JP3010500B2 - 虚血性組織のリポゾームターゲッティング - Google Patents
虚血性組織のリポゾームターゲッティングInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、生化学及び医学の分野に関し、特に、虚血
性組織の診断及び処置におけるリポゾームの使用に関す
る。
性組織の診断及び処置におけるリポゾームの使用に関す
る。
虚血は、組織における血液の欠乏であり、重要な医学
上の問題である。例えば、心疾患は、罹病率及び死亡率
の第一の原因であり、２つの関係する重要な関心事であ
る条件は、心筋虚血（血管収縮のような血液供給の障害
の結果として心筋における組織貧血）及び心筋梗塞（心
筋の局所的死をもたらす虚血条件及び動脈流の障害によ
りもたらされた虚血条件）である。虚血組織の処置にお
いて進歩がなされる一方、多くの改良の余地が存在して
いる。
上の問題である。例えば、心疾患は、罹病率及び死亡率
の第一の原因であり、２つの関係する重要な関心事であ
る条件は、心筋虚血（血管収縮のような血液供給の障害
の結果として心筋における組織貧血）及び心筋梗塞（心
筋の局所的死をもたらす虚血条件及び動脈流の障害によ
りもたらされた虚血条件）である。虚血組織の処置にお
いて進歩がなされる一方、多くの改良の余地が存在して
いる。
有力な抗虚血剤のひとつの問題点は、虚血組織以外に
及ぼすこれらの薬剤の作用である。例えば、多くの有力
な冠血管拡張剤は、心筋虚血の間効果が無い。というの
は、それは非虚血冠血管だけでなく、虚血冠血管も拡張
するためであり、虚血域から血流を流出させるからであ
る。又、多くの抗虚血化合物（例えば、カルシウム流入
阻害剤）は、虚血域に直接ターゲットされればより効果
があるであろう。
及ぼすこれらの薬剤の作用である。例えば、多くの有力
な冠血管拡張剤は、心筋虚血の間効果が無い。というの
は、それは非虚血冠血管だけでなく、虚血冠血管も拡張
するためであり、虚血域から血流を流出させるからであ
る。又、多くの抗虚血化合物（例えば、カルシウム流入
阻害剤）は、虚血域に直接ターゲットされればより効果
があるであろう。
従って、心筋ベッドに化合物を選択的に供給する薬剤
供給システム、即ち、非虚血組織よりもむしろ梗塞心組
織に活性薬剤を好ましく供給する薬剤供給システムが切
に望まれていた。この側面において、用語、「虚血性」
又は「虚血」は、外傷性（traumatic）組織貧血の状態
の組織で、梗塞化組織を含むものを言う。
供給システム、即ち、非虚血組織よりもむしろ梗塞心組
織に活性薬剤を好ましく供給する薬剤供給システムが切
に望まれていた。この側面において、用語、「虚血性」
又は「虚血」は、外傷性（traumatic）組織貧血の状態
の組織で、梗塞化組織を含むものを言う。
リン脂質ベシクル（vesicle）（リポゾーム）は、選
択された組織に集中し、この組織特異性由来の活性薬剤
の供給における更なる強化を持たらすであろうという希
望から追跡されてきた。よって、研究者は、リポゾーム
を活性薬剤の心筋組織への供給に使用しようと企てた。
例えば、キャリド及びザレット（Caride and Zaret）に
よる刊行物、サイエンス198,735−738（1977）におい
て、直径約1,000nmの純陽性、陰性か又は中性電荷のい
ずれかを有する多層（multiamellar）リポゾームを、塞
栓性閉胸内壁心筋梗塞（embolic closedchest interior
wall myocardil infarction）を誘導した後のホ乳動物
へ投与している。リポゾームは、99mTc−DTPA（ジエチ
レントリアミンペンタ酢酸）でラベルされていた。この
刊行物は、梗塞心筋組織における陽及び中性MLVの集積
を報告すると同時に、99mTc−DTPAが、虚血心筋中に集
積（１時間の循環時間後の通常の心筋の10倍）するのが
示され、更に、この文献で観察された梗塞化心筋での
99mTc−DTPAの集積が、循環中のベシクル成分（content
s）の放出；その後の損傷を受けた心筋中のフリーな99m
Tc−DTPAの集積にまことよるものであることがデータで
示されている。
択された組織に集中し、この組織特異性由来の活性薬剤
の供給における更なる強化を持たらすであろうという希
望から追跡されてきた。よって、研究者は、リポゾーム
を活性薬剤の心筋組織への供給に使用しようと企てた。
例えば、キャリド及びザレット（Caride and Zaret）に
よる刊行物、サイエンス198,735−738（1977）におい
て、直径約1,000nmの純陽性、陰性か又は中性電荷のい
ずれかを有する多層（multiamellar）リポゾームを、塞
栓性閉胸内壁心筋梗塞（embolic closedchest interior
wall myocardil infarction）を誘導した後のホ乳動物
へ投与している。リポゾームは、99mTc−DTPA（ジエチ
レントリアミンペンタ酢酸）でラベルされていた。この
刊行物は、梗塞心筋組織における陽及び中性MLVの集積
を報告すると同時に、99mTc−DTPAが、虚血心筋中に集
積（１時間の循環時間後の通常の心筋の10倍）するのが
示され、更に、この文献で観察された梗塞化心筋での
99mTc−DTPAの集積が、循環中のベシクル成分（content
s）の放出；その後の損傷を受けた心筋中のフリーな99m
Tc−DTPAの集積にまことよるものであることがデータで
示されている。
ミュラー（mueller）等の刊行物、サーキュレーショ
ンリサーチ（Circulation Researeh）49,403−415（198
1）は、400から700ナノメーターの大きさで、単層（uni
lamellar）リポゾームに保持された蛋白マーカー（131I
