JP4629308B2

JP4629308B2 - リポソーム

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Publication number: JP4629308B2
Application number: JP2002586908A
Authority: JP
Inventors: シグリッド・フォスハイム; リヴ・イングリッド・オデガルドストゥエン
Original assignee: ジーイー・ヘルスケア・アクスイェ・セルスカプ
Priority date: 2001-05-10
Filing date: 2002-05-10
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2022-05-10
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Description

発明の詳細な説明

発明の分野
本発明は、これらの内部相中にエントラップされた修飾化合物を含む、特定二層組成物のリポソームであって、当該修飾化合物が、その後に内在化される材料を不可逆的に化学的に修飾することができ、その結果等該材料が、リポソーム内に内在化したままであるものに関する。種々の材料は、内在化のために好適であるが、本発明のリポソームは特に、金属キレートの内在化のために特に好適である。該リポソームは、ヒトで感染、炎症、または腫瘍を画像化するために、および薬物物質の有効な送達のために有用である。

発明の背景
リポソームは、水性内容物を閉じこめるリン脂質二層からなる小胞である。水性内容物中の材料のカプセル化は、標的組織中にその材料の蓄積を可能とし、そしてそれが害を及ぼす非標的組織へのその分散を減少させる。これは、該材料が、毒性副作用を有する薬物である場合に特に有用な機構である。リポソームは、そのような薬物のための一般的な送達システムである：例えばもし、全身的に投与したならば、癌治療エピポドフィルロトキシンが白血球減少症、血小板減少症および貧血症を生じる。ＷＯ００／０９０７１は、これらの全身性副作用を回避するための手段としてのエピポドフィルロトキシンのリポソーム調製を開示する。同様に、ＷＯ９６／１７５９６は、α−インターフェロンを含むリポソーム組成物を開示し、そしてＷＯ９２／０２２０８は、ドキサルビシンを含むリポソーム性組成物を開示する。

リポソームはまたかなり興味深く、なぜなら、診断剤のための担体として有益であるからである。例は、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、単一光量子放射技法（ＳＰＥＣＴ）、超音波およびｘ線のための診断剤である。トレーサーおよびＳＰＥＣＴ画像化のための放射性医薬は、特に興味深い。種々の手段を評価し、そして放射性標識化リポソームの詳細な説明を、科学文献に見出し得る。

今日診断核医薬で使用されたほとんどの一般的な放射性標識は、^９９ｍＴｃである。この放射性標識は、モリブデン−９９（^９９Ｍｏ）のベータ崩壊から生産され、そして６時間の半減期を有する。それは低コストの発生器システムから広く利用可能であり、そしてその比較的短い半減期は、他の利用可能な放射性標識よりもより安全かつより便利な取り扱いを提供する。そのガンマ放射は１４１ｋｅＶであり、これは、高解像度画像を生産するため理想的である。^９９ｍＴｃＯ_４は、発生器から生産し、そしてそれは比較的非反応性であるから、放射性医薬としての使用前により低い酸化状態へ減少させなければならない。塩化スズは、最も一般に使用される還元剤である。リポソームの、^９９ｍＴｃＯ_４ ⁻および塩化スズ溶液とのインキュベーションは、リポソームを放射性標識する手段として評価された。その方法の放射性標識化効率は、再現可能でなく、そして過剰の還元剤、遊離パーテクネテートおよび^９９ｍＴｃ−ＳｎＣｌ_２コロイドの除去が問題であった（Barratt, G.M., Tuezel, N.S., and Ryman, B.E., Liposome Technology Volume II, Gregoridas, G., Ed, CRC Press, Boca Raton, (1984)）。またこの文書は、^９９ｍＴｃが、インビトロおよびインビボの両方でリポソームから放出されるべきことを報告した。これらの発表は、多くの応用への限定された有用性のリポソームという結果であった。

リポソーム中に取りこまれたオクタデシルアミン−ＤＴＰＡが、キレート化によって^６７Ｇａまたは^９９ｍＴｃで急速かつ効率的にリポソームを標識することが示された。しかし標識の３０％以上が、血漿中での２時間のインキュベーション後に失われた。

８−ヒドロキシキノリンを使用して^１１１Ｉｎで標識されたマルチラメラ脂質小胞は、３０％の標識化効率を示した（Caride, V.J. and Sostman, H.D. in Liposome Technology Volume II, Gregoridas, G., Ed, CRC Press, Boca Raton, (1984)）。アセチルアセトン、水溶性親油性キレート剤は、^１１１Ｉｎと錯体化することができる。これは次いで、リポソームでカプセル化されたニトリロ酢酸と混合し、標識されたニトリロ酢酸のその後の形成となる。得られた標識されたリポソームは、過剰のアセチルアセトンが、イオン交換過程によって除去されるなければ、不安定である（Beaumier, P. L. and Hwang., K.J., J. Nuc. Med., 23, 810-815(1982)）。

