を低減させる。特に、これらのアンチセンス分子（単独または他のアンチセンス分子との結合体のいずれか）を使用して、CMLおよびおそらく他のガンを効果的に処置することが可能であることが意図される。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド自身（あるいはそれらをコードする発現ベクター）が使用され得る。これらの核酸を送達する好ましい方法は、リポソームを介することである。本発明は、その種々の実施態様において、以下非常に詳細に記載される。Ｂ．ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド用語「アンチセンス」は、Grb2 RNAまたはCrk1 RNAの一部、またはそれに対応するDNAに相補的なポリヌクレオチド分子をいうことが意図される。図４および図５を参照のこと。「相補的な」ポリヌクレオチドは、標準的なワトソン-クリック相補性規則に従う塩基対形成が可能なものである。即ち、より大きなプリンは、より小さなピリミジンと塩基対を形成し、シトシンと対になるグアニン（G: C）、およびDNAの場合チミンのいずれかと対になるアデニン（A:T）、またはRNA の場合、ウラシルと対になるアデニン（A:U）の組合せを形成する。あまり一般的ではない塩基（例えば、イノシン、5-メチルシトシン、6-メチルアデニン、ヒポキサンチン、および配列にハイブリダイズする他の塩基）の封入は、対になることを妨害しない。二本鎖（ds）DNAのポリヌクレオチドでの標的化は、三重ヘリックス形成を導く；RNAの標的化は、二重ヘリックス形成を導く。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞内へ導入される場合、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、そして転写、RNAプロセシング、輸送、翻訳、および／または安定性を妨害する。アンチセンスRNA構築物、またはそのようなアンチセンスRNAをコードするDNAは、宿主細胞内（例えば、ヒト被験体を含む宿主動物内）で、インビトロまたはインビボのいずれかで、遺伝子転写もしくは遺伝子翻訳またはその両方を阻害するために使用され得る。一価のカチオンの細胞内濃度は、約160mM（10mM Na⁺；150mM K⁺）である。二価のカチオンの細胞内濃度は、約20mM（18mM Mg⁺；２mM Ca⁺⁺）である。細胞内タンパク質濃度（ハイブリダイゼーションの容量を減少させ、それゆえ核酸種の有効濃度を増大させることに役立つ）は、150mg/mlである。構築物は、これらのインビボの状態を模倣する条件下でインビトロで試験され得るアンチセンス構築物は、プロモーターおよび他の制御領域、エキソン、イントロン、または遺伝子のエキソン／イントロン境界でさえ結合するために設計され得る。本発明のための最も効果的なアンチセンス構築物は、mRNA開始部位に相補的な領域を含むことが意図される。１つは、標的タンパク質のレベルが影響されるかどうかを決定するために、インビトロで構築物を単純に試験することによって、このような構築物を、容易に試験し得る。同様に、タンパク質合成の有害な非特異的阻害もまた、インビトロでの標的細胞の生存度を決定することによって測定され得る。本明細書中で使用される用語「相補的」または「アンチセンス」は、それらの全体の長さにわたって実質的に相補的であり、そして塩基のミスマッチをほとんど有さないポリヌクレオチドを意味する。例えば、15塩基の長さの配列は、15の範囲外で、13または14ヌクレオチドで相補的なヌクレオチドを有する場合、相補的なヌクレオチドといわれ得る。天然には、「完全に相補的」である配列は、その全体の長さを通して全体的に相補的であり、塩基のミスマッチを有さない配列である。低い程度の相同性を有する他の配列もまた意図される。例えば、高い相同性の限られた領域を有するが、非相同領域（例えば、リボザイム）もまた含むアンチセンス構築物が設計され得る。これらの分子は、50％未満の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。本発明に従うポリヌクレオチドは、Grb2遺伝子もしくはCrk1遺伝子、またはタンパク質発現のアンチセンス阻害に影響するのに充分であるそれらの遺伝子の一部をコードし得る。ポリヌクレオチドは、ゲノムDNA由来であり得る。即ち、特定の生物体のゲノムから直接クローニングされ得る。しかし、他の実施態様において、ポリヌクレオチドは、相補的DNA（cDNA）であり得る。cDNAは、鋳型としてメッセンジャーRNA（mRNA）を用いて調製されたDNAである。従って、cDNAは、いずれの中断されたコード配列も含まず、そして通常、対応するタンパク質のほとんどコード領域のみ（単数または複数）を含む。他の実施態様において、アンチセンスポリヌクレオチドは、合成的に産生され得る。ゲノムDNAの一部は、cDNAまたは合成配列と有利に組み合わされ得、特定の構築物を生成する。例えば、イントロンが最終的な構築物に所望される場合、ゲノムクローンが使用されることが必要である。cDNAまたは合成されたポリヌクレオチドは、構築物の残存部分のためのより都合の良い制限部位を提供し得、それゆえ、配列の残りに用いられる。 Grb2およびCrk1についてのDNA配列およびタンパク質配列は、それぞれLowenst einら（1992）およびten Hoeveら（1993）（それらの両方が本明細書中に参考として援用される）による文献において公開されている。本明細書中に開示されたものとは異なる配列を有する天然の改変体の存在が意図される。従って、本発明は、Grb2およびCrk1についての提供されたポリヌクレオチド配列の使用を制限されないが、むしろ任意の天然に生じる改変体の使用を含む。このような改変体の特定の配列に依存して、標的選択性（即ち、関連する転写物の要求されないアンチセンス阻害を防止する）という点でさらなる利点が提供され得る。本発明はまた、これらの配列の化学的に合成された改変体を含む。上記のように、アンチセンス配列は、完全長のゲノムもしくはcDNAコピー（図４および図５を参照のこと）、またはそれらの大きなフラグメントであり得るが、それらはまた、50未満の塩基のポリヌクレオチドとして本明細書中に定義されるより短いフラグメント、または「オリゴヌクレオチド」であり得る。より短いオリゴマー（８〜20）は、より簡単に作製され、そしてインビボでの接触性を増加させるが、多数の他の要因が、塩基対の特異性を決定することに関与する。例えば、オリゴヌクレオチドの、その相補性標的に対する結合親和性および配列特異性の両方は、増大する長さとともに増大する。８、９、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、または50塩基対のオリゴヌクレオチドが使用されることが意図される。