−アルブミン）の使用を報告している。その結果、正常
の心筋と比較して虚血心筋での陽リポゾームの僅かな集
積（虚血／正常＝1.38:1）が見られ、中性リポゾームに
ついては、虚血心筋でのネットの集積は見られなかった
（比率0.81:1）。
ンリサーチ（Circulation Researeh）49,403−415（198
1）は、400から700ナノメーターの大きさで、単層（uni
lamellar）リポゾームに保持された蛋白マーカー（131I
−アルブミン）の使用を報告している。その結果、正常
の心筋と比較して虚血心筋での陽リポゾームの僅かな集
積（虚血／正常＝1.38:1）が見られ、中性リポゾームに
ついては、虚血心筋でのネットの集積は見られなかった
（比率0.81:1）。
カルジオバスキュラーリサーチ（Cardiovascular Res
earch）16,516−523（1982）コール（Cole）等は、心筋
梗塞の初期において心筋リポゾームの取り込みを開示し
ており、75から125nmリポゾームが虚血性心筋による選
択的取り込みの証拠を示さなかったと結論づけている。
この著者は、リポゾームは、心筋梗塞での薬剤供給の手
段としては限定した能力を有していることを示唆してい
る。抗体を又、このようなベシクルを組織に優先的に供
給しようとして、リポゾームに供給結合させたが、結果
は、多くの例で成功からはほどとおいものであった。
earch）16,516−523（1982）コール（Cole）等は、心筋
梗塞の初期において心筋リポゾームの取り込みを開示し
ており、75から125nmリポゾームが虚血性心筋による選
択的取り込みの証拠を示さなかったと結論づけている。
この著者は、リポゾームは、心筋梗塞での薬剤供給の手
段としては限定した能力を有していることを示唆してい
る。抗体を又、このようなベシクルを組織に優先的に供
給しようとして、リポゾームに供給結合させたが、結果
は、多くの例で成功からはほどとおいものであった。
発明の要点 本発明によれば、患者の血流中に200nm未満の大きさ
の（好ましくは、単一層ベシクル）リポゾームを導入す
ることを特徴とし、好ましくは化学的に純粋な合成ホス
ホリピッドを含むことにより特徴づけられ、最も好まし
くは、少くとも16炭素長の脂肪族側鎖を有し、且つ治
療、診断薬の量をリポゾームに結合した抗体の実質的不
存在下において虚血組織に選択的に供給（即ち、ターゲ
ット）するのに十分な量の治療、診断薬を含む、患者の
虚血組織をターゲットする方法を提供する。表現、「化
学的に純粋なホスホリピッド」とは、有害なデタージェ
ント部（deleterious detergent moieties）及びそこか
ら形成される小単一層ベシクル（SUV）の擬集をもたら
す不純物を実質的に含まないホスホリピッドを意味し、
97％以上純粋のものを言う。
の（好ましくは、単一層ベシクル）リポゾームを導入す
ることを特徴とし、好ましくは化学的に純粋な合成ホス
ホリピッドを含むことにより特徴づけられ、最も好まし
くは、少くとも16炭素長の脂肪族側鎖を有し、且つ治
療、診断薬の量をリポゾームに結合した抗体の実質的不
存在下において虚血組織に選択的に供給（即ち、ターゲ
ット）するのに十分な量の治療、診断薬を含む、患者の
虚血組織をターゲットする方法を提供する。表現、「化
学的に純粋なホスホリピッド」とは、有害なデタージェ
ント部（deleterious detergent moieties）及びそこか
ら形成される小単一層ベシクル（SUV）の擬集をもたら
す不純物を実質的に含まないホスホリピッドを意味し、
97％以上純粋のものを言う。
好ましくは、SUVは、主として、直径50から100nmを有
し、電荷は実質的に中性であり、側鎖長16から18炭素原
子をホスホリピッドを含んでいる。更に好ましくは、こ
のリポゾームはジステアロイルホスファチジルコリンか
ら製造され、ベシクル安定剤としてコレステロール（最
も好ましくは、全リピッドの10から50％の量）を含む。
し、電荷は実質的に中性であり、側鎖長16から18炭素原
子をホスホリピッドを含んでいる。更に好ましくは、こ
のリポゾームはジステアロイルホスファチジルコリンか
ら製造され、ベシクル安定剤としてコレステロール（最
も好ましくは、全リピッドの10から50％の量）を含む。
ターゲットされた虚血組織は、好ましくは、可逆的な
梗塞化心筋組織のような虚血性心筋組織であり、この方
法が、活性薬剤をそこにターゲットするのに有効である
ことを示した。
梗塞化心筋組織のような虚血性心筋組織であり、この方
法が、活性薬剤をそこにターゲットするのに有効である
ことを示した。
急性心筋虚血組織へのリポゾームのターゲットに関す
るいかなる理論にも拘束されるわけではないが、リポゾ
ームは、増加する透過性（増加する孔の大きさ）を有す
るキャピラリーを通過し、選択的に非虚血域に比較し
て、虚血心筋のような虚血組織に浸透することができる
ように思われる。
るいかなる理論にも拘束されるわけではないが、リポゾ
ームは、増加する透過性（増加する孔の大きさ）を有す
るキャピラリーを通過し、選択的に非虚血域に比較し
て、虚血心筋のような虚血組織に浸透することができる
ように思われる。
種々の診断薬をこのリポゾーム中にカプセル化するこ
とができ、本発明の方法に使用しうる。以下の実施例に
おいて、インジウム（111In）の放射活性アイソトープ
をリポゾーム中に負荷し、急性心筋虚血のガンアイメー
ジング（gamma imaging）をさせる。更に、適当なリポ
ゾーマルNMRコントラスト剤；例えば、米国特許第4,72
8,575に記述されている、を磁器共鳴法により心筋虚血
をイメージするのに投与できる。
とができ、本発明の方法に使用しうる。以下の実施例に