^９９ｍＴｃ標識されたリポソームを調製するさらなる方法は、放射性標識のための担体として作用する錯体の形態における放射性標識とのリポソームのインキュベーションに関係する。そのような方法は、早期１９９０年代に開示された（Phillips, W. T. et al., Nuc. Med. Biol., 19, 539-547(1992);US5143713)。好ましい担体は、ヘキサメチレンプロピレンアミンオキシム（ＨＭＰＡＯ）であって、^９９ｍＴｃで標識され、かつ、室温でリポソームとインキュベートされ、放射性標識されたリポソームを生産する。^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯ錯体（complex）は、親油性であり、こうして脂質二層を横切って受動核酸によって移入すると考えられる。^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯは、負に荷電したリポソームの膜を容易に横断すると考えられる。ＵＳ５１４３７１３の負に荷電したリポソームは、１０：９：１の中性リン脂質：コレステロール：負に荷電したリン脂質：α−トコフェロールのモル比率の脂質組成を有する（実施例１ｓｉｃ．）。リポソーム内にエントラップされた酸化防止剤は、親油性^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯをリポソームの内部水性層中に残る親水性形態に変換すると考えられる。しかし、リポソームは、もし酸化防止剤は化学的に安定であり、かつリポソーム内にエントラップされるならば、リポソームが効率的に放射性標識されるのみである。研究は、これらのリポソーム懸濁液の、還元剤グルタチオンの化学的不安定性による限定されたシェルフライフを明かにした（Goins et al., J. Liposome Res., 8, 265,1998）。

放射性標識されたリポソームの臨床的使用は、当業界で周知である。核医学のいくつかの応用は、腫瘍画像化、感染および炎症画像化、および血液プール画像化を含むリポソームのために提唱された。

早期の生物学的研究は、大マルチラメラリポソームを使用し、これは、血液プールから、肝臓および脾臓の単核食細胞に卓越してクリアランスされた（Morgan, J.R. et al., J. Med. Microbiol., 14, 213-217(1981)）。標識化手法はまた、不安定であると示され、リポソームからの標識の過剰の喪失という結果となった。この不安定性は明かに、遊離^９９ｍＴｃの高尿排出を有する感染したラットの画像に見出された。より最近の研究は、単核食細胞システムへの取りこみを最小化し、こうして血液循環時間を延長するサイズに加工されたリポソームを使用した。S. aureusに感染したラットでの研究は、膿瘍が容易に^９９ｍＴｃ−リポソーム注射の２時間以内に可視化され、標的対バックグラウンド比率が２．９±０．３であり、２４時間までに６．９±１．１に増加した（Goins, B. et al., J. Nuc. Med., 34, 2160-2168(1993)）。リポソームを、ＨＭＰＡＯ担体方法を使用して標識し、該標識化手法は、２４時間期間にわたる^９９ｍＴｃのその低尿排出のためにインビボで安定であるようである。使用されたリポソームは、種々の脂質、例えばジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびコレステロールを含んだ。両方の負に荷電したＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＧ：α−トコフェロール（５０：３８：１０：２モル比率）および中性ＤＳＰＣ：コレステロール：α−トコフェロール（６６：３２：２モル比率）リポソームを研究した。リポソームは高度にユニラメラであり、そして１５５ｎｍ周辺の平均直径を有した。腫瘍は、注射後４時間までにバックグラウンド筋肉活性から識別し得る。研究はまた、中性リポソームが、負に荷電したリポソームと比較して、腫瘍ヘの増加した取りこみおよび単核食細胞システムによる減少された非特異的取りこみを有することを見出した。

生理学的温度およびそれ以下のゲル相である、リン脂質小胞のために、コレステロールの包含が、膜を流動化することが知られる。他方、そのような流動化は、脂質二層を横断する材料の拡散のために望ましい。逆に、予め形成されたリポソーム内にエントラップされた化合物を保持する文脈では、望ましくない。最適コレステロール含量を決定することにおける追加的考察は、生物分布への影響である。延長された循環時間が、放射性標識されたリポソームの臨床的適用、例えば腫瘍および炎症／感染画像化を拡大することが数年前に認識された。コレステロール含量は、生物分布および血液クリアランス動態に影響する因子であるべきであると示された；コレステロールの流動化効果は、リポソーム膜表面を、タンパク質吸収により感受性でなくする（すなわちオプソニン化の減少された程度）。例えば、ユニラメラコレステロールに富む、１８５ｎｍ直径周辺のリポソームを、病巣S. aureus感染でラットにおいて試験した（Goins, B., et al., J. Nuc. Med., 34, 2160-2168(1993)）。このリポソームは、ＤＳＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＧ：α−トコフェロール、５０：３８：１０：２で脂質を含んだ。これらのリポソームは、ラットで１０時間の循環半減期を示し、これはより早期の製剤について見出されたのよりもかなりより長かった。３５までの筋肉率への膿瘍は、この製剤で報告された。さらなる研究では、ＤＳＰＣおよび２０モルパーセントのコレステロールを含むリポソームは、ＤＳＰＣおよび３０モルパーセントコレステロールを有するリポソームについての５時間に対して、マウスで３０分の循環半減期を有することが見出された（Semple, S.C. et al., Biocheistry, 35, 2521-(1996))。先行技術の技法に基づいて、好ましい物理化学的特性のボトル保存を確保するステロール含量の選択並びにインビボ生物分布／薬理動態は、明確にほどとおい。