遺伝子配列の全てまたは一部が、アンチセンス構築の状況で使用され得るが、統計学的に、17塩基長の任意の配列は、ヒトゲノムにおいて一回のみ生じるはずであり、それゆえ、唯一の標的配列を特定するのに充分である。特定の実施態様において、他のエレメントを含むアンチセンス構築物（例えば、C-5ピリミジンを含むもの）を使用することを望み得る。ウリジンおよびシチジンのC-5プロピンアナログを含むオリゴヌクレオチドは、高い親和性でRNAに結合し、そして遺伝子発現の強力なアンチセンスインヒビターであることが示されている（Wagnerら、1993）。標的化アンチセンス送達に対する代替品として、標的化リボザイムが使用され得る。用語「リボザイム」は、DNAおよびRNAの両方において、特定の塩基配列を標的化しかつ切断し得るRNAに基づく酵素をいう。リボザイムは、リボザイム配列を取り込むRNAオリゴヌクレオチドの形態において、細胞を直接標的化し得るか、または所望のリボザイムRNAをコードする発現ベクターとして細胞内に導入され得るかのいずれかである。リボザイムは、アンチセンスポリヌクレオチドについての記載とほとんど同じ方法で使用され、そして適用され得る。リボザイム配列はまた、アンチセンスポリヌクレオチドについての記載とほとんど同じ方法で改変され得る。例えば、非ワトソン-クリック塩基を取り込み得るか、または混合されたRNA/DNAオリゴヌクレオチドを作製し得るか、またはホスホジエステル骨格を改変し得るか、またはRNAのリボース糖基における2'ヒドロキシ基を改変し得る。あるいは、本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをコードする核酸を有する発現構築物からの転写を介するRNAとして提供され得る。本出願の全体にわたって、用語「発現構築物」は、核酸配列の一部または全てが転写され得るアンチセンス産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を含むことを意味する。代表的な発現ベクターとしては、細菌プラスミドまたはファージ（例えば、pU CまたはBluescript^TMプラスミドのシリーズのいずれか、または以下でさらに議論されるように、真核生物における使用に適したウイルスベクターが挙げられる。好ましい実施態様において、核酸は、プロモーターの転写制御下でアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをコードする。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するのに必要な細胞の合成機構（または誘導される合成機構）によって認識されるDNA配列をいう。句「転写制御下」は、プロモーターがRNAポリメラーゼ開始を制御する核酸に関連して正確な位置および配向にあることを意味する。用語プロモーターは、RNAポリメラーゼIIについての開始部位の周りにクラスター形成される一群の転写制御モジュールをいうためにここで使用される。どのようにプロモーターが体系づけられるかについての大部分の意見は、いくつかのウイルスプロモーターの分析から誘導され、これは、HSVチミジンキナーゼ（tk ）およびSV40初期転写ユニットについてのプロモーターを含む。より最近の研究によって増大されるこれらの研究は、プロモーターが、分散した機能モジュール（各々約７〜20bpのDNAからなる）から構成され、そして転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含むことを示している。各プロモーターにおける少なくとも１つの分子は、RNA合成のための開始部位を位置づけるために機能する。この最も良く知られる例は、TATAボックスであるが、TATAボックスを欠失するいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびSV40後期遺伝子についてのプロモーター）においては、それ自身の開始部位に横たわる分散したエレメントは、開始の位置を決めるのに役立つ。さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を制御する。代表的には、これらは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターは、最近、同じように、開始部位の下流の機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメントの間の空間は、しばしば可動性であり、その結果、プロモーター機能は、エレメントが互いに相対的に反転されるか移動される場合、保護される。tkプロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が減少し始める前に、50bp離れて増大し得る。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、転写を活性化するのに、同時作動性または非依存性のいずれかで機能し得る。抑制性ペプチドをコードする核酸の発現を制御するために使用される特定のプロモーターは、標的化細胞においてペプチドを発現し得る限りは、重要であるとは考えられていない。従って、ヒト細胞が標的化される場合、ヒト細胞において活性化されるプロモーターに隣接し、そして制御下にある抑制性ペプチドをコードする核酸に位置することが好ましい。一般に、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。種々の実施態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス末端反復配列は、種々のタンパク質の高レベルの発現を得るために使用され得る。本発明に従ってペプチドの発現を達成するための、当業者に周知の他のウイルスまたは哺乳動物細胞、または細菌ファージプロモーターの使用は、同じように、所定の目的に充分である発現のレベルが提供されることが意図される。周知の特性を有するプロモーターを使用して、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルおよびパターンが最適化され得る。さらに、特定の生理学的なシグナルに応じて調節されるプロモーターの選択は、抑制性タンパク質の誘導性の発現を可能にし得る。例えば、ヒトPAI-1プロモーターの制御下の核酸は、腫瘍壊死因子によって誘導可能な発現を生じる。表２および３は、本発明の文脈において、アンチセンス構築物の発現を調節するために使用され得るいくつかのエレメント／プロモーターを列挙する。この一覧表は、発現の促進に関与する全ての可能なエレメントの網羅を意図せず、それらを例示するに過ぎない。エンハンサーは本来、DNAの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝的エレメントとして検出された。