おいて、インジウム（111In）の放射活性アイソトープ
をリポゾーム中に負荷し、急性心筋虚血のガンアイメー
ジング（gamma imaging）をさせる。更に、適当なリポ
ゾーマルNMRコントラスト剤；例えば、米国特許第4,72
8,575に記述されている、を磁器共鳴法により心筋虚血
をイメージするのに投与できる。
治療剤に関して、スーパーオキシド又は酸素ラジカル
スペーシー（例えば、スーパーオキシドジスミューター
ゼ）の分割を触媒する酵素を適当なベシクル中に含める
ことができ、カタラーゼ又はグルコースオキシダーゼ、
又はニカルジピンのようなジヒドロ−ピリジン化合物の
ような治療剤を含めることができる。
スペーシー（例えば、スーパーオキシドジスミューター
ゼ）の分割を触媒する酵素を適当なベシクル中に含める
ことができ、カタラーゼ又はグルコースオキシダーゼ、
又はニカルジピンのようなジヒドロ−ピリジン化合物の
ような治療剤を含めることができる。
本発明に使用できる特別の診断、治療剤は、本発明の
開示をフォローすれば当業者に明白であり、本発明の部
分を構成するものではない。
開示をフォローすれば当業者に明白であり、本発明の部
分を構成するものではない。
説明的な実施例において、虚血組織を描写（delineat
e）するのに放射線ラベル化リポゾームを使用し、本発
明方法が治療又は診断薬を傷害を受けた虚血組織に選択
的に供給することができることを説明する。本開示によ
って、心筋虚血の処置に関する別の診断又は治療薬の使
用は当業者に明白であろう。
e）するのに放射線ラベル化リポゾームを使用し、本発
明方法が治療又は診断薬を傷害を受けた虚血組織に選択
的に供給することができることを説明する。本開示によ
って、心筋虚血の処置に関する別の診断又は治療薬の使
用は当業者に明白であろう。
図面の簡単な説明 図１は、111In−ラベル化リポゾームのイヌでの血液
クリアランスデータを時間とともに示す。データは、ラ
ジオアクティビティー（CPM）/g血液として表わす。各
点で、Ｎ＝４。値は、平均±S.Dとして表わす。
クリアランスデータを時間とともに示す。データは、ラ
ジオアクティビティー（CPM）/g血液として表わす。各
点で、Ｎ＝４。値は、平均±S.Dとして表わす。
詳細な説明 リポゾームの調製 本発明で使用するリポゾームは、200nm未満の大きさ
の小さな単一層リポゾームであり、好ましくは、直径50
から100nmを有する。上記したように、ベシクルは、好
ましくは、飽和側鎖を有する化学的に純粋なホスホリピ
ッドを特徴とし、最も好ましくは、ジステアロイルホス
ファチジルコリンのようなホスホリピッドから製造す
る。コレステロールを、有利には本開示に使用されるベ
シクルの安定性を増すためにリポゾーム中に含める。
の小さな単一層リポゾームであり、好ましくは、直径50
から100nmを有する。上記したように、ベシクルは、好
ましくは、飽和側鎖を有する化学的に純粋なホスホリピ
ッドを特徴とし、最も好ましくは、ジステアロイルホス
ファチジルコリンのようなホスホリピッドから製造す
る。コレステロールを、有利には本開示に使用されるベ
シクルの安定性を増すためにリポゾーム中に含める。
多種の治療又は診断薬を当業者に明らかな方法により
リポゾームの内部水性空間又はリピッド複層中に含め
る。下記の実施例において、ベシクル中にラジオラベル
する外部カチオンを負荷するのにキレート化合物及びイ
オノホール（ionophore）を用いる。好ましいイオノホ
ールはA23187であるが、他の好ましいイオノホールは、
ラザロシドＡ（Ｘ−537A）及びラザロシドの５−ブロモ
誘導体のようなポリエーテル、ベアウベルシンのような
環状デプシペプチド、及びバルノミリンのような環状ペ
プチドである。キレート剤は、好ましは、ニトリロ酢酸
（NTA）であるが、他のキレート剤も又使用しうる。
リポゾームの内部水性空間又はリピッド複層中に含め
る。下記の実施例において、ベシクル中にラジオラベル
する外部カチオンを負荷するのにキレート化合物及びイ
オノホール（ionophore）を用いる。好ましいイオノホ
ールはA23187であるが、他の好ましいイオノホールは、
ラザロシドＡ（Ｘ−537A）及びラザロシドの５−ブロモ
誘導体のようなポリエーテル、ベアウベルシンのような
環状デプシペプチド、及びバルノミリンのような環状ペ
プチドである。キレート剤は、好ましは、ニトリロ酢酸
（NTA）であるが、他のキレート剤も又使用しうる。
リポゾームは、ホスホリピッド及びコレステロールを
クロロホルムのような適当な有機溶媒中に溶解し、溶媒
を蒸発してリピッドフィルムを形成することによって製
造する。下記の実施例のように、もしイオノホールを診
断又は治療薬剤をリポゾーム中に負荷するのに使用する
ならば、この化合物を蒸発前にリピッド溶液中に添加す
ることができる。
クロロホルムのような適当な有機溶媒中に溶解し、溶媒
を蒸発してリピッドフィルムを形成することによって製
造する。下記の実施例のように、もしイオノホールを診
断又は治療薬剤をリポゾーム中に負荷するのに使用する
ならば、この化合物を蒸発前にリピッド溶液中に添加す
ることができる。
乾燥したリピッドフィルムをその後適当な水性相中で
再加水する。例えば、ホスフェートバッファー化食塩水
又は他の物理的に適当な溶媒である。水可溶薬剤又は治
療剤をハイドレーション溶液中に含めることができ、も
負荷をリモートする必要があるなら、上記したキレート
剤のような負荷剤をハイドレーション溶液に添加して、
リポゾームの内部水性空間中にカプセル化することがで
きる。
再加水する。例えば、ホスフェートバッファー化食塩水
又は他の物理的に適当な溶媒である。水可溶薬剤又は治
療剤をハイドレーション溶液中に含めることができ、も