予め形成されたリポソームであって、エンドユーザーによって標識されるものは、長期間保存が可能で、その結果標識化およびその後のインビボの使用のため要するリポソームの物理化学的特性は、保持されなければならない。

単純な糖の存在下の凍結乾燥は、長期間保存のため好適な形態のリポソームを調製する１つの潜在的に有用な手段である。研究は、リポソームが外部スクロースの存在下で凍結乾燥され、その後にこれらのサイズの変化なく再水和できることを示した(Tilcock, C. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1148, 77-84(1993))。さらなる研究は凍結乾燥のためのスクロースの最適濃度を分析した（Szucs, M. and Tilcock, C., Nucl. Med. Biol.,22, 263-268(1995)）。３００ｍＭスクロースで、平均直径およびサイズ分布が、凍結乾燥前と再水和後で顕著には異ならないことが見出された。これらの研究のリポソームは、再水和に続いて^９９ｍＴｃで表面標識され、ある方法は、インビボ^９９ｍＴｃの漏出という結果となることが見出された。

したがって、（１）内在化材料を、長期間保存にわたりその本来の化学的形態中に保持する、（２）長期間保存にわたりそれらの内部サイズを保持する、（３）長期間保存後でさえ、内在化可能材料を負荷することができる、（４）感染、炎症および腫瘍の診断的画像化のために、または薬物物質の効果的な送達のため使用し得る、リポソームの必要性がある。そのようなリポソームを提供することが本発明の目的である。本発明のリポソームを考察するための最も重要な物理化学的特性は、リポソームサイズ、エントラップされるジア量の保持、およびリポソーム含量の安定性である。さらに、これらのリポソームはまた、ある種のＭＲＩ造影剤（contrast agent）並びにひとたびリポソームが内部であると有用な治療的化合物に化学的に変換されるプロドラッグの内在化のために好適である。

発明の記載
最初の側面では、本発明は、内在化可能材料で負荷し、感染、炎症および腫瘍を画像化するため、並びに薬物送達のため好適であるリポソームを提供する内在化可能材料で負荷されることのできる新規リポソームを提供する。該組成物は、物理化学的に丈夫であり、かつその本来の化学的形態中に、加工中、例えば脱水および延長された貯蔵中に、エントラップされた材料を保持するリポソームという結果となる。

本発明のリポソームは：
中性リン脂質、
負に荷電したリン脂質、
ステロールを含み、
当該リポソームの内部相にエントラップされた修飾化合物を有する。

ここで、該修飾化合物は、当該材料が、当該リポソームのリン脂質二層を横断する当該材料の拡散に続いて、当該リポソーム内の内在化可能材料を不可逆的に化学的に修飾することのできる化合物であり、その結果、該不可逆的に化学的に修飾された材料は、当該リポソーム内に内在化したままであり、かつ
ここで、該中性リン脂質は、総脂質含量の６０−９０モルパーセントで存在し、該負に荷電したリン脂質は、総脂質含量の２−２０モルパーセントで存在し、かつ該ステロールは、総脂質含量の５−２５モルパーセントで存在する。

「修飾化合物」は、本発明では、予め形成されたリポソーム内に内在化された材料を、不可逆的に化学的に修飾し、その結果当該材料が、該リポソーム内に内在化したままであり得る、化合物として定義される。該修飾化合物は、それらの製造中にリポソーム内にエントラップされ、そして理想的には、延長された貯蔵のための調製中におよび延長された貯蔵期間中にわたり、実質的にエントラップされたままであり、並びに化学的に変化しない。そのような延長された貯蔵に続いて、リポソームを好適には使用し、当該材料のリン脂質二層を横断する拡散、次いでリポソーム内の該材料の化学的修飾によって材料を内在化させ得る。該修飾化合物によって誘導される化学的修飾は好適には、不可逆的である、かつ該内在化材料がリポソームからの拡散することから防止する修飾であり得る。本発明の範囲の外側の修飾は、可逆的化学反応、例えばリポソーム内ヘのｐH介在遠隔薬物負荷において使用されるようなプロトン化反応である。

本発明の好適な修飾化合物は、化学的反応剤、例えば酸化剤、還元剤またはトランスキレート剤を含む。本発明の好ましい還元剤は、酸化防止剤、アスコルビン酸、グルタチオン、およびシステインである。もっとも好ましい酸化防止修飾化合物は、グルタチオンである。修飾化合物は、本発明のリポソーム内に、その本来の化学的形態である延長された貯蔵期間にわたり、エントラップされたままである。効果な膜横断通過および内在化可能材料の当該リポソーム内への負荷次いで該リポソームの延長された貯蔵が、こうして可能である。その後の膜横断通過および材料の内在化を可能としつつ、長期間貯蔵のための調製中および長期間貯蔵中の両方、エントラップされた修飾化合物を保持するという矛盾する要件は、本発明の脂質二層を使用して履行される。