大きな距離にわたって作用するこの能力は、原核生物の転写調節の古典的な研究においてほとんど前例がなかった。その後の研究は、エンハンサー活性を有するDNAの領域が、プロモーターと同様に体系化される。即ち、それらは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が、１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別が使用できる。全体としてのエンハンサー領域は、少し離れて転写を刺激し得るはずである；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントに関してはそうである必要はない。一方では、プロモーターは、特定の部位および特定の配向においてRNA合成の開始を導く１つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーは、これらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば重複かつ近接し、しばしば非常に類似したモジュラー機構を有するようである。以下は、発現構築物においてNF-IL6抑制性ペプチドをコードする核酸と組み合わせて使用され得る、ウイルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサー、および誘導性プロモーター／エンハンサーの一覧である（表１および表２）。さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組合せ（真核生物プロモーターデータベースEPDPによる）はまた、本発明に従って核酸の発現を駆動するために使用され得る。T3、T7、またはSP6細胞質発現系の使用は、別の可能な実施態様である。真核生物細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、送達複合体の一部またはさらなる遺伝子発現構築物のいずれかとして、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持し得る。本発明の特定の実施態様において、細胞における核酸の送達は、発現構築物中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。マーカーは、発現の簡単な同定を可能にするトランスフェクトされた細胞に対する同定可能な変化を生じる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）（真核生物）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）（原核生物）のような酵素が、使用され得る。あるものは、転写物の適切なポリアデニル化に影響するポリアデニル化シグナルもまた含み得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施に重大であるとは考えられず、そして任意のこのような配列が使用され得る。例えば、SV40、βグロビン、またはアデノウイルスポリアデニル化シグナルが使用され得る。また、発現カセットのエレメントとして意図されるのはターミネーターである。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、そしてカセットから他の配列への通読を最小化するのに役立ち得る。Ｃ．リポソーム形成本発明の好ましい実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、リポソーム中に包括され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁される場合、自発的に形成される。脂質成分は、閉鎖構造および水分の包括、ならびに脂質二重層の間の溶解された溶質の形成の前に自己再構成を起こす（GhoshおよびBachhawat、1991）。また、リポフェクタミン-核酸複合体のような陽イオン性脂質-核酸複合体が意図される。インビトロでのリポソーム媒介性ポリヌクレオチド送達および外来DNAの発現は、非常に成功している。Wongら（1980）は、培養されたニワトリ胚、HeLa、および肝ガン細胞におけるリポソーム媒介性送達および外来DNAの発現の可能性を示した。Nicolauら（1987）は、静脈注射後のラットにおけるリポソーム媒介性遺伝子転移を首尾良く確立した。本発明の特定の実施態様において、リポソームは、血球凝集性ウイルス（HVJ ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、そしてリポソームカプセル化DNAの細胞侵入を促進することが示されている（Kanedaら、1989）。他の実施態様において、リポソームは、複合体化し得るか、または核非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と結合して使用され得る（Katoら、1991）。なおさらなる実施態様において、リポソームは、おそらく複合体化し得るか、またはHV JおよびHMG-1の両方と組み合わせて使用される。このような発現ベクターは、インビトロおよびインビボでのポリヌクレオチドの転移および発現に首尾良く使用され、次いで、本発明に適用可能である。細菌プロモーターが、DNA構築物において使用される場合、リポソーム内に、適切な細菌ポリメラーゼを含むこともまた所望される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層の生成によって形成される種々の単一脂質ビヒクルおよび多重膜脂質ビヒクルを包含する一般的用語である。リン脂質は、本発明に従ってリポソームを調製するために使用され、そして純正電荷、純負電荷を有し得る、または中性である。直接的には、リン酸塩は、リポソーム上の負の電荷を与えるために使用され得、そしてステアリルアミンは、リポソーム上の正電荷を与えるために使用され得る。本発明に従う使用に適切な脂質は、商業的供給源から入手され得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「DMPC]）は、Shigma Chemical Co.から入手され得、ジセチルホスフェート（「DCP」）は、K&K Laboratories（Plainview ，NY）から入手され；コレステロール（「Chol」）は、Calbiochem-Behringから入手され；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「DMPG」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids，Inc．