負荷をリモートする必要があるなら、上記したキレート
剤のような負荷剤をハイドレーション溶液に添加して、
リポゾームの内部水性空間中にカプセル化することがで
きる。
ハイドレーション溶液の添加の際、種々の大きさのリ
ポゾームが瞬時に形成し、水性相の一部をカプセル化す
る。したがって、リポゾーム及び懸濁水性溶液をソニケ
ーションのようなせん断力にさらし、又は米国特許4,75
3,788号に述べられた方法に従ってホモジェナイザーに
より操作して、特定した大きさ内のベシクルを作る。リ
ポゾームのその後プロセスして懸濁液から、キレート剤
又は未カプセル化薬剤のような望ましくない化合物を、
ゲルクロマトグラフィー又はウルトラフィルトレーショ
ンのような方法により除去する。必要ならば、生成物を
その後濃縮して過剰のバッファー溶液を除去する。リポ
ゾームは0.2ミクロンより大きさが小さいので、これら
をその後殺菌した0.22ミクロンフィルターを通過させ
て、他の懸濁液中に存在する微生物を除去する。その
後、リポゾームを殺菌したガラス容器中に充填し、殺菌
エラストマー栓で栓をする。
ポゾームが瞬時に形成し、水性相の一部をカプセル化す
る。したがって、リポゾーム及び懸濁水性溶液をソニケ
ーションのようなせん断力にさらし、又は米国特許4,75
3,788号に述べられた方法に従ってホモジェナイザーに
より操作して、特定した大きさ内のベシクルを作る。リ
ポゾームのその後プロセスして懸濁液から、キレート剤
又は未カプセル化薬剤のような望ましくない化合物を、
ゲルクロマトグラフィー又はウルトラフィルトレーショ
ンのような方法により除去する。必要ならば、生成物を
その後濃縮して過剰のバッファー溶液を除去する。リポ
ゾームは0.2ミクロンより大きさが小さいので、これら
をその後殺菌した0.22ミクロンフィルターを通過させ
て、他の懸濁液中に存在する微生物を除去する。その
後、リポゾームを殺菌したガラス容器中に充填し、殺菌
エラストマー栓で栓をする。
実施例１ ジステアロイルホスファチジルコリン及びコレステロ
ール2:1モル比の有機溶液を作り、溶液を蒸発させて、
リピッドフィルを形成し、リピッドを更に真空下乾燥さ
せてSUVを調製した。111Inをベシクル中へ負荷させるた
めに２価のイオノホール（A23187）を、蒸発前にリピッ
ド溶液に添加した。典型的な調製においては、20μモル
ジステアロイルホスファチジルコリン;10μモルコレス
テロール及び0.04μモルA23187をクロロホルム中に溶解
し、乾燥して薄層とし（60℃、窒素流下）、その後真空
下一晩乾燥した。
ール2:1モル比の有機溶液を作り、溶液を蒸発させて、
リピッドフィルを形成し、リピッドを更に真空下乾燥さ
せてSUVを調製した。111Inをベシクル中へ負荷させるた
めに２価のイオノホール（A23187）を、蒸発前にリピッ
ド溶液に添加した。典型的な調製においては、20μモル
ジステアロイルホスファチジルコリン;10μモルコレス
テロール及び0.04μモルA23187をクロロホルム中に溶解
し、乾燥して薄層とし（60℃、窒素流下）、その後真空
下一晩乾燥した。
乾燥リピッドフィルムをその後、適当な水性相、例え
ば、ホスフェート−バッファー化食塩水（0.9％NaCl及
び5mMリン酸ナトリウム、pH7.4）で、111In3+を負荷す
るキレート剤を含むもので再加水し、せん断力を与えて
SUVを形成した。典型的な調製においては、乾燥リピッ
ドを、キレート剤として1mMニトリロトリ酢酸（NTA）を
含むホスフェート−バッファー化食塩水で再加水し、混
合物を約65℃でサスペンジョンが透明になる迄（約５
分）ソニケートし、その後400gで遠心分離した。未カプ
セル化NTAをセファデックスＧ−50カラムを通して混合
物を濾過してベシクルから除去した。リポゾームをNico
mpモデル270サブミクロン粒子サイズが分析計により測
定し、平均直径100nm未満と決定した。
ば、ホスフェート−バッファー化食塩水（0.9％NaCl及
び5mMリン酸ナトリウム、pH7.4）で、111In3+を負荷す
るキレート剤を含むもので再加水し、せん断力を与えて
SUVを形成した。典型的な調製においては、乾燥リピッ
ドを、キレート剤として1mMニトリロトリ酢酸（NTA）を
含むホスフェート−バッファー化食塩水で再加水し、混
合物を約65℃でサスペンジョンが透明になる迄（約５
分）ソニケートし、その後400gで遠心分離した。未カプ
セル化NTAをセファデックスＧ−50カラムを通して混合
物を濾過してベシクルから除去した。リポゾームをNico
mpモデル270サブミクロン粒子サイズが分析計により測
定し、平均直径100nm未満と決定した。
実施例２ ジステアロイルホスファチジルコリンとコレステロー
ル2:1モル比混合物をクロロホルム中に、イオノホールA
23187と共に溶解した。これらの化合物を完全に溶解す
るまで十分に混合した。溶液をその後ロータリーエバポ
レーター中に置いて、クロロホルムを除去し、エバポレ
ーターフラスコの表面上にリピッドフィルムをデポジッ
トした。別法として、他の公知の乾燥方法を使用して、
リピッドフィルム又はパウダーを形成することができる
であろう。
ル2:1モル比混合物をクロロホルム中に、イオノホールA
23187と共に溶解した。これらの化合物を完全に溶解す
るまで十分に混合した。溶液をその後ロータリーエバポ
レーター中に置いて、クロロホルムを除去し、エバポレ
ーターフラスコの表面上にリピッドフィルムをデポジッ
トした。別法として、他の公知の乾燥方法を使用して、
リピッドフィルム又はパウダーを形成することができる
であろう。
キレート物質（NTA）をその後ホスフェート−バッフ
ァー化食塩水中で混合し、得られた溶液をリピッドフィ
ルムに添加した。かくして形成されたリポゾームを米国