修飾化合物の安定性は、ｐH依存性であり得る。こうして、本発明のさらなる特徴は、リポソーム内およびリポソーム外水性相の組成の調節である。例えば、修飾化合物がグルタチオンであるとき、リポソーム内ｐHは、好ましくは３と６の間であり、グルタチオンの酸化および加水分解を最小化する。好ましいリポソーム内ｐHは、バッファー系の使用で達成され得る。好ましい内部相は、リン酸またはクエン酸−リン酸緩衝スクロース溶液である。長期間貯蔵のための調製中の物理化学的特性の首尾よい保存のための好ましい外部相は、バッファーのないスクロース溶液である。

本発明のリポソーム内への内在化のための好適な材料は、放射性活性SPECT画像化剤、MRI造影剤、ｘ線造影剤またはプロドラッグであることができる。好適なプロドラッグは、本発明のリポソームの脂質二層を横断して受動的に拡散できるものであり、そしてそれは好適には、内在化すると対応薬物内に変換される。当該薬物は好適には、リポソーム膜を横断して拡散しない。内在化のための好ましい材料は、放射性活性化合物、常磁性化合物および放射性不透性化合物である。そのような材料の内在化は、ヒトの感染、炎症および腫瘍を有効な画像化に好適であるリポソームを生産する。本発明の最も好ましい材料は、金属キレートであり、ここで当該金属キレートの金属は好適には、放射性金属、常磁性金属または放射性不透性金属から選択される。好ましい放射性金属は^９９ｍＴｃおよび^１１１Ｉｎであり、好適な常磁性金属は、ガドリニウムおよびマンガンであり、そして好適な放射性不透性金属は、タングステンである。最も好ましい放射性金属は、^９９ｍＴｃであり、ここで該好ましい金属キレートは、^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯである。

「総脂質含量」は、本発明において、リポソームの脂質二層中に存在するすべての脂質成分のモル合計であるとして定義される。これらの脂質成分は、種々のリン脂質プラスステロールである。リポソームの脂質二層中に存在するそれぞれの脂質成分の量は、総脂質含量のモルパーセントの観点から表現され、すなわち総脂質含量はこうして１００モルパーセントに対応する。

中性リン脂質は好ましくは、総脂質含量の７０と８５モルパーセントの間で存在する。負に荷電したリン脂質は好ましくは、総脂質含量の５と１０モルパーセントの間で存在する。好ましい実施態様は、二層組成物を有するリポソームであって、ここで該ステロールが層脂質含量の１０と２５モルパーセントの間で存在する。

本発明のリポソームのステロール成分は好適にはコレステロールまたはその誘導体、例えばエルゴステロール、またはコレステロールヘミスクシネートであるが好ましくはコレステロールである。ステロールは、（１）エントラップされた修飾化合物の最大保持を可能とし、かつ、（２）長期間貯蔵中に物理化学的特性（例えばリポソームサイズおよびサイズ分布）の変化を最小化する、（３）延長された貯蔵期間後でさえ、リポソームの内部総への材料の通過を可能とする、量で存在する。実施例１は、ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：４４）リポソームと比較した場合に、ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：７．５と４９：５：１５の間）リポソームは一般に、グルタチオン（酸化されかつ還元された形態）漏出の減少された程度、リポソームサイズの末端変化および凍結乾燥後の放射性化学的純度（ＲＣＰ）のより小さい変化を実証する（表１）。

コレステロールのようなステロールの、リン脂質二層への包含は、膜流動性に影響することが知られる。本発明は、延長されたシェルフライフのためのインビトロで十分に安定である、ずっとそれらの望ましい物理化学的特性を維持する、かつ材料の内在化後、インビボ使用のため好適な生物分布プロファイルを有する、最適化されたステロール含量のリポソームを提供する。リポソームサイズはまた、実施例６に示すように、薬物動態学および生物分布に影響することが実証された。類似のパーセンテージ血液放射性化性および病変取りこみは、類似サイズの凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロールおよびＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロールリポソーム（モル比率は４９：５：７．５と４９：５：２０の間）、そして高コレステロール含量を有するリポソーム懸濁液（ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール：α−トコフェロール；モル比率；４９：５：４４：２）について見出された。

本発明のリポソームの脂質二層は好ましくは、負に荷電し、かつ中性の、１４と２０の間の炭素原子のアシル鎖を有する脂肪酸部分を有するリン脂質成分を含む。脂質二層の中性リン脂質成分は好ましくは、フォスファチジルコリン、最も好ましくはジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジミリストイルフォスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）から選択される。脂質二層の負に荷電したリン脂質成分は、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリンまたはフォスファチジルイノシトール化合物、好ましくはジステアロイルフォスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびジミリストイルフォスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）から選択され得る。好ましくは、中性リン脂質は、フォスファチジルコリン化合物であり、かつ負に荷電したリン脂質は、フォスファチジルグリセロール化合物である。これらのリン脂質の脂肪酸部分は、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸またはアラキドン（archidonic）酸から選択し得る。好ましい脂肪酸部分は、ミリスチン酸およびステアリン酸であり、アシル鎖長が、それぞれ１４と１８炭素である脂肪酸部分である。負に荷電したかつ中性リン脂質成分の両方の脂肪酸部分が、等しいアシル鎖長のものであるのが、本発明のもっとも好ましい実施態様である。