（Birmingham，Ala.）から入手され得る。クロロホルム、クロロホルム／メタノール、またはt-ブタノール中の脂質のストック溶液は、約-20℃で保存され得る。好ましくは、クロロホルムが唯一の溶媒として使用される。なぜなら、メタノールより容易に蒸発されるからである。天然の供給源からのリン脂質（例えば、卵または大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジル酸、脳または植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン、および植物または細菌ホスファチジルエタノールアミン）は、生じるリポソームの不安定で漏出性（leakiness）のために、好ましくは、１級リン脂質（即ち全リン脂質組成物の50％以上を構成する）として使用されない。本発明に従って使用されるリポソームは、異なる方法によって作成され得る。リポソームのサイズは、合成法に依存して改変される。水性溶液に懸濁したリポソームは、一般的に球状小胞の形状であり、脂質二重層分子の１つ以上の同心性の層を有する。分子の平行列からなる各層は、式XYによって示される。ここでX は親水性部分であり、そしてYは疎水性部分である。水性懸濁物において、同心性の層が配列され、その結果親水性部分は、水性層と接触したままである傾向にあり、そして疎水性領域は自己会合する傾向にある。例えば、水性層がリポソームの内部および外部の両方に存在する場合、脂質分子は、配列XY-YXの二重層（ラメラとして知られる）を形成する。本発明の範囲内のリポソームは、公知の研究室技術に従って調製され得る。１つの好ましい実施態様において、リポソームは、容器（例えば、ガラスのナシ型（pearshaped）フラスコ）において、溶媒中でリポソーム脂質と混合することによって調製される。容器は、予期されるリポソームの懸濁液の容量の10倍を超える容量を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒は、陰圧下で約40℃で除去される。溶媒は通常、約５分から２時間で除去され、これはリポソームの所望の容量に依存する。組成物は、真空下で、デシケーター中で更に乾燥され得る。乾燥した脂質は、時間内に劣化する傾向にあるので、一般的に、約１週間後に捨てられる。乾燥した脂質は、滅菌した発熱物質を含まない水において、約25〜50mMのリン脂質で、すべての脂質フィルムが再懸濁されるまで振盪することによって水和され得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分けられ、バイアルに各々入れられ、凍結乾燥され、そして真空下で封着され得る。代わりに、リポソームは、他の公知の研究室手順に従って調製され得る：Bang hamら（1965）の方法、その内容が本明細書中に参考として援用される；Gregori adisの方法、DRUG CARRIERS IN BI0L0GY AND MEDICINE,G．Gregoriadis編（1979 ）287〜341頁、その内容が本明細書中に参考として援用される；DeamerおよびUs tet（1983）の方法、その内容が本明細書中に参考として援用される；およびSzo kaおよびPapahadjopoulos（1978）により記載される逆相蒸発方法。上記の方法は、それぞれ、水性物質を包括するための方法、およびそれぞれの方法、ならびに空間と脂質の割合において異なる。上記のように調製された乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、核酸の溶液中で再構築され得、そして適切な溶媒（例えば、DPBS）で適切な濃度に希釈され得る。次いで、混合物は、ボルテックスミキサーにおいて激しく振盪される。カプセル化されていない核酸は、29,000×gでの遠心分離によって除去され、そしてリポソームペレットは洗浄される。洗浄したリポソームは、適切な全リン脂質濃度（例えば、約50〜200mM）で再懸濁される。カプセル化された核酸の量は、標準的な方法に従って決定され得る。リポソーム調製物においてカプセル化された核酸の量の決定後、リポソームは、適切な濃度に希釈され得、そして使用まで４ ℃で保存され得る。好ましい実施態様において、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンが使用される。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、過剰のt-ブタノールの存在下で脂質と混合された。混合物は、アセトン／ドライアイス浴中で凍結される前に、ボルテックスされた。凍結混合物は凍結乾燥され、そしてHepes緩衝化生理食塩水（1mM Hepes、10mM NaCl（pH7.5））で一晩水和され、次いでリポソームは、浴型ソニケーターで、10〜15分間超音波処理された。リポソームーオリゴヌクレオチドの代表的なサイズは、サブミクロン粒子選別機自動希釈モデル370（Nicom p，Santa Barbara，CA）によって決定されたように、直径200〜300nmの間の範囲であった。Ｄ．代替の送達系レトロウイルス。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染された細胞において、それらのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴づけられる一群の一本鎖RNAウイルスである（Coffin、1990）。次いで、得られたDNAを、プロウイルスとして細胞染色体として安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質の合成を導く。組み込みは、受容細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の維持を生じる。レトロウイルスゲノムは、それぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、および外被成分をコードする３つの遺伝子（gag、pol、および env）を含む。gag遺伝子の上流に見いだされる配列はΨと称され、ゲノムのウイルス粒子へのパッケージングのためのシグナルとして機能する。２つの末端反復配列（LTR）は、ウイルスゲノムの5'および3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列であり、そして宿主細胞ゲノムにおける取り込みにもまた必要とされる（Coffin,1990）。レトロウイルスベクターを構築するために、Grb2またはCrk1のアンチセンス構築物をコードする核酸は、特定のウイルス配列のかわりに、ウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを産生する。