特許第4,753,788号教示の方法に従がいホモジェナイザ
ーにより処理して平均直径100ナノメーターを越えない
ベシクルを製造した。リポゾームをその後ゲルクロマト
グラフィーカラムを通過させて、リポゾームの外側の懸
濁液中に残っているキレート剤を除去した。生成物をそ
の後、中空ファイバーコンセントレーターを通して濃縮
して過剰のバッファーを除去し、リポゾームサスペンジ
ョンを濃縮した。
ァー化食塩水中で混合し、得られた溶液をリピッドフィ
ルムに添加した。かくして形成されたリポゾームを米国
特許第4,753,788号教示の方法に従がいホモジェナイザ
ーにより処理して平均直径100ナノメーターを越えない
ベシクルを製造した。リポゾームをその後ゲルクロマト
グラフィーカラムを通過させて、リポゾームの外側の懸
濁液中に残っているキレート剤を除去した。生成物をそ
の後、中空ファイバーコンセントレーターを通して濃縮
して過剰のバッファーを除去し、リポゾームサスペンジ
ョンを濃縮した。
その後、リポゾームを0.22ミクロン殺菌フィルターを
通して濾過し、クラス100フードの殺菌ガラス容器に移
し、殺菌エラストマー栓で栓をした。このプロセスを通
じて、適当なAQ/O方法を殺菌操作条件を確保するために
用いた。
通して濾過し、クラス100フードの殺菌ガラス容器に移
し、殺菌エラストマー栓で栓をした。このプロセスを通
じて、適当なAQ/O方法を殺菌操作条件を確保するために
用いた。
ベシクル負荷 上記したように、ベシクルをリピッドフィルム形成の
間、アンフィフィリック剤で、加水の間水性−可溶剤又
は、他の公知の負荷手段によって、負荷することができ
る。リポゾームの心筋組織へのターゲットは、ラジオア
クティブな薬剤の供給によって最も良く説明されるの
で、ガンマイメージング剤、111インジウム3+を使用の
直前リポゾーム中に負荷した。
間、アンフィフィリック剤で、加水の間水性−可溶剤又
は、他の公知の負荷手段によって、負荷することができ
る。リポゾームの心筋組織へのターゲットは、ラジオア
クティブな薬剤の供給によって最も良く説明されるの
で、ガンマイメージング剤、111インジウム3+を使用の
直前リポゾーム中に負荷した。
実施例３ 必要な活性に応じて、104mMクエン酸ナトリウム（pH
7.4）中の500μｌのベシクル、35μｌの3.4μＭのInCl3
及び１−50μｌの111In3+から成るインキュベーション
ミクスチャーを用いて、負荷を実行した。111インジウ
ム3+添加の２倍の等しいPBSの容量をインキュベーショ
ンミクスチャー中に含めた。インキュベーション時間及
び温度は、モーク（Mauk）等、アナリチカルバイオケミ
ストリー94,302−307（1979）のような刊行された手法
に従って選択することができる。一般的には、60から80
℃、15から60分間のインキュベーションにより負荷は、
達成される。インキュベーションは、サンプルを冷却
し、その後10mM EDTA（PBS中）を添加して停止する。
添加した111インジウムの90％まで、事前に形成された
リポゾーム中に、本方法により含めることがで、このリ
ポゾームは、300μCi/mgリピッドまでの特異的活性を生
じる。
7.4）中の500μｌのベシクル、35μｌの3.4μＭのInCl3
及び１−50μｌの111In3+から成るインキュベーション
ミクスチャーを用いて、負荷を実行した。111インジウ
ム3+添加の２倍の等しいPBSの容量をインキュベーショ
ンミクスチャー中に含めた。インキュベーション時間及
び温度は、モーク（Mauk）等、アナリチカルバイオケミ
ストリー94,302−307（1979）のような刊行された手法
に従って選択することができる。一般的には、60から80
℃、15から60分間のインキュベーションにより負荷は、
達成される。インキュベーションは、サンプルを冷却
し、その後10mM EDTA（PBS中）を添加して停止する。
添加した111インジウムの90％まで、事前に形成された
リポゾーム中に、本方法により含めることがで、このリ
ポゾームは、300μCi/mgリピッドまでの特異的活性を生
じる。
実施例４ 実施例２の方法で製造したバイアルは、それぞれ47ml
のリポゾームサスペンジョン（25mgリポゾーム/ml）及
び主として50から100nmの直径を有する小さな単一層リ
ポゾームを含んでいた。これらのバイアル中のリポゾー
ムを下記のプロセスに従って負荷した。0.2mlの0.1Mク
エン酸ナトリウム注入用を各バイアルに添加し、充十に
混合した。ラジオフォーマシュティカル投与を計算する
標準ラジオフォーマシューティカル手法に従って、注入
時処方した投与量の111In3+を得るのに十分の111インジ
ウムクロリド溶液の量をそれから添加した。この混合物
をその後80℃で30分間インキュベートし、ひき続き室温
まで冷却した。
のリポゾームサスペンジョン（25mgリポゾーム/ml）及
び主として50から100nmの直径を有する小さな単一層リ
ポゾームを含んでいた。これらのバイアル中のリポゾー
ムを下記のプロセスに従って負荷した。0.2mlの0.1Mク
エン酸ナトリウム注入用を各バイアルに添加し、充十に
混合した。ラジオフォーマシュティカル投与を計算する
標準ラジオフォーマシューティカル手法に従って、注入
時処方した投与量の111In3+を得るのに十分の111インジ
ウムクロリド溶液の量をそれから添加した。この混合物
をその後80℃で30分間インキュベートし、ひき続き室温
まで冷却した。
0.1mlの0.1Mナトリウムエデテート注入用をその後添
加してリポゾームが過剰の111inをキレートにより負荷
するのを止めた。このプロセスの間、ラジオアクティブ
負荷効率をリポゾーム負荷法を停止するのに先立ち、0.