本発明のリポソームは、これらの膜の成分としてα−トコフェロールの使用を要しない。α−トコフェロールは、いくつかの先行技術放射性標識リポソームで、リン脂質並びに任意のエントラップされた成分の酸化を限定するために必要な酸化防止剤として含まれ、こうして許容されるRCPを確保した。α−トコフェロールの包含は、本発明のリポソームのために必須の要件ではないことが見出され、そして許容されるRCP値は、脂質組成中のα―トコフェロールの不存在で達成された。

インビボのリポソームの血液半減期は、十分長くなければならず、したがって本発明のリポソームは好適なサイズのものでなければならない。本発明のリポソームは好適には、直径５０と４００ｎｍの間であり、そして好ましくは直径８０と１４０ｎｍの間である。実施例６は、リポソームサイズの減少が、血液中のパーセンテージ放射活性、血液滞留時間を示す指標を増加させたことを示す。また負に荷電したリン脂質としてＤＭＰＧよりむしろＤＳＰＧの使用が、所定のリポソームサイズのためのパーセンテージ血液放射性活性をわずかに増加させることが示された。直径範囲１３０−１８０ｎｍを有するリポソームのために、サイズおよび病変取りこみが負に相関する場合、病変取りこみの程度は、凍結乾燥したＤＳＰＧ−とＤＭＰＧ−に基づくリポソームの両方について類似であった。これらの結論は、凍結乾燥されたＤＳＰＧ−およびＤＭＰＧに基づくリポソーム調製品の両方について生物分布の組み合わせた多変量評価によって支持された。図４は、一次的モジュレーターであるリポソームサイズでの、モデル予測パーセンテージ血液放射性活性を示す（注射４時間後）。図５は、ＤＭＰＧとＤＳＰＧの、リポソームサイズの関数として、予測されたパーセンテージ血液放射性活性を示す（注射４時間後）。

本発明のリポソームは、当業界で広く知られる方法によって調製した（Lasic DD. Preparation of liposomes. In:Lasic DD, ed. Liposomes from physics to applications. Amsterdam, The Netherlands: Elsevier Science Publishers B.V., 1993;63-107)。調製の方法は、実施例１に簡単に記載される。

本発明の第２側面では、内在化材料を有するリポソームであって、本発明の第１側面のリポソームを含むものを提供し、ここで該内在化材料は不可逆的に、修飾化合物によって化学的に修飾されたものである。内在化材料を有するリポソームの調製は典型的に、延長された貯蔵後にリポソームの再構成に付随して起こる。好ましくは、内在化材料は、ＳＰＥＣＴ画像化剤、ＭＲＩ造影剤、ｘ線造影剤または薬物である。もっともの好ましくは、該内在化材料は、放射活性化合物、常磁性化合物、または放射不透性化合物である。特に好ましい内在化材料は放射性金属である。放射性金属を好ましくは、当該放射性金属の、リポソーム内への輸送のために好適なキレート剤と錯体化する。好適なキレート剤は、望まれる放射性金属と錯体化し、そしてリポソームの膜を経由して拡散し得るものでなければならない。これは、親油性かつ十分に水溶性である放射性金属錯体を形成する担体を要し、脂質小胞の水区画内の効率的輸送を可能とする。

内在化材料がＳＰＥＣＴ画像化剤である場合、それは好ましくは、ヒト対象の画像化で特に有用である^９９ｍＴｃおよび^１１１Ｉｎでのガンマ放射体である。本発明のもっとも好ましいガンマ放射体は、^９９ｍＴｃである。^９９ｍＴｃのための好適なキレートは、アルキレンアミンオキシムである。^９９ｍＴｃのために、好ましいキレートは、ＨＭＰＡＯであり、というのは^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯは容易に、負に荷電したリポソームの膜を横断するからである。

材料の、本発明のリポソームないへの効率的内在化は、内部相中にエントラップされた修飾化合物の存在に依存する。内在化材料である放射性金属錯体の場合、エントラップされた修飾化合物の機能は、好ましくは^１１１Ｉｎまたは^９９ｍＴｃを含む放射性金属錯体を、リポソーム内に内在化されたままであるより親水性形態に変換し、より効率的な放射性標識化工程という結果となるべきである。こうして、修飾化合物は、予め形成されたリポソーム内側に保持されるのが重要であり、その結果放射性金属錯体の、リポソームないへの膜横断通過が阻害されず、そして放射性金属錯体は、放射化学的純度（ＲＣＰ）に反対に影響するリポソーム外側の親水性形態に変換されない。

実施例１および３では、表ＩおよびＩＩＩは、７．５−１５モル比率コレステロールを含む、凍結乾燥されたＤＭＰＧ−およびＤＳＰＧに基づくリポソームについて７０％の許容されるＲＣＰを示す。実施例２では、外部相からのバッファーの除去は、ＲＣＰ維持を与え、そして凍結乾燥するとグルタチオン漏出の程度を最小化することを実証した。実施例４では、表ＩＶおよびＶは、グルタチオン分解の動態およびカプセル化グルタチオンの漏出が、安定なＲＣＰ値を伴って、ストレス条件下で共にゆっくりであることを示す。図１および２は、組成物ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール：α−トコフェロール（モル比率４９：５：４４：２）のリポソーム懸濁液と比較して、いくつかの選択された凍結乾燥ＤＭＰＧにおよびＤＳＰＧに基づくリポソームの改善されたＲＣＰおよび化学的安定性を実証する。