ウイルス粒子を産生するために、 gag、pol、およびenv遺伝子を含むがLTRおよびΨ成分を有さないパッケージング細胞株が構築される（Mannら、1983）。挿入されたDNAを（レトロウイルスLTRおよびΨ配列とともに）含む組換えプラスミドが、この細胞株に導入される場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、Ψ配列は、ウイルス粒子にパッケージされるべき組換えプラスミドのRNA転写物を与え、次いで、ウイルス粒子は培養培地に分泌される（NicolasおよびRubenstein,1988；Temin,1986；Mannら、19 83）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地は回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子転移に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分割を必要とする（Paskindら、1975）。アデノウイルス：ヒトアデノウイルスは、約36kBのゲノムサイズを有する二本鎖DNA腫瘍ウイルスである（Tooze,1981）。真核生物遺伝子発現についてのモデル系として、アデノウイルスは広範に研究され、そして充分に特徴づけられており、それらを遺伝子転移系としてのアデノウイルスの開発のための魅力的な系にする。この群のウイルスは、増殖および操作が簡単であり、そしてそれらはインビトロおよびインビボでの広範な宿主範囲を示す。溶解性の感染細胞において、アデノウイルスは、宿主タンパク質合成を遮断し、細胞機構を大量のウイルスタンパク質の合成へ指向し、および大量のウイルスを産生することが可能である。ゲノムのE1領域は、ウイルスゲノム、ならびに２，３の細胞遺伝子の転写調節を担うタンパク質をコードするE1AおよびE1Bを含む。E2発現（E2AおよびE2Bを含む）は、ウイルス複製機能（例えば、DNA結合タンパク質、DNAポリメラーゼ、および複製をプライムする末端タンパク質）の合成を可能にする。E3遺伝子産物は、傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を防ぎ、そしてウイルス伝播にとって重要であるようである。E4タンパク質に関連する機能は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断を含む。後期遺伝子産物は、ほとんどのウイルス粒子キャプシドタンパク質を含み、そしてこれらは主要な後期プロモーターからの単一の一次転写のほとんどのプロセシングが生じた後にのみ発現される。主要な後期プロモーター（MLP）は、感染の後期の間に高い有効性を示す（Strat ford-PerricaudetおよびPerricaudet,1991）。ウイルスゲノムの小部分のみが、シスで必要とされるようなので（Tooze,1981 ）、アデノウイルス由来のベクターは、293細胞のような細胞株とともに使用される場合、大きなDNAフラグメントの置換に優れた可能性を提供する。Ad5形質転換ヒト胎児性腎臓細胞株（Grahamら、1977）が、トランスで必須のウイルスタンパク質を提供するために開発されている。外来タンパク質を細胞へ送達するためのアデノウイルス系の特定の利点としては、（i）外来DNAによってウイルスDNAの比較的大きな断片を置換する能力；（i i）組換えアデノウイルスの構造安定性；（iii）ヒトへのアデノウイルス投与の安全性；および（iv）ガンまたは悪性腫瘍とのアデノウイルス感染の任意の既知の関連性の欠失；（v）高力価の組換えウイルスを得るための能力；および（vi ）アデノウイルスの高感染性が挙げられる。アデノウイルスベクターのレトロウイルスを越えるさらなる利点としては、より高レベルの遺伝子発現が挙げられる。さらに、アデノウイルス複製は、レトロウイルス配列とは異なり、宿主遺伝子の複製に依存しない。E1領域におけるアデノウイルス形質転換遺伝子は容易に欠失され得、そしてなお効率的な発現ベクターを提供するので、アデノウイルスベクターに由来する発ガン性の危険は、無視できると考えられる（GrunhausおよびHorwitz，1992）。一般的には、アデノウイルス遺伝子転移系は、組換え体に基づいており、そのゲノム（例えば、E1）の一部の欠失によって複製不能が付与され、そしてなお感染のためのその能力をまだ維持するアデノウイルスが設計される。比較的大きな外来タンパク質をコードする配列は、さらなる欠失がアデノウイルスゲノムにおいて作製される場合に、発現され得る。例えば、E1およびE3領域の両方において欠失したアデノウイルスは、10kBまでの外来DNAを有することが可能であり、そして293細胞において高力価に増殖され得る（Stratford-PerricaudetおよびPerr icaudet，1991）。驚くべきことに、アデノウイルス感染後の導入遺伝子の持続的な発現もまた報告されている。発現構築物としての他のウイルスベクター。他のウイルスベクターが、本発明の発現構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ridgeway，1998；Baic hwalおよびSugden，1986；Couparら、1988）、アデノ随伴ウイルス（AAV）（Rid geway，1998；BaichwalおよびSugden，1986；HermonatおよびMuzycska,1984）、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが使用され得る。それらは、種々の哺乳動物細胞についてのいくつかの魅力的な特色を提供する（Frie dmann，1989；Ridgeway，1998；BalchwalおよびSugden，1986；Couparら、1988 ；Horwichら、1990）。欠損Ｂ型肝炎ウイルスの近年の認識では、新たな見解は、異なるウイルス配列の構造一機能相関性に引き起こされた。インビトロでの研究は、そのゲノムの80 ％までの欠失にもかかわらず、ウイルスが、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写する能力を保持し得ることを示した（Horwichら、1990）。これは、ゲノムの大部分が外来遺伝物質と置換され得ることを示唆した。肝向性（hepatotr opism）および持続性（取り込み）は、肝臓指向性遺伝子転移のための特に魅力的な特徴である。Changらは、近年、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を、アヒルB型肝炎ウイルスゲノム内へ、ポリメラーゼ、表面、および前表面をコードする配列の代わりに導入した。