5mlのリポゾーム溶液を引き抜き、この溶液を0.5gChele
x100を含む1.5ml遠沈バイアルに移した。遠沈バイアル
の内容物を室温で５分間、時々攪拌してインキュベート
し、遠沈バイアルの全ラジオアクティビティをドーズキ
ャリブレーターを用いて決定した。0.5mlの0.1m注入用
クエン酸ナトリウムを遠沈バイアルに添加し、攪拌し
た。バイアルをChelex100をコンパクトするおだやかな
速度で５分間遠心分離した。0.5mlの上澄液を適当なシ
リンジにより除去し、上澄液のラジオアクティビティー
を決定した。負荷効率を上澄液のラジオアクティビティ
ーを全ラジオアクティビティーで２回除して計算し、10
0倍してパーセント負荷効率を得た。全ての場合に、負
荷効率は90％よりも大きかった。
加してリポゾームが過剰の111inをキレートにより負荷
するのを止めた。このプロセスの間、ラジオアクティブ
負荷効率をリポゾーム負荷法を停止するのに先立ち、0.
5mlのリポゾーム溶液を引き抜き、この溶液を0.5gChele
x100を含む1.5ml遠沈バイアルに移した。遠沈バイアル
の内容物を室温で５分間、時々攪拌してインキュベート
し、遠沈バイアルの全ラジオアクティビティをドーズキ
ャリブレーターを用いて決定した。0.5mlの0.1m注入用
クエン酸ナトリウムを遠沈バイアルに添加し、攪拌し
た。バイアルをChelex100をコンパクトするおだやかな
速度で５分間遠心分離した。0.5mlの上澄液を適当なシ
リンジにより除去し、上澄液のラジオアクティビティー
を決定した。負荷効率を上澄液のラジオアクティビティ
ーを全ラジオアクティビティーで２回除して計算し、10
0倍してパーセント負荷効率を得た。全ての場合に、負
荷効率は90％よりも大きかった。
虚血心筋組織へのターゲッティング 実施例５ 本発明の小単一層リポゾームの抗体ターゲッティング
組織の不存在下における虚血心筋への選択的供給の例を
実施例２及び４の方法に従って製造したラベル化リポゾ
ームの使用により説明する。リポゾームが動物に投与さ
れ該組織にターゲットするのが分かった。
組織の不存在下における虚血心筋への選択的供給の例を
実施例２及び４の方法に従って製造したラベル化リポゾ
ームの使用により説明する。リポゾームが動物に投与さ
れ該組織にターゲットするのが分かった。
使用した全ての動物は、各性の雑種犬（16−20kg,N＝
４）であった。手術前に30mg/kgナトリウムペンドバル
ビタールを用いて注脈注射により麻酔した。ポリエチレ
ンカテーテルを血圧測定及び心拍数、血液サンプリング
及びリポゾーム注入用に大腿動脈及び静脈に挿入した。
気管にカニューレを挿入し、動物を室内空気を用いるハ
ーバードレスピレーターにより人工呼吸した。ユーカプ
ニア（eu capnia）を維持し、ゴダート−スタタムカプ
ノグラフによりモニターした。左の開胸術を第５肋間で
施こし、部分ペリカルディオトミーにより心臓を現わに
し、ペリカルディオアルクラドルを形成した。左前部下
行冠状動脈（LAD）を約1cmを単離してその第１大分枝の
末端とし、シルク結紮糸を血管周囲にゆるく置いた。
４）であった。手術前に30mg/kgナトリウムペンドバル
ビタールを用いて注脈注射により麻酔した。ポリエチレ
ンカテーテルを血圧測定及び心拍数、血液サンプリング
及びリポゾーム注入用に大腿動脈及び静脈に挿入した。
気管にカニューレを挿入し、動物を室内空気を用いるハ
ーバードレスピレーターにより人工呼吸した。ユーカプ
ニア（eu capnia）を維持し、ゴダート−スタタムカプ
ノグラフによりモニターした。左の開胸術を第５肋間で
施こし、部分ペリカルディオトミーにより心臓を現わに
し、ペリカルディオアルクラドルを形成した。左前部下
行冠状動脈（LAD）を約1cmを単離してその第１大分枝の
末端とし、シルク結紮糸を血管周囲にゆるく置いた。
大動脈圧及び心拍数をステータム（Statham）P23AAト
ランスデューサーを用いて測定し、ベックマンＲ−411
レコーダー上に記録した。大腿動脈カテーテルから得た
血液サンプルで、血液ガス及びpHを電気計測的に分析し
た（ラジオメーターBMS3血液ガスアナライザー）。この
時、実施例２及び３に従って製造した6mg/kgの111Inラ
ベル化リポゾームをi.v注射した。動物へのリポゾーム
の注射後、動脈血を1,2,3,4,5,10分及び1,2,3,4,5,6時
間注射後サンプルした。そして血液ラジオアクティビテ
ィーを後で決定した。リポゾーム注射の10分後、LADを
サージカルシルクスネア（sur gical silk snare）によ
り閉塞し、この閉塞を２時間継続した。この時、閉塞を
解き、再灌流を４時間継続せしめた。
ランスデューサーを用いて測定し、ベックマンＲ−411
レコーダー上に記録した。大腿動脈カテーテルから得た
血液サンプルで、血液ガス及びpHを電気計測的に分析し
た（ラジオメーターBMS3血液ガスアナライザー）。この
時、実施例２及び３に従って製造した6mg/kgの111Inラ
ベル化リポゾームをi.v注射した。動物へのリポゾーム
の注射後、動脈血を1,2,3,4,5,10分及び1,2,3,4,5,6時
間注射後サンプルした。そして血液ラジオアクティビテ
ィーを後で決定した。リポゾーム注射の10分後、LADを
サージカルシルクスネア（sur gical silk snare）によ
り閉塞し、この閉塞を２時間継続した。この時、閉塞を
解き、再灌流を４時間継続せしめた。
実験の終りに、血液ガス及び血液動態的変数を再び決
定し、その後心臓を除去した。大動脈を食塩水で100mmH