本発明の第３側面は、内在化された材料を有するリポソームの調製のためのキットを提供する。用語「キット」は、ヒトヘの投与のため好適な内在化材料を有するリポソームの容易な調製のために設計された本発明の商業的に許容される実施態様として意味する。本発明のキットは：
（ｉ）本発明の第１側面に従うリポソームを含む第１区画、および
（ｉｉ）本発明の第１側面に従う材料またはその前駆体を含む第２区画
を含む。

キットの構成要素は、バイアルのような別々の容器として、または代替的に１つのバイアルまたは１つの２区画シリンジのような単一容器の別々の区画として存在し得る。材料の、リポソームヘの内在は、最初に材料またはその前駆体を、適当な溶液と再構成し、次いでリポソームを有する該溶液をインキュベートすることによって達成する。バイアルが材料の前駆体を含む場合、溶液は好適には、材料を生産するための必要な反応剤、例えば放射性化合物の場合には、適当な放射性同位体を含む。そこに生産されるリポソームの好ましい使用は、感染、炎症または腫瘍を画像化する目的のためのヒトヘの投与である。最も好ましい使用の様式では、滅菌凍結乾燥リポソームを、滅菌^９９ｍＴｃ−ＨＭＰＡＯとインキュベートし、ヒトへの投与のため好適な^９９ｍＴｃで標識したリポソームを与える。

第１区画のリポソームは、
（ｉ）好適なサイズ分布の第１形態のリポソームの集合物を生産すること、
（ｉｉ）リポソームの外部相を、該内部相と異なる媒体で置換すること、および
（ｉｉｉ）延長された貯蔵のために好適な第２形態へリポソームを加工すること、
によって調製する。
最適生物学的成績のため適当なサイズおよびサイズ分布を有するリポソームの集合物を創出することは、ある数の方法によって達成し得る。商業的品質の調製のために、好ましい方法は、高圧ホモジナイズである。単一の稼動またはある数の稼動は、好適にサイズ化された、リポソームの集合物が生産されるまで、実施し得る。

内部相の構成要素は、望まれる脂質構成要素の均質な混合物を水和するとまたは加工中に、カプセル化し得る。外部の修飾化合物を除去する工程が、加工に含まれる。外部の修飾化合物の除去は、遠心分離、透析ろ過、透析またはクロマトグラフィーによって実施し得る。透析ろ過は、外部相の置換のための最も好ましい方法である。

好ましい実施態様では、リポソームを、それらの物理化学的および生物学的特性を維持するのに好適な形態に加工し得る。本発明にしたがうリポソームの二相組成物は、それらを第１の懸濁形態から、エントラップされた修飾化合物の喪失なく延長された貯蔵に好適な第２の形態へ加工、リポソームサイズの変化または膜流動性の変化されることのできるようにする。この第２の形態は、第１の形態の凍結または脱水版であり得る。この第２の形態を生産する好適な方法は、凍結、凍結乾燥、および硝子化である。好ましい方法は凍結乾燥である。この第２形態では、リポソームは、延長された貯蔵期間にわたり、これらの本来のサイズを保持すること並びにその本来の化学的形態中に就職化合物をエントラップすることが可能である。実施例１および３で実証するように、凍結乾燥するとＤＳＰＧに基づくおよびＤＭＰＧに基づくリポソームの成績は、コレステロール含量が低範囲におけるときにのみ満足いくものであった（表ＩおよびＩＩＩ）。最小グルタチオン漏出、リポソームサイズの末端変化およびＲＣＰは、凍結乾燥するとリポソーム組成の両方の型について共通の特徴であった。

本発明のリポソームは好ましくは、感染、炎症および腫瘍の画像化のためにヒトへの投与のために好適な形態で調製する。したがって、リポソームは（１）適当な物理化学的特性（例えばサイズ、サイズ分布および脂質二相流動性）を有し、（２）望まれる内部および外部水性相を有し、かつ（３）滅菌性であることを確保することが必要である。本発明の第４の側面は、ヒトで感染、炎症および腫瘍を画像化するためのリポソームの使用である。本発明の内在化材料を有するリポソームは、好ましくは、ヒトで感染および／または炎症を画像化するために使用する。好適な感染および炎症状態は、骨髄炎、炎症性腸疾患、および虫垂炎を含む。

内在化材料を有するリポソームの生物学的成績は、キー物理化学的特性に関するインビトロおよびインビボ両方の調製の安定性に依存する。リポソーム調製のために、内在化材料は、リポソームと会合したままであることが重要である。