それは、野生型ウイルスで、鳥類肝臓ガン細胞株に同時トランスフェクトされた。高力価の組換えウイルスを含む培養培地は、一次子ガモ肝細胞に感染させるために使用された。安定なCAT遺伝子発現は、感染の少なくとも24日後に検出された（Changら、1991）。非ウイルス方法：発現ベクターの培養された哺乳動物細胞への転移のためのいくつかの非ウイルス方法もまた、本発明によって意図される。これらは、リン酸カルシウム沈殿（GrahamおよびVan Der Eb,1973；ChenおよびOkayama,1987；Rip peら、1990）、DEAE-デキストラン（Gopal,1985）、エレクトロポレーション（T ur-Kaspaら、1986；Potterら、1984）、直接マイクロインジェクション（Harlan dおよびWeintraub,1985）、DNA充填リポソーム（NicolauおよびSene,1982；Fral eyら、1979）およびリポフェクタミンDNA複合体、細胞超音波処理（Fechheimer ら、1987）、高速微粒子を使用する遺伝子照射（Yangら、1990）、ポリカチオン（Boussifら、1995）、ならびにレセプター媒介トランスフェクション（WuおよびWu,1987；WuおよびWu,1988）を含む。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾良く適用され得る。本発明の1つの実施態様において、発現構築物は単純に、裸の組換えベクターから構成され得る。構築物の転移は、細胞膜に物理的または化学的に透過させる上記に示される任意の方法によって実施され得る。例えば、Dubenskyら（1984）は、成体および新生マウスの肝臓および脾臓へのCaPO₄沈殿の形成において、ポリオーマウイルスDNAを首尾良く注入し、このことは活性ウイルス複製および激しい伝染力を示す。BenvenistyおよびNeshif（1986）はまた、CaPO₄沈殿したプラスミドの直接腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現を生じることを実証した。Grb2またはCrk1構築物をコードするDNAはまた、類似の方法でインビボでトランスフェクトされ得る事が想像される。裸のDNA発現ベクターの細胞への転移のための本発明の別の実施態様は、微粒子銃を含み得る。この方法は、DNAコートされた微粒子を高速に加速する能力に依存して、細胞を殺傷せずに微粒子を細胞膜を貫通させ、そして細胞に進入させることを可能にする（Kleinら、1987）。小粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。このようなデバイスの1つは、高電圧に依存して電流を生じる。これは、次いで、輸送力を提供する（Yangら、1990）。使用される微粒子は、タングステンまたは金のビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボで照射されている（Yangら、1990；Zeleninら、1991）。これは、組織または細胞の外科的暴露を必要とし得、銃と標的器官との間の任意の介在性組織を除去する。Grb2またはCrk1構築物をコードするDNAは、この方法を介して送達され得る。Ｅ．薬学的組成物および投与の経路アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含むリポソームの臨床適用が行われる場合、意図される適用に適切な薬学的組成物としてリポソーム複合体を調製する必要がある。一般的には、このことは必然的に、発熱物質ならびにヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物を基本的に含まない薬学的組成物を調製する。これはまた一般的には、複合体に安定性を付与する適切な緩衝液を使用し、そして標的細胞による取り込みを可能にすることが所望される。本発明の水性組成物は、上記のようにリポソームにカプセル化され、さらに薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に分散された、有効量のアンチセンス発現ベクターを含む。このような組成物はまた、接種材料としてもいわれる。句「薬学的または薬理学的に受容可能」は、適切な動物（またはヒト）に投与される場合、有害か、アレルギー性か、または有害反応を産生しない組成物をいう。本明細書中で使用されるように、「薬学的に受容可能なキャリア」には、溶媒、分散媒体、コート剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等のいずれか、または全てが含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。従来の媒体または試薬のいずれかが、活性な成分と不適合である程度を除いて、治療的組成物におけるその使用が意図される。補充性活性成分はまた、組成物に取り込まれ得る。治療的組成物の溶液はまた、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中、および油中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は防腐剤を含み、微生物の増殖を阻害する。液体溶液または懸濁液のいずれかのような注射用組成物の形態（注射前に液体中の溶液、または液体中の懸濁物に適した固体形態）で有利に投与され得る本発明の治療的組成物もまた、調製され得る。これらの調製物はまた、乳化され得る。このような目的のための代表的な組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。例えば、組成物は、リン酸緩衝化生理食塩水１ミリリットルあたり10mg、25 mg、50mg、または約100mgまでのヒト血清アルブミンを含み得る。他の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水性溶液、非毒性賦形剤（塩を含む）、防腐剤、緩衝液などが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性キャリアとしては、水、アルコール／水性溶液、生理食塩水溶液、塩化ナトリウムのような非経口ビヒクル、リンゲルのデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流動液および栄養補給剤が挙げられる。防腐剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性化ガスが挙げられる。薬学的組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は、周知のパラメーターに従って調整される。さらなる処方物は、経口投与に適している。