gの圧力で灌流して、冠血管をクリアにした。
定し、その後心臓を除去した。大動脈を食塩水で100mmH
gの圧力で灌流して、冠血管をクリアにした。
左ベントキュラーフリーウォール（ventricular free
wall）をその後虚血域から６つの小片に、そして非虚
血域から６つの小片に切断した。これらの小片をその後
サブオプロカルディアル部分のサブエンドカルディアル
部に分けた。肝臓及び大腿薄筋を採取した。ラジオアク
ティビティーをその後血液及び組織の両方でヒューレッ
トパッカードガンマカウンターを用いて決定した。
wall）をその後虚血域から６つの小片に、そして非虚
血域から６つの小片に切断した。これらの小片をその後
サブオプロカルディアル部分のサブエンドカルディアル
部に分けた。肝臓及び大腿薄筋を採取した。ラジオアク
ティビティーをその後血液及び組織の両方でヒューレッ
トパッカードガンマカウンターを用いて決定した。
全てのデータをペアドＴ−テストを閉いて分析した。
組織及び血液のクリアランスデータは、組織又は血液の
グラム当りカウント／分（CPM）ラジオアクティビティ
ーとして表わされる。全てのデータは、平均±S.Dとし
て表わす。
組織及び血液のクリアランスデータは、組織又は血液の
グラム当りカウント／分（CPM）ラジオアクティビティ
ーとして表わされる。全てのデータは、平均±S.Dとし
て表わす。
血液動態データを表１に示す。全ての値はイヌの正常
範囲であった。実験中これらの変数に対する相違は無か
った。実験中に、血液ガスにおける変化は見られなかっ
た。
範囲であった。実験中これらの変数に対する相違は無か
った。実験中に、血液ガスにおける変化は見られなかっ
た。
リポゾームに対する血液クリアランスデータを図１に
示す。迅速な初期クリアランス、引き続きゆっくりした
相が観察される。データはCPMラジオアクティビティ（C
PM）/g血液として表わされる。リポゾームの半分以上
が、実験の最後には血液からクリアしたことが明白であ
る。
示す。迅速な初期クリアランス、引き続きゆっくりした
相が観察される。データはCPMラジオアクティビティ（C
PM）/g血液として表わされる。リポゾームの半分以上
が、実験の最後には血液からクリアしたことが明白であ
る。
心筋組織のリポゾームクリアランスのデータを表２に
示す。データは、CMP/g組織として表わす。全ての動物
の虚血域はその対となった非虚血域と比較してよりラジ
オアクティビティーを含んでいた。その違いは、５−10
倍であった。虚血域内で、サブエンドカルジウムはサブ
エピカルジウムに含まれたラジオアクティビティーの２
倍を含んでおり、この相違は大きかった。肝臓は、リポ
ゾームを種極的にクリアし、CPM/gが12.34×104±5.49
×104PM/gでクリアした。骨格筋は、心臓の非虚血域と
類似の量、0.11×104±0.01×104CPM/gをクリアした。
示す。データは、CMP/g組織として表わす。全ての動物
の虚血域はその対となった非虚血域と比較してよりラジ
オアクティビティーを含んでいた。その違いは、５−10
倍であった。虚血域内で、サブエンドカルジウムはサブ
エピカルジウムに含まれたラジオアクティビティーの２
倍を含んでおり、この相違は大きかった。肝臓は、リポ
ゾームを種極的にクリアし、CPM/gが12.34×104±5.49
×104PM/gでクリアした。骨格筋は、心臓の非虚血域と
類似の量、0.11×104±0.01×104CPM/gをクリアした。
イヌの虚血におけるラベル化リポゾームの生体分布のサ
マリー 動物:16−20kgイヌ−４研究 平均全リピッド投与量:6mg/kg×18kg＝108mgリピッド 平均全ラジオアクティビティー（注射時の平均血液レベ
ルからの計算）:1300×105cpm 平均生体分布６時間:cpm/gm（×104） 虚血サブエンドカルジウム 2.2±1.1 虚血サブエピカルジウム 1.6±0.9 非虚血サブエンドカルジウム 0.26±0.10 非虚血サブエピカルジウム 0.27±0.14 血液 2.0±0.5 骨格筋 0.11±0.01 肝臓 12.3±5.5 心筋虚血及び梗塞は、とりわけキャピラリー透過性の
増加により特徴づけられる。この増加した透過性によ
り、供給ビヒクルとして適当な大きさのリポゾームを用
いて、虚血域に薬剤を供給することができる。本研究に
おいて、虚血域のラジオアクティビティーの局所化（そ
して恐らくリポゾームの）は、非虚血心筋と比較して５
−10倍大きかった。特別の理論に拘束されるつもりはな
いが、リポゾームは増加したキャピラリー透過性により
虚血域に居所化されたものと思われる。興味深いこと
に、虚血サブエンドカルジウムは、虚血サブエピカルジ
ウムと比較して、よりリポゾームを局所化する傾向があ
った。これは、サブエンドカルジウムが通常、虚血中、
より危険であるという事実を反映しているかもしれな
い。非虚血のサブエピカルジアル−サブエンドカジアル
のリポゾーム局所化における相違は、大きな相違ではな
かった。リポゾームの高い肝臓クリアランスは、この臓
器が血液生成粒子除去の重要部位であることから、驚く
に値しない。これは又111Inがリポゾームに結合してい
たことを示す。というのは、フリーである111Inは、恐
らく肝臓によりクリアされなかったであろうからであ
る。推定のラベル効率は70−80％であった。非虚血心筋
及び骨格筋は、比較的低いリポゾーム局所化であった。
マリー 動物:16−20kgイヌ−４研究 平均全リピッド投与量:6mg/kg×18kg＝108mgリピッド 平均全ラジオアクティビティー（注射時の平均血液レベ