２５℃で貯蔵したときの凍結乾燥されたＤＭＰＧにおよびＤＳＰＧに基づくリポソーム（黒色印）およびリポソーム懸濁液（白色印）のＲＣＰ安定性を示す（組成の詳細について実施例４参照）。２５℃で貯蔵したときの凍結乾燥されたＤＭＰＧにおよびＤＳＰＧに基づくリポソーム（黒色印）およびリポソーム懸濁液（白色印）についてのカプセル化されたグルタチオンの化学的安定性を示す。再構成された^９９ｍＴｃで標識された凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＸＰＧ：コレステロール（モル比率：４９：５：Ｘ）リポソーム（４時間ｐｉ、脂質用量−２ｍｇ／ｋｇｂｗ）について（ａ）血液および（ｂ）病変におけるパーセンテージ放射性活性に関してＤＳＰＧおよびＤＭＰＧを比較する。リポソーム懸濁液についての結果は含まれる。データは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）で与える。（組成の詳細は実施例６参照）。変数としてコレステロール含量、ＤＭＰＧ／ＤＳＰＧおよびリポソームサイズを使用する部分的最小二乗（ＰｌＳ−１）モデル血液中の（ａ）予測された、対、測定されたパーセンテージ放射活性、（ｂ）モデルについての回帰係数を示す。図４で示すＰＬＳ−モデルについてのリポソームサイズおよびＤＭＰＧ（０）／ＤＳＰＧ（１）の関数としての血液中のパーセンテージ放射活性の応答二乗を示す。感染したおよび非感染のラットにおいて、再構成された^９９ｍＴｃで標識された凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率：４９：５：１２．５）リポソームの注射後のガンマカメラ画像を比較する。

本発明は、以下の非限定的実施例によって例示する。
実験的実施例
実施例１−コレステロールレベルの、リポソームを含む凍結乾燥グルタチオンの成績に及ぼす影響
ＤＳＰＣ、ＤＭＰＧ（またはＤＳＰＧ）およびコレステロールを、モル比率４９：５：Ｘで含む脂質混合物を調製した。ここでＸは、０と４４の間であった。簡単には、脂質を有機溶媒に溶解し、そして得られた脂質混合物を、減圧下で乾燥し、そしてふるって微小脂質粉末を生産した。

脂質の、グルタチオン含有１０ｍＭクエン酸−リン酸バッファー３００ｍＭスクロース溶液（ｐＨ５）の分散液を、高圧ホモジナイズおよび／または押し出しの工程の対象とした。リポソーム外グルタチオンの除去を、３００ｍＭスクロース溶液に対する透析ろ過によって達成した。リポソームを次いで凍結乾燥した。

前調製リポソームの放射性標識化を、^９９ｍＴｃで標識したＨＭＰＡＯの、脂質二相を横断する拡散によって達成した。簡単には、^９９ｍＴｃを商業的^９９Ｍｏ／^９９ｍＴｃ発生器（AmertecII）の溶出および２００ＭＢｑ／ｍｌの濃度への希釈によってナトリウムパーテクネテートの形態で取得した。溶出液を、発生器からの溶出２時間以内に使用した。ＨＭＰＡＯ（Ceretec（登録商標））の１バイアルを、５ｍｌのパーテクネテート（２００ＭＢｑ／ｍｌ）と再構成し、そして１０秒間振とうした。活性は、９００ＭＢｑと１１００ＭＢｑ（±１０％）の間であった。１と５分の間後、４ｍｌの放射性活性溶液を、凍結乾燥リポソームに移動し、そして混合物を１０秒間振とうした。得られた溶液の加性は、８１０ＭＢｑと９９０ＭＢｑの間であった（±１０％）。

凍結乾燥グルタチオン含有ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）リポソームの物理化学的特性を、表Ｉにまとめる。典型的には、リポソームサイズ（Ｚ−平均；強度−重量平均直径）を光量子相関分光法によって、大小胞（１−３０^Ｓ _Ｂｍ）の数濃度を、Coulter Counter技法によって、ＲＣＰをインスタント薄層クロマトグラフィーによって、グルタチオンのリポソーム外および総含量をＨＰＬＣによって測定した。

表Ｉ：内部および外部相としてそれぞれクエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）および非バッファースクロース溶液を含む凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）リポソームの物理化学的特性

^＊還元されおよび酸化されたグルタチオン

実施例２−リポソーム外バッファーの除去の、凍結乾燥グルタチオン含有リポソームの成績に及ぼす影響
モル比率が４９：５：１０であるＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロールの組成のグルタチオンを含有するリポソームを、実施例１に記載のように調製した。内部相は、リン酸バッファー３００ｍＭスクロース溶液（ｐＨ６）を含んだ。外部相は、３００ｍＭスクロース溶液またはリン酸バッファー３００ｍＭスクロース溶液（ｐＨ６）を含んだ。
表ＩＩは、凍結乾燥中の、外部バッファーの、グルタチオンを含有する、ｄＳＰＣ：ＤＭＰＣ：コレステロール（モル比率；４９：５：１０）リポソームの成績に及ぼす影響をまとめる。

表ＩＩ：内部相としてリン酸バッファースクロース溶液（ｐＨ６）および、外部相としてスクロース溶液またはリン酸緩衝するクロース溶液（ｐＨ６）を含む凍結乾燥ＤＳＰＣ：ＤＭＰＣ：コレステロール（モル比率；４９：５：１０）リポソームの物理化学的特性