経口処方物としては、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような代表的な賦形剤が挙げられる。組成物は、溶液、懸濁物、錠剤、ピル、カプセル、持続性放出処方物、または粉末の形態をとる。経路が局所的である場合、形態は、クリーム、軟膏(ointment)、軟膏(salve)、またはスプレーであり得る。本発明の治療的組成物は、古典的な薬学的調製物を含み得る。本発明に従う治療的組成物の投与は、標的組織がそのような経路を介して利用可能である限りは従来の経路のいずれかを介する。これは、経口、鼻腔、口内、直腸、膣、または局所を含む。局所投与は、皮膚ガンの処置に特に有利であり、化学治療誘発性脱毛または他の真皮性過剰増殖性疾患を防ぐ。あるいは、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によってである。このような組成物は、通常、生理学的に受容可能なキャリア、緩衝液、または他の賦形剤を含む薬学的に受容可能な組成物として投与される。肺の状態の処置のために、好ましい経路は、肺へのエアロゾル送達である。エアロゾルの容量は、約0.01ml〜0.5mlである。同様に、大腸関連疾患の治療に好ましい方法は、浣腸剤を介してである。浣腸の容量は、約1ml〜100mlの間である。薬学的組成物の有効量は、意図される目標に基づいて決定される。用語「単位用量」または「投薬量」は、被験体における使用に適切な物理的に個別の単位（その投与（すなわち、適切な経路および治療養生法）と関連する所望される応答（上記）を産生するために計算される治療的組成物の予め決定された量を含む各単位）をいう。処置の数および単位用量の両方による、投与されるべき量は、所望される保護に依存する。治療的組成物の正確な量はまた、実施者の判定に依存し、そして各々の個体に特有である。用量に影響する要因としては、患者の生理的および診断的状態、投与の経路、治療の意図される目標（治療に対する症状の緩和）および効力、特定の治療物質の安定性および毒性が挙げられる。即時の適用のためには、単位用量を含む治療的組成物の量は、約５〜30mgのポリヌクレオチドの範囲であることが想像される。Ｆ．臨床プロトコル代表的には、処置のための候補者である患者は、CMLの慢性期にある患者である。１年あたり約7,000人の新たな患者がCMLを有すると診断され、そして疾患の慢性期の半分の持続期間が５年間存続する。代表的な処置のコースは、８週間周期で与えられるが、患者に副作用が観察されない場合はより長い期間が使用され得、そして患者が望まれるような処置に耐えられない場合はより短時間の処置が使用され得る。各周期は、等しく配置された20〜35の間の個体からなるが、これは診断状況に依存して変更され得る。Ｇ．実施例実施例１：オリゴヌクレオチドの合成。ヌクレアーゼ耐性p-エトキシオリゴヌクレオチドを、0ligos Etc（Willsonvil le,OR）から購入した。オリゴヌクレオチドの長さは、16〜18塩基の範囲である。5'から3'のオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである：１．Grb2の翻訳開始部位を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド：２．Crk1の翻訳開始部位を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド：３．コントロールオリゴ：実施例２：リポソーム形成。脂質（ジオレオイルホスファチジルコリン）を、Avanti Polar Lipids,Inc．（Alabaster AL）から購入した。ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドを、過剰のt-ブタノールの存在下で脂質と混合した。アセトン／ドライアイス浴中で凍結させる前に、混合物をボルテックスした。凍結混合物を凍結乾燥させ、そしてHe pes緩衝化生理食塩水（１mM Hepes，10mM NaCl、pH7.5）で一晩水和させ、次いでリポソームを浴型ソニケーター中で、10〜15分間超音波処理した。サブミクロン粒子選別機自動希釈モデル370（Nicomp,Santa Barbara，CA）によって決定されたリポソームオリゴヌクレオチドの代表的なサイズは、直径200〜300nmの間の範囲であった。実施例３：細胞増殖のオリゴヌクレオチド阻害（Grb2）。 CML細胞株BV173およびK562を使用して、細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチドの能力を試験した。これらの細胞株は、急性転化状態のヒトCML患者から最初に得られた。両方の細胞株は、p210^Bcr-Abl融合タンパク質を発現する。ヒト前骨髄球性患者から最初に得られたHL60細胞を、bcr-abを産生せず、そしてそれらの増殖がrasシグナリング経路に依存しない細胞と同様なコントロールとして使用した。 5000のK562細胞、10000のBV173細胞、または10000のHL60細胞を、10％のウシ胎児血清を含む0.1mLのRPMI 1640培地中で、96ウェルプレートの各ウェルにプレーティングした。プレーティングの２時間後、最終濃度０〜10μＭのリポソームオリゴヌクレオチドをこれらの細胞に添加した。細胞をリポソームオリゴヌクレオチドとともに３日間インキュベートした。白血病細胞の増殖におけるリポソームオリゴヌクレオチドの効果を、alamarBlue（Alamar,Sacramento,CA）アッセイによって試験した。 alamarBlueは、酸化／還元指標色素であり、その吸光度は、細胞代謝的還元に関連する。それゆえ、これは、細胞数および細胞の代謝活性の両方の測定である。リポソームオリゴヌクレオチドとのインキュベーションの後、50μＬの細胞／ウェルのアリコートを130μＬの培地に添加した。20μＬのalamerBlue色素を各ウェルに添加した。37℃にて６〜８時間のインキュベーションの後、プレートをマイクロプレートリーダー（Molecular Devices，Menlo Park，CA）にて570および59 5nmで直接読み取った。570と595nmとの間の吸光度の差異を、白血病細胞の全体の吸光度値として得た。リポソーム-オリゴヌクレオチド処理細胞の生存度を、未処理細胞の吸光度値と比較した。 Gbr2に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的様式において、白血病細胞の増殖を阻害し得る。５〜７μＭ濃度のGbr2に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合（図１）、CML細胞株BV173およびK562の生存度は、未処理細胞の10〜60％であった。