ルからの計算）:1300×105cpm 平均生体分布６時間:cpm/gm（×104） 虚血サブエンドカルジウム 2.2±1.1 虚血サブエピカルジウム 1.6±0.9 非虚血サブエンドカルジウム 0.26±0.10 非虚血サブエピカルジウム 0.27±0.14 血液 2.0±0.5 骨格筋 0.11±0.01 肝臓 12.3±5.5 心筋虚血及び梗塞は、とりわけキャピラリー透過性の
増加により特徴づけられる。この増加した透過性によ
り、供給ビヒクルとして適当な大きさのリポゾームを用
いて、虚血域に薬剤を供給することができる。本研究に
おいて、虚血域のラジオアクティビティーの局所化（そ
して恐らくリポゾームの）は、非虚血心筋と比較して５
−10倍大きかった。特別の理論に拘束されるつもりはな
いが、リポゾームは増加したキャピラリー透過性により
虚血域に居所化されたものと思われる。興味深いこと
に、虚血サブエンドカルジウムは、虚血サブエピカルジ
ウムと比較して、よりリポゾームを局所化する傾向があ
った。これは、サブエンドカルジウムが通常、虚血中、
より危険であるという事実を反映しているかもしれな
い。非虚血のサブエピカルジアル−サブエンドカジアル
のリポゾーム局所化における相違は、大きな相違ではな
かった。リポゾームの高い肝臓クリアランスは、この臓
器が血液生成粒子除去の重要部位であることから、驚く
に値しない。これは又111Inがリポゾームに結合してい
たことを示す。というのは、フリーである111Inは、恐
らく肝臓によりクリアされなかったであろうからであ
る。推定のラベル効率は70−80％であった。非虚血心筋
及び骨格筋は、比較的低いリポゾーム局所化であった。
上記記述から、約200ナノメーター、好ましくは60か
ら100nmの大きさのリポゾームが、診断又は治療剤のよ
うな活性薬剤を虚血心筋域に、選択的にターゲットし、
特に、通常リスクのより大きい虚血サブエンドカルジウ
ムにリポゾームを選択的に局所化させ、最も虚血の厳し
い域に薬剤を供給することを助けることが明らかであ
る。
ら100nmの大きさのリポゾームが、診断又は治療剤のよ
うな活性薬剤を虚血心筋域に、選択的にターゲットし、
特に、通常リスクのより大きい虚血サブエンドカルジウ
ムにリポゾームを選択的に局所化させ、最も虚血の厳し
い域に薬剤を供給することを助けることが明らかであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，198（4318），735− ７（1977) Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ，49（２）405−15（1981) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 9/133 A61K 47/24
Claims (16)
- 【請求項１】治療薬または診断薬を患者の回復性虚血組
織に選択的に送達するために、虚血患者の血流中に導入
されるべき組成物であって、中性ホスホリピッドを含む
200ナノメーター未満の大きさの単一層リポソームを、
薬剤の必要な量を送達するために十分な量含み、該リポ
ソームは薬剤を含むことを特徴する上記組成物。 - 【請求項２】虚血組織が心筋組織であり、薬剤が非虚血
心筋よりもむしろ虚血組織に選択的に送達される請求項
１の組成物。 - 【請求項３】リポゾームが、約50から約100ナノメータ
ーの大きさである請求項１の組成物。 - 【請求項４】リポゾームが、約50から約100ナノメータ
ーの大きさである請求項２の組成物。 - 【請求項５】リポゾームが、化学的に純粋な合成ホスホ
リピッドからなることを特徴とする請求項１の組成物。 - 【請求項６】リポゾームが、化学的に純粋な合成ホスホ
リピッドからな成ることを特徴とする請求項２の組成
物。 - 【請求項７】リポゾームが、化学的に純粋な合成ホスホ
リピッドから成ることを特徴とする請求項３の組成物。 - 【請求項８】リポゾームが、化学的に純粋な合成ホスホ
リピッドから成ることを特徴とする請求項４の組成物。 - 【請求項９】化学的に純粋な合成ホスホリピッドが、少
くとも16炭素長の脂肪族側鎖を有する請求項５の組成
物。 - 【請求項１０】化学的に純粋な合成ホスホリピッドが、
少なくとも16炭素長の脂肪族側鎖を有する請求項６の組
成物。 - 【請求項１１】化学的に純粋な合成ホスホリピッドが、
少くとも16炭素長の脂肪族側鎖を有する請求項７の組成
物。 - 【請求項１２】化学的に純粋な合成ホスホリピッドが、
少くとも16炭素長の脂肪族側鎖を有する請求項８の組成
物。 - 【請求項１３】化学的に純粋な合成ホスホリピッドがジ
ステアロイルホスファチジルコリンである請求項９の組
成物。 - 【請求項１４】化学的に純粋な合成ホスホリピッドがジ
ステアロイルホスファチジルコリンである請求項10の組
成物。 - 【請求項１５】化学的に純粋な合成ホスホリピッドがジ
ステアロイルホスファチジルコリンである請求項11の組
成物。 - 【請求項１６】化学的に純粋な合成ホスホリピッドがジ
ステアロイルホスファチジルコリンである請求項12の組
成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33968289A | 1989-04-18 | 1989-04-18 | |
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