^＊還元されおよび酸化されたグルタチオン

実施例３−負に荷電したリン脂質としてのＤＭＰＧの代わりのＤＳＰＧの使用
４９：５：Ｘのモル比率であるＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロールの組成のグルタチオンを含有するリポソームを、実施例１に概説のように調製した。ここでＸｈａ１０ないし１５であった。内部相は、クエン酸−燐酸バッファー３００ｍＭスクロース溶液（ｐＨ５）を含んだが、一方で外部相は３００ｍＭスクロース溶液であった。

表ＩＩＩ：内部相および外部相としてそれぞれ、クエン酸−リン酸バッファー（ｐＨ５）および非バッファースクロース溶液を含む、凍結乾燥したＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）リポソームの物理化学的特性

^ａ還元されおよび酸化されたグルタチオン、^ｂ凍結乾燥中の誤りのサイズ増加（表Ｖ参照）

実施例４−延長された期間にわたる、凍結乾燥された、グルタチオンを含有するリポソームの貯蔵
ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロールおよびＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）の組成[ここでＸは１０ないし１５である（表Ｉ−ＩＩＩ参照）]の、種々の凍結乾燥されたリポソームバッチの安定性を、制御された温度および湿度および光から保護された安定室中の貯蔵バイアルによって監視した。使用された種種の貯蔵条件は、４℃／環境湿度、２５℃／６０％湿度、３０℃／６０％湿度および４０℃／７５％湿度であった。以下のパラメーターを、５ヶ月の貯蔵まで、放出するとき測定した：リポソーム外および総グルタチオン含量、リポソームサイズ、およびＲＣＰ。

表ＩＶ：選択された凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）リポソームの安定性データ

^ａ還元されおよび酸化されたグルタチオン、^ｂ酸化されたグルタチオン

表Ｖ：選択された凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）の安定性データ

^ａ還元されおよび酸化されたグルタチオン、^ｂ酸化されたグルタチオン、^ｃ恐らく装置エラーのための大サイズ。

実施例５−感染ラットモデル
２００ｇ（±２５ｇ）メスWistarラットを、Halothaneで麻酔した。病巣膿瘍を、０．１ｍｌの７ｘ１０^８細胞／ｍｌS. Aureus濃縮懸濁液の、薄筋内ヘの接種によって右ももに創出した。針を、注射後に除去し、そしてその領域を７０％エタノール溶液に浸したコットンウールボールで軽く拭いた。動物を、それらのケージに戻し、そして回復させつつ注意深く監視した。動物を、接種の４８時間以内に研究した。

実施例６−感染ラットモデルにおける、凍結乾燥したＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロールおよびＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロールリポソームの生物分布
凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）およびＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：Ｘ）リポソームバッチ（ここでＸは７．５ないし２０である）を、インビボで調査した（表Ｉ−ＩＩＩ参照）。生物分布研究を、実施例５に記載したS. Aureus感染したラットモデルで実施した。

図ＩＩＩは、再構成した^９９ｍＴｃで標識した凍結乾燥ＤＳＰＧにおよびＤＭＰＧに基づくリポソームの静脈内注射４時間後の、（ａ）血液、および（ｂ）病変中の％放射性活性を比較する（脂質用量、２ｍｇ／ｋｇ体重）。

実施例７−ガンマカメラ画像
ラットのダイナミックガンマカメラ画像を、本発明のリポソームの注射後取得した（脂質用量４ｍｇ／ｋｇ体重）。

図ＶＩは、再構成された^９９ｍＴｃ標識した凍結乾燥されたＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール（モル比率；４９：５：１２．５）リポソームを注射３０分後の、注射したおよび注射しないラットの比較画像を示す。

Claims

（ｉ）ジステアロイルフォスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる中性リン脂質、
（ｉｉ）ジミリストイルフォスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）からなる負に荷電したリン脂質、
（ｉｉｉ）コレステロールからなるステロール
を含むリポソームであって、
当該リポソームの内部相中にエントラップされたグルタチオンを有し、
上記グルタチオンが、当該リポソームのリン脂質二層を横断して拡散した^99mＴｃ標識ヘキサメチレンプロピレンアミンオキシム（^99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ）を当該リポソーム内で還元して、還元された^99mＴｃ−ＨＭＰＡＯが当該リポソーム内に内在化したまま残るようにすることができ、
上記ＤＳＰＣ：ＤＭＰＧ：コレステロールのモル比が４９：５：７．５−４９：５：１５の範囲内にある、リポソーム。
（ｉ）請求項１記載のリポソームと、
（ｉｉ）当該リポソーム内に内在化された還元された^99mＴｃ標識ヘキサメチレンプロピレンアミンオキシム（^99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ）と、
を含むリポソーム。
請求項２記載のリポソームの調製用キットであって、
（ｉ）請求項１記載のリポソームを含む第１の区画と、
（ｉｉ）^99mＴｃ標識ヘキサメチレンプロピレンアミンオキシム（^99mＴｃ−ＨＭＰＡＯ）又はその前駆体を含む第２区画
を含むキット。