言い換えれば、40〜90％の増殖阻害が、CML細胞において誘導された。同一の条件下で、HL60 細胞の細胞生存度は、減少されなかった。実際には、HL60細胞の生存度は、８〜 10μＭの濃度が使用されるまで減少されなかった。実施例４：細胞増殖のオリゴヌクレオチド阻害（Crk1）。実施例５に記載のようにアッセイを行った。Crk1に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的様式において、白血病細胞の増殖を阻害し得る。５〜８μＭの濃度のCrk1に特異的なリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合（図２）、BV173細胞の生存度は、未処理細胞の生存度の10〜40％であった。８〜９μＭの濃度のリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合、K562細胞の生存度は、未処理細胞の10〜40％であった。HL60細胞の細胞生存度は、10μＭの濃度のリポソームアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した場合を除いて、40％まで減少されなかった。実施例５：細胞増殖のオリゴヌクレオチド阻害（コントロール）。 Grb2またはCrk1配列にハイブリダイズしないリポソームコントロールオリゴヌクレオチドは、高濃度を除いて、CML細胞の増殖を阻害しない。BV173細胞の生存度は、８μＭより多い濃度のリポソームコントロールオリゴが使用される場合、 50％によって減少された。K562細胞およびHL60細胞の生存度は、10μＭの濃度を除いては、減少されなかった。Ｈ．参考文献本明細書中で説明される例示的な手順または他の補助的な詳細が提供される範囲での以下の参考文献は、本明細書中に参考として詳細に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 35/02 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 5/00 Ｅ (72)発明者エーリングハウス，ラルフビー. アメリカ合衆国テキサス 77401，ベライレ，ウィロウストリート 4819

Claims

【特許請求の範囲】１．Grb2コードポリヌクレオチドの翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、組成物。２．Crk1コードポリヌクレオチドの翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、組成物。３．前記ポリヌクレオチドが、８〜50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。４．前記ポリヌクレオチドが、８〜50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。５．前記ポリヌクレオチドが、配列ATATTTGGCGATGGCTTC（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。６．前記ポリヌクレオチドが、配列GTCGAACCGGCGGAGGA（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドである、請求項２に記載の組成物。７．前記ポリヌクレオチドがカプセル化されているリポソームをさらに含む、請求項１に記載の組成物。８．前記ポリヌクレオチドがカプセル化されているリポソームをさらに含む、請求項２に記載の組成物。９．前記リポソームが、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンを含む、請求項７に記載の組成物。１０．前記リポソームが、脂質ジオレオイルホスファチジルコリンを含む、請求項８に記載の組成物。１１．（i）Grb2コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1コードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、組成物。１２．bcr-ablコードポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。１３．Grb2コードポリヌクレオチドの翻訳開始部位にハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物であって、ここで該第１のポリヌクレオチドが、真核生物細胞において活性であるプロモーターの制御下にある、組成物。１４．Crk1コードポリヌクレオチドの翻訳開始部位にハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドをコードする発現構築物を含む組成物であって、ここで該第１のポリヌクレオチドが、真核生物細胞において活性であるプロモーターの制御下にある、組成物。１５．ガン細胞の増殖を阻害する方法であって、該ガン細胞を、（i）Grb2核酸の翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1核酸の翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチドを、少なくとも含む組成物と接触させる工程を含む、方法。１６．前記ポリヌクレオチドが、８〜50塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。１７．前記組成物が、bcr-abl核酸にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６に記載の方法。１８．前記組成物が、（i）Grb2核酸の翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ii）Crk1核酸の翻訳開始部位にハイブリダイズするポリヌクレオチドの両方を含む、請求項１７に記載の方法。１９．前記ガン細胞が白血病細胞である、請求項１６に記載の方法。２０．前記ガン細胞が慢性骨髄性白血病細胞である、請求項１９に記載の方法。２１．前記組成物が、前記ポリヌクレオチドがカプセル化されているリポソームをさらに含む、請求項１６に記載の方法。２２．前記接触工程が患者において行われる、請求項１６に記載の方法。２３．前記患者がヒトである、請求項２２に記載の方法。２４．前記組成物が、１用量あたり0.50-10.0・lの容量で前記ヒトに送達される、請求項２２に記載の方法。２５．前記組成物が、１m²あたり５〜30mgのポリヌクレオチドの量で前記ヒトに送達される、請求項２２に記載の方法。２６．前記組成物が、１週あたり３回、８週間投与される、請求項２５に記載の方法。